CN114941042A - 一种检测hiv-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用 - Google Patents

一种检测hiv-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测HIV‑1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用，扩增引物核苷酸序列如SEQIDNO.1～4所示，测序引物核苷酸序列如SEQIDNO.5～8所示，基于所述引物组构建检测HIV‑1整合酶耐药突变扩增测序体系和检测方法，高灵敏度且覆盖范围广地检测HIV整合酶耐药突变，为研发新药物、为患者探索更适合的治疗方案提供基础。

Description

一种检测HIV-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及检测HIV-1整合酶耐药突变的技术。
背景技术
HIV是一种能攻击人体免疫系统的病毒。人体感染HIV后逐渐丧失免疫功能，因而易罹患不同疾病，也发生恶性肿瘤，病死率高。抗HIV治疗技术中，以整合酶为治疗靶点之一，人们已开发多种整合酶抑制剂与其他药物配合治疗控制艾滋病发展。由于HIV在病毒复制过程中高突变特性以及抗HIV药物的使用导致HIV耐药突变的情况出现，检测整合酶区基因是否发生耐药突变对于分析整合酶抑制剂药效非常重要。现有检测方法有基因型分析法，首先RT-PCR扩增目的基因，再测序分析耐药突变情况，然而现有技术对HIV整合酶基因扩增灵敏度局限，扩增失败情况常见，面对不同亚型的HIV整合酶需要设计不同的引物，导致检测工作繁琐。因此，研发高灵敏度覆盖范围广的HIV整合酶耐药突变技术，为研发新药物、为患者探索更适合的治疗方案提供基础是有必要的。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种检测HIV-1整合酶耐药突变的引物组。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种检测HIV-1整合酶耐药突变的引物组，包括扩增引物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1～4所示。
进一步地，还包括测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～8所示。
本发明还提供所述的引物组在检测HIV-1整合酶耐药突变中的应用。
优选地，所述HIV-1整合酶选自亚型为CRF01-AE、CRF08-BC、C、CRF07-BC的HIV-1。
本发明还提供一种用所述的引物组检测HIV-1整合酶耐药突变的方法，步骤包括：提取HIV-1核酸作为模板，以权利要求2的引物组作为RT-PCR、PCR、测序PCR扩增引物进行反应，对产物进行测序分析，得到突变类型信息。
本发明还提供所述的引物组在制备检测HIV-1整合酶耐药突变的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，包括RT-PCR扩增体系和PCR扩增体系，
RT-PCR扩增体系包括：
(a)RT-PCR反应液14μL，其中包括包含dNTP Mixture及Mg2+的2×One-StepMasterMix 12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；
(b)RT-PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U。
(c)10μL HIV-1病毒核酸；
PCR扩增体系包括：
(a)PCR反应液42μL，其中包括含Mg2+的10×PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；
(b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水；
(c)RT-PCR扩增产物5μL。
本发明还提供一种应用所述的扩增体系的扩增方法，过程是：
首先进行RT-PCR扩增，反应程序为：
(a)50℃30min；
(b)94℃预变性5min；
(c)94℃变性20s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；
(d)72℃延伸10min，4℃保温；
RT-PCR扩增完成后，进行PCR扩增，反应程序为：
(a)94℃预变性5min；
(b)94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，3个循环；
(c)94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；
(d)72℃延伸5min，4℃保温。
本发明还提供一种包含所述的引物组的扩增测序体系，包括RT-PCR扩增体系、PCR扩增体系、测序PCR体系，
RT-PCR扩增体系包括：
(a)RT-PCR反应液14μL，其中包括包含dNTP Mixture及Mg2+的2×One-Step MasterMix 12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；
(b)RT-PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U；
(c)10μL HIV-1病毒核酸；
PCR扩增体系包括：
(a)PCR反应液42μL，其中包括含Mg2+的10×PCR buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；
(b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水；
(c)RT-PCR扩增产物5μL；
测序PCR体系20μl，其包括：
(a)Bigdye 2μl；
(b)Bigdye buffer 3μl；
(c)3.2μM测序引物1μl；
(d)纯化得到的PCR产物10～100ng或Xμl，X取值为1-5；
(e)无菌水余量。
测序引物如SEQ ID NO.5～8所示，共4条测序引物，每条测序引物按上述测序PCR体系要求单独配制一个测序PCR体系，配制4个测序PCR体系。
本发明还提供一种应用所述的扩增测序体系的HIV-1整合酶耐药突变检测方法，包括过程如下：
1)HIV-1核酸样本提取、纯化；
2)扩增体系配制及扩增实验：
进行RT-PCR扩增，反应程序为：
(a)50℃30min；
(b)94℃预变性5min；
(c)94℃变性20s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；
(d)72℃延伸10min，4℃保温；
RT-PCR扩增完成后，继续PCR扩增，PCR扩增的反应程序为：
(a)94℃预变性5min；
(b)94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，3个循环；
(c)94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；
(d)72℃延伸5min，4℃保温；
3)产物纯化；
4)测序实验：
同一个HIV-1核酸样本需采用4个测序PCR体系分别做测序PCR反应，
测序PCR扩增程序：
(a)96℃预变性1min；
(b)96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环；
(c)4℃保温。
5)测序产物纯化及测序分析，得到相关的突变类型信息。
本发明的优点包括：
采用RT-PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶区(1～288)常见耐药突变，能检测多种亚型的HIV-1整合酶耐药突变，稳定性好，覆盖范围广，检测灵敏度可达到HIV-1病毒载量为200copies/mL。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1-图4是实施例一测序峰图开头片段；
图5是实施例二PCR扩增琼脂凝胶电泳图；
图6是实施例二测序分析结果；
图7是实施例三PCR扩增琼脂凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一：HIV-1整合酶耐药突变检测
1.实验材料
试剂包括：
核酸提取试剂盒(磁珠法，达安DA0623)
Evo M-MLV One Step RT-PCR Kit(AG11606，广州瑞真生物技术有限公司)
Accurate Taq HS DNA Polymerase(Mg2+and dNTPs plus)(AG11203，广州瑞真生物技术有限公司)
BigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(4337456，赛默飞世尔科技公司)
HiDi Formamide(4404307，赛默飞世尔科技公司)
NaAc(3M,PH 5.2，R00738，Leagene)
EDTA(AM9260G，Invitrogen)
无水乙醇(AR(分析纯)，广东光华化学厂有限公司)
本实施例针对HIV-1基因组整合酶区，在保守区设计特异性引物，采用RT-PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶区(1～288)常见耐药突变，扩增引物如表1中SEQ ID NO.1～4(Invitrogen)所示，测序引物如表1中SEQ IDNO.5～8(Invitrogen)所示：
表1
Figure BDA0003668901840000051
Figure BDA0003668901840000061
设备及耗材：
PCR仪(veriti，ABI)、高速冷冻离心机(75007201，赛默飞世尔科技公司)、振荡器(Lab daucer)、移液器(17014422，瑞宁)、测序仪(3500xl Dx，ABI)、-20℃/-80℃冰箱(Haier)、通风柜(广州汇绿实验设备有限公司)、生物安全柜(BioBase)、移液吸头(Axygen)、50ml离心管(BIOFIL)、1.5ml离心管(AXYGEY)。
2.实验步骤
1)HIV-1核酸样本提取、纯化：
全自动磁珠提取或柱法提取。HIV-1病毒载量浓度高于1×104copies/ml的样本，请按照核酸提取试剂盒(磁珠法，达安DA0623)说明书进行操作；而HIV-1病毒载量浓度低于1×104copies/ml的样本，请将提取的样本量加大到500μl并用30μl洗脱液收集核酸，其他操作按照试剂盒说明书即可；
2)扩增体系配制及扩增实验：
RT-PCR体系包含：
(a)RT-PCR反应液14μL，其中包括2×One-Step Master Mix(包含dNTP Mixture及Mg2+)12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；
(b)RT-PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U。
(c)10μL步骤1)提取得到的HIV-1病毒核酸；
进行RT-PCR扩增，反应程序为：
(a)50℃30min；
(b)94℃预变性5min；
(c)94℃变性20s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；
(d)72℃延伸10min，4℃保温。
RT-PCR扩增完成后，继续PCR扩增。
PCR体系包含：
(a)PCR反应液42μL，其中包括10×PCR buffer(含Mg2+)5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；
(b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水。
(c)RT-PCR扩增产物5μL。
PCR扩增的反应程序为：
(a)94℃预变性5min；
(b)94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，3个循环；
(c)94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；
(d)72℃延伸5min，4℃保温。
3)产物分析与纯化：
PCR扩增结束后，取5μl产物进行琼脂糖凝胶电泳，若有目的条带(约1100bp)，则继续进行PCR产物纯化(可用商品化的PCR产物纯化试剂盒)；
4)测序PCR体系配制及测序实验：
测序PCR体系20μl，其包括：
(a)Bigdye 2μl；
(b)Bigdye buffer 3μl；
(c)3.2μM测序引物1μl；
(d)步骤3)纯化得到的PCR产物Xμl(或者纯化得到的PCR产物10～100ng)，
X的取值视浓度高低而定，可以根据琼脂糖凝胶电泳所得条带亮度来判读浓度高低，浓度高，则条带亮，X取值为1-2；若PCR产物浓度低，则条带亮度偏暗，X取值为4-5；
(e)无菌水余量。
测序引物如SEQ ID NO.5～8所示，共4条测序引物，每条测序引物按上述测序PCR体系要求单独配制一个测序PCR体系，同一个HIV-1核酸样本需做4个测序PCR反应。
测序PCR扩增程序：
(a)96℃预变性1min；
(b)96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环；
(c)4℃保温。
5)测序产物纯化及测序：使用酒精沉淀法对测序PCR产物进行纯化，然后上机ABI3500xl Dx测序仪进行测序，如图1-4所示，选取某阳性样本的4个测序峰图的开头片段，图1-4的出峰整齐没有杂乱，可以判断实验过程顺利；
结果分析，将测序所得的4条序列使用具有拼接功能的软件进行序列接拼，得到完整fasta格式序列，再导入HIV耐药数据库(如国际公认的斯坦福大学HIV耐药数据库：https://hivdb.stanford.edu/hivdb/by-sequences/#select-all)，得到相关的突变类型信息。
实施例二
选取5个亚型分别是：CRF01-AE、CRF08-BC、C、CRF07-BC、CRF07-BC的HIV-1阳性样本做待测组1-5，无HIV-1病毒的胎牛血清做阴性对照组NC，按照实施例一的方法进行RT-PCR、PCR扩增，结果如图5所示，NC没有出现条带，而编号1-5的待测组均出现了长度约1100bp的目的条带。说明本发明RT-PCR及PCR体系扩增稳定性好、普适性好。
产物经过纯化后，按照实施例一的方法进行测序PCR反应及测序PCR产物纯化，对测序PCR产物进行测序分析工作，结果如图6所示，other一栏中清晰显示了5个样本各自存在的突变位点，说明本发明能够准确获得不同亚型HIV-1的突变位点信息，能为HIV-1对整合酶抑制剂耐药研究提供基础。
实施例三
选取HIV-1病毒载量分别为200copies/mL、500copies/mL、1000copies/mL、2000copies/mL、5000copies/mL的5个HIV-1阳性样本做待测组1-5，无HIV-1病毒的胎牛血清做阴性对照组NC，按照实施例一的方法进行RT-PCR扩增、PCR扩增，结果如图7所示，NC没有出现条带，而编号1-5的待测组均出现了长度约1100bp的目的条带。说明本发明RT-PCR及PCR体系扩增灵敏度能够达到HIV-1病毒载量200copies/mL。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Figure BDA0003668901840000101
Figure BDA0003668901840000111
Figure BDA0003668901840000121
序列表
<110> 广州立菲达安诊断产品技术有限公司
<120> 一种检测HIV-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用
<130> 2022
<141> 2022-05-30
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gccgcaagat tcgggatcag aag 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gccaaatgcc agtctctttc tcctg 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
gcgatgggta ccagcacaca aagg 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cggctcctag tgggatgtgt acttc 25
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cagcacacaa agg 13
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tagtgggatg tgtacttc 18
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gcgagcagtc catgtagcca gtg 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gcggagtagt ttggctggtc cttt 24

Claims (10)

1.一种检测HIV-1整合酶耐药突变的引物组，其特征在于：
包括扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测HIV-1整合酶耐药突变的引物组，其特征在于：
还包括测序引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5～8所示。
3.如权利要求1或2所述的引物组在检测HIV-1整合酶耐药突变中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述HIV-1整合酶选自亚型为CRF01-AE、CRF08-BC、C、CRF07-BC的HIV-1。
5.一种用权利要求2所述的引物组检测HIV-1整合酶耐药突变的方法，其特征在于：
步骤包括：提取HIV-1核酸作为模板，以权利要求2的引物组作为RT-PCR、PCR、测序PCR扩增引物进行反应，对产物进行测序分析，得到突变类型信息。
6.如权利要求1或2所述的引物组在制备检测HIV-1整合酶耐药突变的试剂盒中的应用。
7.一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，其特征在于：
包括RT-PCR扩增体系和PCR扩增体系，
RT-PCR扩增体系包括：
(a)RT-PCR反应液14μL，其中包括包含dNTP Mixture及Mg2+的2×One-Step Master Mix12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；
(b)RT-PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U。
(c)10μL HIV-1病毒核酸；
PCR扩增体系包括：
(a)PCR反应液42μL，其中包括含Mg2+的10×PCR buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；
(b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水；
(c)RT-PCR扩增产物5μL。
8.一种应用如权利要求7所述的扩增体系的扩增方法，其特征在于：
过程是：
首先进行RT-PCR扩增，反应程序为：
(a)50℃30min；
(b)94℃预变性5min；
(c)94℃变性20s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；
(d)72℃延伸10min，4℃保温；
RT-PCR扩增完成后，进行PCR扩增，反应程序为：
(a)94℃预变性5min；
(b)94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，3个循环；
(c)94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；
(d)72℃延伸5min，4℃保温。
9.一种包含如权利要求2所述的引物组的扩增测序体系，其特征在于：
包括RT-PCR扩增体系、PCR扩增体系、测序PCR体系，
RT-PCR扩增体系包括：
(a)RT-PCR反应液14μL，其中包括包含dNTP Mixture及Mg2+的2×One-Step Master Mix12.5μL，10μM如SEQ ID NO.1所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.2所示的扩增引物各0.75μL；
(b)RT-PCR酶反应液1μL，其中包括逆转录酶200U，热启动Taq酶5U，RNA酶抑制剂2U；
(c)10μL HIV-1病毒核酸；
PCR扩增体系包括：
(a)PCR反应液42μL，其中包括含Mg2+的10×PCRbuffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM如SEQ ID NO.3所示的扩增引物和10μM如SEQ ID NO.4所示的扩增引物各2μL，H2O 32μL；
(b)PCR酶反应液3μL，其中包括热启动Taq酶1.25U，余量为甘油和水；
(c)RT-PCR扩增产物5μL；
测序PCR体系20μl，其包括：
(a)Bigdye 2μl；
(b)Bigdye buffer 3μl；
(c)3.2μM测序引物1μl；
(d)纯化得到的PCR产物10～100ng或Xμl，X取值为1-5；
(e)无菌水余量。
测序引物如SEQ ID NO.5～8所示，共4条测序引物，每条测序引物按上述测序PCR体系要求单独配制一个测序PCR体系，配制4个测序PCR体系。
10.一种应用如权利要求9所述的扩增测序体系的HIV-1整合酶耐药突变检测方法，其特征在于：
包括过程如下：
1)HIV-1核酸样本提取、纯化；
2)扩增体系配制及扩增实验：
进行RT-PCR扩增，反应程序为：
(a)50℃30min；
(b)94℃预变性5min；
(c)94℃变性20s，53℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；
(d)72℃延伸10min，4℃保温；
RT-PCR扩增完成后，继续PCR扩增，PCR扩增的反应程序为：
(a)94℃预变性5min；
(b)94℃变性20s，53℃退火30s，72℃延伸1min30s，3个循环；
(c)94℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸1min，27个循环；
(d)72℃延伸5min，4℃保温；
3)产物纯化；
4)测序实验：
同一个HIV-1核酸样本需采用4个测序PCR体系分别做测序PCR反应，测序PCR扩增程序：
(a)96℃预变性1min；
(b)96℃变性10s，50℃退火5s，60℃延伸4min，25个循环；
(c)4℃保温。
5)测序产物纯化及测序分析，得到相关的突变类型信息。
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