CN116606965A - 一种检测hbv c区基因突变的引物组、方法及其应用 - Google Patents
一种检测hbv c区基因突变的引物组、方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116606965A CN116606965A CN202310805065.2A CN202310805065A CN116606965A CN 116606965 A CN116606965 A CN 116606965A CN 202310805065 A CN202310805065 A CN 202310805065A CN 116606965 A CN116606965 A CN 116606965A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- primer
- sequencing
- hbv
- gene mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 44
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- -1 HBV nucleic acid Chemical class 0.000 claims description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- SBVBIDUKSBJYEF-VIFPVBQESA-N N-(3-cyano-4-fluorophenyl)-1-methyl-4-[[(2S)-1,1,1-trifluoropropan-2-yl]sulfamoyl]pyrrole-2-carboxamide Chemical compound C(#N)C=1C=C(C=CC=1F)NC(=O)C=1N(C=C(C=1)S(N[C@H](C(F)(F)F)C)(=O)=O)C SBVBIDUKSBJYEF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 8
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 2
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测HBVC区基因突变的引物组、方法及其应用，引物组的序列如SEQ ID NO.1～2所示，使用引物组配制反应体系，经过PCR扩增反应和测序PCR反应，再进行测序，获得HBVC区的突变信息。本发明优点包括：扩增总长度约为686bp，能有效覆盖C区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μL。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测病毒突变的技术领域，尤其检测HBV C区基因突变的技术。
背景技术
HBV属嗜肝DNA病毒科，其基因组为部分环状双链DNA，约3200bp，包括4个开放读码框：前S/S区、前C/C区、X区以及P区，分别编码乙肝病毒包膜蛋白、E抗原(HBeAg)/核心蛋白(HBcAg)、x蛋白以及DNA聚合酶。HBV具有高突变性，HBV变异后易造成免疫逃逸。
HBcAg被认为是CTL(细胞毒性T细胞)攻击的主要靶抗原。因此，C区基因序列的变化、HBcAg表达水平或HBcAg抗原决定簇结构改变都可能对HBV所致肝损害产生影响。C区基因会发生随机的错义变异，随着病情进展会出现错义变异的聚集，C区基因不同区域发生的聚集错义变异和严重肝损害密切相关。有些聚集错义变异区域与HBeAg C末端加工点有关。有研究表明C区基因变异与进展性肝病有关，C区基因变异聚集区出现氨基酸替换者都伴有进展性乙型肝炎疾病，变异聚集区未出现变异者其发展呈平静的过程，C区基因变异聚集区产生变异可作为疾病向差方向发展的一个指标。
另外C区基因突变中还存在耐药突变，不同的耐药突变会不同程度地影响不同药物的治疗效果。某些C区基因变异会影响对干扰素的应答，影响治疗效果。此外，C区还存在对其他药物产生耐药的一些基因变异。衣壳组装调节剂(capsid assembly modulators,CAMs)是一类有发展前景的治疗药物，JNJ-56136379(JNJ-6379)是一种有效的CAM。曾有研究针对JNJ-6379的治疗效果与不同耐药突变的关系进行分析。该研究提及多个HBV核心蛋白氨基酸位置(如105、109、118等)与JNJ-6379和/或其他CAMs的体外耐药相关。其中，2例JNJ-6379治疗的患者具有Y118F基线多态性，具有对JNJ-6379的体外耐药性；2例JNJ-6379治疗的患者具有I105T基线多态性，不具有对JNJ-6379的体外耐药性，但在一项1期研究中指出I105T基线多态性出现将AB-506(CAM-N)的体外活性降低19倍的情况，导致患者对AB-506治疗缺乏反应；患者分别携带T109M(+I105L)和T109T/I基线多态性，在1期研究中，T109M替代将ABI-H0731(CAM-N)的体外活性降低了150倍，导致对ABI-H0731的次优反应，而T109I替代将GLS4(CAM-A)的体外活性降低了6.8倍。
一项能高效检测出HBV C区存在哪些基因突变的技术是具有极大临床价值的，能够为指导用药、制定治疗方案提高，利于预后向好的方向发展。然而现有的检测技术水平还是存在一些局限，例如会出现灵敏度不足等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测HBV C区基因突变的引物组、方法及其应用，以解决现有技术中检测HBV C区基因突变技术灵敏度不足等问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种检测HBV C区基因突变的引物组，包括PCR扩增引物，其序列如SEQ ID NO.1～2所示。
进一步地，还包括测序PCR引物，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述的检测HBV C区基因突变的引物组在制备试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种包含所述引物组的测HBV C区基因突变试剂盒，包括PCR酶系、PCR反应液、Bigdye、Bigdye buffer、测序PCR引物。
进一步地，所述PCR酶系包括：热启动Taq酶2.5U；
所述PCR反应液包括：含Mg2+的10×Ace TaqBuffer，10mM dNTPs，扩增引物SEQ IDNO.1、扩增引物SEQ ID NO.2，H2O；
Bigdye；
Bigdye buffer；
测序PCR引物。
本发明还提供一种包含所述引物组的用于检测HBV C区基因突变的反应体系，包括PCR扩增体系和测序PCR反应体系，
PCR扩增体系成分包括：
待测核酸20μL；
PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
PCR反应液，其包括含Mg2+的10×Ace Taq Buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQID NO.1所示扩增引物2μL、10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
测序PCR反应体系成分包括：
PCR产物XμL，X＝1-2μL，若产物浓度低增至4-5μL；
Bigdye 2μL；
Bigdye buffer 3μL；
3.2μM测序PCR引物1μL；
无菌水14-XμL。
本发明还提供一种应用所述引物组检测HBV C区基因突变的方法，步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.1所示的引物作为测序PCR引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
更优地，所述PCR扩增反应的程序为：95℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，45个循环；72℃，7min；4℃，保温。
更优地，所述测序PCR扩增反应的程序为：96℃，1min；96℃，10s，50℃，5s，60℃，4min，25个循环；4℃，保温。
本发明的优点包括：针对HBV C区设计特异性引物，采用PCR扩增结合Sanger测序，检测HBV C区基因突变，扩增总长度约为686bp，能有效覆盖C区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μL。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1-4是实施例一某阳性样本的部分测序峰图；
图5是实施例二的PCR扩增结果图；
图6是实施例三的PCR扩增结果图；
图7是实施例四的PCR扩增结果图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例一
1.实验材料
试剂：
核酸提取试剂(磁珠法，达安DA0623)
DNAPolymerase(P401，诺唯赞生物科技有限公司)
BigDyeTMTerminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit(4337456，赛默飞世尔科技公司)
HiDi Formamide(4404307，赛默飞世尔科技公司)
NaAc(3M,PH 5.2，R00738，Leagene)
EDTA(AM9260G，Invitrogen)
无水乙醇(AR(分析纯)，广东光华化学厂有限公司)
扩增引物如SEQ ID NO.1～2所示
设备及耗材：
PCR仪(veriti，ABI)、高速冷冻离心机(75007201，赛默飞世尔科技公司)、振荡器(Lab daucer)、移液器(17014422，瑞宁)、测序仪(3500xl Dx，ABI)、-20℃/-80℃冰箱(Haier)、通风柜(广州汇绿实验设备有限公司)、生物安全柜(BioBase)、移液吸头(Axygen)、50mL离心管(BIOFIL)、1.5mL离心管(Axygen)。
2.实验步骤
选取5个HBV样本，每个HBV样本按如下步骤进行实验：
1)HBV样本核酸提取：样本病毒载量浓度高于2×102copies/mL的样本，请按照试剂盒说明书进行操作；而样本载量浓度低于2×102copies/mL的样本，请用柱法提取，将提取的样本量加大到300μL并添加30μL蛋白酶裂解样本，其他操作按照试剂盒说明书即可；
2)PCR扩增体系配制及PCR扩增：按照表1配制PCR扩增体系所需试剂，并加入20μL提取好的HBV样本核酸，按照表2的程序进行PCR扩增。
表1PCR扩增体系
所述PCR酶系包括：热启动Taq酶2.5U；
所述PCR反应液包括：含Mg2+的10×Ace Taq Buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μMSEQ ID NO.1所示扩增引物2μL，10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL。
表2PCR扩增程序
3)PCR扩增产物分析与纯化，PCR扩增结束后，取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现约686bp目的条带，则用商品化的PCR产物纯化试剂盒进行PCR产物纯化；
4)测序PCR，测序PCR引物是SEQ ID NO.1所示引物，根据表3配制测序PCR反应体系，按照表4的程序进行测序PCR反应：
表3
表4测序PCR扩增程序
5)测序PCR产物纯化及测序：使用酒精沉淀法对测序PCR产物进行纯化，然后上机ABI 3500xl Dx测序仪进行测序；如图1-4所示的出峰整齐没有杂乱，可以判断实验过程顺利；
6)结果分析，将测序所得的序列与各型别的参考序列进行对比，根据位点得到相关的突变类型信息，便于判断存在哪些基因突变。本实施例5个样本C区常见突变位点没有出现突变，结果如表5所示。
表5
实施例二
选取8个HBV阳性样本做待测组，上述HBV阳性样本的实验组编号为1-8；无HBV病毒的胎牛血清做阴性对照NC。参照实施例一进行PCR扩增、测序PCR及结果分析，结果如图5所示，阴性对照NC没有出现条带，编号为1-8的实验组均出现了长度约686bp的目的条带。此外，测序结果显示编号为1-8实验组的扩增片段均为HBV的C区区域。说明本发明的PCR体系扩增具有较好的稳定性。
实施例三
选取16个HBV样本，编号1-16。编号1-4，5-8，9-12，13-16的病毒载量分别为200copies/μL、500copies/μL、1000copies/μL、5000copies/μL，无HBV病毒的胎牛血清做阴性对照组NC，参照实施例一的方法进行PCR扩增、测序PCR及结果分析，结果如图6所示，阴性对照没有出现条带，编号为1-16实验组均出现了长度约686bp的目的条带。此外，测序结果显示扩增片段均为HBV的C区区域。说明本发明反应灵敏度可以达到200copies/μL。
实施例四
选1个HBV样本血浆，样本分4份，一份不加任何物质，一份加入甘油三酯至终浓度37mmol/L，一份加血红蛋白至终浓度2g/L，一份加胆红素至终浓度342μmol/L；选择HIV-1血浆、HCV血浆，然后各取200μL提取核酸。
然后参考实施例一，将各核酸样品进行PCR实验，每个样本都做复孔，结果如图7所示，1-2：不加干扰物质的HBV核酸，3-4加甘油三脂的HBV核酸、5-6加血红蛋白的HBV核酸、7-8加胆红素的HBV核酸、9-10为HIV-1核酸，11-12为HCV核酸。1-8均出现长度约686bp的明亮条带，9-12并没有出现条带。
将各PCR产物进行纯化，然后测序，从测序结果看，1-8均测序成功，经分析均为HBV的序列，且序列经比对完全一致，9-12均无测序信号，本发明特异性好，且不受其他干扰物质影响。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (9)
1.一种检测HBV C区基因突变的引物组，其特征在于：
包括PCR扩增引物，其序列如SEQ ID NO.1～2所示。
2.根据权利要求1所述的一种检测HBV C区基因突变的引物组，其特征在于：
还包括测序PCR引物，其序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种如权利要求1或2所述的检测HBV C区基因突变的引物组在制备试剂或试剂盒中的应用。
4.一种包含权利要求2所述引物组的测HBV C区基因突变试剂盒，其特征在于：
包括PCR酶系、PCR反应液、Bigdye、Bigdye buffer、测序PCR引物。
5.根据权利要求4所述的一种包含所述引物组的检测HBV C区基因突变试剂盒，其特征在于：
所述PCR酶系包括：热启动Taq酶2.5U；
所述PCR反应液包括：含Mg2+的10×Ace Taq Buffer，10mM dNTPs，扩增引物SEQ IDNO.1、扩增引物SEQ ID NO.2，H2O；
Bigdye；
Bigdye buffer；
测序PCR引物。
6.一种包含所述引物组的用于检测HBV C区基因突变的反应体系，其特征在于：
包括PCR扩增体系和测序PCR反应体系，
PCR扩增体系成分包括：
待测核酸20μL；
PCR酶系，其包括热启动Taq酶2.5U；
PCR反应液，其包括含Mg2+的10×Ace Taq Buffer 5μL，10mM dNTPs 1μL，10μM SEQ IDNO.1所示扩增引物2μL、10μM SEQ ID NO.2所示扩增引物2μL，H2O 17μL；
测序PCR反应体系成分包括：
PCR产物XμL，X＝1-2μL，若产物浓度低增至4-5μL；
Bigdye 2μL；
Bigdye buffer 3μL；
3.2μM测序PCR引物1μL；
无菌水14-XμL。
7.一种应用权利要求2所述引物组检测HBV C区基因突变的方法，其特征在于：
步骤包括：提取HBV核酸作为模板，以SEQ ID NO.1～2所示的引物作为PCR扩增引物进行PCR扩增反应，以SEQ ID NO.1所示的引物作为测序PCR引物进行测序PCR反应，对测序PCR产物进行测序分析，得到突变信息。
8.根据权利要求7所述一种应用所述引物组检测HBV C区基因突变的方法，其特征在于：
所述PCR扩增反应的程序为：95℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，45个循环；72℃，7min；4℃，保温。
9.根据权利要求7所述一种应用所述引物组检测HBV C区基因突变的方法，其特征在于：
所述测序PCR扩增反应的程序为：96℃，1min；96℃，10s，50℃，5s，60℃，4min，25个循环；4℃，保温。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310805065.2A CN116606965A (zh) | 2023-07-03 | 2023-07-03 | 一种检测hbv c区基因突变的引物组、方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310805065.2A CN116606965A (zh) | 2023-07-03 | 2023-07-03 | 一种检测hbv c区基因突变的引物组、方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116606965A true CN116606965A (zh) | 2023-08-18 |
Family
ID=87674918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310805065.2A Pending CN116606965A (zh) | 2023-07-03 | 2023-07-03 | 一种检测hbv c区基因突变的引物组、方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116606965A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013078786A1 (zh) * | 2011-11-28 | 2013-06-06 | 浙江大学 | 乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用 |
| CN107475461A (zh) * | 2017-10-11 | 2017-12-15 | 广州立菲达安诊断产品技术有限公司 | 一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法 |
| CN114941042A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-08-26 | 广州立菲达安诊断产品技术有限公司 | 一种检测hiv-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用 |
-
2023
- 2023-07-03 CN CN202310805065.2A patent/CN116606965A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013078786A1 (zh) * | 2011-11-28 | 2013-06-06 | 浙江大学 | 乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用 |
| CN107475461A (zh) * | 2017-10-11 | 2017-12-15 | 广州立菲达安诊断产品技术有限公司 | 一种检测乙型肝炎病毒耐药性基因的引物、试剂盒和方法 |
| CN114941042A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-08-26 | 广州立菲达安诊断产品技术有限公司 | 一种检测hiv-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JIA J等: "Hepatitis B virus core antigen mutations predict post-operative prognosis of patients with primary hepatocellular carcinoma", J GEN VIROL, vol. 98, no. 6, pages 1406 - 1407 * |
| 夏乾峰等: "热带医学概论", 31 December 2020, 中山大学出版社, pages: 356 * |
| 黄庆等: "HBV核心区基因突变的研究", 中华医院感染学杂志, vol. 19, no. 14, pages 1793 - 1796 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114941042A (zh) | 一种检测hiv-1整合酶耐药突变的引物组、方法及其应用 | |
| CN109182600B (zh) | 一种同步检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1型的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN105483283B (zh) | 丙型肝炎病毒hcv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 | |
| CN109837345B (zh) | 检测小鼠细胞残留dna的引物及方法 | |
| CN111893173A (zh) | 检测基因pear1 snp位点的引物、方法和试剂盒 | |
| CN107574261B (zh) | 用于检测汉坦病毒的检测引物、检测试剂盒及检测方法 | |
| CN114250325A (zh) | 快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法 | |
| CN111057791A (zh) | 一种检测血液中HBV pgRNA的试剂盒 | |
| CN116606965A (zh) | 一种检测hbv c区基因突变的引物组、方法及其应用 | |
| US20230167514A1 (en) | Method for detecting hbv genotype, oligonucleotide and kit | |
| CN111172297B (zh) | 一种RhD血型基因RHD993C＞T等位基因及应用 | |
| CN112195239B (zh) | 一种食管鳞癌转移组织及血清外泌体标志物及其应用 | |
| CN116479182B (zh) | 一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒 | |
| CN109439655B (zh) | 适用于超微量细胞核酸提取的试剂盒及方法 | |
| CN103667439A (zh) | 可区分hbv b型和非b型的双探针实时定量pcr法 | |
| CN112063615A (zh) | 一种基因组dna提取液、基因组dna提取方法及其应用 | |
| CA2834113C (en) | Methods of nucleic acid liquid-phase extraction and detection | |
| CN105969842A (zh) | 基于AllGlo探针的Glu504lys检测分型试剂盒及其分型方法 | |
| CN111850099A (zh) | 一种用于检测鼠痘病毒的rpa试剂盒、引物、探针及方法 | |
| CN113136415A (zh) | 一种核酸提取方法及其用途 | |
| CN112626204B (zh) | 检测可用于指导卡马西平用药的hla-b*1502分型的引物和方法 | |
| CN117265090B (zh) | 一种用于检测人类白细胞抗原hla-dqa1基因分型的引物组及试剂盒 | |
| CN116949156B (zh) | 一种基于核酸变体的通用型检测人t细胞的分析方法 | |
| CN107937507B (zh) | 一种可溶性微针贴片及其制备方法 | |
| CN116732243A (zh) | 一种用于检测hbv前s/s区基因突变的引物组、检测方法及其试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |