CN116949156B - 一种基于核酸变体的通用型检测人t细胞的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物分析领域，具体公开一种基于核酸变体的通用型检测人T细胞的分析方法。本发明通过生物信息学查找到富含C的一段CD3G的基因序列，并利用DNA的转化技术充分实现DNA的转化，通过测人CD3目标序列转化后的变体的形式实现对T细胞药代和生物分布的特异性鉴别和定量，从而建立一种基于DNA水平检测的通用性且便利操作且特异性强的新型qPCR技术的人T细胞的分析方法，为基于T细胞构建的细胞治疗类产品的临床前研究甚至临床研究提供技术便利。
Description
技术领域
本发明涉及生物分析领域，尤其是生物医药、细胞基因治疗、肿瘤免疫治疗、分子生物学、临床或临床前药代动力学研究、药物生物分析、生物分布研究领域，具体涉及一种基于核酸变体的通用型检测人T细胞的分析方法。
背景技术
分子生物学、细胞生物学、免疫学及基因工程技术的发展推动了生物技术药物的不断前进与发展。生物技术药物已经从单抗、融合蛋白、多肽等基于氨基酸为基本组成单位的大分子药物形式发展到了更为复杂的细胞基因治疗形式。随着世界首个T细胞治疗产品于2017年8月由诺华公司CAR-T (CTL019，商品名：Kymriah)获批上市，全球基于T细胞免疫治疗以及其它免疫细胞治疗产品的开发风起云涌。细胞治疗领域各种细胞治疗产品的开发百花齐放，成为生物医药企业研发追逐的对象，生物医药领域也进入到了细胞基因治疗的时代。
当前正在研究和进行开发的免疫细胞治疗类产品种类繁多，除了各种基因工程改造的CAR结构表达的CAR-T、CAR-NK、CAR-γδT以外，还有不经改造的T细胞治疗产品，如未改造的病人自体来源的γδT、肿瘤浸润T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞等等。
种类繁多的细胞治疗类产品给肿瘤治疗带类了新的希望。但在研发过程中，由于这类细胞治疗产品不同于传统大分子药物，因此在研发过程中生物医药研发工作者在不同领域和不同流程上遇到了不同的挑战。细胞治疗药物临床前和临床研究阶段都离不开其药代动力学与生物分布的生物分析。对于CAR-T细胞，因为CAR的序列通常是基因工程加入的序列，即外源导入的序列，因此基于产品上特异的CAR的DNA序列结构，可以很容易地找到特异性序列作为定量分析的目标序列，并由此开发qPCR的定量方法作为其特异性的药代分布分析方法。但是，非CAR修饰的（人体来源的）T细胞治疗产品，如γδT、肿瘤浸润T淋巴细胞等未经修饰的T细胞，则很难找到特异性DNA序列来区分T细胞和其它细胞尤其是区分治疗用T细胞和人肿瘤细胞。这导致非CAR修饰的T细胞治疗产品在临床前生物分析过程中需要克服的技术性问题较多，特别在药代分布分析方面困难重重。在工业和研发实践中，临床前经常会用到人的肿瘤细胞系构建荷瘤鼠模型做实验，前述问题如不得到解决，会导致后续药代分布研究难以推进。
CD3虽然可以作为T细胞的标志性分子之一，但在基因组DNA层面其实无论在T细胞还是肿瘤细胞中都能检测到CD3的序列，故基于DNA层面检测CD3的序列缺乏足够的特异性。有学者提出基于CD3的表达即 mRNA层面序列的差异构建特异性分析方法，由于RNA提取比DNA提取更加复杂、RNA不稳定、易损失、对生物样品的保存和处理过程要求更高等，导致基于mRNA层面的分析方法操作难度大，执行qPCR的分析方法则涉及的步骤更多。尤其是需要增加反转录步骤，这也进一步提高了检测方法的误差，为实际操作带来更多挑战。另外，细胞治疗医药研发同行对于CAR-T细胞的药代分析通常针对CAR序列设计特异性引物和探针来执行分析方法，但CAR是CAR-T设计的核心部分，如果基于CAR序列设计特异性分析方法，很容易将CAR序列暴露，这不利于对药物设计的核心环节进行知识产权保护。因此，克服上述不利因素，寻找一个通用的方法来基于T细胞固有的成分进行序列和探针的设计而开发出对于T细胞检测既具特异又便于实践操作的方法是许多医药研发者迫切渴望的。
发明内容
针对上述技术性难点和挑战以及药物研发过程中的现实性需求，本发明致力于建立一种基于DNA水平检测的通用性且便利操作且特异性强的新型qPCR技术的人T细胞的分析方法，为基于T细胞构建的细胞治疗类产品的临床前研究甚至临床研究提供技术便利。
第一方面，本发明提供SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列在特异性区分人T细胞和人肿瘤细胞中的应用。
第二方面，本发明提供SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体，所述变体是SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列的C转变为T的DNA片段变体。
第三方面，本发明提供一种制备SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体的方法，对SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列进行重亚硫酸盐处理。
第四方面，本发明提供SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体在特异性区分人T细胞和人肿瘤细胞中的应用。
第五方面，本发明提供引物对，所述引物对由Primer-F正向引物和Primer-R反向引物组成， Primer-F正向引物为SEQ ID No.3所示的引物，Primer-R反向引物为SEQ IDNo.4所示的引物。
第六方面，本发明提供探针，所述探针在SEQ ID No.5 所示的基因序列的5´端偶联发光基团和3´端偶联淬灭基团。
第七方面，本发明提供引物探针组，包括上述引物对和探针。
第八方面，本发明提供上述引物探针组在鉴定人T细胞于小鼠和荷人源肿瘤细胞系荷瘤鼠体内药代分布的应用。
第九方面，本发明提供上述引物探针组在制备 人T细胞治疗产品qPCR试剂盒中的应用。
第十方面，本发明提供一种基于核酸变体的通用型检测人T细胞的分析方法，包括以下步骤：对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理以将基因序列的C转变为T；利用qPCR法对标准品、质控样本和/或待测样本中的靶DNA序列进行扩增和检测；根据以标准品回归拟合的标准曲线计算质控样品及待测样品的Ct值；通过样品的Ct值得到未知样品浓度的Log值，进而得到样品浓度。
较佳地，扩增反应条件为：95℃/ 15分钟，循环1次；95℃/ 3秒、60℃/ 32秒，循环40次。
第十一方面，本发明提供SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列在鉴定人T细胞于小鼠和荷人源肿瘤细胞系荷瘤鼠体内药代分布中的应用。
第十二方面，本发明提供SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体在鉴定人T细胞于小鼠和荷人源肿瘤细胞系荷瘤鼠体内药代分布的应用。
第十三方面，本发明提供SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列在制备人T细胞治疗产品qPCR试剂盒中的应用。
第十四方面，本发明提供SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体在制备人 T细胞治疗产品qPCR试剂盒中的应用。
附图说明
图1为基于本发明的引物特异性及亚硫酸盐处理后扩增效果进行鉴定的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。
图2为本发明的产物扩增曲线图。
图3为本发明设计的qPCR方法的标准曲线图。
实施方式
通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
为了建立一种基于DNA水平检测通用便利且特异性强的qPCR技术的人T细胞的分析方法，以达到为基于T细胞形成的细胞治疗类产品的临床前研究提供技术便利的技术目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提出可以特异性区分人T细胞与肿瘤细胞在基因组DNA层面差异的序列。通过生物信息学分析比对，对T细胞与肿瘤细胞的遗传学特性进行调研，找到两者差异后，获得能够克服特异性问题的目标序列（靶基因中的靶序列）。
发明人充分利用表观遗传学上的特征和性质，结合生物信息学手段查找，从多个CD3链中筛选出CD3G（CD3 gama）基因中的一段特殊的富含胞嘧啶（C）的特殊序列作为原始序列，即SEQ ID No.1所示的基因序列，该序列是CD3中的原始DNA序列。但是CD3序列在T细胞和肿瘤细胞都有存在，如果把T细胞产品输入肿瘤病人或肿瘤小鼠模型上，直接基于CD3G的原始序列来检测T细胞，则不能确定所测到的CD3序列是来自于T细胞还是肿瘤细胞，从而无法特异性检测T细胞的分布。本发明首先提出该富含C的一段CD3G的基因序列作为目标检测DNA序列，首次确认和鉴定了基于CD3一段特殊的基因序列可以用于检测人源T细胞的药代和生物分布，会很好地把人源T细胞与人肿瘤细胞及动物例如小鼠的基因组DNA区分开，具有很好的特异性，从而能实现该方法在临床前和临床的应用价值。
本发明还提出基于CD3G基因序列的变体。通过对前述筛选到的CD3中的原始序列进行重亚硫酸盐处理，使得CD3G中的C被转化，从而获得所述基于CD3基因序列的变体，即SEQ ID No.2所示的基因序列。
详细来说，本发明涉及的T细胞治疗产品的分布分析方法的开发过程中，CD3作为T细胞的标志物为大家熟知，对于T细胞的CD3基因序列来说一般不容易甲基化，而突变的肿瘤细胞其胞嘧啶（C）容易发生甲基化，甲基化也是恶变的肿瘤细胞一个特征，即使是其它免疫细胞的CD3基因上也较T细胞容易甲基化。在基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）经过重亚硫酸盐处理后可以转化为尿嘧啶（U），含有尿嘧啶（U）的序列在添加了dTTP（A、T、G、C）的PCR扩增反应体系里U又转变为T，所以最终未甲基化的C会转变为T，而已经甲基化的胞嘧啶（C）进行这样的处理是无效的，不会发生转变。以上就是重亚硫酸盐转化的变体在qPCR方法中的应用原理，本发明通过探索，利用生物信息学找到一段富含胞嘧啶的CD3原始序列，再利用重亚硫酸盐对原始序列实现其转变，再巧妙地基于变体形式设置特异引物和探针，突破了直接基于原始序列的非特异性问题，转变手段、转变形式、引物探针组及方法反应条件的组合利用得以实现性能很好的技术方法应用。
本发明也提出了针对前述靶基因序列变体的特异性引物以及探针。
引物对由Primer-F正向引物和Primer-R反向引物组成。所述Primer-F正向引物为SEQ ID No.3所示的基因序列。所述Primer-R反向引物为SEQ ID No.4 所示的基因序列。
探针具体采用TaqMan探针。TaqMan探针是单链DNA，其5´端偶联发光基团FAM，3´端偶联淬灭基团TAMRA。游离的完整探针无荧光信号，发光基团发出的荧光会被淬灭基团吸收淬灭，当探针被水解，发光基团和淬灭基团远离就可以检测到荧光信号。反应开始时，模板链经热变性解链形成单链，TaqMan探针优先跟模板链退火，引物随后退火到模板上，之后进行链的延伸，延伸过程中Taq酶发挥5´-3´外切酶活性，遇到探针会从5´端逐个碱基切除探针，发光基团会跟淬灭基团分开，因此荧光检测系统可以接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号的累积和PCR产物形成是同步的。
具体地，本发明基于TaqMan探针法设计针对靶序列的特异性探针分子。所述探针在SEQ ID No.5 所示的基因序列的5´端偶联发光基团和3´端偶联淬灭基团。特别说明的是，本发明的探针不是直接基于基因组原始序列，而是基于原始序列的变体进行设计。
一些实施方式中，所述探针的解链温度（Tm值）为51-53℃。另一些实施方式中，探针的解链温度与Primer-F 正向引物或者Primer-R 反向引物的差值为2-10℃。
本发明基于筛选和确定的CD3G基因片段，设计了可以检测人T细胞标志物基因CD3基因DNA片段的引物对及其Taqman探针的组合，这对引物和探针能很好地特异性地扩增CD3G基因的特定DNA片段，从而能用于人源T细胞的药代和生物分布研究。
本发明还提出一种基于核酸变体的通用型检测T细胞的分析方法。
所述方法包括：采用重亚硫酸盐先将纯化的基因组DNA进行处理转化和再纯化；利用qPCR法对标准品、质控样本和/或待测样本中的目标DNA序列进行扩增反应和检测。本方法标准曲线基于Ct值与样品浓度（以拷贝数计）的Log值呈线性关系。质控样品及待测样品可以根据以标准品回归拟合的标准曲线进行计算，通过样品的Ct值得到未知样品浓度的Log值，进而得到样品浓度。
由于CD3是人成熟T细胞的通用型标志物，本发明所述方法避免了用T细胞基因工程改造序列，而是筛选到天然成分的天然序列，由此巧妙开发出T细胞生物分析的通用型方法，且取得了有益效果。该基于Taqman探针法设计的基于CD3基因序列的变体进行qPCR扩增的的分析方法，特异性强且通用于T细胞药代与生物分布，能够达到特异性区分人源T细胞与肿瘤细胞的同时，又可以作为通用型方法。
可选地，PCR扩增反应的条件设置为：95℃/ 15分钟，循环1次；95℃/ 3秒、60℃/32秒，循环40次。
以上说明，本发明成功开发了新的不同形式的T细胞分析方法，以期T细胞在临床前和临床阶段的药代与生物分布的分析研究有新的创造性的技术方法突破。
本发明还提出基于上述方法构建的qPCR试剂盒。
在该试剂盒中的构建过程中，基于Taqman qPCR的方法设计实时定量扩增CD3部分基因序列的方法，从而达到能够区分人源T细胞和肿瘤细胞基因组的特异性要求，并基于此设计的方法，确立反应体系和反应条件，优化、验证并构建qPCR试剂盒，以期其能够适用于T细胞治疗产品在早期临床前在小鼠甚至其它动物种属的药代动力学与生物分布研究。
基于本发明的技术方法构建qPCR扩增试剂盒，其成分包含具有靶序列的标准质粒，PCR反应预混液，引物探针组，DNA/RNase free水的组合。在试剂盒的使用过程中，使用者根据所测样品类型，补充提供对应基质来源的基因组DNA。例如，样品是小鼠或人及其它种属抗凝全血，则可以使用DNA稀释液配制含有靶序列变体的质粒DNA配制标准曲线，小鼠全血提取的基因组DNA后进行亚硫酸盐转化提取后即可按本方面提供的步骤进行分析，也可以适当配制QC样品，按本发明的反应体系进行体系配制及条件进行反应，方便快捷。
综上，本发明通过生物信息学查找到富含C的一段CD3G的基因序列，并利用DNA的转化技术充分实现DNA的转化，创新性地通过测人CD3目标序列转化后的变体的形式实现对T细胞药代和生物分布的特异性鉴别和定量，这是在该类细胞治疗上的创造性应用。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对 现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
仪器设备
ABI荧光定量PCR仪（7500或等同的可替代版本）；
荧光定量PCR 8联管&盖（BBI，F602004-0001，或等同的可代品）；
台式迷你离心机（上海生工生物，Super Mini Dancer，或等同的可替代品）；
4）96孔PCR板（AXYGEN，PCR-96-AB-C，或等同的可替代品）。
试剂材料
标准质粒pUC-GW-Kan-CD3（苏州金唯智生物科技有限公司，Clone ID：LA22019-1/U718775，≤-10℃）；
2）2×SuperReal PreMix（TIANGEN，Cat#: FP206-02, Lot#: X0617，≤-10℃）；
无DNA酶和RNA酶去离子水（Cat#：RT121-02，Lot#: Y1306，天根生化，常温保存）；
样品前处理重亚硫酸盐处理试剂套（Cat#：59104，QIAGEN）。
实施例1
样品的重亚硫酸盐处理
具体步骤如下：
解冻DNA以用于亚硫酸盐反应。在每个等分中加入800µL不含Rase的水，溶解所需数量的亚硫酸溶液。漩涡5分钟左右直到亚硫酸氢盐混合物完全溶解。
准备PCR管依次按比例和量加入每个成分，包括：DNA溶液（1ng-2µg）最多20µL，亚硫酸盐溶液85µL，DNA保护缓冲液35µL，补充RNase free的水至管子里总体积为140µL。
盖上PCR管与亚硫酸溶液彻底混合，在室温反应至颜色彻底由绿变蓝。
在PCR仪上执行热循环进行亚硫酸盐转化。热循环程序参数为：95℃，5min；60℃，25min；95℃，5min；60℃，85min；95℃，5min；60℃，175min。循环结束后设置维持温度20℃。亚硫酸盐转化的作用是将基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）经过重亚硫酸盐处理后可以转化为尿嘧啶（U）。
亚硫酸氢盐转化完成后，将含有亚硫酸盐反应的PCR管短暂离心，然后将完整的亚硫酸盐反应转移到清洁的1.5 mL微离心管中。
加入560µL新鲜制备的平衡缓冲液，涡旋混合溶液，然后短暂离心。
将必要数量的EpiTect旋转柱和收集管放置在合适的容器中架子上，并将每个试管中的整体混合物转移到相应的EpiTect旋转柱中。
以最大速度将自旋柱离心1分钟。丢弃流过的液体，并将自旋柱放回收集管中。
在每个自旋柱中加入500µL洗涤液，以最高转速离心1分钟。丢弃流穿液，并将旋转柱放回收集管中。
每个自旋柱加入500µL 的脱磺酸基缓冲液，室温孵育15分钟 (15-25℃)。
以最大速度将自旋柱离心1分钟。丢弃流过的液体，并将自旋柱放回收集管中。
在每个自旋柱中加入500µL 洗涤液，以最大速度离心1分钟。丢弃流穿液，将旋转柱放回收集管中，再重复一次。
将自旋柱放入新的2mL收集管中，并将自旋柱以最大速度离心1分钟以去除任何残留液体。将旋转柱放入干净的1.5 mL微离心管。吸取20µL洗脱缓冲液浸润在每个膜的中心。用15,000 x g (12,000 rpm)离心1分钟收集亚硫酸盐转化后的DNA产物。
实施例2
2.1配制反应体系的反应混合物（Master Mix）
表1 反应体系的配制表
根据实际检测样品数量需要，可以适当等比例调整反应体系Mater Mix的各组分加样量。本发明中模板（Template DNA）量可以为2-6μL。本发明的Template DNA即基因组DNA重亚硫酸盐转化后的产物。若模板的上样量增加，则DNase/RNase free Water的体积即作相应减少，只要最后补水到反应体系总体积为20μL皆可。
2.2配制标准曲线
标准质粒上插入有扩增的目标DNA序列，以作为标准品，并用来配制标准曲线。将1.0×1010 copies/μL标准质粒经过10倍的多个系列稀释后，形成107~102 copies/μL的标准品于荷瘤小鼠提取基因组DNA中，102 copies/μL的标准品分别继续稀释1.33倍和2倍成50 copies/μL，即形成7个不同拷贝数浓度的标准品。不同Copy数浓度的标准品用于形成方法的标准曲线。
表2 标准曲线的配制表
2.3质控样品（QC）的制备
表3 质控样品的配制表
以上标准曲线和质控样品配制的具体体积可以依据上表同比例调整，根据需要样品数。
2.4反应
表4 反应条件参数
2.5 数据计算与处理
每一个分析批的数据将用Sequence Detection Software v1.5.1软件(ABI7500)进行采集，SoftMax软件对数据进行处理，以一次线性关系对标曲各浓度点扩增曲线的Ct值及理论浓度（拷贝数浓度）的Log值的关系进行回归从而确定标准曲线；质控样品和/或待测样品的浓度（拷贝数浓度）可以由标准曲线计算得出，若QC和/或待测样品被稀释过，可以将测量浓度（以拷贝数计）乘以相应的稀释倍数得到最终的测量浓度(拷贝数浓度)。
实施例3
筛选引物和探针组
在本发明所设计方法开发的过程中，经过多轮比较筛选，确定了以下四对引物和探针组进行合成和进一步实验摸索，通过运用亚硫酸盐处理的T细胞DNA然后扩增，初步看是否有产物扩增情况。
表5 四对引物和探针组的序列表
表6 产物扩增结果
在本发明形成过程中，实际上经过发明人不断思考，信息学比对和实验调研，不断尝试，在此发明的所用的引物和探针组确立前，尝试了多对，最有希望的四对在进一步实验验证中，仅有本发明中的引物探针组有明确的扩增Ct，其它基本上很难有很好的特异性扩增产物，甚至无法实现有信号的Ct，不能被检测到扩增产物，因此本发明的引物探针组是在不断实验探索和对比中显示出优势效果。
实施例4
琼脂糖凝胶电泳鉴定
基于本发明的引物特异性及亚硫酸盐处理后扩增效果进行鉴定的如1所示的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。其中，M是DNA 分子量标准物（DNA marker）；1是亚硫酸盐处理的A549肿瘤细胞DNA；2是未经亚硫酸盐处理的A549肿瘤细胞；3是亚硫酸盐处理的空白小鼠基因组DNA对照；4是亚硫酸盐处理的人CD3 T细胞；5是未经亚硫酸盐处理的人CD3 T细胞；6是亚硫酸盐处理的Hela人肿瘤细胞DNA；7是未经亚硫酸盐处理的Hela肿瘤细胞DNA；8是亚硫酸盐处理的Raji人肿瘤细胞DNA；9是未经亚硫酸盐处理的Raji肿瘤细胞DNA。
从图1可以看出，通过对本发明引物对及方法的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定，只有人CD3 T细胞出现条带，且只有亚硫酸盐处理后出现更明显更亮条带。说明基于本发明的方法提供基于CD3的引物对，可以很好地扩增得到特异性的目标DNA片段，而且基于重亚硫酸盐处理后扩增的特异性强，产物增强。其它肿瘤细胞无论处理前后均不会出现条带，同样处理的空白对照鼠DNA也不会出现条带。没有在CD3T细胞以外的对照样品中出现目标条带，说明本发明所述方法特异性强，而且利用重亚硫酸盐处理后检测转化后的变体形式有效。因此，可以基于筛选到的基因序列作为鉴定人T细胞在小鼠体内以及荷人源肿瘤细胞系荷瘤鼠体内药代分布的一个标志性基因序列，且需要转化为变体进行检测。
实施例5
基于本发明技术方案的扩增效率与扩增曲线性能
图2为本发明的产物扩增曲线图。从图2可以看出，标准曲线的R2值为0.998，扩增效率为100.92%。也就是说，基于本发明的方法可以取得较为良好的扩增曲线和标准曲线。
实施例6
基于本发明技术方案的标准曲线
图3为本发明设计的qPCR方法的标准曲线图。从图3可以看出，标准曲线的R2值为0.998，接近于1，基于标准曲线拟合的参数计算出的扩增效率为100.92%。
以上说明，经过一系列条件优化后确定的本发明所述技术方案，并证明基于本发明的标准曲线设置条件及技术体系和反应条件执行试验显示扩增曲线表现佳，具有优势效果。
实施例7
准确度和精密度测试
表7标准曲线的准确度和精密度
可以看出，基于本发明的技术方案，执行准确度与精密度的运行考察配制出一条标准曲线和独立配制的三套质控样品（QC），标准曲线（STD）拟合的准确度和精密度非常好；质控样品的回收率及不同套间的同一水平质控样品检测结果非常一致。
表8质控样品（QC）的准确度和精密度结果
通过该实施例的实施，考察了本发明涉及方法的准确度和精密度，也考察了不同套QC样品间的准确度。可以看出，一条标准曲线检测三套独立的质控样品，标准曲线的准确度和精密度很好，三套质控样品，每一套都有很好的准确度和精密度，且三套之间进行比较时，其批间的准确度和精密度也很好。说明本发明方法有很好的实用性效果和价值。而且定量下限为50 Copeis/μL效果很好，灵敏度能够满足工业上的需求。
实施例8
对基质效应克服的实施效果
为了检验重亚硫酸盐对基因组DNA处理效果，随机采用三个不同的人的T细胞进行处理后扩增，并将qPCR的扩增产物进行测序鉴定并与预期的扩增目标序列进行比对。结果如下：
T细胞样品1扩增产物测序序列如SEQ ID No.15所示。T细胞样品2扩增产物测序序列如SEQ ID No.16所示。T细胞样品3扩增产物测序序列如SEQ ID No.17所示。
结果显示，根据产物测序的序列，3个T细胞来源样品的其中一个样品的胞嘧啶完全转化，测序序列与预期目标序列完全相同，另外两个样品仅有一个胞嘧啶未转化为T，与预期目标序列99%相同。说明本发明的方法实施过程可靠，扩增序列保真度高，准确度高。
Claims (10)
1. SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列在制备特异性区分人T细胞和人肿瘤细胞的产品中的应用。
2. SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体，其特征在于，所述变体是SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列的C转变为T的DNA片段变体。
3. 一种制备SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体的方法，其特征在于，对SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列进行重亚硫酸盐处理。
4. SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体在制备特异性区分人T细胞和人肿瘤细胞的产品中的应用。
5. 引物对，其特征在于，所述引物对由Primer-F正向引物和Primer-R反向引物组成，Primer-F正向引物为SEQ ID No.3所示的引物，Primer-R反向引物为SEQ ID No.4所示的引物。
6. 探针，其特征在于，所述探针在SEQ ID No.5 所示的基因序列的5´端偶联发光基团和3´端偶联淬灭基团。
7.引物探针组，其特征在于，包括根据权利要求5所述的引物对和根据权利要求6所述的探针。
8.根据权利要求7所述的引物探针组在制备鉴定人T细胞于小鼠和荷人源肿瘤细胞系荷瘤鼠体内药代分布的产品中的应用。
9. SEQ ID No.1所示的基于CD3G的原始靶基因序列在制备鉴定人T细胞于小鼠和荷人源肿瘤细胞系荷瘤鼠体内药代分布的产品中的应用。
10. SEQ ID No.2所示的基于CD3G的原始靶基因序列的变体在制备鉴定人T细胞于小鼠和荷人源肿瘤细胞系荷瘤鼠体内药代分布的产品中的应用。
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