CN112400027A

CN112400027A - 用于免疫诊断和新生儿筛查的人类血液样品中表观遗传免疫细胞检测和计数的方法

Info

Publication number: CN112400027A
Application number: CN201980045376.5A
Authority: CN
Inventors: 斯文·欧莱克
Original assignee: Precision Medical Co ltd
Current assignee: Precision Medical Co ltd
Priority date: 2018-07-05
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2021-02-23
Also published as: US20220090196A1; WO2020007928A1; CA3105679A1; EP3818178A1; CO2020016598A2; MX2020014237A; US12006546B2; CL2021000002A1; PE20210631A1; ECSP20084782A; DE102018116353A1; DE102018116353B4; BR112020026951A2

Abstract

本发明涉及表观遗传的血液和免疫细胞的检测和计数的改进方法，以及各自的用途和试剂盒。

Description

用于免疫诊断和新生儿筛查的人类血液样品中表观遗传免疫细胞检测和计数的方法

本发明涉及用于人类血液样品中表观遗传血液和免疫细胞检测和计数(特别是用于免疫诊断和新生儿筛查)的方法，以及各自的用途和试剂盒。

发明背景

淋巴样和髓样免疫细胞亚群的定量异常指示着几种人类疾病，因此构成了诊断和患者监测的重要参数。目前，免疫细胞定量主要通过流式细胞术(FCM)进行，其提供了关于所分析的细胞类型和准确性的灵活性(1)。然而，尽管诊断实验室中使用的血液分析仪已经高度发展，并且样品物流已得到广泛应用，但FCM仍然存在固有的局限性。基于FCM的细胞计数需要新鲜的、抗凝的或保存良好的血液样品，其具有完整的白细胞。即使使用新鲜的样品，也建议快速地工作，因为分析时间可以影响结果，其中在抽血后最初几小时细胞退开始。分析时间影响结果，这是由于血液采集后几个小时内细胞退化导致的。由于生物学、技术和操作的变化，标准化仍然是一个挑战(2-5)，并且仍然需要建立标准化方案，特别是对于具有少量某些细胞群体的样品，例如在免疫缺陷中的样品(6,7)。关键的挑战是基于FCM的细胞计数需要完整的白细胞，但新鲜或保存良好的血液不能用于所有医学应用。

然而，最关键的挑战是不是所有的医学应用都保证新鲜或保存良好的血液样品的可用性，并且流式细胞仪不能在这些情况下应用。

HIV感染患者的治疗决策依赖于CD4⁺T细胞计数。在低于500个CD4⁺T细胞/μl血液的频率下，推荐抗逆转录病毒疗法，并且当频率低于200个细胞/μl时变得势在必行。在资源匮乏的区域中，当无法紧密连续地进行血液采集和测量时，会妨碍适当的细胞计数。因此，仅基于HIV相关的临床症状开始治疗，这可能导致次优的结果(8,9)。此外，FCM在新生儿筛查中不适用于严重的但可治疗的先天性缺陷，常规地在干燥血斑(DBS)上进行。原发性免疫缺陷(PID)构成此类先天性疾病组并且被认为是或已经是筛查程序的一部分(10)。通常，遗传缺陷导致特定白细胞亚群的定量缺乏。严重的联合免疫缺陷(SCID)代表此类PID，并且在临床上以T细胞或B细胞的缺乏为特征。目前，新生儿中SCID的检测基于定量PCR辅助T细胞受体(TREC)和免疫球蛋白κ缺失重组切除环(KREC)分析(11)。这些方法可靠地检测出缺乏近期的胸腺T细胞和骨髓B细胞迁移物，这是新生儿血液中存在的主要T细胞和B细胞亚型，即新生儿血液中存在的主要T和B细胞亚型。然而，TREC/KREC分析未能检测出严重PID中的其它特定淋巴细胞亚群缺陷(如自然杀伤(NK)细胞或嗜中性粒细胞)。尽管有这种限制，然而由于较早期的诊断，TREC新生儿筛查是有效的并且显示出改进的疾病结果(12)。新生儿分析中的TREC分析仅用于初始筛查。有疗效的造血干细胞移植之前和之后的鉴别诊断和患者监测需要技术的改变，并通过流式细胞术进行。

为了克服目前的技术和诊断局限性并扩大免疫监测的适用性，本发明的发明人建立了基于DNA(未)甲基化的免疫细胞定量评估(表观遗传qPCR)。该技术提供了可应用于新鲜、冷冻或纸斑、干血的相对和绝对免疫细胞计数。信号是数字的，即，指示每个细胞的一个正值或负值，而不是如在FCM中针对“阳性”的任意限定的阈值。它可以以自动的、与操作者无关的方式进行，并降低对试剂可变性(如抗体)的易感性。

在本发明的第一方面，上述目的通过用于鉴定血液免疫细胞的改进的甲基化测定的方法来实现，所述方法包括以下步骤：

a)提供人血液样品，特别是来自新生儿的人血液样品，其包含血液免疫细胞的基因组DNA；

b)用亚硫酸氢盐处理所述免疫细胞的所述基因组DNA，以将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；

c)使用合适的引物对扩增所述经处理的基因组DNA以产生扩增子，和

d)基于分析经扩增的所述扩增子来鉴定所述血液免疫细胞，

其中，所述扩增和分析包括使用选自以下的组中的至少一组的引物和探针的扩增和/或qPCR：针对CD4的SEQ ID NO 1至12、针对CD8β的SEQ ID NO 13至20、针对LRP5的SEQID NO 21至28、针对MVD的SEQ ID NO 29至36、针对LCN2的SEQ ID NO 37至44、针对CD3γ/δ的SEQ ID NO 45至56，以及

其中，所述扩增子中至少一个CpG位置的脱甲基化指示选自以下的至少一种血液免疫细胞：CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、嗜中性粒细胞、CD14⁺单核细胞、CD56⁺NK细胞和CD19⁺B细胞。

优选的是根据本发明的方法，其还包括如例如US2012-0107810中所公开的针对CD3ε的扩增子的分析。

优选的是根据本发明的方法，其还包括待鉴定的所述血液免疫细胞的另外的FCM。

表观遗传免疫细胞计数提供了强大的平台，其能够诊断免疫缺陷并且任选地和方便地互补了流式细胞术和T细胞受体切除环分析，然而，没有它们各自的限制。

本发明还涉及使用上述测定获得的甲基化数据的准确定量。这涉及几个组成部分和考虑事项：

1.内标，例如经由电脑模拟转换的质粒。

2.与特定基因的甲基化变体相反的(例如)GAPDH标准子。

3.因此，根据用1定量，将强制性脱甲基化GAPDH的所有脱甲基化拷贝与特异性(但以相同的拷贝数存在)脱甲基化基因进行比较。

4.然而，上述不允许真正的“绝对”定量，因为经由电脑模拟转换的标准品不对应于生物样品(其仅在反应小瓶中被转换)。

5.基于添加和测量所谓的GNOM(甲基化的基因组标准子)来解决4.处的问题，这里，所有原始序列等摩尔地包括在质粒中，然后进行整个过程(亚硫酸氢盐处理和纯化)。由于它们以1:1存在，因此可以在使用1中的标准品进行定量之后鉴定标准品，所述标准品显示出经由电脑模拟甲基化和原位甲基化之间的差异。使用该因子，可以校正测量的甲基化值，这显著改进了结果。

6.使用确定量的具有反转CG碱基的标准基因的核酸(质粒)，此外，可以考虑在该过程中的任何材料损失，这进一步改进了该方法。

7.为临床实践和需要而设计的可靠的和特定的测定组件。

在qPCR中扩增的细胞类型特异性DNA甲基化标志物(13-15)潜在地允许免疫细胞检测和定量，甚至在有限数量和质量的样品中。已经在前面描述了用于鉴定细胞类型特异性表观遗传标志物的基本原理(14,16-18)。用于基于DNA甲基化的免疫细胞定量的可替代方法包括依赖于微阵列分析在全基因组范围内分析单个CpG位点(19)。此类方法允许基于计算的β值(甲基化强度)来估算白细胞亚群。本发明的发明人假定基因座特异性个体化表观qPCR是高度特异性和灵敏的，因此非常适合诊断方法。

对于表观遗传qPCR，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA。未甲基化的CpG二核苷酸被转换为TpG，而甲基化的CpG保持不变。因此，亚硫酸氢盐转换将表观遗传标志物翻译成序列信息，其允许辨别和定量两种变体。由于DNA是稳定的底物，因此表观遗传qPCR对细胞完整性的丧失不易感。它可以在新鲜冷冻的血液、DBS或其它样品上进行，而对保存状态无特别要求。另外，PCR组分是合成产生的，并且易于实现标准化。然而，由于缺乏良好限定的特异性生物标志物和缺乏确定的和绝对的定量，尚未证明经由表观遗传qPCR计数免疫细胞(20)。

本发明的发明人研究了免疫细胞类型特异性表观遗传qPCR，其用于定量人血液中的白细胞群体。对于总CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺细胞毒性T细胞(21,22)，分析编码细胞类型决定蛋白的基因中的调控元件的甲基化状态。从全基因组发现和所得候选基因的图谱中鉴定嗜中性粒细胞、B细胞和NK细胞的表观遗传标志物。绝对细胞数(即，细胞/μl血液)的确定构成金标准，例如用于HIV患者中CD4⁺T细胞的计数的金标准。本发明的发明人基于健康供体以及HIV患者同类族群中免疫细胞的细胞类型特异性表观遗传信号来测试免疫细胞的确定和绝对计数，并分析它们与FCM的等价性。对于血液体积难以确定的DBS，未甲基化免疫细胞类型特异性标志物基因的拷贝与通用分母(GAPDH)的拷贝相关。此外，通过使用DBS在临床上不可预见的新生儿同类群组中鉴定PID病例证明了表观遗传qPCR的诊断潜力。

在根据本发明的方法的优选实施方案中，所述方法被整合，并且还包括使用选自在所有待鉴定细胞中表达的基因(如例如管家基因，如例如GAPDH和β-肌动蛋白)的脱甲基标准基因(优选使用选自针对所述GAPDH基因的SEQ ID NO 57至61的引物和探针)进行分析和第一标准化。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述方法被整合，并且还包括使用经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸的第二标准化，优选使用选自针对GAP[GC]构建体的SEQ ID NO 62至64的引物和探针使用经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸的第二标准化，所述经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸包含将所述至少一个脱甲基标准基因(GAP[GC]构建体)的所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列。

在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，所述方法被整合，并且还包括使用校准质粒的第三次标准化，所述校准质粒在其未转换的基因组(即，未甲基化的)状态中包含每个扩增子序列的一个拷贝。

在根据本发明方法的另一个优选实施方案中，所述方法还包括对所鉴定的所述血液免疫细胞的定量。

在其优选的实施方案中，根据本发明的方法包括：

a)提供确定体积的人血液样品(特别是来自新生儿的人血液样品)，其包含待定量的血细胞的(例如二倍体)基因组DNA；

b)提供包含脱甲基化标准基因、将所述脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列和血细胞特异性基因的经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸；

c)提供重组核酸，其包含b)中所述的脱甲基化标准基因的脱甲基化基因组序列、将所述脱甲基化标准基因的所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列和b)中所述的血细胞特异性基因；

d)提供重组核酸，其包含将b)中所述的至少一种脱甲基标准基因的所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列；

e)向a)中所述的样品添加确定量的d)中所述的重组核酸(“加标(spiking)”)；

f)用亚硫酸氢盐处理a)中的待定量细胞的所述(例如二倍体)基因组DNA以及c)和d)中所述的重组核酸，以将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；

g)使用合适的引物对扩增所述a)、b)、c)和f)的核酸分子以产生扩增子；和

h)基于分析所述扩增子来鉴定血液免疫细胞，

任选地，如本文中所述的，包括所述血液免疫细胞的定量步骤。

优选的是根据本发明的方法，其还包括对上述CD3ε的扩增子的分析。

优选地，所述脱甲基化标准基因选自在所有待检测细胞中表达的基因，如例如管家基因(如例如GAPDH和β-肌动蛋白)。

在根据本发明的方法的一个方面，分析多于一种血细胞特异性基因，例如，根据需要或期望产生1、2、3、4、5或6种血细胞特异性基因的一组，任选地连同分析如本文中所述的多于一种的脱甲基化标准基因。

优选地，核酸是质粒(例如线性化质粒，如细菌质粒(例如pUC))、酵母人工染色体(YAC)、人人工染色体(HAC)、PI衍生的人工染色体(PAC)、细菌人工染色体(BAC)和/或PCR产物。

在该方法的一个方面，使用包含脱甲基化标准基因(例如GAPDH)、“人工序列”(将所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列)以及血细胞特异性基因(“特异性基因”，例如CD4)的第一经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的核酸(质粒)对扩增进行标准化。所有三种元件在所述核酸上均相同地存在(等摩尔)，并且是经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的。因此，可以直接将标准化曲线和相应的校准曲线与样品进行比较，从血细胞特异性基因与脱甲基化标准基因的比例来确定相对细胞计数。然而，核酸不对应于“真实的”序列，因为每个C被T取代。如上所述的所有基因的系列稀释和每个浓度的确定产生了用于测定的校准曲线。

为了提高该方法的准确性，使用包含脱甲基化标准基因(例如GAPDH)、“人工序列”(将所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列)和血细胞特异性基因(“特异性基因”)的第二核酸(质粒)。然而，这些序列不是经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的，并且对应于基因组序列(就具有基因组对应物而言，参见下文)，因此仅可被用于测量扩增(例如qPCR)效率。

第二个标准的原因有两个。A)对于确定的定量，需要与待分析的生物样品中相同的标准品(这也是规章要求)。然而，在第一核酸中，将双链富含AT的序列与单链富含U的序列进行比较。只有双链核酸的“真正的”亚硫酸氢盐转换允许这种确定的比较。然后，使用第一核酸标准化的血细胞特异性基因向脱甲基化标准基因的亚硫酸氢盐转换的商给出效率的因数。基于通过脱甲基化标准基因的亚硫酸氢盐转换将所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列的亚硫酸氢盐转换的划分，同样适用于商。

优选地，“人工序列”(将所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列)是包含C和CpG序列(用于亚硫酸氢盐转换)的随机序列，其不存在于人类基因组中。在一个实施方案中，人工序列是被扩增的GAPDH部分的确切序列(扩增子)，其中CpG序列被反转为GpC序列。如上所述，在所有三种核酸上发现了“人工序列”，即在第一种核酸上(经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的)、第二种核酸上(用于亚硫酸氢盐转换)以及在第三种核酸上-作为唯一被分析的序列-(经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的)。

第三核酸以确定的量被给予确定量的血液(特别是来自新生儿的血液)，然后被分析(例如纯化、亚硫酸氢盐处理、二次纯化、脱磺酸化、特异性扩增)。然后，对第一核酸进行标准化(测量了多少拷贝并给予到反应中)，使用与第二核酸的比较来确定效率，并且使用第三核酸来确定(残留)拷贝数。将任何损失与进行相同程序的基因组DNA的损失进行比较。整个过程允许精确确定和绝对定量所述DNA以及通过该过程在血液样品(如例如全血)中的细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及人工序列，其是被扩增的GAPDH部分的确切序列(扩增子)，其中当进行本发明的方法时，CpG序列被反转成GpC序列作为工具。

细胞免疫系统的组成拥有对于各种疾病的有价值的诊断信息。用于定量免疫细胞监测的标准技术是流式细胞术。然而，这种方法局限于其中保留细胞完整性的血液样品。在临床惯例中，这有效地限制了作为分析底物的新鲜血液样品的分析。

为了扩大诊断免疫监测的使用范围，本发明的发明人实施表观遗传qPCR系统以定量主要白细胞群体。在确定免疫细胞类型特异性甲基化标志物后，分析来自25名健康供体、97名HIV患者和325张来自新生儿的Guthrie卡(包括来自患有原发性免疫缺陷(PID)(包括但不限于XLA、SCID、SCN)的患者的25张卡)。确定B细胞、NK细胞、总T细胞、辅助性T细胞、嗜中性粒细胞和细胞毒性T细胞的流式细胞术和表观遗传学数据之间的方法学一致性，并测试该新技术鉴定定量免疫细胞缺陷的能力。

数据显示，根据Bland-Altman测试，经由表观遗传qPCR测定和流式细胞术的定量在健康对象和HIV患者中同等地进行。表观遗传定量适用于新鲜和冷冻血液样品中白细胞亚群的相对和绝对频率。与流式细胞术相比，Guthrie卡的免疫细胞分析准确地鉴定出新生儿中的病例PID。免疫细胞群的表观遗传定量与提供更广泛的可能应用(包括可能为偏远地区或来自新生儿的患者的血液计数铺平道路的干血斑分析)的标准流式细胞术高度相当。

因此，优选的是根据本发明的方法，其中所述血液样品选自外周，毛细血管或静脉血液样品或它们的亚级分(如例如外周血单核细胞、血凝块和干血斑)。还优选的是根据本发明的方法，其包括基于所述定量诊断人(特别是新生儿)的原发性免疫缺陷(PID)的步骤，其中所述样品优选是干燥的样品，如Guthrie卡(还进一步参见下文)或DBS(干血斑)。

优选的是根据本发明的方法，其还包括基于所述至少一种免疫细胞类型的至少一个定量来推断人的免疫状态的步骤。

优选的是根据本发明的方法，其中所述重组核酸分子选自质粒、酵母人工染色体(YAC)、人人工染色体(HAC)、PI衍生的人工染色体(PAC)、细菌人工染色体(BAC)和PCR产物。

优选的是根据本发明的方法，其中所述脱甲基化标准基因选自在所有待检测细胞中表达的基因，如例如管家基因，如例如GAPDH和β-肌动蛋白。

优选的是根据本发明的方法，其中所述血细胞特异性基因选自：已知或发现在所有待检测的血细胞中表达的基因、CD4、CD8β和/或α、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5)、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD)、脂质运载蛋白-2(LCN2)和CD3γ/δ区域(基因)。

本发明的另一方面涉及诊断试剂盒，其包含用于进行根据本发明的方法的材料，任选地以及使用说明书。优选的材料是核酸分子和/或亚硫酸氢盐试剂。优选的材料选自引物和探针，所述引物和探针选自以下中的任一组：针对CD4基因的SEQ ID NO 1至12、针对CD8β基因的SEQ ID NO 13至20、针对LRP5基因的SEQ ID NO 21至28、针对MVD基因的SEQ IDNO 29至36、针对LCN2基因的SEQ ID NO 37至44、针对CD3γ/δ基因区的SEQ ID NO 45至56、针对GAPDH基因的SEQ ID NO 57至61和针对GAP[GC]构建体的SEQ ID NO 62至64。

本发明的另一方面涉及根据本发明的试剂盒在进行根据本发明的方法中的用途。

本发明的又一方面涉及选自SEQ ID NO：1至64中任一个的引物或探针，和通过选自以下的引物对扩增的扩增子：SEQ ID NO.1和2；3和4；5和6；7和8；10和11；13和14；15和16；18和19；21和22；23和24；26和27；29和30；1和32；34和35；37和38；39和40；42和43；45和46；47和48；49和50；51和52；54和55；57和58；59和60；以及62和63。

本发明还包括治疗人(特别是新生儿、有需要的患者)的免疫相关疾病的方法，其包括进行如本文中所述的方法，并基于所述方法的结果提供对所述免疫相关疾病的治疗。一个另外的实施方案包括免疫细胞监测，并且免疫相关疾病包括例如PID、其它免疫缺陷或癌症。

目前的免疫细胞监测需要新鲜的或保存良好的血液，这在其中不能获得此类底物的医学领域中阻碍了诊断。这里，本发明的发明人描述了免疫细胞类型特异性表观遗传qPCR，其允许从未观察到的保守的、纸斑点干血或新鲜样品中确定免疫细胞计数。先前使用调节性T细胞中的“Treg特异性脱甲基化区域(TSDR)”已经显示了表观遗传qPCR的总体可行性(13)。在鉴定用于许多诊断相关免疫细胞群的特异性表观遗传标志物后，本发明的发明人证明相应的表观遗传qPCR与免疫细胞分析的金标准技术(FCM、TREC/KREC分析)的性能等同。为此，分析来自健康对照的新鲜冷冻血液和/或DBS中的免疫细胞的定量、原发性免疫缺陷(PID)或获得性(HIV)免疫缺陷的同类群组，以及具有或不具有先天性免疫缺陷的新生儿的同类群组。

用于细胞类型鉴定的理想DNA甲基化标志物在靶细胞(接近0％甲基化)和所有对照细胞(接近100％甲基化)之间是可辨别的。除了分析T细胞相关基因CD3G/D、CD4和CD8B外，发现基因MVD、LRP5和LCN2中的基因座仅分别在NK细胞、B细胞和嗜中性粒细胞中未甲基化。MVD是甲羟戊酸途径的一个组分(33)，并且在睾丸、十二指肠和结肠中表达。LRP5参与骨生成(34)。LCN2是细胞外转运蛋白和人泪液的主要蛋白(35)。在这些区域中特异性缺乏甲基化的原因和功能仍有待分析，但不影响其用于外周血中的细胞定量。通过亚硫酸氢盐测序来验证所有标志物，并选择辨别性CpG二核苷酸用于qPCR开发，并对人工产生的甲基化和未甲基化DNA进行表征。在未检测来自非靶模板的背景的情况下，实现靶DNA的定量扩增。qPCR测定性能是稳健的，具有低的变化，如通过新鲜、冷冻或干血中的小的测定内和测定间CV所示的。

为了同时定量生物样品中的不同细胞类型，本发明的发明人设计了含有GAPDH的未甲基化基因组序列作为参考定量物和细胞类型特异性标志物的校准质粒。尽管GAPDH先前被描述为不稳定的基因表达标准子(36)并且包含片段重复(37)，但是这里选择的GAPDH基因座是稳定的二倍体并且总是未甲基化的。因此，通过用经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的标准品和校准仪调节生物样品的定量，可以校正测定的特定技术效率低的问题，并允许相对于未甲基化的GAPDH(即，所有有核细胞)确定地定量(20)各个基因座。因此，表观遗传qPCR展示与通过FCM所确定的细胞类型成正比的关系。方法(38)之间剩余的观察到的偏差可能是由于基于核酸的方法和基于抗体的方法之间的生物学和技术差异造成的。均一误差分布和精度与先前在不同的基于抗体的方法中进行的方法比较的数据相当(39)。总之，这些数据提示来自液体和干燥血液底物的表观遗传qPCR进行与FCM相当的免疫细胞的相对定量。

关于临床应用，在HIV治疗指南中相对细胞定量被WHO接受，但是在医学实践中治疗决策取决于每体积的细胞计数(40,41)。对于表观遗传qPCR，由于DNA回收不是定量的，并且DNA量和血液体积之间的关系不是固定的，因此这引起了问题。为此，本发明的发明人的实验设置包括将确定浓度的人工GAP[GC]加标到血液中，从而在随后的qPCR分析中提供对确定血液体积中的原始DNA含量的近似推断。尽管已经描述了基因组和质粒DNA的不同效率(42)，但是在亚硫酸氢盐处理和产生的基因组DNA片段化之后，此类差异被进一步减少。当应用于健康供体和HIV同类群组时，数据显示出与描述用于相对定量方法比较的数据类似的高相关性和偏差以及一致的极限。因此，本发明的发明人得出结论，每微升的免疫细胞计数可以通过等价于FCM的表观遗传qPCR进行。

目前，新生儿筛选总是从DBS进行的。由于FCM不适用于该底物，因此TREC/KREC分析被用于PID筛查。因此，在此类筛查中引入表观遗传qPCR需要与TREC/KREC等同的测试。由于测试的不同参数(即DNA切除环相对于基因组DNA)，方法比较是不可行的。相反，本发明的发明人从(43)估算TREC/KREC的特异性和灵敏度。当使用99％置信区时，表观遗传qPCR以相似的灵敏度和特异性可靠地鉴定患有不同类型PID的新生儿。它仅不能鉴定一个具有母体细胞移植的新生儿PID患者(即其中T细胞和B细胞的缺失被母体细胞掩盖的患者)。与切除环的分析不同，表观遗传分析不限于主要淋巴细胞亚群。这种问题可以通过将表观遗传qPCR组合扩展到记忆T细胞或B细胞的标志物来解决，所述标志物在没有移植的新生儿中不存在。当在新生儿中检测到时，此类标志物物可以允许检测移植，从而表明不存在健康的固有免疫系统。

其它免疫细胞群的其它定量缺陷出现在嗜中性粒细胞和高度特化的Treg中。本发明的发明人的数据表明，基于对嗜中性粒细胞和Treg的表观遗传qPCR的此类患者的鉴定在出生后早期是可能的，从而允许SCN(这潜在地构成威胁生命的PID)的早期诊断(43,44)。前面已经举例说明了检测和治疗这些严重免疫病症的重要性(46)。

由于患者的稀少性，对罕见遗传病进行全面研究提出了重大挑战。这里，这种局限性对仅6名SCN患者的分析影响最大，但是具有不同遗传背景的SCID患者组与先前公开的研究相当(47)。在本发明中提供的有限的数据组仅仅证明了技术可行性，但是还不允许转化成新生儿筛查。尽管本发明有严格的局限性，本发明的发明人的数据表明表观遗传qPCR可以在医学筛排查程序中提供选择。

总之，本发明表明表观遗传qPCR提供了用于免疫细胞检测和监测的精确和准确的手段，并且强调表观遗传qPCR可以帮助或甚至取代目前的免疫诊断学，特别是对于不注意保存的血液或DBS。

现在将在以下实施例和附图中进一步描述和解释本发明，然而，本发明不限于此。出于本发明的目的，如本文中所引用的所有参考文献通过引用整体并入。

图1显示了纯化的免疫细胞中细胞特异性标志物基因的亚硫酸氢盐测序衍生的DNA甲基化。免疫细胞类型排列成列，扩增子(AMP)和相关基因名称排列成行。不同的基因座由红线分开，相同基因座内的扩增子由黑线分开。每一个单独的行代表单个CpG位点。甲基化速率从浅灰色(0％)到深灰色(100％)进行颜色编码。

图2显示了通过FCM和表观遗传qPCR的免疫细胞定量的比较。用流式细胞术(y轴)和表观遗传qPCR(x轴)测量来自独立供体的25个血液样品的免疫细胞。在A)中，相对免疫细胞计数显示为总白细胞的百分比。在B)中，绝对免疫细胞计数显示为每μl全血的细胞数。如从所有数据点计算的那样，回归线以红色表示，黑线表示等分线。

图3显示了HIV同类群组中T细胞亚群的方法比较。通过(A)FCM和表观遗传qPCR在液体全血中，(B)通过如A)中的FCM和表观遗传qPCR从DBS，和(C)通过表观遗传qPCR比较来自液体血液和DBS，确定以总有核细胞的％计的CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞的相对计数。在左手侧，数据表示为散点图。如从所有数据点计算的那样，回归线以红色表示，黑线表示等分线。在右手侧，Bland-Altman图显示了在它们的相对差异(y轴)上绘制的各个分析(x轴)的平均细胞计数。红线反映了约定的极限。中心灰线表示系统偏差。各个95％CI以虚线显示。上图：总CD3⁺T细胞；中间图：CD4⁺T细胞；右下：CD8⁺T细胞。

图4显示了新生儿DBS的表观遗传qPCR。来自细胞类型特异性qPCR的拷贝(y轴)对GAPDH拷贝(x轴)作图。(A)未甲基化的CD3G/D，B)MVD和C)LRP5。来自健康新生儿(n＝250，灰色圆圈)的DBS估算每个测定的参考范围，如99％置信区(红色椭圆)和99.9％置信区(蓝色)所限定的。来自PID诊断的新生儿的24个DBS显示为彩色圆圈，每一个参考了表2中所示的疾病特征。

图5显示了来自患有SCN的新生儿的DBS上的表观遗传qPCR。对来自健康对照(灰色+框)和确诊为SCN的新生儿的DBS进行表观遗传qPCR以定量CD15⁺嗜中性粒细胞。健康的同类群组在方框图中表示，而患病患者的结果以浅灰色表示。

图6显示了表观遗传学细胞计数的不同定量方法的示意图。在A)中，示出了基因座特异性相对百分比定量。qPCR允许如基于通过扩增结果(f)的线性插入(f-1)计算系列稀释的经有电脑模拟转换的质粒来计数拷贝数。通过该基因座处最初未甲基化拷贝的插入拷贝数除以该基因座处的所有拷贝(即甲基化和未甲基化拷贝数)来计算基因组基因座处的相对甲基化百分比。生物样品中的转换扰乱基因组DNA的完整性，而质粒代表扩增产物而不是底物。通过未知的“转换因数(CF)”给出扩增效率的结果差异。当将两个高度同源序列的扩增与很少的甲基化状态依赖性SNP进行比较时，被认为是可忽略不计的。在(B)中，将普遍未甲基化的GAPDH基因座(代表基因组DNA拷贝的总数)用作分母以确定任何细胞类型特异性未甲基化基因座的比率。这里，CF导致不同qPCR测定之间的实质性转变。在C)中，含有等摩尔基因组靶序列的校准质粒被用于补偿在引入效率因数(EF)的不同基因组基因座的转换效率。为了计数确定体积的血液中细胞的绝对数目，补充了已知拷贝数的含有合成的、非天然DNA序列(GAP-GC)的质粒。插入GAP-GC的起始量允许监测DNA制备、转换和qPCR，从而提供良好的过程效力的估算量。

图7显示了HIV同类群组中T细胞亚群的绝对定量的相关性分析。通过流式细胞术和表观遗传qPCR分析从97名HIV⁺患者的血液样品中测量绝对免疫细胞计数(以细胞/血液表示)。左侧散点图显示了通过表观遗传qPCR分析(x轴)和流式细胞术(y轴)测量的三个T细胞群体。黑色和红色的线分别代表等分线和回归线。皮尔逊相关系数(Pearsoncorrelation coefficient)r＝0.955(p<0.0001)。右侧的图展示了Bland-Altman图，其中在x轴上的每个表观遗传学测量值和细胞计数测量值之间平均的平均细胞计数(细胞/μl)在它们的(相对)差异(y轴)上绘图。红线反映了一致性的极限，以及中心灰线说明了系统的偏差。在这些线中的每一个的上方和下方，各自的95％置信区间被示为虚线灰线。上图：总CD3⁺T细胞；中间图：CD8⁺T细胞；右下：CD4⁺T细胞。

图8显示了来自新生儿的DBS上的表观遗传免疫细胞定量。对Guthrie卡上的干血斑进行表观遗传qPCR分析以定量未甲基化的CD4(A；特异性针对CD4⁺T细胞)和CD8B(B，特异性针对CD8B⁺T细胞)基因拷贝。将来自免疫细胞特异性测定(y轴)的计算值分散在平行测量的GAPDH拷贝(x轴)上。测量来自健康新生儿的参考样品(n＝250，灰点)并分别用于估算由红色(99％置信区)和天蓝色(99.9％置信区)椭圆限定的每个测定的正常范围。红色、蓝色、绿色和黑色圆圈显示了来自新生儿的24个样品，每个样品均具有已诊断的PID(分类如右下角的图例框中所示的)，每个圆圈均与根据表2引用疾病特征的标识符相关。

表1.细胞型特异性表观遗传qPCR系统

表1.RD_ls：相对的未甲基化(基因座特异性的)(％)；RD_U：相对的未甲基化(通用的)(％)；EF：效率因数；DD_U：确定的未甲基化(通用的)(％)

表4：来自方法比较分析的数据。来自在对97名HIV+患者的血液样品(液体；在Guthrie卡上点样并干燥，DBS)上进行的表观遗传qPCR和流式细胞术的比较的皮尔逊系数、偏差和精度。

表5：DBS的稳定性测试。通过表观遗传qPCR分析从血液中测量T细胞亚群、点样、在Guthrie卡上干燥，并在不同时间和不同温度下储存。

表6：用稀释的血液点样的DBS的表观遗传qPCR。通过表观遗传qPCR从一系列稀释的EDTA血液样品中测量了不同浓度的三个主要T细胞亚群。

表7A/B：用于亚硫酸氢盐测序和qPCR的寡核苷酸及其在反应中使用的各自的浓度。

表7A

表7B

实施例

研究设计-研究目的是确定表观遗传qPCR是否可以互补用于诊断免疫细胞计数的当前方法。为了测试这一点，本发明的发明人鉴定和评估了用于相关免疫细胞的细胞类型特异性未甲基化DNA基因座，所述相关免疫细胞包括CD15⁺嗜中性粒细胞、CD19⁺B、CD56⁺NK、CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺T细胞和Treg。开发表观遗传qPCR并使用确定的标准化参数进行标准化。该标准化的关键步骤是通过调整不同基因组基因座之间的qPCR效率和不同区域的不同亚硫酸氢盐转化效果，以及对DNA纯化效率进行标准化以对每血液体积的细胞进行绝对定量，从而为所有细胞特异性qPCR提供可比较的测量。应用相对定量和绝对定量两者来评估来自25名健康供体、97名HIV患者的全血，以及来自250个干血斑的干斑点，所述250个干血斑来自健康新生儿和24张来自患有原发性免疫缺陷的新生儿患者的新生儿卡片。表观遗传qPCR的结果被证实与标准FCM相当，并且还在免疫细胞计数中的当前诊断不足的应用中进行测试，特别是原发性和获得性免疫缺陷。病人材料提供自德国和加利福尼亚的医院，在进行数据分析之前不知情。

干血斑-从250名随机选择的匿名新生儿和一名确诊为IPEX的患者的毛细血管血液中获得遗传证实的IPEX、SCID、SCN和XLA患者的三个3.2mm DBS冲孔。按照临床测序探索性研究(Clinical Sequencing Exploratory Research，CSER)联合体的从业人员工具包进行所包括的PID患者的测序和遗传确认。获得所有参与者的书面父母同意书。该研究得到了德国弗莱堡大学萨克森州伦理委员会或机构审查委员会的医学协会商会(the MedicalAssociation Chamber of Saxony ethics committee or institutional review boardat University of Freiburg,Germany)的批准。

外周全血-经伦理同意，从25名健康对象和在莱比锡大学(Leipzig University)接受治疗的97名HIV⁺患者中，收集了EDTA抗凝的外周血。对样品进行表观遗传qPCR和标准FCM(48)。实验人员对信息一无所知。

DNA制备和亚硫酸氢盐转换-对于纯化的细胞，分离基因组DNA，并使用DNeasy组织和EpiTect快速亚硫酸氢盐转换试剂盒(Qiagen，希尔登，德国)根据制造商的说明进行亚硫酸氢盐处理。对于EDTA血液，20μl底物补充有16μl裂解缓冲液、3μl蛋白酶K(30mg/mL)和GAP[GC]质粒(最终浓度为20,000个拷贝/μl)，并在56℃下裂解10分钟。为了进行转换，使用了EpiTect快速亚硫酸氢盐转换试剂盒。将3×3.2mm DBS冲孔加入68.75μl裂解缓冲液、10.75μl蛋白酶K(30mg/mL)、20,000个拷贝/μl GAP[GC]质粒(最终浓度)中，并在56℃下裂解60分钟。加入180μl亚硫酸氢铵(68％-72％，pH 4.8-5.3，Chemos AG，慕尼黑，德国)和60μl四氢呋喃醇(Sigma-Aldrich)，在80℃下进行45min转换。为了进行纯化，使用了“我的硅烷基因组DNA试剂盒(My Silane Genomic DNA kit)”(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)，按照制造商的说明进行。先前已经分析了亚硫酸氢盐的转换率，并在制造商手册中提供了高于98％的值(49)。常规通过亚硫酸氢盐测序检查转换效率，显示转换率高于98％。作为过程对照，在每个单独的qPCR中，基因组校准仪均包扩转换对照。BioPerl被用于序列的经由计算机模拟的重亚硫酸氢盐转换50)。

表观遗传qPCR-使用Roche LightCycler 480 Probes Master在5μl(DBS)或10μl(EDTA血液)中如下进行热循环：1×95℃持续10或35min，然后50×95℃持续15sec以及61℃持续1min。为了从常染色体基因计算细胞数，假定2:1等位基因与细胞的比例。对于RD_ls[％]，将TpG拷贝除以TpG+CpG-拷贝。对于RD_U[％]，计算(各自免疫细胞类型的)TpG拷贝和GAPDH拷贝的商。对于DD_U[％]，通过EF校正RD_U以补偿不同qPCR之间的性能差异。对于测定特异性EF，本发明的发明人使用基于质粒的校准仪，其含有所有qPCR的基因组靶区域，包括GAPDH(通用分母)和人工GAP[GC]区。校准仪进行亚硫酸氢盐转换，然后进行qPCR。通过将测量的TpG拷贝除以平行测量的GAPDH拷贝来计算EF。EF来源于大约25个实验。95％CI为0.90-1.19(CD3G/D)、0.47-0.63(CD4)、0.75-1.00(CD8B)、0.58-0.77(LRP5)、0.89-1.18(MVD)和0.38-0.48(LCN2)。为了绝对定量，设计了将所有CpG二核苷酸反转为GpC(GAP[GC])的人工GAPDH序列及其对应的表观遗传qPCR，而不具有与内源性GAPDH交叉反应性。GAP[GC]的EF为0.87，其中95％CI为0.75-1.00。

组合TREC/KREC新生儿筛查测定-如前所述应用TREC/KREC筛查(51)。简而言之，在96孔格式中提取来自原始DBS的一个3.2-mm冲孔的DNA，并使用ViiA7实时PCR系统(AppliedBiosystems，福斯特城，CA，美国)进行TREC、KREC和β-肌动蛋白(ACTB)的定量三重实时qPCR。每个3.2-mm冲孔确定TREC和KREC拷贝数。ACTB被用于验证每个DBS的合适DNA量，而不用于正常化TREC/KREC拷贝。

质粒-对应于甲基化或未甲基化的、亚硫酸氢盐转换的基因组区的序列被经由电脑模拟设计并插入到质粒pUC57(Genscript Inc.，香港，中国)，以及用于测定建立并作为qPCR定量标准。标准质粒等摩尔地含有所有测定靶序列。质粒通过分光光度法定量，通过ScaI线性化，并在10ng/μL的λ-噬菌体DNA(New England Biolabs)中系列稀释，以在最终反应中获得31250、6250、1250、250、50或30个拷贝。校准质粒以基因组未转换的、未甲基化的形式中等摩尔地含有所有测定靶序列。人工加标入质粒携带具有反转的CpG二核苷酸的未转换的GAPDH(GAP[GC])。

寡核苷酸-在表7中描述了寡核苷酸(Metabion AG，慕尼黑，德国)。

流式细胞术-对于白细胞纯化，通过FCM将来自健康成年供体的外周血分成CD15⁺细胞、CD14⁺细胞、CD56⁺NK细胞、CD19⁺B细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，其中，如前所述的(13)，细胞纯度>97％，存活率>99％。对于分析细胞定量，通过MACSQuant细胞计数器(MiltenyBiotec，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)确定绝对CD45⁺白细胞计数。如前所述的(13,48)，计算CD15⁺嗜中性粒细胞、CD19⁺B细胞、CD56⁺NK细胞、CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞以及FOXP3⁺Treg的频率和绝对计数。

统计分析-使用LC480软件(Roche，曼海姆，德国)通过二阶导数最大值计算三次重复测量的CP(交叉点)，以通过从用基于质粒的标准品的系列稀释产生的校准曲线插入扩增(f)来产生拷贝数(质粒单位)。选择用于方法比较的样品大小为100来提供95％CI，以+/-0.34×基本标准偏差的一致性为极限。参考范围的估算需要至少120个个体的健康群体用于95％CI的非参数估算。健康病例的数目增加直到可用样品耗尽以适应多维和极端分位数的估算为止。使用Henze-Zinkler检验检查多元正态性。流式细胞术和基于qPCR的测量技术之间的方法比较如下：在散点图中说明来自两种方法的双变量数据。a)对不同于1的斜率和b)对不同于0的截距进行线性回归。检测Bland-Altman图，分析偏差和精确统计(29)。可接受的精度被认为是偏离偏差的平均百分比。将由间测定CV(0.2)所限定的qPCR测定的定量极限用作精确标准，且可接受的一致性极限为0.4。Wilcoxon-Rank-Sum检验被用于中值差异。报告估算的偏差、精度统计和各自的95％CI。对于相关性，使用皮尔逊积矩相关性。所有p值都是双侧的。使用统计软件R3.3.0。

细胞类型特异性亚硫酸氢盐转换-通过亚硫酸氢盐测序分析CpG二核苷酸的甲基化依赖性转换(24)，目的是鉴定来自人外周血的免疫细胞群的标志物。候选基因座选自文献或使用基于Illumina的450k阵列的测定发现的。本发明的发明人的数据显示，对于CD56⁺NK细胞、CD19⁺B细胞和嗜中性粒细胞(靶细胞类型)，在各个CpG位置都不存在明显的甲基化，而在对照细胞类型中，相同的CpG被甲基化了(表3)。基于这些发现，设计扩增子(AMP)用于在鉴定区域中进行更稠密的CpG甲基化分析。作为CD4⁺T细胞的可能候选标志物，本发明的发明人设计了三种用于亚硫酸氢盐序列分析的AMP，其覆盖CD4基因中第一内含子(AMP1255、2000和2001)的5'区域内的调控元件(21,22)。在亚硫酸氢盐转换和扩增仅在靶细胞(即CD4⁺T淋巴细胞)中发生之后，检测到未甲基化的CpG位点成为TpG残基。在对照细胞类型(包括CD56⁺NK细胞、CD8⁺T淋巴细胞、CD14⁺单核细胞、CD19⁺B淋巴细胞和CD15⁺粒细胞)中，相同的CpG对亚硫酸氢盐转换是惰性的(图1)。接下来，本发明的发明人通过设计靶向其第三内含子(AMP2007)内的调控元件的扩增子来研究CD8B基因作为CD8⁺T细胞的潜在表观遗传标志物(21,22)。这里，仅在CD8⁺T细胞中观察到亚硫酸氢盐介导的CpG转换，而那些CpG对对照细胞中的转换是惰性的。分别在编码低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP5，AMP2249)、甲羟戊酸脱羧酶(MVD，AMP2674)和脂质运载蛋白2(LCN2，AMP1730)的基因中鉴定B细胞、NK细胞和嗜中性粒细胞的相应表观遗传标志物。每种AMP在靶细胞类型中独特地未甲基化并且在相应的对照白细胞群中被完全甲基化(图1)。基因间CD3G和CD3D区(AMP 1405、1406和1408)(构成CD3⁺T细胞的标志物)的DNA甲基化，以及GAPDH(AMP1570)的甲基化图谱先前已被公开(15)。

基因座特异性相对qPCR测量-为了靶向上述不同甲基化的CpG位置，设计了辨别qPCR测定系统。这些在克隆到质粒中的合成模板DNA上表征。模板对应于亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA，即用胸苷(T)取代所有的胞嘧啶(C)。对于TpG模板(模拟未甲基化的CpG)，设计了等摩尔化学计量的携带用于所有测定的靶标的通用质粒。相应地产生通用CpG质粒(模拟甲基化的CpG)。对于所有的qPCR，都证明了所期望DNA序列的排他性扩增，而不具有与互斥的模板的交叉反应性(表1)。在免疫细胞群上测试测定特异性，所述免疫细胞群如材料和方法章节中所述的来纯化。对于靶细胞，在它们各自的TpG特异性系统中观察到高拷贝数，并且在对应的CpG系统中测量到低拷贝数。相反，对于对照细胞，在TpG系统和CpG系统中分别发现了低拷贝和高拷贝。通过将来自相应扩增(f')的qPCR信号与系列稀释的标准质粒(f)的扩增相关联来确定靶基因的原始拷贝数，所述标准质粒(f)各自具有确定浓度的经由电脑模拟转换的未甲基化形式。基因座特异性未甲基化DNA的相对测定(RD_ls)在靶细胞类型中为89.9％-100％，在对照中为0-3％(表1)。对于CD4⁺T细胞观察到例外，在CD8B基因座处显示8.9％的RD_ls，反之亦然(即，在CD8⁺T细胞中9.6％的CD4 RD_ls)，这可能是由于相互的和残留的细胞污染。

通用和确定的定量-扩增效率和估算的拷贝数对于每个基因座特异性qPCR系统是不同的(25)。因此，GAPDH基因的恒定未甲基化调控区(26)被用作通用分母以确定相对于所有有核细胞的每个细胞类型基因座。将该系统应用于纯化的CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞、嗜中性粒细胞、CD14⁺单核细胞、CD56⁺NK细胞和CD19⁺B细胞。与未甲基化细胞类型特异性基因座和通用未甲基化GAPDH作为分母(RD_U)的定量相比，当在特定表观遗传基因座(RD_ls)处使用甲基化和未甲基化扩增数据时，定量不同(表1)。

由于经由电脑模拟转换的双链、富含GC的质粒不完全代表真正的亚硫酸氢盐转换的单链GC贫化DNA(27,28)，因此采用“校准质粒”，其中包含所有检测靶标的一个拷贝处于它们的未转化的基因组(即未甲基化)状态。该校准子平行于样品进行亚硫酸氢盐转换。当通过标准质粒插入获得来自该校准子的拷贝数时，检测测定之间的系统扩增差异并将其转换为效率因数(EF)，调整细胞类型特异性测定和GAPDH之间的偏差。在大约25个实验中测量细胞类型特异性EF，其范围在CD4的0.53(95％置信区间(CI)＝0.42,0.61)和CD3D/G的1.17(95％CI＝0.95,1.31)之间(参见材料和方法章节中的“表观遗传qPCR”)。计算的EF为每个测定提供了对未甲基化DNA(DD_U)的普遍确定的测定(表1)。使用这种方法，本发明的发明人应用表观遗传qPCR对来自生物样品的免疫细胞进行通用和确定的定量。在该工作中使用的免疫细胞定量的概念示于图6中。

FCM和表观遗传学qPCR的方法比较-为了允许与FCM相当的绝对细胞定量(即，细胞/μl)，本发明的发明人引入了含有通过将所有CpG二核苷酸转换为GpC(GAP[GC])产生的人工GAPDH衍生序列的“加标入质粒(spike-in plasmid)”和相应的表观遗传学qPCR。对于绝对免疫细胞计数，将该质粒以确定的浓度加入到血液样品中。在定量标准品中包括经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的人工GAP[GC]序列，并将未转换的序列包含到校准质粒中。

为了评估表观遗传学细胞计数的总体性能，与FCM相比，在来自25名成年健康供体的血液样品中分析B细胞、NK细胞、CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、FOXP3⁺Treg和嗜中性粒细胞的标志物。将来自两种方法的数据以相对细胞计数(图2A)或绝对细胞计数(图2B)进行分散绘图，每种方法产生大于0.95(p<0.0001)的皮尔逊系数(r)。

为了测试临床相关环境中的个体表观遗传标志物，本发明的发明人使用来自97名HIV⁺对象的血液并通过标准FCM和表观遗传qPCR定量CD3⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞计数。对于后者，将EDTA血液或DBS用作底物。对所有三种方法进行方法比较。为了比较液体血液中的FCM与表观遗传学qPCR，相关分析得到用于相对定量的从0.96到0.98(p<0.001)的皮尔逊r系数(图3A)。通过FCM与表观遗传qPCR确定的白细胞数/微升血液高度相关(皮尔逊r＝0.8；p<0.001)(图7)。来自DBS和FCM的比较分析(图3B)得到0.7至0.95的皮尔逊r(p<0.001)。来自液体血液和DBS的表观遗传测量产生0.8至0.95的皮尔逊r(p<0.001)(图3C)。

图3A-C中所示的Bland-Altman分析(29)(右图)确定了表6中所列出的所有方法和标志物的系统偏差和精度。对于所测试的细胞类型，FCM的生物读取和来自任一底物的表观遗传计数是良好相关的。在液体血液的FCM和表观遗传qPCR之间检测到较小的偏差(CD3、CD4、CD8的分别为4.3-、-6.6、10.3)和高精度(均<20％)，而在DBS和CD4⁺T细胞的两种其它方法之间观察到显著的变化(>20％)。为了研究DBS中的底物不稳定性的影响，监测了模拟未观察到的收集的DBS的不同储存时间和条件以及样品稀释。数据显示在不同的储存条件下没有降解的迹象，对于所有的温度和时间点变异的变化(CV)低于15％(表5)。CV在1:9地血液稀释时低于30％(表6)。如前所分析的，基因组DNA是稳定的分析物，并且可以从保存一年之久的DBS中提取(30-32)。

新生儿筛查样品中的表观遗传qPCR-在病例/对照研究中应用表观遗传qPCR，该研究由来自24名PID患者和250名随机选择的新生儿的原始新生儿筛查卡(即DBS)组成，测量总T细胞、B细胞和NK细胞(图4)。PID病例包括具有不同基因缺陷和与BTK突变相关的X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)的SCID患者(表2)。使用所有白细胞(GAPDH特异性qPCR)和特异性免疫细胞类型的联合分布建立参考范围。将拷贝数进行对数变换并用于估算二元正态分布，其置信区(99％和99.9％的曲线)限定了新生儿的参考范围。当将三个组中的每一个调整到99％或99.9％的置信区时，Bonferroni校正保证了低于3％或0.3％的家庭错误率，分别产生99.7％或97％的最终置信度。

对于CD3⁺T细胞和GAPDH测量，来自SCID患者的16个样品中的13个在99.9％的置信区之外，发现SCID15在99％之外，但在99.9％区之内，并且SCID9和18呈现为不可疑的。然而，SCID15和18在NK细胞和GAPDH测量的99.9％置信区之外。此外，对于B细胞和GAPDH测量，在99.9％置信区外发现SCID18，在99％区外发现SCID15(图4)。因此，16名SCID患者中的15名通过基于他们的新生卡的表观遗传学测试被明确地鉴定为非正常的。然而，如通过FCM和染色体分析所证实的，SCID9呈现母体淋巴细胞移植，没有显示出细胞计数的定量损伤，并且被分类为正常。CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和GAPDH的表观遗传qPCR证实了这些发现，而没有向SCID样品中的CD3⁺T细胞分析添加诊断信息。还分析了与亚等位基因JAK3或ADA突变相关的迟发型SCID(DO-SCID)的DBS。JAK3缺陷型迟发型患者(DO-SCID14)显示在99.9％置信区外降低的CD3、NK、B和CD4、CD8值(图4)。ADA相关的DO-SCID4在NK细胞和B细胞的99.9％置信区之外并且在CD3的99％区之外，而DO-SCID3在B细胞中的99.9％置信区之外并且在NK中的99％置信区但是在CD3⁺T细胞中正常。总的来说，所有三个DO-SCID样品都是基于表观遗传分析鉴定的。来自五名患有XLA患者中的四名患者的DBS显示在99.9％置信区之外的B细胞计数。在B细胞和NK细胞中，亚等位基因XLA24在99％置信区之外。NK细胞和T细胞计数在其它XLA样品(NK中的XLA23和XLA20，T细胞中的XLA23)的参考范围的边界。XLA表型与B细胞缺陷完全一致。与TREC/KREC值的比较显示表观遗传学定量检测到除了一名患者之外的所有患者，而TREC/KREC未能检测到具有迟发型遗传背景或亚等位基因遗传背景的五例病例中的2例。然而，母体植入掩盖经由表观遗传学计数的检测，而TREC分析未受影响(表2)。筛查分类是基于显著细胞计数的三种测试，使用99％置信区获得0.958的灵敏度和0.984的特异性。对于99.9％置信区，灵敏度下降到0.9167，而特异性达到1。

IPEX和严重的先天性中性粒细胞减少症(SCN)是其它形式的严重PID，目前没有可用的新生儿筛查。考虑到他们的严重早期发作和发病率，患者将受益于新生儿诊断。在幼年IPEX患者中，与健康的年龄匹配的供体和疾病对照相比，外周Treg独特地增加(23)。

对嗜中性粒细胞应用表观遗传qPCR，通过嗜中性粒细胞的显著减少(p＝4.4×10e-6)来检测患有SCN的新生儿患者(图5A)。中性粒细胞的中值百分比在对照卡(n＝26)中为55％，在中性粒细胞减少患者(n＝6)中为17％。

通过Treg和CD3⁺T细胞的表观遗传qPCR分别测试来自新生儿和2岁IPEX患者的DBS(图5B)。与未受影响的健康供体相比，IPEX患者的Treg/CD3⁺T细胞的比例显著增加。

所引用的参考文献：

1.A.Adan,G.Alizada,Y.Kiraz,Y.Baran,A.Nalbant,Flow cytometry:basicprinciples and applications.,Crit.Rev.Biotechnol.8551,1–14(2016).

2.L.Whitby,A.Whitby,M.Fletcher,D.Barnett,Current laboratory practicesin flow cytometry for the enumeration of CD 4+T-lymphocyte subsetsCytom.PartB-Clin.Cytom.88,305–311(2015).

3.C.T.Nebe,A.Dorn-Beineke,P.Braun,V.Daniel,Z.Ilieva,G.Kuling,C.Meisel,U.

U.Sack,Messunsicherheit und

im Bereichder

der Lymphozytensubpopulationen im peripherenBlutLaboratoriumsMedizin 37,233–250(2013).

4.L.A.Herzenberg,J.Tung,W.A.Moore,L.A.Herzenberg,D.R.Parks,Interpreting flow cytometry data:A guide for the perplexedNat.Immunol.7,681–685(2006).

5.A.H.Kverneland,M.Streitz,E.Geissler,J.Hutchinson,K.Vogt,D.

N.Niemann,A.E.Pedersen,S.Schlickeiser,B.Sawitzki,Age and gender leucocytesvariances and references values generated using the standardized ONE-Studyprotocol,Cytom.Part A 89,543–564(2016).

6.H.T.Maecker,J.P.McCoy,R.Nussenblatt,Standardizing immunophenotypingfor the Human Immunology ProjectNat.Rev.Immunol.12,191–200(2012).

7.H.T.Maecker,J.P.McCoy,M.Amos,J.Elliott,A.Gaigalas,L.Wang,R.Aranda,J.Banchereau,C.Boshoff,J.Braun,Y.Korin,E.Reed,J.Cho,D.Hafler,M.Davis,C.G.Fathman,W.Robinson,T.Denny,K.Weinhold,B.Desai,B.Diamond,P.Gregersen,P.Dimeglio,F.Nestle,M.Peakman,F.Villnova,J.Ferbas,E.Field,A.Kantor,T.Kawabata,W.Komocsar,M.Lotze,J.Nepom,H.Ochs,R.O’Lone,D.Phippard,S.Plevy,S.Rich,M.Roederer,D.Rotrosen,J.H.Yeh,A model for harmonizing flow cytometryin clinical trialsNat.Immunol.11,975–978(2010).

8.World Health Organization,Consolidated guidelines on the use ofantiretroviral drugs for treating and preventing HIV infection:recommendations for a public health approach,World Heal.Organ.,155 p.(2016).

9.L.Ryom,C.Boesecke,V.Gisler,C.Manzardo,J.K.Rockstroh,M.Puoti,H.Furrer,J.M.Miro,J.M.Gatell,A.Pozniak,G.Behrens,M.Battegay,J.D.Lundgren,C.Manzardo,A.d.A.Monforte,J.Arribas,N.Clumeck,N.Dedes,A.M.Geretti,A.Horban,C.Katlama,S.McCormack,J.M.Molina,C.Mussini,F.Raffi,P.Reiss,H.J.Stellbrink,G.Behrens,M.Bower,P.Cinque,S.Collins,J.Compston,G.Deray,S.De Wit,C.A.Fux,G.Guraldi,P.Mallon,E.Martinez,C.Marzolini,S.Papapoulos,R.du Pasquier,N.Poulter,I.Williams,A.Winston,M.Puoti,S.Bhagani,R.Bruno,S.Konov,K.Lacombe,S.Mauss,L.Mendao,L.Peters,A.Rauch,C.Tural,H.Furrer,J.M.Miro,V.Gisler,G.

O.Kirk,A.Mocroft,P.Morlat,A.Volny-Anne,F.Mulcahy,C.Katlama,C.Oprea,M.Youle,Essentials from the 2015 European AIDS Clinical Society(EACS)guidelines for the treatment of adult HIV-positive persons,HIV Med.17,83–88(2016).

10.J.van der Spek,R.H.H.Groenwold,M.van der Burg,J.M.van Montfrans,TREC Based Newborn Screening for Severe Combined Immunodeficiency Disease:ASystematic Review,J.Clin.Immunol.35,416–430(2015).

11.A.Sottini,C.Ghidini,C.Zanotti,M.Chiarini,L.Caimi,A.Lanfranchi,D.Moratto,F.Porta,L.Imberti,Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primaryimmunodeficiency undergone to stem cell transplantation,Clin.Immunol.136,217–227(2010).

12.J.King,J.Ludvigsson,L.

Newborn Screening for PrimaryImmunodeficiency Diseases:The Past,the Present and the Future,Int.J.NeonatalScreen.3,19(2017).

13.U.Baron,S.Floess,G.Wieczorek,K.Baumann,A.Grützkau,J.Dong,A.Thiel,T.J.Boeld,P.Hoffmann,M.Edinger,I.Türbachova,A.Hamann,S.Olek,J.Huehn,DNAdemethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells fromactivated FOXP3+conventional T cells,Eur.J.Immunol.37,2378–2389(2007).

14.G.Wieczorek,A.Asemissen,F.Model,I.Turbachova,S.Floess,V.Liebenberg,U.Baron,D.Stauch,K.Kotsch,J.Pratschke,A.Hamann,C.Loddenkemper,H.Stein,H.D.Volk,U.Hoffmüller,A.Grützkau,A.Mustea,J.Huehn,C.Scheibenbogen,S.Olek,Quantitative DNA methylation analysis of FOXP3 as a new method forcounting regulatory T cells in peripheral blood and solid tissue,CancerRes.69,599–608(2009).15.J.Sehouli,C.Loddenkemper,T.Cornu,T.Schwachula,U.Hoffmüller,A.Gr？？tzkau,P.Lohneis,T.Dickhaus,J.Gr？？ne,M.Kruschewski,A.Mustea,I.Turbachova,U.Baron,S.Olek,Epigenetic quantification of tumor-infiltratingT-lymphocytes,Epigenetics 6,236–246(2011).

16.S.Rapko,U.Baron,U.Hoffmüller,F.Model,L.Wolfe,S.Olek,DNAmethylation analysis as novel tool for quality control in regenerativemedicine.,Tissue Eng.13,2271–80(2007).

17.T.O.Kleen,J.Yuan,Quantitative real-time PCR assisted cell counting(qPACC)for epigenetic-based immune cell quantification in blood and tissue,J.Immunother.Cancer 3(2015),doi:10.1186/s40425-015-0087-8.

18.E.A.Houseman,W.P.Accomando,D.C.Koestler,B.C.Christensen,C.J.Marsit,H.H.Nelson,J.K.Wiencke,K.T.Kelsey,DNA methylation arrays assurrogate measures of cell mixture distribution,BMC Bioinformatics 13(2012),doi:10.1186/1471-2105-13-86.

19.W.P.Accomando,J.K.Wiencke,E.A.Houseman,H.H.Nelson,K.T.Kelsey,Quantitative reconstruction of leukocyte subsets using DNA methylation,GenomeBiol.15(2014),doi:10.1186/gb-2014-15-3-r50.

20.J.W.Lee,V.Devanarayan,Y.C.Barrett,R.Weiner,J.Allinson,S.Fountain,S.Keller,I.Weinryb,M.Green,L.Duan,J.A.Rogers,R.Millham,P.J.O’Brien,J.Sailstad,M.Khan,C.Ray,J.A.Wagner,in Pharmaceutical Research,(2006),vol.23,pp.312–328.

21.P.Kung,G.Goldstein,E.L.Reinherz,S.F.Schlossman,Monoclonalantibodies defining distinctive human T cell surface antigens.,Science(80-.).206,347–9(1979).

22.R.E.L.,S.S.F.,Regulation of the Immune Response—Inducer andSuppressor T-Lymphocyte Subsets in Human Beings,N.Engl.J.Med.303,370–373(1980).

23.F.Barzaghi,L.Passerini,E.Gambineri,S.Ciullini Mannurita,T.Cornu,E.S.Kang,Y.H.Choe,C.Cancrini,S.Corrente,R.Ciccocioppo,M.Cecconi,G.Zuin,V.Discepolo,C.Sartirana,J.Schmidtko,A.Ikinciogullari,A.Ambrosi,M.G.Roncarolo,S.Olek,R.Bacchetta,Demethylation analysis of the FOXP3 locus showsquantitative defects of regulatory T cells in IPEX-like syndrome,J.Autoimmun.38,49–58(2012).

24.J.Lewin,A.O.Schmitt,P.Adorján,T.Hildmann,C.Piepenbrock,Quantitative DNA methylation analysis based on four-dye trace data fromdirect sequencing of PCR amplificates,Bioinformatics 20,3005–3012(2004).

25.P.M.Warnecke,C.Stirzaker,J.R.Melki,D.S.Millar,C.L.Paul,S.J.Clark,Detection and measurement of PCR bias in quantitative methylation analysis ofbisulphite-treated DNA,Nucleic Acids Res.25,4422–4426(1997).

26.H.J.M.de Jonge,R.S.N.Fehrmann,E.S.J.M.de Bont,R.M.W.Hofstra,F.Gerbens,W.A.Kamps,E.G.E.de Vries,A.G.J.van der Zee,G.J.te Meerman,A.terElst,Evidence Based Selection of Housekeeping Genes,PLoS One 2,e898(2007).

27.D.Chen,P.S.Rudland,H.L.Chen,R.Barraclough,Differential reactivityof the rat S100A4(p9Ka)gene to sodium bisulfite is associated withdifferential levels of the S100A4(p9Ka)mRNA in rat mammary epithelial cells,J.Biol.Chem.274,2483–2491(1999).

28.J.Harrison,C.Stirzaker,S.J.Clark,Cytosines adjacent to methylatedCpG sites can be partially resistant to conversion in genomic bisulfitesequencing leading to methylation artifactsAnal.Biochem.264,129–132(1998).

29.D.Giavarina,Understanding Bland Altman analysis,Biochem.Medica 25,141–151(2015).

30.S.Chaisomchit,R.Wichajarn,N.Janejai,W.Chareonsiriwatana,Stabilityof genomic DNA in dried blood spots stored on filter paper,Southeast AsianJ.Trop.Med.Public Health 36,270–273(2005).

31.M.V.Hollegaard,J.Grauholm,B.

D.M.Hougaard,DNAmethylome profiling using neonatal dried blood spot samples:A proof-of-principle study,Mol.Genet.Metab.108,225–231(2013).

32.M.V.Hollegaard,P.Thorsen,B.Norgaard-Pedersen,D.M.Hougaard,Genotyping whole-genome-amplified DNA from 3-to 25-year-old neonatal driedblood spot samples with reference to fresh genomic DNA,Electrophoresis 30,2532–2535(2009).

33.H.M.Miziorko,Enzymes of the mevalonate pathway of isoprenoid biosynthesisArch.Biochem.Biophys.505,131–143(2011).

34.T.Mizuguchi,I.Furuta,Y.Watanabe,K.Tsukamoto,H.Tomita,M.Tsujihata,T.Ohta,T.Kishino,N.Matsumoto,H.Minakami,N.Niikawa,K.I.Yoshiura,LRP5,low-density-lipoprotein-receptor-related protein 5,is a determinant for bonemineral density,J.Hum.Genet.49,80–86(2004).

35.B.Redl,Human tear lipocalinBiochim.Biophys.Acta-ProteinStruct.Mol.Enzymol.1482,241–248(2000).

36.M.Krzystek-Korpacka,D.Diakowska,J.Bania,A.Gamian,Expressionstability of common housekeeping genes is differently affected by bowelinflammation and cancer:Implications for finding suitable normalizers forinflammatory bowel disease studies,Inflamm.Bowel Dis.20,1147–1156(2014).

37.M.Ghani,C.Sato,E.Rogaeva,Segmental duplications in genome-widesignificant loci and housekeeping genes；warning for GAPDH and ACTB,Neurobiol.Aging 34(2013),doi:10.1016/j.neurobiolaging.2012.11.006.

38.D.Tsikas,A proposal for comparing methods of quantitative analysisof endogenous compounds in biological systems by using the relative lowerlimit of quantification(rLLOQ),J.Chromatogr.B Anal.Technol.Biomed.LifeSci.877,2244–2251(2009).

39.W.R.Rodriguez,N.Christodoulides,P.N.Floriano,S.Graham,S.Mohanty,M.Dixon,M.Hsiang,T.Peter,S.Zavahir,I.Thior,D.Romanovicz,B.Bernard,A.P.Goodey,B.D.Walker,J.T.McDevitt,A microchip CD4 counting method for HIV monitoring inresource-poor settings,PLoS Med.2,0663–0672(2005).

40.D.M.Moore,R.S.Hogg,B.Yip,K.Craib,E.Wood,J.S.Montaner,CD4percentage is an independent predictor of survival in patients startingantiretroviral therapy with absolute CD4 cell counts between 200 and 350cells/microL,HIV Med 7,383–388(2006).

41.L.M.Yu,P.J.Easterbrook,T.Marshall,Relationship between CD4 countand CD4％in HIV-infected people,Int.J.Epidemiol.26,1367–1372(1997).

42.S.J.Read,Recovery efficiencies of nucleic acid extraction kits asmeasured by quantitative LightCycler^TM PCR,J.Clin.Pathol.-Mol.Pathol.54,86–90(2001).

43.F.Hauck,C.Klein,Pathogenic mechanisms and clinical implications ofcongenital neutropenia syndromesCurr.Opin.Allergy Clin.Immunol.13,596–606(2013).

44.K.Bin Dhuban,C.A.Piccirillo,The immunological and genetic basis ofimmune dysregulation,polyendocrinopathy,enteropathy,X-linkedsyndromeCurr.Opin.Allergy Clin.Immunol.15,525–532(2015).

45.R.E.Schmidt,B.Grimbacher,T.Witte,Autoimmunity and primaryimmunodeficiency:Two sides of the same coin？Nat.Rev.Rheumatol.14,7–18(2018).

46.L.Brown,J.Xu-Bayford,Z.Allwood,M.Slatter,A.Cant,E.G.Davies,P.Veys,A.R.Gennery,H.B.Gaspar,Neonatal diagnosis of severe combined immunodeficiencyleads to significantly improved survival outcome:The case for newbornscreening,Blood 117,3243–3246(2011).

47.S.Borte,U.Von

A.Fasth,N.Wang,M.Janzi,J.Winiarski,U.Sack,Q.Pan-

M.Borte,L.

Neonatal screening for severe primaryimmunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR,Blood119,2552–2555(2012).

48.A.Boldt,S.Borte,S.Fricke,K.Kentouche,F.Emmrich,M.Borte,F.Kahlenberg,U.Sack,Eight-color immunophenotyping of T-,B-,and NK-cellsubpopulations for characterization of chronic immunodeficiencies,Cytom.PartB-Clin.Cytom.86,191–206(2014).

49.E.E.Holmes,M.Jung,S.Meller,A.Leisse,V.Sailer,J.Zech,M.Mengdehl,L.A.Garbe,B.Uhl,G.Kristiansen,D.Dietrich,Performance evaluation of kits forbisulfite-conversion of DNA from tissues,cell lines,FFPE tissues,aspirates,lavages,effusions,plasma,serum,and urine,PLoS One 9(2014),doi:10.1371/journal.pone.0093933.

50.J.E.Stajich,An Introduction to BioPerl.,Methods Mol.Biol.406,535–548(2007).

51.M.Barbaro,A.Ohlsson,S.Borte,S.Jonsson,R.H.

J.King,J.Winiarski,U.von

L.

Newborn Screening for Severe PrimaryImmunodeficiency Diseases in Sweden—a 2-Year Pilot TREC and KREC ScreeningStudy,J.Clin.Immunol.37,51–60(2017).

序列表

<110> 艾皮恩蒂斯有限公司(Epiontis GmbH)

<120> 用于免疫诊断和新生儿筛查的人类血液样品中表观遗传免疫细胞检测和计数的方法

<130> E31941WO

<150> DE 10 2018 116 353.3

<151> 2018-07-05

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

ggtttaggag gggttgtata tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

ggtttaggag gggttgtata tt 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

gggttagagt ttagggttgt t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

actatcccca atatcctcta ctt 23

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

tctaaaatat acaaaactaa cccaat 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

gtgttagata gagtttgggg gt 22

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

ccctactctt ataataaaca tttttatcaa 30

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

gaaattattt tttgagtgtt tttaatg 27

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

tgattttgag ggtggtggtt attttg 26

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

ccctactctt ataataaaca tttttatc 28

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

ggaaattatt tttcgagtgt ttttaacg 28

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

attttgaggg cggcggttat ttt 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

aatgttttat ttgggggttt at 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

cctactactc cttcaattct caa 23

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

gtggttaaga aattaatagg aaaaagaatg 30

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

cttccccacc acaatacaac a 21

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 17

tgtttgtgag gtatttagtt gatgggagtt t 31

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

ggttaagaaa ttaataggaa aaagaac 27

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 19

ccccatatta cttccccg 18

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 20

cgtttgtgag gtatttagtc gacgggag 28

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 21

atttttgtgt gattttaggg tt 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 22

atatccaaat atcctaccct cc 22

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 23

aatattacaa ccatacaccc aacaa 25

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 24

aagtgataga attttatgtt ttttttatg 29

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 25

ttagttgagg tgaggtgttt tgttagt 27

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 26

attaatatta cgaccgtacg c 21

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 27

cgatagaatt ttacgttttt tttac 25

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 28

acgaaacgcc tcgcctcga 19

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 29

aacccctaat ttccttctta ct 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 30

ggtgtgggtt tgagtttatt t 21

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 31

ggttttgtgg tatttttata gagtagt 27

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 32

ccatatacac cctcctcaa 19

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 33

ccctaaacca cctcttcccc tacac 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 34

ttttgtggta tttttataga gtagc 25

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 35

ccatatacgc cctcctcg 18

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 36

aaaccgcctc ttcccctacg 20

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 37

gattaggttt gaggtggagt t 21

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 38

tatccctacc aaaaatacaa ca 22

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

accaaaaata caacacttca a 21

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

ggtaattgtt agtaattttt gtg 23

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 41

cactctcccc atccctctat c 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 42

taccaaaaat acaacactcc g 21

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 43

aggtaattgt tagtaatttt tacg 24

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 44

ctcactctcc ccgtccctct atc 23

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 45

gatttttaga tgtttggggt t 21

<210> 46

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 46

ttattccacc tattaccttc ca 22

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 47

tttaggttgt gtgtaaatgt gg 22

<210> 48

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 48

ataaacctca ctcccatcaa ta 22

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 49

aggatgagga tagttaggtt ttt 23

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 50

aatccctcct aaattcatta cc 22

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 51

cctaaacact accacatctc aa 22

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 52

agaaatttag ttgttatggt ttgt 24

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 53

aaaaaaccat caaccccata acacaaa 27

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 54

ctaaacacta ccacatctcg a 21

<210> 55

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 55

aaatttagtt gttacggttt gc 22

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 56

ccgtcgaccc cataacgc 18

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 57

aaacccactt ctttaattta cc 22

<210> 58

<211> 17

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 58

tgggggtagg gtagttg 17

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 59

ggtttttggt attgtaggtt tt 22

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 60

ccaattacaa cataacaacc a 21

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 61

tgtttggatg ttgtgtttgt ggtagagtg 29

<210> 62

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 62

ggttttgtgt atgttaggtt tg 22

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 63

ccacattaca acataaacac ac 22

<210> 64

<211> 29

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 64

tgttgtgatg ttggttttgg tgtagaggt 29

1

Claims

1.用于鉴定血液免疫细胞的改进的甲基化测定的方法，其包括以下步骤：

d)基于分析经扩增的所述扩增子来鉴定所述血液免疫细胞，

其中，所述扩增和分析包括使用选自以下的组中的至少一组的引物和探针的扩增和/或qPCR：针对CD4的SEQ ID NO 1至12、针对CD8β的SEQ ID NO 13至20、针对LRP5的SEQ IDNO 21至28、针对MVD的SEQ ID NO 29至36、针对LCN2的SEQ ID NO 37至44、针对CD3γ/δ的SEQ ID NO 45至56，以及

2.根据权利要求1所述的方法，其还包括对CD3ε的扩增子的甲基化状态的分析。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其还包括使用选自在所有待鉴定细胞中表达的基因，例如管家基因，例如GAPDH和β-肌动蛋白的脱甲基标准基因，优选使用选自针对所述GAPDH基因的SEQ ID NO 57至61的引物和探针进行分析和第一标准化。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括使用经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸的第二标准化，优选使用选自针对GAP[GC]构建体的SEQ ID NO 62至64的引物和探针使用经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸的第二标准化，所述经由电脑模拟的亚硫酸氢盐转换的重组核酸包含将所述至少一个脱甲基标准基因(GAP[GC]构建体)的所有CpG二核苷酸反转为GpC的序列。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其还包括使用校准质粒的第三种标准化，所述校准质粒包含处于其未转换的基因组(即，未甲基化的)状态的每个扩增子序列的一个拷贝。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述分析还包括对所鉴定的所述血液免疫细胞的定量。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括待鉴定的所述血液免疫细胞的另外的FCM。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中分析多于一种的血细胞特异性基因，例如，1、2、3、4、5或6种血细胞特异性基因的一组，任选地连同分析多于一种的脱甲基标准基因。

9.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述血液样品选自：外周血样品、毛细血管样品或静脉血样品或它们的消减物，如例如外周血单核细胞、血凝块和干血斑。

10.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其还包括基于所述至少一种免疫细胞类型的至少一个定量来推断人的免疫状态的步骤。

11.诊断试剂盒，其包括用于进行权利要求1至10中任一项所述的方法的材料，任选地以及使用说明书。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述材料选自引物和探针，所述引物和探针选自以下中的任一组：针对CD4基因的SEQ ID NO 1至12、针对CD8β基因的SEQ ID NO 13至20、针对LRP5基因的SEQ ID NO 21至28、针对MVD基因的SEQ ID NO 29至36、针对LCN2基因的SEQ ID NO 37至44、针对CD3γ/δ基因区的SEQ ID NO 45至56、针对GAPDH基因的SEQ IDNO 57至61和针对GAP[GC]构建体的SEQ ID NO 62至64。

13.权利要求11或12所述的试剂盒在进行权利要求1至10中任一项所述的方法中的用途。

14.选自SEQ ID NO：1至64中任一个的引物或探针，和通过选自以下的引物对扩增的扩增子：SEQ ID NO.1和2；3和4；5和6；7和8；10和11；13和14；15和16；18和19；21和22；23和24；26和27；29和30；1和32；34和35；37和38；39和40；42和43；45和46；47和48；49和50；51和52；54和55；57和58；59和60；以及62和63。