CN1764729A - 使用嵌入核酸检测核酸中甲基化改变的分析 - Google Patents

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道格拉斯·斯彭切尔·米勒
约翰·罗伯特·梅尔基
杰夫雷·W·格里格
乔治·L·加博尔·米克洛斯
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Abstract

本发明公开了检测样品中靶核酸存在的方法，包括用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；向处理过的样品以嵌入核酸(INA)形式提供能够结合到核酸靶区域的检测配体，允许检测配体结合到靶核酸足够的时间；和检测检测配体结合到样品中核酸分子以指示靶核酸的存在。

Description

使用嵌入核酸检测核酸中甲基化改变的分析
技术领域
本发明涉及DNA杂交分析和改进的寡核苷酸或嵌入核酸(INA)分析。本发明特别涉及使用这些分析区分DNA中包含5甲基胞嘧啶碱基的特定碱基序列的方法。
背景技术
许多方法可以用于检测具体的核酸分子。这些方法一般地依靠靶DNA和核酸探针之间序列依赖的杂交，所述探针长度可以从短的寡核苷酸(20碱基或更少)到数千碱基的序列。
对直接检测而言，靶DNA最常见根据凝胶电泳确定的大小而分离并在用与靶序列互补的探针杂交(Southern和Northern印迹)前转移到固相支持物中。探针可以是天然的核酸或类似物例如INA或锁核酸(LNA)、PNA、HNA、ANA和MNA。该探针可被直接标记(如使用32P)或可以使用间接的检测方法。间接的方法通常依靠向该探针掺入“标记”例如生物素或地高辛配基，然后该探针通过例如酶联底物转化或化学发光的方法检测。
另一个广泛使用的直接检测核酸的方法为“夹心”杂交。在此方法中，捕捉探针连接到固相支持物上，溶液中的靶DNA与结合的探针杂交。未结合的靶DNA被冲洗去，而结合的DNA使用杂交到靶序列的第二探针检测。检测可以使用以上概述的直接或间接法。“分支DNA”信号检测系统是运用夹心杂交原理(Urdea Ms分支DNA信号扩增，Biotechnology 12：926-928)的例子。
运用核酸杂交直接检测核酸序列的迅速成长的领域是DNA微阵列(Young RA Biomedical discovery with DNA arrays.Cell 102：9-15(2000)；Watson，New tools.A new breed of high tech detectives.Science289：850-854(2000))。在这个方法中，单个核酸种类，其可以从寡核苷酸变动到更长的序列例如cDNA克隆，被固定到网格形状的固相支持物上。加标签的或标记的核酸群体然后与所述阵列杂交，定量阵列中与各斑点的杂交水平。最常见的是放射活性的或荧光标记的核酸(例如cDNAs)用于杂交，尽管其他的检测系统也被采用。
从核酸序列群体中扩增具体序列最广泛使用的方法是聚合酶链式反应(PCR)(Dieffenbach C和Dveksler G编，PCR Primer：A LaboratoryManual。Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)。在这个扩增方法中，寡核苷酸，通常位于互补DNA链上15到30核苷酸长度，处于待扩增的DNA区域的任一端，用来在变性的单链DNA上引发DNA合成。使用热稳定的DNA聚合酶进行逐次循环的变性、引物杂交和DNA链合成使得引物之间的序列得以指数的扩增。RNA序列可以通过首先使用反转录酶复制生产互补DNA拷贝而扩增。扩增的DNA片段可以通过多种的方法检测，包括凝胶电泳、与标记的探针杂交、使用能后续识别的加标签引物(例如通过酶联分析)、使用在与靶DNA杂交时产生信号的加荧光标签的引物(例如Beacon和TaqMan系统)。
除PCR之外，其他的方法已经开发用于检测和扩增具体的序列。一个例子为连接酶链式反应(Barany F使用克隆热稳定连接酶检测遗传病和扩增DNA(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193(1991)).
目前供选的检测DNA中甲基化改变的方法取决于此种序列在DNA的亚硫酸氢盐修饰以后的PCR扩增，所述甲基化改变例如在前列腺癌GSTP1基因启动子区域发现的。在亚硫酸氢盐处理的DNA中，胞嘧啶被变为尿嘧啶(由此在PCR过程中被扩增成胸腺嘧啶)而甲基化胞嘧啶是非反应性的，保持为胞嘧啶(Frommer M，McDonald LE，MillarDS，Collis CM，Watt F，Grigg GW，Molloy PL和Paul CL在单个DNA链中产生5-甲基胞嘧啶残基的正显示的基因组测序方案。PNAS89：1827-1831(1992)；Clark SJ；Harrison J，Paul CL和Frommer M.高灵敏的甲基化胞嘧啶作(High sensitivity mapping of methylatedcytosines).Nucleic Acids Res.22：2990-2997(1994)).因此(在亚硫酸氢盐处理后)包含5-甲基胞嘧啶碱基的DNA在序列上与对应的未甲基化DNA不同。Frommer等1992的结果是亚硫酸氢盐方法用于在DNA中测序5-甲基胞嘧啶残基的基础。若干年后这个分析被用作US5786146中CpG岛甲基化状态的PCR分析的基础。引物可以选择来非选择性扩增目的基因组区域以确定其甲基化状态，或可以设计成能有选择地扩增其中特定的胞嘧啶被甲基化的序列(Herman JG，GraffJR，Myohanen S，Nelkin BD和Baylin SB.Methylation-specific PCR：anovel PCR assay for methylation status of CpG islands.PNAS 93：9821-9826(1996)).
另外的用于检测胞嘧啶甲基化的方法包含用其切割能被位点特异的DNA甲基化阻断的限制性内切酶消化，继之以Southern印迹和对目的区杂交探针分析。该方法局限于在所述位点处DNA被甲基化具有显著的比例(通常＞10％)，和有足够的检测DNA，通常10pg的情形。用其切割被位点特异的DNA甲基化阻断的限制性内切酶消化，继之以使用限制性内切酶位点两侧的引物进行PCR扩增。这个方法可以利用较少量的DNA，但由于DNA甲基化之外的原因任何缺少完全的酶解作用都可导致假阳性信号。
若干年前，已经开发其中全部的脱氧核糖磷酸骨架已经用在结构上同型的不带电的聚酰胺骨架替换的肽核酸(PNA)，所述聚酰胺骨架包括N-(2-氨乙基)甘氨酸单位(Ray A和Norden B.Peptide nucleic acid(PNA)：its medical and biotechnical applications and for the future.FASEBJ 14：1041-1060(2000)).
已经开发了利用PNA配体用于灵敏地和特异地检测DNA的方法，其不要求PCR扩增(WO 02/38801)。最近，一种新的DNA配体，嵌入核酸(INA)已经被开发，其具有独特的有用性质
本发明人已经开发使用INA探针用于检测目的核酸的新分析方法。
发明详述
第一方面，本发明提供检测样品中靶核酸存在的方法，该方法包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；
(b)向处理过的样品以嵌入核酸(INA)形式提供能够结合到核酸的靶区域的检测配体，并让测检配体与靶核酸结合足够的时间；和
(c)测量检测配体与样品中核酸分子的结合以检测样品中靶核酸的存在。
第二方面，本发明提供检测样品中靶核酸甲基化的方法，该方法包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；
(b)向处理过的样品以嵌入核酸(INA)形式提供以能够区别核酸甲基化和未甲基化的胞嘧啶的检测配体，并允许检测配体与靶核酸结合足够的时间；和
(c)检测检测配体与样品中核酸的结合，这样的结合是靶核酸甲基化程度的指示。
第三方面，本发明提供检测样品中靶核酸存在的方法，该方法包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；
(b)提供结合有捕捉配体的支持物，所述捕捉配体能够识别靶核酸序列的第一部分；
(c)用处理过的样品接触该支持物足够的时间使核酸结合到捕捉配体，如此使样品中的靶核酸通过该捕捉配体结合到支持物；
(d)用能够识别靶核酸序列第二部分的检测配体接触支持物，并允许检测配体与结合到支持物的靶核酸结合足够的时间；以及
(e)测量检测配体与结合到支持物的核酸的结合以确定样品中靶核酸的存在，其中至少一种捕捉配体或检测配体为嵌入核酸(INA)形式。
第四方面，本发明提供判断检测样品中靶核酸甲基化程度的方法，该方法包括：
(a)用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；
(b)提供结合有捕捉配体的支持物，所述捕捉配体能够识别靶核酸序列的第一部分；
(c)用处理过的样品接触支持物足够的时间，以允许DNA结合到捕捉配体，如此使样品中的靶核酸通过捕捉配体结合到支持物；
(d)用能够区别DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的检测配体接触支持物，以使检测配体结合到支持物上的任何靶核酸；和
(e)测量检测配体与支持物的结合，以致结合的程度或量是靶核酸甲基化的程度的指示，其中至少一种捕捉配体或检测配体如嵌入核酸(INA)形式。
在第五方面，本发明提供检测含甲基化CpG或CpNpG的DNA的方法，该方法包括：
(a)用亚硫酸氢盐处理含DNA的样品以将DNA中未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶；
(b)向处理过的样品提供能够区别DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的检测INA配体；和
(c)根据检测INA配体结合的存在与否检测甲基化DNA。
第六方面，本发明提供判断检测样品中靶DNA甲基化程度的方法，该方法包括：
(a)用亚硫酸氢盐处理含DNA的样品以将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶；
(b)提供磁珠、多孔微量板或成形颗粒形式的固相支持物，其上结合有能够识别靶DNA序列第一部分的INA、PNA或寡核苷酸配体形式的捕捉配体；
(c)用处理过的怀疑含靶DNA的样品接触支持物，如此使样品中的靶DNA通过捕捉配体结合到支持物；
(d)用能够区别DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的INA、PNA或寡核苷酸配体形式的检测配体接触支持物；和
(e)通过测量结合的检测配体量确定结合到支持物上的DNA的甲基化程度，其中至少一种捕捉或检测配体是INA。
在一个优选的形式中，捕捉配体是INA。在另一个优选的形式中，检测配体是INA。
在第七方面，本发明涉及修饰未甲基化的胞嘧啶但不修饰甲基化的胞嘧啶的试剂，和一种或多种能够区别核酸中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的INA探针形式的配体在分析靶核酸甲基化的方法中的应用。
在第八方面，本发明提供分析已经用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理的核酸的试剂盒，包括至少一种能够区别DNA中甲基化和未甲基化的胞嘧啶的INA配体。
优选地，该试剂盒包含一种或多种固定到固相支持物的INA配体。试剂盒也可以包含扩增处理过的DNA的引物。
核酸可以包括包括或拷贝自真核生物基因组，原核生物和病毒，及线粒体核酸，在其他的细胞器发现的核酸和细胞外的核酸。如此处定义的核酸，还可以包含DNA和RNA形式和天然的或其人工衍生物，例如嵌入核酸(INA)、阿卓糖醇核酸(ANA)、环己酰核酸(CNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、己糖醇核酸(HNA)、甘露醇核酸(MNA)和其嵌合的组合。
核酸可以衍生自正常的或患病的有机体，其已经被细菌、病毒、viroidor真核生物或朊病毒感染。核酸还可能衍生自修饰的(转基因的)有机体(不管该修饰的有机体是否由种系的-、暂时的-或体细胞的-转染方法得到)，所述有机体包含来自不同物种或人工合成来源的核酸。核酸可以衍生自具有插入或连接的设备的有机体的细胞、组织或器官，所述设备通过机械的、电子的或化学的方式释放(例如支架、贴片、起搏器等等)。核酸可以衍生自下述方法得到的有机体：非标准的接合生殖方法，人工授精，胚胎干细胞克隆方法，或核转移(从体细胞或种系核)，或细胞质、细胞核或膜的提取物修饰的细胞或核，或外源因子修饰的细胞，(包括转决定和转分化方法)，或从相同或不同物种的线粒体或其他细胞器输入或修饰的，或其组合。核酸可以衍生自自体的-，异源的-或外移植物；组织或器官移植物；或已经移植人细胞到其他有机体中的组织，(例如在模式有机体介入心脏病学)。核酸可以衍生自下列有机体：通过基因敲除、敲入或降低的方法生产或修饰的有机体，(或者在体内、离体、或通过基因组或转录组被暂时或永久地改变的任何方法，例如被RNAi、核糖酶、适配子(aptamer)、转位子活化、药物或小分子操作法改变，例如由于PNA、INA、ANA、MNA、LNA、HNA、CNA分子或其他的基于核酸的共轭物的干扰(包括然而并非局限于Trojan肽)。核酸除了来自染色体不平衡的个体或有机体，或来自不同自体的细胞群体的嵌合体，例如雌雄间体的个体或有机体；或来自二倍体、非整倍体或片段非整倍体的细胞群体的嵌合体的个体或有机体之外，还可以衍生自人全部的生命阶段：从受精到死后48小时或从(正常的或异位的)怀孕的任何阶段的个体，以及胚胎或胎儿材料。核酸可以衍生自源于上述任何或所有来源的原始或培养细胞系，或来自存储的材料例如组织样本、组织和器官以及来自细胞(以及细胞系)和它们的分离自人组织、自体以及异源移植物、异种移植物的衍生物，以及可以来源于冷冻或(存储的；天然的或人工保存或干化的)、解剖或切除来源的样品；来源例如显微镜用载玻片、嵌入块或液体培养基中的样品、或提取自合成或天然的表面或液体中的样品。
优选地，核酸是DNA，更优选动物或人的基因组DNA。
修饰剂优选选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。更优选，所述试剂是亚硫酸氢钠，其在有水的情况下将胞嘧啶修饰成尿嘧啶。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)迅速地与胞嘧啶的5，6-双键反应形成磺酸化胞嘧啶反应中间体，该中间体易于脱氨，并在有水的情况下产生尿嘧啶亚硫酸盐。如有必要，亚硫酸盐基团可在适度的碱性条件下除去，产生尿嘧啶。因此，潜在地全部胞嘧啶将转化为尿嘧啶。然而任何甲基化的胞嘧啶由于甲基化的保护不能被修饰试剂转化。
嵌入核酸(INA)是非天然存在的多核苷酸，其可序列特异性地杂交到核酸(DNA和RNA)。由于INA显示若干合乎需要的性质，从而是基于探针的杂交分析中替代核酸探针的候选物。INA是杂交到核酸形成杂交物的聚合物，所述杂交物比对应的天然存在的核酸/核酸复合物在热力学上更稳定。它们不是已知降解肽或核酸的酶的底物。因此，INA应该在生物样品中更稳定，而且具有比天然存在的核酸片段更长的储存期限。与非常取决于离子强度的核酸杂交不同，INA与核酸的杂交相当地独立于离子强度，并且在强烈地不支持天然存在的核酸杂交到核酸上的情况下在低离子强度是有利的。INA的结合强度除取决于通常的双链结构中以特殊方式堆积的碱基之间的氢键相互作用之外，还取决于分子中嵌入基团的数目。INA识别DNA的序列辨别力比DNA识别DNA的辨别力更有效。
优选地，INA是(S)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-(1-芘基甲基)-甘油的亚磷酰胺。
INA以可商业供应的方式通过修改标准的寡核苷酸合成方法而合成。INA的完整定义及其合成可以在WO 03/051901，WO 03/052132，WO 03/052133和WO 03/052134(Unest A/S)中找到，上述专利在此引入作为参考。
在INA探针和标准的核酸探针之间的确存在许多差异。这些差异可以方便地分为生物学的、结构的和物理化学的差异。正如以上和以下的讨论，当试图在典型情况下采用核酸的应用中使用INA探针时，这些生物学的、结构的、和物理化学的差异可以导致不可预测的结果。在化学领域经常观察到这种不同组成的非等价性。
关于生物差异，核酸是在活的物种生命中作为基因传递和表达的因子起着重要作用的生物材料，它们的体内性质是了解得相当清楚的。然而INA是最近开发的完全人造的分子，由化学家构思并使用合成有机化学方法制备。它没有已知的生物功能。
在结构上，INA也显著地不同于核酸。尽管两者可以采用常见的核碱基(A，C，G，T和U)，这些分子的组成是结构上多变化的。RNA、DNA和INA的骨架由重复的磷酸二酯核糖和2-脱氧核糖单位组成。INAs不同于DNA或RNA在于具有一个或多个通过接头分子连接到该聚合物的大的扁平的分子。该扁平的分子嵌入在双链结构中相对INA的互补DNA链的碱基之间。
INA和DNA或RNA之间的物理/化学差异也是很多的。INA结合到互补DNA比核酸探针结合到相同靶序列更迅速。与DNA或RNA片段不同，除非嵌入基团位于末端位置，INAs与RNA的结合差。由于互补DNA链上嵌入基团和碱基之间强相互作用，INA/DNA复合物的稳定性比类似的DNA/DNA或RNA/DNA复合物高。
与其他的DNA例如DNA或RNA片段或PNAs不同，INAs不显示自身聚集或结合性质。
概括地说，因为INA以序列特异性杂交到核酸，INA为开发基于探针的分析的有用候选物和特别适用于试剂盒和筛选分析。然而INA探针，不是核酸探针的等同物。因此，任何改善基于探针的分析的特异性、敏感性和可靠性的试剂盒或组合物可以有效用于检测、分析和定量含DNA的样品。INAs具有用于所述目的的必要性质。
在步骤(b)，可以使用两个检测配体，其中一个配体能够结合到包含一个或多个甲基化的胞嘧啶的核酸区域，而另一个配体能够结合到(步骤(a))处理前不包含甲基化胞嘧啶的对应区域。由于样品可以包含靶核酸的许多拷贝，经常所述拷贝具有不同的甲基化的量。因此，两个配体结合的比例将与样品中靶核酸的甲基化程度成比例。这两个配体可以在一个检测中一同添加或可以在平行试验中单独加入。各配体可以包含在一个检测中同时检测或分开检测的独特的标记，或具有相同标记并分别地在单独的检测中检测。
优选地，捕捉配体选自INA探针、PNA探针、LNA探针、HNA探针、ANA探针、MNA探针、CNA探针、寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、单链DNA、RNA、适配子、抗体、蛋白、肽、其组合，或其嵌合的形式。
更优选，捕捉配体是INA探针、PNA探针或寡核苷酸探针。进一步优选，捕捉配体是INA探针。
支持物是任何适合的支持物，例如塑料材料、荧光珠、磁珠、成形粒子、板、微量滴定板、合成或天然膜、乳胶珠、聚苯乙烯、柱支持物、玻璃珠或载玻片、纳米管、纤维或其他有机的或无机的支持物。优选地，支持物是磁珠、荧光珠、成形粒子或一孔或多孔的微量滴定板。
固相基质一般地是玻璃或聚合物，最常使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固相支持物可以以管、珠、盘或微量培养板，或任何其他的适于进行分析的表面的形式。结合方法是现有技术公知的，通常组成为共价交联结合或物理吸附分子到不溶性载体上。
在优选的形式中，步骤(b)包括多个排列在固相支持物上的捕捉配体。阵列可以包含多拷贝相同配体以在阵列上捕捉相同靶核酸或可以包含多个不同的靶向到不同核酸的配体以在阵列上捕捉多个靶核酸分子。一般地，阵列包括大约10到200,000个捕捉配体。然而可以理解阵列可以具有任意数目的捕捉配体。
在一种形式中，捕捉寡核苷酸探针、INA探针、或捕捉PNA探针可以位于阵列上用于捕捉亚硫酸氢盐处理的核酸以测量核酸的甲基化状态。阵列技术是已公知的并已经用于在未处理的样品中检测基因或核苷酸序列的存在。然而本发明可以扩展阵列技术的有用性以提供诸多不同来源的核酸关于甲基化状态的有价值的信息。
在优选的形式中，样品可以是任何生物样品，例如干细胞、血液、尿、粪便、精液、脑脊髓液、细胞或组织例如脑、结肠、泌尿生殖组织、肺、肾、生血组织、乳房、胸腺、睾丸、卵巢，或子宫，环境的样品，微生物包括细菌、病毒、真菌、原生动物、类病毒等等。干细胞包括含真正祖细胞的细胞群体。这也适用于生殖细胞群体以及包括与体细胞融合形成能够采用特定表型的杂交细胞的干细胞。
优选地，修饰剂能够修饰未甲基化的胞嘧啶而不是甲基化的胞嘧啶。修饰剂优选选自亚硫酸氢盐、醋酸盐和柠檬酸盐。优选地，试剂是亚硫酸氢钠，以及胞嘧啶被修饰为尿嘧啶。
此处使用的术语“修饰”表示未甲基化的胞嘧啶转化为另一核苷酸，这将区分未甲基化和甲基化的胞嘧啶。优选地，所述试剂将未甲基化的胞嘧啶修饰为尿嘧啶。优选地，用来修饰未甲基化胞嘧啶的试剂是亚硫酸氢钠。其他类似地修饰未甲基化胞嘧啶而不是甲基化胞嘧啶的试剂也可以用于本发明的这一方法中。例子包括但不限于亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。优选地，所述试剂是亚硫酸氢钠，其在有水的情况下将胞嘧啶修饰成尿嘧啶。
亚硫酸氢钠(NaHSO3)与胞嘧啶的5，6-双键容易地反应，但与甲基化的胞嘧啶反应很差。胞嘧啶与亚硫酸氢盐离子反应形成易于脱氨的磺酸化胞嘧啶反应中间体，生成磺酸化尿嘧啶。磺酸盐基团可在碱性条件下除去，产生尿嘧啶。因此全部的未甲基化的胞嘧啶将被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶将免于转化，从而可以制备识别含胞嘧啶序列或对应的含尿嘧啶序列的配体。两个探针结合的比例可以提供给定的核酸中甲基化程度的精确测量。
重要的是，在许多情形下无需扩增核酸以获得需要的信息，因此克服潜在的错误和产生更快速和更简便的适于自动化的分析。对本发明而言在捕捉后扩增或在处理前选择核酸也是可能的。
在优选的形式中，检测配体涉及含CpG或CpNpG的DNA区域，其中N指定四个可能碱基A、T、C或G中的任何一个。优选地，含CpG-或CpNpG-的DNA区域处于基因的调控区域，或任何调控元件的增强子区域，所述调控元件包括启动子、增强子、癌基因、逆元件、可移动的序列，或活性被环境因素改变的其他调控元件，所述环境因素包括化学品、毒素、药物、辐射、合成或天然的化合物和微生物或其他的传染因子如病毒、细菌、真菌和朊病毒。例如，启动子或调控元件是肿瘤抑制基因启动子、癌基因或任何可以控制或影响一个或多个与疾病状态相关或改变正常状态例如老化的基因的其他的元件或区域。
样品DNA中存在含甲基化的CpG或CpNpG的区域可以显示细胞功能性变化，特别是关于细胞重新编程。变化还可以是增殖异常。其可以包括低级星形细胞瘤、退行发育性星形细胞瘤、恶性胶质瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、肺癌、肾癌、白血病、乳癌、前列腺癌、子宫内膜癌和成神经细胞瘤，或正常细胞分裂、干细胞群体的分化或代谢/分解代谢失调。
为帮助核酸修饰剂的反应，可以添加任选的添加剂例如尿素、甲氧胺和其混合物。
步骤(b)一般地用于捕捉在本方法后面的步骤中分析其甲基化的目的核酸。因此，步骤(b)实现目的核酸的捕捉和浓缩。优选一个或多个INA探针用于步骤(b)中。
在一个优选的形式中，步骤(b)包括多个排列在固相支持物上的捕捉配体。所述阵列可以包括多拷贝的相同配体以在阵列上捕捉相同的靶核酸用于随后的检测。另外地，所述阵列可以包含多个靶向到不同的DNA分子的不同的捕捉配体，以在阵列上捕捉许多不同的靶DNA样品用于随后的检测。在优选的形式中，捕捉配体结合到微量滴定板的孔上以可以进行多重测定。
在步骤(d)，可以使用两个检测配体，其中一个配体能够结合到包含一个或多个甲基化的胞嘧啶的核酸区域，而第二配体能够结合到不包含甲基化胞嘧啶的核酸对应区域。样品可以包含靶核酸的许多拷贝，而所述拷贝具有不同量的甲基化。因此，两个配体结合的比例将与样品中靶核酸的甲基化程度成比例。这两个配体可以在一个检测中一同添加或可以在平行试验中单独加入。各配体可以包含独特的标记，在一个检测中同时检测或分别检测，或具有相同的标记并分别地在单独的检测中检测。
为检测检测配体与靶核酸的结合，优选配体具有连接在其上的可检测标记物。结合的标记物的存在显示配体结合的程度。适合的标记物包括但不限于，化学发光、荧光、放射性、酶、半抗原，和树枝状聚合物(dendrimer)。
本发明使用的检测配体用于检测在亚硫酸氢盐修饰后样品中含CpG或CpNpG的DNA，可以特异性区分未处理的DNA、甲基化的和未甲基化的DNA。对非甲基化的DNA而言，寡核苷酸或PNA或INA探针形式的检测配体优选在3’CpG或CpNpG对中具有T或A以将其与保留在甲基化的DNA中的C区分开来。
本发明的探针可以设计成“基本上地”与待测试的基因组座位的一条链互补并包括合适的G或C核苷酸。这意味着引物应该充分地互补以在允许结合的条件下与各自目的区域杂交。换句话说，所述探针优选应该与待杂交的5’和3’两侧序列具有足够的互补性。
本发明的INA探针可以使用本领域已知的任何适合的方法制备。优选地，探针按照WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133和WO 03/052134(Unest A/S)的教导制备，上述专利在此引入作为参考。
根据本发明涉及靶核酸的甲基化状态的方法可以使用任何纯化或未纯化的形式的核酸样品作为原材料，只要它包含，或怀疑包含特定的含靶区域(通常CpG或CpNpG)的核酸序列。在一个优选的形式中，未扩增的样品用于本发明的方法。
INA混合物或具体的INA分子可被用于在通过检测配体捕捉前的扩增富集步骤中。单个或许多的INAs能被用于特异性地或随机地扩增亚硫酸氢盐处理的核酸。
目的核酸分子可以在根据本发明方法的步骤(a)前选择或浓缩。富集或选择步骤包括但不限于，物理方法包括超声处理和剪切、酶消化、酶处理、限制性消化、核酸酶处理、Dnase处理、浓缩、抗体捕捉，化学法包括酸或碱消化及其组合。例如，针对5-甲基胞嘧啶的抗体可以用来捕捉核酸例如富含5-甲基胞嘧啶或高度甲基化的基因组DNA。核酸来自通过任何适合的物理或酶的方法进行裂解以将其打断成大小更适合处理的核酸的基因组DNA。
用来检测甲基化CpG或CpNpG的含核酸的样本可以来自任何来源，并可以通过多种方法提取，例如Maniatis等描述的方法(MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY.，pp 280，281，1982)。
当样品中的核酸包含两条链，必须在其被修饰前分开核酸的这些链。链分离可以单独步骤或与化学处理同时进行而实现。链分离可以使用不同的适合的变性条件完成，包括物理的、化学的、或酶的方法，词“变性”包括所有这些意思。一个分离核酸链的物理方法包括加热所述核酸直到它变性。对DNA来说一般热变性可以包括温度范围从大约80到105℃，持续时间范围从大约1到10分钟。还可以通过称作解旋酶的酶类或通过具有解旋酶活性的酶RecA和在已知使DNA变性的riboATP存在的情况下诱导链分离。适于用解旋酶进行DNA链分离的反应条件描述于Kuhn Hoffmann-Berling(CSH-QuantitativeBiology，43：63，1978)和使用Rec A的技术综述于C.Radding(Ann.Rev.Genetics，16：405-437，1982).
可检测的标记物可以是化学发光的、荧光的或放射性的或包含微球体或纳米晶体形式的第二标记物或标识。荧光的或放射性的微球体或纳米晶体可以共价结合到捕捉或检测配体。
优选杂交到靶核酸的特异性用来区分甲基化胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶。
许多适合的结合到核酸并且其激发波长和发射波长不同的荧光染料是已知的，一些荧光染料对单链DNA是选择的。检测系统还可以是携带正电荷区域的酶，所述区域有选择地结合到DNA并且可以使用酶法分析检测，或带有正电荷的放射性分子的酶，所述分子有选择地结合到捕捉的DNA。适合的实体还可以是核/壳CdSe/ZnS半导体纳米晶体(Gerion等2002J Am Chem Soc 24：7070-7074)。
在该方法中使用INA探针作为配体之一与使用寡核苷酸或PNA探针相比具有非常显著的优点。INA结合更快达到平衡并显示更大的序列特异性，并且由于INAs携带一个或多个嵌入基团，它们比其他的配体例如寡核苷酸或PNAs以更高的结合系数结合靶DNA分子。结合特性可以通过选择不同数目的嵌入基团添加到INA而修饰。
由于本发明可以使用直接检测方法，该方法可以产生真实和精确的样品中靶核酸量的测量。所述方法没有被现有技术方法固有的潜在偏见影响，现有技术的方法依赖于例如PCR方法信号放大，其中通常用于此种方法的酶可以通过不同序列的扩增率的差别而引入系统偏离。
有许多检测器系统和仪器可用于检测或测量荧光或放射性。许多厂商正在进行设备的改进和提升。应当理解许多不同的量具能用于本发明。例如，多光子检测是检测极低量选择的放射性同位素的专有系统。它比现有方法灵敏1000倍。它的敏感性为1000个碘125原子，定量测定zeptomole量的生物材料。它需要小于1微微居里的同位素，这比一玻璃杯水中的活性少100倍。一类MPD仪器已经存在用于测量样品中的放射性。它们为配置用于96孔，384孔和更多孔的仪器。MPD使用与电脑控制电子设备结合的并发多路检测光子，以有选择地计数那些与操作者选择的放射性同位素相容的光子。由于能够使用多种不同的同位素，这是多色的系统。MPD图象系统比磷光图像灵敏100倍。这样的仪器在配体或支持物被制成是放射性的本发明的检测部分特别适合。
包含结合到其上的捕捉配体或检测配体的珠可以通过测量荧光的细胞分类器来加工或测量。例子或适合的仪器包括流式细胞仪和其改良形式。
根据本发明的方法特别适于按比例加大和自动化加工许多样品。
尽管如上所述，如果有必要扩增有限量的DNA以提供探测足够的检测材料，描述的方法可与这样的扩增方法联用。此外，PCR可被用来有选择地扩增已经用针对甲基化或未甲基化的核酸的INA配体捕捉的DNA。
甲基化的DNA：在本发明详述的特定的修改中，该方法可用于区别已经用亚硫酸氢钠处理的DNA中甲基化胞嘧啶的存在。由于胞嘧啶被转化为尿嘧啶而甲基胞嘧啶保持未反应，来自甲基化和未甲基化分子的亚硫酸氢盐处理的DNA序列是不同的。通过选择对选定的靶区域特异性的INA配体(4到100残基长度，优选20±10残基长度)，杂交的特异性可用于区分在CpG或CpNpG位点甲基化的胞嘧啶(其保持为胞嘧啶)和未甲基化的CpG或CpNpG位点甲基化的胞嘧啶，在未甲基化的CpG或CpNpG处胞嘧啶被转变为尿嘧啶，从而保证只估价其中不在CpG或CpNpG位点的胞嘧啶已经充分反应并被转变为尿嘧啶的分子。
可以类似地检测在其他位点的甲基化的胞嘧啶。合适的INA探针能被用作对照来鉴定与亚硫酸氢盐未完全反应的分子(一个或多个未被转变为尿嘧啶的胞嘧啶)的存在。然而应当理解，其他的可以区分DNA甲基化状态的配体可以相似的方式使用。
该方法适应用于多种形式包括多孔板，微阵列、光纤阵列和悬浮颗粒。合适选择供阵列形式使用的特异配体可以实现在多个靶区域同时确定单个胞嘧啶的甲基化状态。
多态性/突变和epimutation检测：根据本发明的方法可以用于区分基因的不同等位基因，其中捕捉配体和/或检测配体的序列将与一个等位基因匹配而与另一个不匹配。
DNA定量：通过使用本发明的方法，有可能直接确定DNA群体在特定的区域具有一个序列的分子对另一个序列的分子的比例。这可以通过将代表序列的替换形式的配体偶联到支持物上而完成，所述支持物例如不同颜色荧光染料的微球体、纳米晶体或放射性的分子、粒子和微量滴定板。这样的序列差异可以是基因原来碱基序列的差异或原始DNA甲基化差异引起的亚硫酸氢盐处理的DNA碱基顺序的差异。
细胞定量：该方法可以用于确定在群体(例如在癌细胞和正常细胞)中在基因组的特定位点碱基序列有差异的细胞的比例。
变异：该方法适应用于多种形式包括多孔板，微阵列、光纤阵列和悬浮颗粒。合适选择供阵列形式使用的特异INA探针可以实现同时测定不同的DNA序列的存在，例如，用于在多个靶区域确定单个胞嘧啶的甲基化状态。
整个说明书中，除非上下文另有需要，词“包括”或变体例如“包含”或“含有”，理解为暗示包含陈述的元件，整数或步骤，或元件、整数或步骤的组，然而并非排除任何其他的元件，整数或步骤，或元件、整数或步骤的组。
已经包括在本说明书内的任何文献、动作、材料、装置、物品等的讨论仅用于提供本发明背景的目的。由于其在该申请的各权利要求的优先权日期前在澳大利亚已经存在，并不等于承认这些事件的任何部分或全部形成与本发明有关领域的现有技术或公知常识。
为更清楚地了解本发明，优选的形式是参考以下的附图和实施例来描述。
附图简述
图1显示夹心INA信号放大。
图2显示使用磁珠或可检测的粒子的夹心INA信号放大技术。
图3显示使用抗体捕捉甲基化DNA的示意图。
图4显示使用微球体检测甲基化DNA的示意图。
图5显示使用微球体检测甲基化DNA的示意图。
图6显示当比较不接受抗体的基因组DNA样品与抗体捕捉的样品时提供的富集率的结果。
图7显示使用抗体捕捉多配体分析的非PCR信号放大的结果。结果显示使用下列：1.无抗体富集LNCaP DNA(甲基化DNA)，2.抗体富集的Du145DNA(未甲基化的DNA)和3.抗体富集的LNCaP DNA(甲基化DNA)获得的信号。
图8显示甲基化DNA检测和随后的扩增的示意图。
图9显示INA捕捉和PCR方法的琼脂糖凝胶图像。特异用于未甲基化的基因组DNA序列的INA配体被连接到磁珠上并与亚硫酸氢盐处理的基因组DNA混合。所述珠/DNA复合物被洗涤，结合的分子用作下游区域PCR的模板。泳道；标记，1，2，3。
泳道1：HepG2 DNA(已知在靶位点甲基化)，
泳道2：Du145 DNA(已知在靶位点未甲基化)，
泳道3：BL13 DNA(已知在靶位点未甲基化)。
图10显示INA针对未甲基化的DNA的特异性。该图显示DNA甲基化的百分比。
图11显示INA针对甲基化的DNA的特异性。该图显示DNA甲基化的百分比。
图12显示PNA、INA和寡核苷酸样品与合成的设计为GSTP1基因的甲基化区域的110bp寡核苷酸杂交产生的信号。该寡核苷酸按描述稀释然后标记并与样品杂交。由此可见，INA产生与PNA配体相似的信号强度，如果不比其强度高的话。
图13显示使用INAs和使用常规的寡核苷酸作对比的杂交结果。顶端两排信号使用INAs产生。底端两排信号使用常规的寡核苷酸产生。从结果可以清楚地看出使用INA配体产生品质更好的杂交信号。
发明的实施方式
定义
实验胚胎学/epigenomics/methylomics
对样品的核酸中5-甲基胞嘧啶残基的分析，样品来自全部生命周期阶段的人、动物、细菌(包括nanobacterial和细胞外的以及细胞内的细菌)和病毒，来自受精直到死后48小时的所有细胞、组织和器官，和分离自人组织、自体和非自体移植物、异种移植物的细胞(及细胞系)和它们的衍生物，以及来自冷冻的或(别的方式储存的)分割的或切除的来源、组织来源例如显微镜用载玻片的样品，嵌入在块或液体培养基中的样品，或提取自合成或天然的表面或液体的样品。
实验胚胎学/epigenomics/methylomics
包括健康个体的细胞、组织和器官(健康如WHO所定义)，以及患病个体的细胞、组织和器官之间天然产生的5-甲基胞嘧啶差异的分析(患病的概念包括参考Harrison内科学原理，12th版，Jean D Wilson等编辑，McGraw Hill Inc，及后续版本中所述或所指的全部人类疾病、痛苦、小毛病和异常症状，以及OMIM，Online Mendelian Inheritance inMan，www.ncbi.gov中描述的所有疾病、痛苦、小毛病和异常症状)，但重点是首位的致死因素，即恶性的赘生物、(癌)、缺血性心脏病、脑血管疾病、慢性阻塞性肺病、肺炎和流行性感冒、动脉疾病、(包括动脉粥样硬化和主动脉瘤)、糖尿病，和中枢神经系统疾病、加上社会性地衰弱症状，比如忧虑、压力有关神经精神病学症状和肥胖，和所有由异常染色体数或染色体重排、(包括常染色体和性染色体的非整倍性，在种系或体细胞条件下的重复、缺失、易位和插入)，以及相似的线粒体基因组异常引起的症状。
正常的或患病的个体可以来自，(a)不同种族和演化世系的群体(b)，菌株和地理分离株(c)，亚种，(d)相同或不同性别的孪生子或高级多胎，(e)来自正常的接合生殖方法、人工授精、胚胎干细胞方法克隆得到的个体，或核转移，(来自体细胞或种系的细胞核)，或通过细胞质的提出物或外缘因子修饰细胞或核，(转决定和转分化)，或来自输入或修饰线粒体或其他的细胞器得到的个体，(f)，来自转基因敲除、敲入或降低方法(在体内或是离体)，或通过基因活性被暂时或永久地改变的任何方法，例如通过RNAi、核糖酶、转位子活化、药物或小分子操作法、PNA、INA、AMA、AHA、等等或基于核酸的结合物，(包括然而并非局限于Trojan肽)改变得到的个体，或处于怀孕(正常的或异位的)任何阶段的个体。
实验胚胎学/epigenomics/methylomics
指来自以细胞外的或细胞内的方式与人类疾病相关的原核或真核生物和病毒(或其组合)的核酸中5-甲基胞嘧啶残基的分析，用于在正常变化的和患病的系统中确定和治疗地改变变化的参数和下列潜在机制的目的：
(i)遗传性疾病；
(ii)由环境诱导因子引起的非遗传的或后生的疾病，不管是生物学的或非生物学的来源，(环境的在这种意义上讲还包括有机体本身内部的环境，在怀孕的整个阶段期间，或在受精和不育处理的症状下)；
(iii)遗传的或非遗传性疾病的倾向，包括由“朊病毒”类因子，通过暴露到压力变化和失重、或通过辐射作用导致的疾病；
(iv)所有细胞类型、组织、器官系统和生物学网络在老化的过程中5-甲基胞嘧啶的改变，包括老化有关的抑郁症、疼痛、神经精神病学的和神经退行性的病症和绝经前后的病症，(包括在两性中生育力的降低)；
(v)在癌症(或由体细胞的核酸剂量改变而加强的疾病；包括具有异常染色体组型的细胞由于核酸扩增、删除、重排、易位和插入事件引起的改变)中5-甲基胞嘧啶的改变，以及在不同的细胞周期现象(包括细胞周期对昼夜节律、光周期、睡眠、记忆、和“时差综合症”的影响)中它们的变异或变化；
(vi)最广义定义的新陈代谢网络中5-甲基胞嘧啶的改变，来自通过胚胎发生的受精卵、胎儿的发育、出生、青春期、成人期以及老年期(包括通过组织缺氧、血缺氧、任何类型的辐射(不管是电离的或非电离的、或来自化疗处理、或暴露高纬度)、压力、或通过线粒体、细胞核或细胞器基因组之间的不平衡带来的代射影响；
(vii)由于在分子、细胞、组织、器官以及完整的有机体水平对蛋白、多肽、肽、以及DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA等或对肽适配子(包括任何具有翻译后添加，翻译后切割产物，翻译后修饰(例如inteins和exeins，泛素化产物和降解产物)的反应而产生的5-甲基胞嘧啶的改变；对含稀有的天然氨基酸的蛋白、多肽和肽，以及单个的稀有氨基酸例如与学习、脑的生长和细胞死亡相关的D-丝氨酸的反应而产生的改变；对药物、生物药剂、化学实体(此处化学实体和生物药剂的定义见于G.Ashton 2001，Nature Biotechnology 19，307-3111)，代谢产物、新的盐、前体药物、现有化合物的酯、疫苗、抗原、聚酮化合物、非核糖体肽、维生素和来自任何天然来源的分子(例如来自植物的环杷明(cyclopamine))的反应而产生的改变；
(viii)由于在分子、细胞、组织、器官和完整有机体水平对单链或双链RNA和DNA病毒的反应而产生的5-甲基胞嘧啶的改变，不管所述病毒来自外部来源还是内部活化的例如在内源的转座子或反转座子中活化，(SINES和LINES)；
(ix)由于在分子、细胞、组织、器官和完整有机体水平对RNA转录本的反转录拷贝的反应而产生的5-甲基胞嘧啶的改变，不管RNA转录本是基因的或非基因的来源，(或是否包含内含子)；
(x)由于在分子、细胞、组织、器官和完整有机体水平对下列物质的反应而产生的5-甲基胞嘧啶的改变：(a)DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA等等(或DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA、全部组合中的任意适配子)；包括在所有流体包括血液和脑脊髓液以及在怀孕之前、期间和之后母体流体中循环的DNA、RNA、PNA、INA、AMA、AHA等分子(b)结合的生物分子的组合，所述分子为肽和核酸的嵌合物；或天然分子例如胆固醇部分、激素和核酸的嵌合物，以及
(xi)由于干细胞，或使用最广义的perturbogen已经被(或正在被)的转决定或转分化的细胞(包括来自非人源例如两栖类卵母细胞、植物、动物、细菌或病毒来源、药物、抗体、或任何其混合物的perturbogen)的反应引起的5-甲基胞嘧啶的改变，沿着对任何其他已存在的或新的细胞类型的轨道，优选沿着至或来自干细胞的轨道，(或者在体内、离体或与新的环境或天然的以及合成基质或者其组合有关进行)。
核酸
术语“核酸”覆盖天然存在的核酸、DNA和RNA。术语“核酸类似物”包含天然存在的核酸、DNA和RNA的衍生物，以及天然存在的核酸的合成类似物。合成类似物包括一种或多种核苷酸类似物。术语核苷酸类似物包括全部能够被结合到核酸骨架和能够特异性碱基配对(见下文)，基本上类似于天然存在的核苷酸的核苷酸类似物。
因此术语“核酸”或“核酸类似物”表示任何基本上由多个核苷酸和/或核苷酸类似物和/或插入的假核苷酸组成的分子。对本发明有用核酸或核酸类似物可以包括许多具有不同的骨架单体单位的核苷酸。
优选地，单链核酸或核酸类似物能够与基本上互补的单链核酸和/或核酸类似物杂交以形成双链的核酸或核酸类似物。更优选这样的双链类似物能够形成双螺旋。优选地，双螺旋由氢键作用形成，更优选地，双螺旋选自A型、B型、Z型及其中间体的双螺旋。
因此，本发明有用的核酸和核酸类似物包括，但不局限于DNA、RNA、LNA、PNA、MNA、ANA、HNA、INA和其混合物与其杂交物，以及磷原子修饰的上述物质，例如而不是局限于硫代磷酸酯、甲基phospholates、亚磷酰胺、phosphorodithiates、phosphoroselenoates、磷酸三酯和phosphoboranoates。此外，非含磷化合物可以用来连接到核苷酸，例如而不是局限于甲基亚氨基甲基、formacetate、thioformacetate与包括酰胺的连接基团。特别是核酸与核酸类似物可以包括一种或多种插入的假核苷酸。
在上下文中，“混合物”指包括各种不同种的核苷酸或核苷酸类似物的核酸或核酸类似物链。此外，在上下文中，“杂交物”的意思包括含一条链的核酸或核酸类似物，该链包含具有一种或多种骨架的核苷酸或核苷酸类似物，和含另一个链，其包含具有不同种的骨架的核苷酸或核苷酸类似物。
INA是指按照WO 03/051901、WO 03/052132、WO 03/052133和WO 03/052134(Unest A/S)教导的嵌入核酸，上述专利在此引入作为参考。HNA是指如Van Aetschot等1995描述的核酸。MNA是指Hossain等，1998描述的核酸。ANA涉及Allert等，1999描述的核酸。LNA可以是WO 99/14226(Exiqon)描述的任何LNA分子，优选地，LNA选自WO 99/14226的摘要中描绘的分子。更优选地，LNA是指Singh等，1998，Koshkin等，1998或Obika等，1997描述的核酸。PNA是指Nielsen等，1991描述的肽核酸。
术语核苷酸指定核酸或核酸类似物的构件，而术语核苷酸包括天然存在的核苷酸和其衍生物以及能够完成与天然存在的核苷酸和其衍生物基本上相同的功能的核苷酸。天然存在的核苷酸包括含四种主要核碱基腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一的脱氧核糖核苷酸，和含四种核碱基腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)之一的核糖核苷酸。除了上述主要的或常用碱基，其他可以存在于一些核酸分子中的较少常用的天然存在的碱基包括5-甲基胞嘧啶(met-C)和6-甲基腺嘌呤(met-A)。
核苷酸类似物可以是任何能够结合到核酸骨架并能够特异性碱基配对的类似核苷酸的分子。非天然存在的核苷酸包括但不局限于下列物质中包含的核苷酸：DNA，RNA，PNA，INA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，α-L-核糖-LNA，α-L-木糖-LNA，β-D-木糖-LNA，α-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二环-DNA，6-氨基-二环-DNA，5-表-二环-DNA，α-二环-DNA，三环-DNA，二环[4.3.0]-DNA，二环[3.2.1]-DNA，二环[4.3.0]酰胺-DNA，β-D-核糖吡喃糖基-NA，α-L-来苏吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，α-L-RNA或α-D-RNA，β-D-RNA.
核苷酸和核苷酸类似物的功能是能够特异性与互补的核苷酸通过该互补核苷酸核碱基的氢键相互作用，以及能够结合至核酸或核酸类似物中。天然存在的核苷酸，以及一些核苷酸类似物能够通过酶作用结合至核酸或核酸类似物中，例如通过RNA或DNA聚合酶。然而，核苷酸或核苷酸类似物还可以通过化学方法结合至核酸或核酸类似物中。
此外，核酸或核酸类似物可以通过偶联两个小的核酸或核酸类似物到另一个上面而制备，例如这可通过酶法例如连接酶或通过化学法而完成。
核苷酸或核苷酸类似物包括骨架单体单位和核碱基。核碱基可以是天然存在的核碱基或其衍生物或其能够完成基本上相同功能的类似物。核碱基的功能是能够特异性地与一个或多个其他的核碱基通过氢键联合。因此核碱基的重要特征是它只能与一个或几个其他的核碱基形成稳定的氢键，但是不能与大多数其他的核碱基通常包括它本身形成稳定的氢键。一个核碱基与另一个核碱基的特异相互作用通常命名为“碱基配对”。
碱基配对在预先决定和互补的核苷酸之间产生特异的杂交。互补的核苷酸是包括能够碱基配对的核碱基的核苷酸。
在常用的天然存在的核碱基中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)配对；以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。因此，包含A的核苷酸与包含T或U的核苷酸互补，而包含G的核苷酸与含C的核苷酸互补。
核苷酸可以进一步被衍生化包含附加的分子实体。核苷酸可以在核碱基上或在单体单位的骨架上衍生。优选的在碱基上的衍生位点包括8-位腺嘌呤，5-位尿嘧啶，5-或6-位胞嘧啶，和7-位鸟嘌呤。杂环的修饰可以归为三种结构类型：增强的碱基堆积、附加的氢键作用、和这些类别的组合。通过扩展平面系统的π电子云增强碱基堆积的修饰由在嘧啶的5位和7-脱氮嘌呤的7-位上共轭的、亲脂性的修饰来表示。在嘧啶5-位修饰的置换包括丙炔、己炔、噻唑和只是甲基；7-位脱氮嘌呤的取代基包括碘、丙炔基、和氰基基团。还可能修饰胞嘧啶的5-位从丙炔到五元杂环和到三环稠合系统，其发源自4-和5-位(胞嘧啶箝位)。第二种杂环修饰由2-氨基-腺嘌呤代表，其中附加的氨基基团在A-T碱基对提供另一氢键，类似于G-C碱基对的三个氢键。提供组合效果的杂环修饰由2-氨基-7-脱氮-7-修饰的腺嘌呤和具有异源双链体的乙氧基氨基官能团的三环胞嘧啶类似物来代表。此外，N2-修饰的2-氨基腺嘌呤修饰的寡核苷酸是通常的修饰。在核糖或脱氧核糖部分上优选的衍生位点是非连接碳位置C-2’和C-4’修饰，连接碳C-1’，C-3’和C-5’的修饰，糖氧的置换、O-4’，脱水糖修饰(构象限制的)、环糖修饰(构象限制的)、核糖呋喃糖基环大小变化、糖到糖的连接位点、(C-3’到C-5’/C-2’到C-5’)，杂原子环修饰的糖以及上述修饰的组合。然而，其他位点可以衍生，只要核酸或核酸类似物的总体碱基配对特异性没有破坏。最后，如果骨架单体单位包括磷酸基，一些骨架单体单位的磷酸酯可被衍生化。
此处使用的寡核苷酸或寡核苷酸类似物是基本上由核苷酸和/或核苷酸类似物和/或嵌入假核苷酸的序列组成的分子。优选寡核苷酸或寡核苷酸类似物包含5到100个单独的核苷酸。寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以包括DNA、RNA、LNA、2’-O-甲基RNA、PNA、ANA、HNA和其混合物，以及任何其他的核苷酸和/或核苷酸类似物和/或嵌入假核苷酸。
对应的核酸
核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物当它们能够杂交被认为是对应的。优选对应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在低严格条件下杂交，更优选对应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在中等严格条件下杂交，更优选对应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够在高严格条件下杂交。
此处使用的高严格条件应该表示通常Southern印迹和杂交中所用的严格程度，如Southern E.M.，1975，J.Mol.Biol.98：503-517的描述。为此目的，常规的实践包括预杂交和杂交的步骤。这样的步骤通常使用含以下物质的溶液完成：6xSSPE，5％Denhardt’s，0.5％SDS，50％甲酰胺，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA(在42℃温育18小时)，随后用2×SSC和0.5％SDS(在室温和在37℃)洗涤，并用0.1×SSC和0.5％SDS洗涤(在68℃温育30分钟)，如Sambrook等.，1989，“Molecular Cloning/A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor)的描述，此处引入作为参考。
此处使用的中等严格条件应该表示在包含1mM EDTA、10mMNa2HPO4·H2O、140mM NaCl、pH7.0的缓冲液中杂交。优选地，提供大约1.5μm各核酸或核酸类似物链。替代的中等严格程度可以表示在包含50mM KCI，10mM TRIS-HCI(pH9.0)，0.1％Triton X-100，2mM MgCl2的缓冲液中的杂交。
低严格条件表示在1M NaCl、10mM Na3PO4、pH7.0的缓冲液中的杂交。
此外，对应的核酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸、核酸类似物、寡核苷酸或寡核苷酸在给定的序列基本上彼此互补，例如大于70％互补，例如大于75％互补，例如大于80％互补，例如大于85％互补，例如大于90％互补，例如大于92％互补，例如大于94％互补，例如大于95％互补，例如大于96％互补，例如大于97％互补。
优选给定的序列长至少10个核苷酸，例如至少15个核苷酸，例如至少20个核苷酸，例如至少25个核苷酸，例如至少30个核苷酸，例如10到500个核苷酸，例如10到100个核苷酸，例如10到50个核苷酸。更优选对应的核苷酸或核苷酸类似物基本上全长互补。
交叉杂交
术语交叉杂交包括在至少两个核酸或核酸类似物之间非所需的杂交。因此术语交叉杂交可以用来描述例如核酸探针或核酸类似物探针序列杂交到除其预定目标序列以外的其他的核酸序列或核酸类似物序列。
交叉杂交经常发生在探针和一个或多个对应的非靶序列之间，即使这些序列具有比探针和其对应的靶序列低的互补程度。这种不需要的效果起因于探针相对于靶大量过剩和/或迅速的退火动力学。交叉杂交还在少数核碱基之间通过氢键作用发生，例如在PCR反应的引物之间，导致形成引物二聚物和/或非特定的PCR产物。
包括一种或多种对同类型核苷酸类似物具有高亲合力的核苷酸类似物的核酸根据碱基配对趋向于形成二聚物或更高级复合物。包含核苷酸类似物例如但不局限于LNA、2’-O-甲基RNA和PNA的探针通常对包含同类型骨架单体单位的寡核苷酸类似物具有高亲合力。因此即使单独的探针分子只有低互补程度它们还是趋向于杂交。
自杂交
术语自杂交包括核酸或核酸类似物分子通过在其自身上折叠而退火到本身，产生例如发夹结构的二级结构的过程，或一个分子结合到另一相同的分子导致分子聚集的过程。在大多数应用中避免自杂交是非常重要的。此外，自杂交还可以增加本底信号和显著地降低分子生物学方法或分析的灵敏度。二级结构的产生可以抑制与所需的核酸靶序列的杂交。在大多数分析中，例如当核酸或核酸类似物被用作PCR反应的引物或作为核酸外切酶分析的荧光/猝灭剂标记的探针时，上述自杂交是不希望得到的。在两个分析中，自杂交将抑制杂交到靶核酸而且另外降低核酸外切酶分析中荧光团猝灭的程度。
包括一种或多种对同类型的核苷酸类似物具有高亲合力的核苷酸类似物的核酸趋向于自杂交。包含核苷酸类似物例如但不局限于LNA、2’-O-甲基RNA和PNA的探针通常具有自杂交高亲合力。因此即使单独的探针分子只具有低互补程度，它们还是趋向于自杂交。
解链温度
核酸的解链是指双链核酸分子两条链的分离。解链温度(Tm)表示存在50％螺旋状(杂交的)对比卷曲(未杂交的)形式时的摄氏温度。
高解链温度表示稳定的复合物和因此在单独的链之间具有高亲合力。类似地，低解链温度表现在单独的链之间相对低的亲合力。因此，通常在两条链之间强的氢键作用产生高解链温度。
此外，在双链核酸的核碱基之间插入嵌入剂还可以稳定双链核酸并因此产生高解链温度。
此外，解链温度取决于周围环境的物理/化学状态。例如解链温度取决于盐浓度和pH。
解链温度可以通过许多分析来确定，例如可以通过使用紫外光谱来确定杂交的形成和分解(解链)。
嵌入核酸(INA)或嵌入假核苷酸
本说明书中嵌入核酸(INA)还命名为嵌入假核苷酸。
假核苷酸或多核苷酸类似物包括嵌入剂并具有一个或多个以下合乎需要的特征：
在预定位置嵌入到双螺旋中；
I.大大增加对DNA的亲合力；
II.抑制或降低自杂交和交叉杂交；
III.区分不同的核酸，比如RNA和DNA；
IV.大大增加杂交的特异性；
V.增加核酸酶的稳定性；
VI.显著地增强链的侵入；
VII.显示杂交时荧光强度的变化。
嵌入假核苷酸具有下列通式结构：
X-Y-Q
其中
X是能够结合至核酸或核酸类似物骨架的骨架单体单位，
Q是包含至少一个基本上平面共轭系的嵌入剂，其能够与DNA的核碱基共堆积；以及
Y是连接骨架单体单位和嵌入剂的接头部分。
更优选嵌入假核苷酸具有下列通式结构：
X-Y-Q
其中
X是能够结合至通式核酸或核酸类似物的骨架的骨架单体单侍，
Figure A20048000791300361
其中n＝1到6
R1是三价或五价取代的磷原子，
R2分别选自能够形成至少两个键的原子，R2任选分别地取代，以及
R6是保护基；
Q是含至少一个基本上平面共轭系的嵌入剂，其能够与DNA的核碱基共堆积；以及
Y是连接骨架单体单位的任何R2和嵌入剂的接头部分；和其中Q和Y的总长度为大约
Figure A20048000791300362
到
Figure A20048000791300363
。
当嵌入剂是芘，例如，Q和Y的总长度为大约9到13，优选从大约9到11。
术语“结合至核酸或核酸类似物的骨架”是指嵌入假核苷酸可以被插入到核酸和/或核酸类似物序列中。
术语“平面共轭系”是指基本上全部包括在共轭系中的原子位于一个平面。
术语“基本平面共轭系”是指任何时候至多20％的所有包括在共轭系中的原子没有位于同一平面。
术语“共轭系”是指含有三个或更多个相邻原子的原子p轨道重叠的化学键的结构单位(Gold等，1987.Compendium of ChemicalTerminology，Blackwell Scientific Publications，Oxford，UK).
共堆积是共轴堆积的简略形式。共轴堆积是能量有利的结构，其中平面分子沿着堆积样机构中的共轴成行于彼此的上面(平面对着平面)。共堆积需要单独分子的两个π电子云之间的相互作用。就嵌入假核苷酸来说，与核碱基以双链体的形式共堆积，优选在相对的链上有π电子系统的相互作用，更优选在两条链上有π电子系统的相互作用。共堆积相互作用在分子间和分子内都有发现。例如核酸采用双链体结构以允许核碱基共堆积。
骨架单体单位
可以采用任何适合的骨架单体单位。骨架单体单位包括可以结合至寡核苷酸或寡核苷酸类似物骨架的部分嵌入假核苷酸。此外，骨架单体单位可以包括一个或多个离去基团、保护基和/或活性基团，其在包含骨架单体单位的寡核苷酸或寡核苷酸类似物合成期间或合成之后可以任何方式除去或改变。
术语‘骨架单体单位’只包括骨架单体单位本身，它不包括，例如，将骨架单体单位连接到嵌入剂的接头。因此，嵌入剂以及接头不是骨架单体单位的的一部分。
因此，骨架单体单位只包括选自下列原子，其中单体结合至序列中：
能够形成与相邻核苷酸的骨架单体单位连接的原子；或
至少在两个位点连接到其他原子的骨架单体单位的原子；或
在一个位点连接到骨架单体单位而不连接到其他原子的原子。
骨架单体单位原子因此被定义成当该单体结合至序列中时，该原子参与相邻核苷酸的骨架磷原子之间的直接连接(最短路径)，其中那相邻的核苷酸是天然存在的核苷酸。
骨架单体单位可以是任何适合的骨架单体单位。骨架单体单位可以例如选自下列骨架单体单位：DNA，RNA，PNA，INA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，α-L-核糖-LNA，α-L-木糖-LNA，β-D-木糖-LNA，α-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二环-DNA，6-氨基-二环-DNA，5-表-二环-DNA，α-二环-DNA，三环-DNA，二环[4.3.0]-DNA，二环[3.2.1]-DNA，二环[4.3.0]酰胺-DNA，β-D-核糖吡喃糖基-NA，α-L-来苏吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，α-L-RNA或α-D-RNA，β-D-RNA.
LNA(锁核酸)的骨架单体单位是空间限制的DNA骨架单体单位，其包括限制通常的DNA骨架单体单位构象自由度的分子内桥。LNA可以是任何WO 99/14226(Exiqon)描述的LNA分子。优选的LNA包括连接2’-O位置到4’-C位置的甲基接头，然而其他的LNA例如其中2’氧原子被氮或硫取代的LNA也包括在本发明之内。
嵌入假核苷酸的骨架单体单位优选在被结合至寡核苷酸和/或核苷酸类似物中时具有下列通式：
其中
n＝1到6，优选n＝2到6，更优选n＝3到6，更优选n＝2到5，更优选n＝3到5，更优选n＝3到4；
R1是三价或五价取代的磷原子，优选R1是
或
Figure A20048000791300393
其中R2可以分别选自能够形成至少两个键的原子，该原子任选分别地取代，优选R2分别选自O、S、N、C、P，任选分别地取代。术语“分别地”是指R2可以代表相同分子中一个、两个或更多不同的基团。在两个R2之间键可以饱和或不饱和或是环状系统的一部分或其组合。各R2可以分别用任何适合的取代基取代，例如选自H、低级烷基、C2-C6链烯基、C6-C10芳基、C7-C11芳甲基、C2-C7酰氧基甲基、C3-C8烷氧基羰氧基甲基、C7-C11aryloyloxymethyl、C3-C8S-酰基-2-硫乙基的取代基。
“烷基”基团是指任选取代的饱和的脂肪族烃、包括直链、支链和环状的烷基。优选地，烷基具有1到25个碳和包含不超过20个杂原子。更优选，它是1到12个碳低级烷基，更优选1到6碳，更优选1到4碳。杂原子优选选自氮、硫、磷和氧。
“链烯基”基团是指任选取代的含至少一个双键的碳氢化合物，包括直链、支链和环状的链烯基基团，所有这些基团都可以被任选取代。优选地，链烯基具有2到25个碳和包含不超过20个杂原子。更优选，它是2到12个碳的低级链烯基，更优选2到4个碳。杂原子优选选自氮、硫、磷和氧。
“炔基”基团是指任选取代的含至少一个三键的不饱和烃，包括直链、支链和环状的炔基基团，所有这些基团都可以被任选取代。优选地，炔基具有2到25个碳和包含不超过20个杂原子。更优选，它是2到12个碳的低级炔基，更优选2到4个碳。杂原子优选选自氮、硫、磷和氧。
“芳基”是指任选取代的具有至少一个带有共轭π电子系统的环的芳基，包括碳环芳基、杂环芳基、二芳基和三芳基基团。芳基置换取代基的例子包括烷基、链烯基、炔基、芳基、氨基、取代氨基、羧基、羟基、烷氧基、硝基、磺酰、卤素、硫醇和芳氧基。
“碳环芳基”是指芳环上所有的原子是碳原子的芳基。如上所述，芳基的碳原子被任选取代。优选地，碳环芳基是任选取代的苯基。
“杂环芳基”是指在芳环上具有1到3个杂原子作为环原子和其余的环原子是碳原子的芳基。适合的杂原子包括氧、硫，和氮。杂环芳基的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯、嘧啶基、吡嗪基、和咪唑基。杂环芳基的芳基如上所述被任选取代。
在两个或更多个R2上的取代基可以替代连接以形成环状系统，例如任何上述定义的环状系统。优选R2用选自H、甲基、R4、羟基、卤素和氨基的原子或基团取代，更优选R2用选自H、甲基、R4的原子或基团取代。更优选R2分别选自O、S、NH、N(Me)、N(R4)、C(R4)2、CH(R4)或CH2，其中R4定义如下。
R3是甲基、β-氰乙基、p-硝基乙氧苯基、o-氯苯基、或p-氯苯基。
R4是低级烷基，优选低级烷基例如甲基、乙基或异丙基、或杂环的例如吗啉代、吡咯烷基或2，2，6，6-四甲基吡咯烷基，其中低级烷基定义为C1-C6，例如C1-4。
R5是烷基、烷氧基、芳基或H，附带条件是当X2＝O-时R5是H，优选R5选自低级烷基、低级烷氧基、芳氧基。在优选方案中，芳氧基选自苯基、萘基或吡啶。
R6是保护基，选自任何适合的保护基。优选R6选自三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、2-氯三苯甲基、1，1，1，2-四氯-2，2-二(p-甲氧基苯基)-乙烷(DATE)、9-苯基黄嘌呤-9-基(pixyl)和9-(p-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)或其他在“Current Protocols In Nucleic Acid Chemistry”volume 1，Beaucage Wiley等中提及的保护基。更优选，保护基可以选自单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。最优选保护基可以是4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
R9选自O、S、N任选取代的，优选R9选自O、S、NH、N(Me)。
R10选自O、S、N、C、任选取代。
X1选自Cl、Br、I或N(R4)2。
X2选自Cl、Br、I、N(R4)2、或O-。
如上所述相对于取代基，骨架单体单位可以是非环状的或环状系统的一部分。
优选地，嵌入假核苷酸的骨架单体单位选自非环形的骨架单体单位。非环形的是指包括任何骨架单体单位，其不包括环状结构，例如骨架单体单位优选不包括核糖或脱氧核糖基团。
特别地，优选嵌入假核苷酸的骨架单体单位是非环形的骨架单体单位，其能够稳定凸出的插入物(定义如下)。
嵌入假核苷酸的骨架单体单位可以选自包括至少选自化学基团的骨架单体单位，所述化学基团选自三价和五价磷原子，例如五价磷原子。更优选，嵌入假核苷酸的骨架单体单位的磷酸酯原子可以选自包括至少一个选自下列化学基团的骨架单体单位：磷酸二酯、磷酸酯、氨基磷酸酯和亚磷酰胺基团。
优选的骨架单体单位包括至少一个选自下列的化学基团：磷酸、磷酸酯、磷酸二酯、氨基磷酸酯和亚磷酰胺基团，其中当该骨架单体单位结合至核酸骨架时，至少一个磷原子到相邻核苷酸的至少一个磷原子的距离，不包括该磷原子，为最大6原子长，例如2，例如3，例如4，例如5，例如6原子长。
优选骨架单体单位能够以某种方式结合至核酸或核酸类似物的磷酸酯骨架，以使至多5个原子(更优选至多4个)分开嵌入假核苷酸骨架单体单位的磷原子和最近邻的磷原子，更优选5个原子分开嵌入假核苷酸骨架单体单位的磷原子和最近邻磷原子，在两个情况下，不包括该磷原子本身。
在特别优选的形式中，所述嵌入假核苷酸包括含有亚磷酰胺的骨架单体单位，和更优选骨架单体单位包括三价的亚磷酰胺。适合的三价亚磷酰胺是可以结合至核酸和/或核酸类似物的骨架中的三价亚磷酰胺。通常，amidit基团可以不结合至核酸的骨架中，而是amidit基团或amidit基团的一部分可以作为离去基团和/或保护基。然而，优选骨架单体单位包括亚磷酰胺基团，因为这样的基团可以促进骨架单体单位掺入到核酸骨架中。
被插入到寡核苷酸或寡核苷酸类似物中的嵌入假核苷酸的骨架单体单位可以包括磷酸二酯键。另外，嵌入假核苷酸的骨架单体单位可以包括五价的氨基磷酸酯。优选嵌入假核苷酸的骨架单体单位是非环形的骨架单体单位，后者可以包括五价的氨基磷酸酯。
离去基团
骨架单体单位可以包括一个或多个离去基团。离去基团是化学基团，当嵌入假核苷酸或核苷酸是单体时其是骨架单体单位的一部分，但只要嵌入假核苷酸或核苷酸已经结合至寡核苷酸或寡核苷酸类似物，则其不再存在于分子中。
离去基团的性质依赖于骨架单体单位。例如，当骨架单体单位是磷amidit，离去基团可以，例如是二异丙胺基团。通常，当骨架单体单位是磷amidit，离去基团例如以二异丙胺的形式附于磷原子上，并且离去基团在偶联磷原子到亲核基团时被除去，而余下的磷酸基或其一部分可以变成核酸或核酸类似物骨架的一部分。
反应基团
此外，骨架单体单位可以包括能够与另一核苷酸或寡核苷酸或核酸或核酸类似物进行化学反应形成核酸或核酸类似物的活性基团，反应后得到的产物比在反应前长一个核苷酸。因此，当核苷酸处于它们的游离态，即未结合至核酸时，它们可以包括能够与另一核苷酸或核酸或核酸类似物反应的反应基团。
该反应基团可以通过保护基而被保护。在该化学反应前，该保护基可以除去。从而保护基将不是新形成的核酸或核酸类似物的一部分。反应基团的例子是亲核试剂，例如DNA或RNA骨架单体单位的5’-羟基。
保护基团
骨架单体单位还可以包括在合成期间除去的保护基团。除去该保护基可以实现在嵌入假核苷酸和核苷酸或核苷酸类似物或另一个嵌入假核苷酸之间的化学反应。
特别是，核苷酸单体或核苷酸类似物单体或嵌入假核苷酸单体可以包含保护基，但只要核苷酸或核苷酸类似物或嵌入假核苷酸已经结合至核酸或核酸类似物，则该保护基不再存在于分子中。此外，骨架单体单位可以包括在掺入核苷酸或核苷酸类似物或嵌入假核苷酸之后存在于寡核苷酸或寡核苷酸类似物的保护基，但保护基在向寡核苷酸或寡核苷酸类似物引入另外的核苷酸或核苷酸类似物以后可以不再存在，或者保护基可以在全部的寡核苷酸或寡核苷酸类似物合成以后除去。
保护基可以通过众多本技术领域专业人员所知的适合的技术除去。优选地，保护基可以通过选自下列的处理除去：酸处理、苯硫酚处理和碱处理。
用来保护骨架单体单位的5’末端或5’末端类似物的优选保护基可以选自：三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、2-氯三苯甲基、1，1，1，2-四氯-2，2-二(p-甲氧基苯基)-乙烷(DATE)、9-苯基黄嘌呤-9-基(pixyl)和9-p-甲氧基苯基)黄嘌呤-9-基(MOX)或其他的在“Current Protocols InNucleic Acid Chemistry”volume 1，Beaucage Wiley等提到的保护基。更优选保护基可以选自单甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。最优选保护基可以是4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。4，4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)基团可以通过酸处理，例如通过在3％三氯乙酸或在3％二氯乙酸的CH2Cl2中短暂保温(30到60秒为足够)处理而除去。
保护骨架单体单位的磷酸酯或亚磷酰胺基团的优选保护基可以例如选自甲基和2-氰乙基。甲基保护基可以例如通过用苯硫酚或2-氨基甲酰2-丙烯腈-1，1-二硫羟酸二钠处理而除去。2-氰乙基基团可以通过碱处理，例如用浓氨水、1∶1含水甲胺和浓氨水或用氨气处理而除去。
嵌入剂
术语嵌入剂覆盖任何包含至少一个基本平面共轭系的分子部分，所述平面共轭系能够与核酸的核碱基共同堆积。优选嵌入剂由至少一个能够与核酸或核酸类似物的核碱基共同堆积的基本平面共轭系组成。
优选嵌入剂包括选自下列的化学基团：多芳香物质或杂多芳香物质，更优选所述嵌入剂基本上由多芳香物质或杂多芳香物质组成。最优选，嵌入剂选自多芳香物质和杂多芳香物质。
多芳香物质或杂多芳香物质可以由任意合适数目的环组成，例如1个，例如2个，例如3个，例如4个，例如5个，例如6个，例如7个，例如8个，例如超过8个。此外，多芳香物质和杂多芳香物质可以用一种或多种选自下列基团取代：羟基、溴、氟、氯、碘、巯基、硫代、氰基、烷基硫代、杂环、芳基、杂芳基、羧基、carboalkoyl、烷基、链烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基和氨基。
在一个优选的形式，嵌入剂可以选自能够发荧光的多芳香物质和杂多芳香物质。
在另一个更优选的形式，该嵌入剂可以选自能够形成激发二聚体、激态复合物、荧光共振能量传递(FRET)或电荷转移复合物的多芳香物质和杂多芳香物质。
因此，嵌入剂可以优选选自下列基团：菲咯啉、吩嗪、菲啶、蒽醌、芘、蒽、环烷烃(napthene)、菲、二萘品苯、、并四苯、吖啶酮、苯并蒽、二苯乙烯、乙二酸一酰基吡啶瞳巴唑、叠氮苯、卟啉、补骨脂素和任何用一种或多种下列基团取代的上述嵌入剂：羟基、溴、氟、氯、碘、巯基、硫代、氰基、烷基硫代、杂环、芳基、杂芳基、羧基、carboalkoyl、烷基、链烯基、炔基、硝基、氨基、烷氧基和/或氨基。
优选嵌入剂选自下列基团：菲咯啉、吩嗪、菲啶、蒽醌、芘、蒽、环烷烃、菲、二萘品苯、、并四苯、吖啶酮、苯并蒽、1-2-二苯乙烯、乙二酸一酰基吡啶瞳巴唑、叠氮苯、卟啉和补骨脂素。
嵌入剂的例子不应被理解为以任何方式的限制，而是只提供用作嵌入剂的可能结构的例子。此外，还包括在各嵌入剂上一个或多个化学基团的置换获得修饰的结构。
嵌入假核苷酸的嵌入部分通过接头连接到骨架单位。当从骨架沿着接头走到嵌入部分时，接头和嵌入剂连接定义为接头原子和共轭系部分第一个原子之间的键，当寡核苷酸或寡核苷酸类似物杂交到包括所述嵌入假核苷酸的寡核苷酸类似物时，该键能与寡核苷酸或寡核苷酸类似物链的核碱基共同堆积。
该接头可以包括共轭系和该嵌入剂可以包括另一个共轭系。在这种情况下，接头共轭系不能够与相对的寡核苷酸或寡核苷酸类似物链的核碱基共同堆积。
接头
嵌入假核苷酸的接头是连接嵌入剂和嵌入假核苷酸的骨架单体的部分。接头可以在原子之间包括一个或多个原子或键。
通过此处定义的骨架和插入部分的定义，接头是连接骨架和嵌入剂的最短路径。如果嵌入剂直接连接到骨架，所述接头是键。接头通常由一连串原子或原子的支链组成。链可以是饱和和不饱和的。接头还可以是有或者没有共轭键的环状结构。例如，接头可以包括一连串m个选自C、O、S、N、P，Se，Si，Ge，Sn和Pb原子，其中链一端连接到嵌入剂而链另一个端连接到骨架单体单位。
接头和嵌入假核苷酸的嵌入剂的总长度优选在8和13A之间。因此，m应该根据具体的嵌入假核苷酸的嵌入剂的大小来选择。也就是说，当嵌入剂小时m应该相对大而当嵌入剂大时m应该相对小。然而为大多数目的，m为从1到7的整数，例如从1到6，例如从1到5，例如来自1到4。如上所述，接头可以是不饱和的链或另一个包含共轭键的系统。例如，接头可以包括环状的共轭结构。优选地，当接头是饱和链时m从1到4。
当嵌入剂为芘时，m优选为从1到7的整数，例如从1到6，例如从1到5，例如从1到4，更优选从1到4，更优选从1到3，最优选m是2或3。
当嵌入剂具有如下结构
Figure A20048000791300471
m优选从2到6，更优选2。
链接头可以用一种或多种下列原子取代：C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb。
在一种形式中，接头是氮杂烷基、氧杂烷基、硫代烷基或烷基链。例如，接头可以是用一个或多个选自下列原子：C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb取代的烷基链。在优选实施方案中，接头由不分枝的烷基链组成，其中链的一端连接到嵌入剂而链的另一端连接到骨架单体单位，其中每个C用2个H取代。更优选，不分枝的烷基链为1到5个原子长，例如从1到4个原子长，例如从1到3个原子长，例如从2到3个原子长。
在另一个形式中，接头是包含选自下列原子：C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb的环状结构。例如接头可以是用一种或多种选自下列原子C、H、O、S、N、P、Se、Si、Ge、Sn和Pb取代的环状结构。
在另一个形式中，该接头由1到6个C原子、0到3个O、S、N原子组成。更优选，该接头由1到6个C原子和0到1个O、S和N原子组成。在优选的形式中，接头由一连串C、O、S和N原子组成，任选被取代。优选地，链应该由至多3个原子组成，从而包括0到3个分别选自下列的原子：C、O、S、N，任选被取代。
在优选形式中，接头由一连串C、N、S和O原子组成，其中链的一端连接到嵌入剂而链的另一端连接到骨架单体单位。
接头构成上述定义的嵌入假核苷酸通式X-Y-Q中的Y，由此X和Q不是接头的一部分。
嵌入假核苷酸
嵌入假核苷酸或INA分子优选具有通式结构
X-Y-Q
其中
X是能够结合至核酸或核酸类似物骨架的骨架单体单位；
Q是包括至少一个基本上平面共轭系的嵌入剂，所述共轭系能够与核酸的核碱基共同堆积；和
Y是连接骨架单体单位和嵌入剂的接头部分；其中Q和Y的总长度为大约7到20。
此外，在本发明的优选实施方案中，嵌入假核苷酸包括骨架单体单位，其中骨架单体单位能够以某种方式结合至核酸或核酸类似物的磷酸酯骨架，以便至多4个原子分开最接近于嵌入剂的骨架的两个磷原子。
嵌入假核苷酸优选不包括能够形成Watson-Crick氢键作用的核碱基。因此嵌入假核苷酸优选不能够Watson-Crick碱基配对。
优选Q和Y的总长度从大约7到20，更优选，从大约8到15，更优选从大约8到13，更优选从大约8.4到12，最优选从大约8.59到10或从大约8.4到10.5。
例如当嵌入剂为芘，Q和Y的总长度优选从大约8到13，例如从大约9到13，更优选从大约9.05到11，例如从大约9.0到11，更优选从大约9.05到10，例如从大约9.0到10，最优选大约9.8。
接头(Y)和嵌入剂(Q)的总长度应该通过确定从接头离嵌入剂最远的非氢原子中心到嵌入剂离骨架单体单位最远的基本平面共轭系的非氢原子中心的距离而确定。优选距离应该是不以任何方式破坏或扭曲键角和正常的化学规律的最大距离。
距离应该优选通过计算具有最低构象能水平的自由嵌入假核苷酸的结构来测定，然后确定从接头离嵌入剂最远的非氢原子中心到嵌入剂离骨架单体单位最远的基本平面共轭系的非氢原子中心可能的最大距离，无需比可自由旋转的键(如非双键或参与环状结构的键)的简单旋转更多的弯折、拉伸或其他的扭曲结构。优选通过从头开始或力场计算发现能量有利的结构。
距离可以通过由以下步骤组成的方法确定：
目的嵌入假核苷酸结构通过电脑使用ChemWindow6.0程序(BioRad)绘制；
所述结构转入到计算机程序SymAppsTM(BioRad)；
使用计算机程序SymAppsTM(BioRad)计算包括嵌入假核苷酸的键长度和成键角的3-维结构；
该3维结构被转入计算机程序RasWin Molecular Graphics Ver2.6-ucb；
使用RasWin Molecular Graphics Ver.2.6-ucb旋转键获得最大的距离(距离如上述定义)；以及
确定所述距离。
嵌入假核苷酸可以是上述的骨架单体单位、接头和嵌入剂的任何组合。
在另一个优选的形式中，嵌入假核苷酸选自下列基团：1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。更优选，嵌入假核苷酸选自(S)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺和(R)-1-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-芘甲基氧基-2-丙醇的亚磷酰胺。
嵌入假核苷酸的制备
嵌入假核苷酸或INA分子可以通过任何适合的方法合成。一个适合的方法包括步骤：
a1)提供含有嵌入剂的化合物，所述嵌入剂包括至少一个能够与核酸的核碱基共同堆积的基本平面共轭系，和任选包括连接到反应基团的接头部分；
b1)提供包括至少两个反应基团的接头前体分子，该两个反应基团可以任选被分别地保护；和
c1)将嵌入剂与接头前体反应从而获得嵌入剂-接头；
d1)提供包括至少两个反应基团的骨架单体前体单位，该两个反应基团可以任选被分别地保护和/或掩蔽并任选包括接头部分；和
e1)将嵌入剂-接头与骨架单体前体前体反应从而获得嵌入剂-接头-骨架单体前体；
或
a2)提供包括至少两个反应基团的骨架单体前体单位，该两个反应基团可以任选被分别地保护和/或掩蔽并任选包括接头部分；和
b2)提供包括至少两个反应基团的接头前体分子，该两个反应基团可以任选被分别地保护；
c2)将单体前体单位与接头前体反应从而获得骨架-接头；
d2)提供含有嵌入剂的化合物，所述嵌入剂包括至少一个能够与核酸的核碱基共同堆积的基本平面共轭系，和任选包括连接到反应基团的接头部分；和
e2)将嵌入剂与骨架-接头反应从而获得嵌入剂-接头-骨架单体前体；
或
a3)提供含有嵌入剂的化合物，所述嵌入剂包括至少一个能够与核酸的核碱基共同堆积的基本平面共轭系，和连接到反应基团的接头部分；
b3)提供包括至少两个反应基团的骨架单体前体单位，该两个反应基团可以任选被分别地保护和/或掩蔽，和包括接头部分；
c3)将嵌入剂-接头部分与骨架单体前体一接头反应从而获得嵌入剂-接头-骨架单体前体；
f)任选保护和/或去保护该嵌入剂-接头-骨架单体前体；
g)提供能够将两个假核苷酸、核苷酸和/或核苷酸类似物连接在一起的含磷化合物；
h)将含磷化合物与嵌入剂-接头-骨架单体前体反应；和
i)获得嵌入假核苷酸。
优选地，选择嵌入剂反应基团以便它可以与接头反应基团反应。因此，如果接头反应基团是亲核试剂，则优选嵌入剂反应基团是亲电子试剂，更优选选自下列基团的亲电子试剂：卤烷基、甲磺酰氧基烷基和甲苯磺酰氧基烷基。更优选嵌入剂反应基团是氯甲基。此外，该嵌入剂反应基团可以是例如包括羟基、巯基、selam、胺或其混合物的亲核基团。
优选地，环状或非环状的链烷可以是包括至少三个接头反应基团的多取代链烷或烷氧基。更优选该多取代链烷包括三个亲核基团，例如而非局限于，链烷三醇、氨基链烷二醇或巯基链烷二醇。优选多取代链烷包含一个反应性比其它基团强的亲核基团，或者两个所述亲核基团可以通过保护基保护。更优选环状或非环状的链烷是2，2-二甲基-4-甲基羟基-1，3-dioxalan，更优选链烷是D-α，β-异亚丙基甘油。
优选地，接头反应基团应能与嵌入剂反应基团反应，例如接头反应基团可以是亲核基团，例如选自羟基、巯基、selam和胺，优选羟基。或者所述接头反应基团可以是亲电子基团，例如选自卤素、triflates、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯的基团。在优选的形式中，至少2个接头反应基团可以被保护基保护。
该方法可以进一步包括连接保护基到嵌入剂-前体单体的一个或多个反应基团的步骤。例如，DMT基团可以通过提供连接到卤素，例如Cl的DMT并将DMT-Cl与至少一个接头反应基团反应而添加。因此，优选至少一个接头反应基团是可利用的并且一个是保护的。如果该步骤在与含磷试剂反应前完成，则含磷试剂可以只与一个接头反应基团相互作用。
含磷试剂可以例如是亚磷酰胺，例如NC(CH2)2OP(Npri 2)2或NC(CH2)2OP(Npri 2)Cl。优选含磷试剂可以与嵌入剂-前体在存在碱的情况下起反应，所述碱例如N(et)3、N(‘pr)2Et和CH2Cl2。
嵌入假核苷酸合成方法的一个具体例子在实施例1和图7中概述。
一旦确定了寡核苷酸或寡核苷酸类似物合适的序列，它们优选使用可商购的方法和设备通过化学法合成。例如，固相亚磷酰胺方法可用于生产包括嵌入假核苷酸的短寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
例如寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以通过任一在“CurrentProtocols in Nucleic acid Chemistry”Volume 1，Beaucage Wiley等中描述的方法合成。
含嵌入假核苷酸的寡核苷酸
合成核酸对靶核酸的高亲合力可以大大便利检测分析，此外对靶核酸具有高亲合力的合成核酸可以用于大量其他的目的，例如基因靶向和核酸纯化。含嵌入剂的寡核苷酸或寡核苷酸类似物已经显示增加对同源互补核酸的亲合力。
当由寡核苷酸或寡核苷酸类似物与同源互补DNA组成的杂交物(DNA杂交物)的解链温度比由相同核苷酸序列组成的缺乏嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物作为寡核苷酸或寡核苷酸类似物和同源的互补DNA之间的杂交物(对应的DNA杂交物)的解链温度显著高时，可以生产含至少一个嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物。
优选地，DNA杂交物的解链温度比对应的DNA杂交物高从1到80℃，更优选至少2℃，更优选至少5℃，更优选至少10℃。
寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以具有至少一个内部嵌入假核苷酸。在内部安置嵌入剂单位可以实现设计上更大的柔性。含内部安置嵌入假核苷酸的核酸类似物从而可以比内部不安置嵌入假核苷酸的核酸类似物对同源互补核酸具有更高的亲合力。包含至少一个内部嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物还能区分RNA(包括RNA样的核酸类似物)和DNA(包括DNA样的核酸类似物)。此外内部安置的荧光嵌入单体可以用作诊断工具。
嵌入假核苷酸可以放置在给定的寡核苷酸或寡核苷酸类似物内任何合乎需要的位置。例如，嵌入假核苷酸可以放置在寡核苷酸或寡核苷酸类似物的末端，或嵌入假核苷酸可以放置在寡核苷酸或寡核苷酸类似物的内部位置。
当寡核苷酸或寡核苷酸类似物包括超过1个嵌入假核苷酸时，嵌入假核苷酸可以放置在彼此相关的任何位置。例如，它们可以彼此紧挨着放置，或者它们可以如此放置以使1个，例如2个，例如3个，例如4个，例如5个，例如超过5个核苷酸分开嵌入假核苷酸。在一个优选实施方案中，在寡核苷酸或者寡核苷酸类似物内的两个嵌入假核苷酸相邻地放置，即它们可以放置在寡核苷酸或者寡核苷酸类似物内任何位置，只要1个核苷酸分开该两个嵌入假核苷酸。在另一个优选的形式，两个嵌入剂分别放置于寡核苷酸或者寡核苷酸类似物的各末端或非常接近于各末端。
寡核苷酸或者寡核苷酸类似物可以包括任何类型的核苷酸和/或核苷酸类似物，例如此处上述的核苷酸和/或核苷酸类似物。例如，寡核苷酸或者寡核苷酸类似物可以包括包含在DNA、RNA、LNA、PNA、ANA INA、和HNA内的核苷酸和/或核苷酸类似物。因此，寡核苷酸或者寡核苷酸类似物可以包括一个或多个下列亚基：PNA，同型-DNA，b-D-阿卓吡喃糖基-NA，b-D-葡糖吡喃糖基-NA，b-D-异吡喃糖基-NA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，□-L-核糖-LNA，□-L-木糖-LNA，□-D-木糖-LNA，□-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二环-DNA，6-氨基-二环-DNA，5-表-二环-DNA，□-二环-DNA，三环-DNA，二环[4.3.0]-DNA，二环[3.2.1]-DNA，二环[4.3.0]酰胺-DNA，□-D-核糖吡喃糖基-NA，□-L-来苏吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，2’-OR-RNA，□-L-RNA，α-D-RNA，β-D-RNA，即寡核苷酸类似物可以选自PNA，同型-DNA，b-D-阿卓吡喃糖基-NA，b-D-葡糖吡喃糖基-NA，b-D-异吡喃糖基-NA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，□-L-核糖-LNA，□-L-木糖-LNA，□-D-木糖-LNA，□-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二环-DNA，6-氨基-二环-DNA，5-表-二环-DNA，□-二环-DNA，三环-DNA，二环[4.3.0]-DNA，二环[3.2.1]-DNA，二环[4.3.0]酰胺-DNA，□-D-核糖吡喃糖基-NA，□-L-来苏吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，2’-OR-RNA，□-L-RNA，α-D-RNA，β-D-RNA及其混合物。
寡核苷酸或者寡核苷酸类似物的一个优点是由寡核苷酸或者寡核苷酸类似物组成的包括至少一个嵌入假核苷酸与基本互补DNA的杂交物(DNA杂交物)的解链温度比由基本互补DNA和其互补的DNA组成的双链体的解链温度显著地高。
因此，寡核苷酸或者寡核苷酸类似物可以比天然存在的核酸以更高的亲合力与DNA形成杂交物。解链温度优选提高2到30℃，例如从5到20℃，例如从10℃到15℃，例如从2℃到5℃，例如从5℃到10℃，例如从15℃到20℃，例如从20℃到25℃，例如从25℃到30℃，例如从30℃，到35℃，例如从35℃到40℃，例如从40℃到45℃，例如从45℃到50℃。
特别是，解链温度的增加可以由于嵌入剂的插入而获得，因为插入可以稳定DNA双链体。因此，优选嵌入剂能够在DNA的核碱基之间插入。优选地，嵌入假核苷酸在双链体中以凸出插入物或者末端插入物放置(见下文)，所述嵌入假核苷酸在一些核酸或者核酸类似物中可以允许嵌入。
包含至少一个嵌入假核苷酸和基本互补RNA(RNA杂交物)或者RNA样核酸类似物(RNA样杂交物)的寡核苷酸或者寡核苷酸类似物的解链温度，可以比由基本互补RNA或者RNA样靶和不包含嵌入假核苷酸的寡核苷酸类似物组成的双链体的解链温度显著地高。优选寡核苷酸或者寡核苷酸类似物的大多数或所有嵌入假核苷酸安置于一端或两端。
因此，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物可以与RNA或者RNA样核酸类似物或者RNA样寡核苷酸类似物以比天然存在的核酸更高的亲合力形成杂交物。解链温度优选提高2到20℃，例如从5到15℃，例如从10℃到15℃，例如从2℃到5℃，例如从5℃到10℃，例如从15℃到20℃或更多。
当安置在寡核苷酸或者寡核苷酸类似物的末端时，嵌入假核苷酸优选只稳定RNA和RNA样靶。然而这不排除在待与RNA或者RNA样核酸类似物杂交的寡核苷酸或者寡核苷酸类似物中安置嵌入假核苷酸，以使嵌入假核苷酸位于形成的杂交物的内部区域。这样做的目的是可以获得某些杂交不稳定性或者影响杂交后形成的分子内和分子间复合物的总体二维或者三维结构。
包含一个或多个嵌入假核苷酸的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物可以形成三条链的结构(三链体结构)，所述三链体结构由通过Hoogsteen碱基配对结合到同源互补的核酸或者核酸类似物或者寡核苷酸或者寡核苷酸类似物的寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物组成。寡核苷酸或者寡核苷酸类似物可以提高三链体结构的Hoogsteen碱基配对的解链温度。
寡核苷酸或者寡核苷酸类似物可以不依赖于特殊序列限制如嘌呤富集/嘧啶富集的核酸或者核酸类似物双链体靶序列的存在的方式，而提高三链体结构中Hoogsteen碱基配对的解链温度。因此，三链体结构中的Hoogsteen碱基配对具有比双链体靶的Hoogsteen碱基配对显著地高的解链温度，如果该寡核苷酸或者寡核苷酸类似物没有嵌入假核苷酸的话。
因此，寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物与同源互补的核酸或核酸类似物或寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以以比天然存在的核酸更高的亲合力形成三链体结构。解链温度优选可以提高2到50℃，例如从2到40℃，例如从2到30℃，例如从5到20℃，例如从10℃到15℃，例如从2℃到5℃，例如从5℃到10℃，例如从10℃到15℃，例如从15℃到20℃，例如从20℃到25℃，例如从25℃到30℃，例如从30℃到35℃，例如从35℃到40℃，例如从40℃到45℃，例如从45℃到50℃。
特别是，解链温度的增加可以由于嵌入剂的插入而获得，因为插入可以稳定DNA三链体。因此，优选嵌入剂能够在三链体结构的核碱基之间插入。优选地，嵌入假核苷酸在双链体中以凸出插入物或者末端插入物放置(见下文)，所述嵌入假核苷酸在一些核酸或者核酸类似物中可以允许插入。
三链体的形成可以或可以不在链侵入时进行，该方法中Hoogsteen碱基配对的第三链侵入靶双链体并替换部分或所有相同的链以与互补链形成Watson-Crick碱基对。这可以被开发用于若干目的。只要存在双链的核酸或核酸类似物靶，寡核苷酸和寡核苷酸可以合适地使用，并且不可能、可行或设想要分开靶链，通过区域的单链侵入或互补区域的双链侵入检测，无需事先解链双链的核酸或核酸类似物靶，用于三链体形成和/或链侵入。因此，提供包含至少一个嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其能够侵入核酸或核酸类似物分子的双链区域。
提供包含至少一个嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其能以序列特异性的方式侵入双链核酸或核酸类似物。包含至少一个嵌入假核苷酸的侵入寡核苷酸和/或寡核苷酸类似物将以序列特异性的方式以比替换的链更高的亲和力结合到互补链。
包含至少一个嵌入假核苷酸和同源互补DNA的寡核苷酸类似物组成的杂交物(DNA杂交物)的解链温度，通常比由寡核苷酸或寡核苷酸类似物和同源互补RNA或RNA样核酸类似物靶或RNA-样寡核苷酸类似物靶组成的杂交物(RNA杂交物)的解链温度显著地高。该寡核苷酸可以是上述任何寡核苷酸类似物。例如，寡核苷酸可以是含至少一个嵌入假核苷酸的DNA寡核苷酸(类似物)或包含至少一个嵌入假核苷酸的下列寡核苷酸或其混合物：同型-DNA，b-D-阿卓吡喃糖基-NA，b-D-葡糖吡喃糖基-NA，b-D-异吡喃糖基-NA，HNA，MNA，ANA，LNA，CNA，CeNA，TNA，(2’-NH)-TNA，(3’-NH)-TNA，□-L-核糖-LNA，□-L-木糖-LNA，□-D-木糖-LNA，□-D-核糖-LNA，[3.2.1]-LNA，二环-DNA，6-氨基-二环-DNA，5-表-二环-DNA，□-二环-DNA，三环-DNA，二环[4.3.0]-DNA，二环[3.2.1]-DNA，二环[4.3.0]酰胺-DNA，□-D-核糖吡喃糖基-NA，□-L-来苏吡喃糖基-NA，2’-R-RNA，2’-OR-RNA，□-L-RNA，α-D-RNA，β-D-RNA。
因此，寡核苷酸或寡核苷酸类似物对DNA的亲合力比寡核苷酸或寡核苷酸类似物对RNA或RNA样靶的亲合力显著地高。因此在包含有限数量的寡核苷酸或寡核苷酸类似物和同源互补DNA和同源互补RNA或同源互补RNA样靶的混合物中，寡核苷酸或寡核苷酸类似物优选杂交到同源互补DNA。
优选地，DNA杂交物的解链温度比同源互补RNA或RNA样杂交物的解链温度高至少2℃，例如高至少5℃，例如至少10℃，如至少15℃，例如至少20℃，如至少25℃，例如至少30℃，如至少35℃，例如至少40℃，例如从2至30℃，例如从5至20℃，例如从10℃至15℃，例如从2℃至5℃，例如从5℃至10℃，例如从10℃至15℃，例如从15℃至20℃，例如从20℃至25℃，例如从25℃至30℃，例如从30℃至35℃，例如从35℃至40℃，例如从40℃至45℃，例如从45℃至50℃，例如从50℃至55℃，例如从55℃至60℃。
包含至少一个嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以杂交到核酸或核酸类似物的二级结构。寡核苷酸或寡核苷酸类似物能够稳定这种对二级结构的杂交。二级结构可以是但不局限于茎环结构、Faraday接合、回折、H结、和凸出。二级结构可以是RNA的茎环结构，其中包括至少一个嵌入假核苷酸的寡核苷酸或寡核苷酸类似物的设计方式使嵌入假核苷酸在三个以三通方式连接形成的双链体之一的末端在所述二级结构和寡核苷酸寡核苷酸类似物之间杂交。
嵌入假核苷酸的位置
寡核苷酸或寡核苷酸类似物设计的方式使其可以杂交到同源互补核酸或核酸类似物(靶核酸)。优选寡核苷酸或寡核苷酸类似物可以基本上互补到该靶核酸。更优选，至少一个嵌入假核苷酸被安置以便当寡核苷酸类似物与该靶核酸杂交时，嵌入假核苷酸被安置为凸出的嵌入物，即，嵌入假核苷酸的上游相邻核苷酸和下游相邻核苷酸杂交到靶核酸中的相邻核苷酸。
嵌入假核苷酸可以紧挨着双链体的任何一端或两端放置，该双链体在含嵌入假核苷酸的寡核苷酸类似物和其靶核苷酸或核苷酸类似物之间形成，例如嵌入假核苷酸可以安置为悬垂的共同堆积末端。
寡核苷酸或寡核苷酸类似物的所有嵌入假核苷酸或INA可以安置以使寡核苷酸类似物与靶核酸杂交时，所有的嵌入假核苷酸安置成凸出嵌入物和/或悬垂的、共同堆积末端。
包含嵌入假核苷酸的寡核苷酸的例子描绘如下：
N1-(P)q-N2，
N1-(P-N3)q-N2，
(P)q-N2，
N1-(P)q，
(P)q-N2-(P)r，
N1-(P)q-N2，
N1(P-N3)q-N2-(P-N3)r-N4，
其中
N1，N2，N3，N4分别表示至少一个核苷酸的核苷酸和/或核苷酸类似物序列，
P表示嵌入假核苷酸，q和r分别选自从1到10的整数。
甲基化
基因组DNA甲基化的程度或量与许多条件如老化、干细胞分化、遗传异常、癌症及其他疾病状态关联。大量重要的甲基化状态的暗示陈述如下。
已经进行了胚胎干细胞与成人胸腺细胞的融合以检查融合后在DNA甲基化水平发生的重新编程。不活动的体细胞染色体X通过完整染色体检查的显现变成活动的(Tada等，2001；Current Biology，11，1553-1558)。
以偶发的结肠直肠癌的临床病理学特征在特殊的DNA区域中检查甲基化模式，作为鉴定这种肿瘤的便宜和精确的途径(Ward等，2001；Gut，48，821-829)，和人结肠隐窝干细胞中的甲基化模式(Ro等，2001，Proc Natl Acad Sci，USA，98，10519-10521；Yatabe等，2001，Proc.Natl.Acad Sci USA，在线版本)。
前列腺癌和用5-氮胞苷处理以重新活化特定基因的细胞系中的甲基化模式(Chetcuti等，2001，Cancer Research，61，6331-6334)。
子宫内膜癌的各种不同雌激素受体中的甲基化模式，其中通过甲基化基因失活发生在许多癌症，但在正常的个体不以高频率出现(Sasaki等，2001，Cancer Research，61，3262-3266)。
膀胱癌中的甲基化模式(markl等，2001，Cancer Research，61，5875-5884)。
乳癌中的甲基化模式(Nielsen等，2001，Cancer Letters，163，59-69)。
在涉及肺癌和乳癌的特定启动子中的甲基化模式(Burbee等，2001，J Natl Cancer Institute，93，691-699)。
在食管腺癌患者血浆中自由DNA的甲基化模式(Kawakami等，2000，J Natl Cancer Institute，92，1805-1811)。
遗传性扩散胃癌中CDH1启动子的甲基化(Grady等，2000，Nature Genetics，26，16-17)。
基因组印记，其中，例如基因的父本等位基因是活动的，母本等位基因是不活动的，反之亦然。通过相关基因或它们附近的序列甲基化的改变实现失活。本质上，DNA区域在一个性别的生殖系中变成甲基化的，而在另一个性别中则不是如此(Mann，2001，Stem Cells，19，287-294)。
通过核转移或体外受精克隆不同的物种(绵羊、牛、山羊、猪和小鼠)的研究中基因组范围的甲基化模式。因此，被插入至卵母细胞中的供体核的甲基化模式差异很大，这被认为是当前的克隆实验中高失败率的原因。这些分化的核或许需要更多重新编程这种较少分化的核，如在胚胎干细胞中(Kang等，2001；Nature Genetics，28，173-177；Humphreys等，2001，Science，293，95-97)。
在24种癌细胞系中过量超甲基化模式与正常组织的对比(Smiraglia等，2001，Hμman Molecular Genetics，10，1413-1419)。
甲基化DNA嵌入到非甲基化微基因构建体中以检查对基因表达和印记的作用(Holmgren等，2001，Current Biology，11，1128-1130)。
在成熟B细胞淋巴瘤中的甲基化模式，其中特定的基因通过甲基化被失活(Malone等，2001，Proc Natl Acad Sci USA 98，10404-10409)。
在急性骨髓性白血病中特定基因的甲基化模式(Melki等，1999，Leukemia，13，877-883)。
在基因敲除小鼠中Mecp2基因的分析。该蛋白涉及结合到DNA中甲基化位点并被认为涉及Rett综合症，该症是遗传的神经系统紊乱(Guy等，Nature Genetics，27，322-326)。
5个特定的基因在自然老化过程和溃疡性结肠炎中的甲基化模式(Issa等，2001，Cancer Research，61，3573-3577)。
在凋亡过程中甲基化的损失，其影响信号转导途径，细胞周期调控、可动元件在基因组内的移动(Jackson-Grusby等，2001，NatureGenetics，27，31-39)。
在不同物种如人和小鼠中启动子和基因区域甲基化模式的比较，以确定涉及基因调控的CpG岛的进化保守程度或其缺失(Cuadrado等，2001，EMBO Reports，21，586-592)。
不同发育阶段睾丸精子的DNA甲基化模式(Manning等，2001，Urol Int，67，151-155)。
使用单克隆抗体的免疫组织化学染色分析DNA甲基化模式(Piyathilake等，2000，Biotechnic and Histochem，75，251-258)。
基因和假基因甲基化模式之间的差异(Grunau等，2000，HumanMol Genet，9，2651-2663)。
模式无脊椎动物，例如果蝇(Drosophila melanogaster)5-甲基胞嘧啶的含量(Gowher等，2000，EMBO J，19，6918-6923)。
使用CpG岛的甲基化模式对人启动子的大规模作图(loshikhes等，2000，Nature Genetics，26，61-63)。
在哺乳动物发育期间由于ATRX基因表达的变化，所述基因引起智力迟钝、面部变形、泌尿生殖的异常和α地中海贫血，在染色质重塑、DNA甲基化和基因表达过程中的诱导变化(Gibbons等，2000，Nature Genetics，24，368-371)。
涉及前列腺癌的GSTP1基因启动子区域甲基化和未甲基化结构域之间的边界(Millar等，2000，J Biological Chemistry，275，24893-24899；Millar等，1999，Oncogene，18，1313-1324)。
在正常老化过程中甲基化的改变(Toyota等，1999，Seminars inCancer Biology，9，349-357)。
在老化和心血管系统动脉粥样硬化中甲基化的变化(Post等，1999，Cardiovascular Research，43，985-991)和在结肠直肠粘膜的自然老化和癌症中甲基化的改变(Ahuja等，1998，Cancer Research，58，5489-5494)。
在睾丸生殖细胞和支持细胞中的甲基化模式(Coffigny等，1999，Cytogenet Cell Genets，87，175-181)。
在模式脊椎动物如斑马鱼发育期间DNA甲基化的变化(Macleod等，1999，Nature Genetics，23，139-140)。
在人组织血液ABO基因启动子区域的甲基化模式(Kominato等，1999，J Biol Chem，274，37240-37250)。
在哺乳动物着床前发育期间使用单克隆抗体确定的甲基化模式(Rougier等，1999，Genes and Development，12，2108-2113)。
通过各种不同的癌症化学治疗的药物诱导的甲基化模式(Nyce，1997，Mutation Research，386，153-161；Nyce 1989，Cancer Research，49，5829-5836)和在苯巴比妥诱导的以及自发的肝脏肿瘤中DNA甲基化的改变(Ray等，1994，Molecular Carcinogenesis 9，155-166)。
通过亚硫酸氢盐测序方法分析5-甲基胞嘧啶残基(Grigg，1996，DNA Sequence，6，189-198)。
使用甲基化DNA结合柱分离CpG岛(Cross等，1994，NatureGenetics，6，236-244)。
KSHV裂解生长是通过甲基化敏感性开关诱导的吗？(Laman和Boshoff，Trends Microbiol 2001 Oct；9(10)：464-6)。皮肤多发性出血性肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV或HHV-8)的潜伏和裂解生长都与发病机理有关。
从大量不同甲基化状态的例子和上述提供的暗示可以看出，应当理解本发明提供研究甲基化的强大工具和因此可以用于疾病和健康的许多方面。
材料和方法
固相支持物
表1显示用于连接本发明的捕捉配体的固相支持物的一些例子。
表2显示供本发明使用的检测系统的可能选择。
表1附着捕捉配体标记的固相支持物
  标记   氟珠   柱   磁珠   乳胶珠   P/苯乙烯珠   膜   玻璃
  INA   +   +   +   +   +   +   +
  寡核苷酸   +   +   +   +   +   +   +
  RNA   +   +   +   +   +   +   +
  嵌合体   +   +   +   +   +   +   +
表2检测配体的检测系统
  标记   氟珠   磁珠   乳胶珠   P/苯乙烯珠   玻璃   适配子
  预标记   +
  荧光   +   +   +   +   +   +
  化学发光   +   +   +   +   +   +
  放射标记   +   +   +   +   +   +
  树枝状聚合物   +   +   +   +   +   +
嵌入核酸(INA)
嵌入核酸(INA)是非天然存在的多核苷酸，其可序列特异性地杂交到核酸(DNA和RNA)。由于INA显示若干合乎需要的性质，从而是基于探针的杂交分析中作为核酸探针替代物的候选物。INA是杂交到核酸形成比对应的核酸/核酸复合物热力学更稳定的杂交物的聚合物。它们不是已知降解肽或核酸的酶的底物。因此，INA应该在生物样品中更稳定，而且具有比天然存在的核酸片段更长的储存期限。与非常取决于离子强度的核酸杂交不同，INA与核酸的杂交相当地独立于离子强度，并且在其强烈地不支持天然存在的核酸杂交到核酸上的情况下在低离子强度是有利的。INA的结合强度除取决于通常的双链结构中以特殊的方式堆积的碱基之间的氢键之外，还取决于改造至分子中嵌入基团的数目。INA识别DNA的序列辨别力比DNA识别DNA的辨别力更有效。
INA通过以可商业供应的方式修改标准的寡核苷酸合成步骤而合成。
在INA探针和标准的核酸探针之间的确存在许多差异。这些差异可以方便地分为生物学的、结构的和物理化学的差异。正如以上和以下的讨论，当试图在典型情况下已采用核酸的应用中使用INA探针时，这些生物学的、结构的、和物理化学的差异可以导致不可预测的结果。在化学领域经常观察到这种不同组合物的非等价性。
关于生物差异，核酸是在活的物种生命中作为基因传递和表达的因子起着重要作用的生物材料。它们的体内性质了解得相当地透彻。然而，INA是最近开发的完全人造的分子，由化学家构思并使用合成有机化学制备。它没有已知的生物功能。
在结构上，INA也显著地不同于核酸。尽管两者可以采用常见的核碱基(A，C，G，T和U)，这些分子的组成是结构上多样化的。RNA、DNA和INA的骨架包括重复的磷酸二酯核糖和2-脱氧核糖单位。INAs不同于DNA或RNA在于具有一个或多个通过接头分子连接到该聚合物的大的扁平分子。该扁平分子嵌入在双链结构中与INA相对的互补DNA链的碱基之间。
INA和DNA或RNA之间的物理/化学差异也是很多的。INA结合到互补DNA比核酸探针结合到相同靶序列更迅速。与DNA或RNA片段不同，除非嵌入基团位于末端位置，INAs与RNA的结合差。由于互补DNA链上嵌入基团和碱基之间强相互作用，INA/DNA复合物的稳定性比类似的DNA/DNA或RNA/DNA复合物高。
与其他的DNA如DNA或RNA片段或PNAs不同，INAs不显示自身聚集或结合性质。
概括地说，因为INAs以序列特异性杂交到核酸，INAs是开发基于探针的分析的有用候选物和特别适用于试剂盒和筛选分析。然而，INA探针不是核酸探针的等同物。因此，任何可以改善基于探针的分析的特异性、敏感性和可靠性的试剂盒或组合物将用于检测、分析和定量含DNA的样品。INAs具有用于所述目的的必要性质。
INA用于本发明实施例的例子是(S)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-(1-芘基甲基)-甘油的亚磷酰胺。然而，应当理解还可以使用其他化学形式的INAs。
亚硫酸氢钠-特定的脱氨方法
用亚硫酸钠处理核酸的标准方法可以在大量参考文献中找到，包括Frommer等1992，Proc Natl Acad Sci 89：1827-1831；Grigg和Clark1994 BioAssays 16：431-436；Shapiro等1970，J Amer Chem Soc92：422-423；Wataya和Hayatsu 1972，Biochemistry 11：3583-3588。通过本发明人还对这些方案进行了一些改进。
检测系统
包被磁珠
用于附着到磁珠的INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以有许多途径进行修饰。在这个例子中，为使INA通过杂双功能的接头如EDC共价附着到珠上，INA包含5’或者3’氨基基团。然而，INA还可以用5’基团如生物素修饰，因此生物素被动地附着于用亲和素或链亲和素基团修饰的磁珠上。
10μL羧酸酯修饰的MagnabindTM珠(Pierce)或100μLDynabeadsTM链亲和素(Dynal)被转移到干净的1.5ml管和90μl PBS溶液被加到该磁珠中。
混合所述珠然后磁化并弃去上清液。所述珠用PBS洗涤两次每次100μL，最后重悬在90μL pH4.5的50mM MES缓冲液中或另一个由生产商提供的说明书确定的缓冲液。
1μL的250μM INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA(浓度取决于由寡核苷酸杂交实验确定的选择的INA的比活)被添加到样品中，涡旋震动该管并在室温下放置10-20分钟。
然后添加10μL新鲜制备的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，样品经涡旋振荡和在室温或者4℃温育直至60分钟。
接着样品被磁化，弃去上清液，并且如有必要，所述珠通过添加100μL的0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封闭10分钟。
该珠再用PBS溶液洗涤两次，最后重悬于100μL PBS溶液中。使用磁珠的杂交
10μL INA包被的MagnabindTM珠被转移到干净的管和40μLExpressHybTM缓冲液(Clontech)或者原液或蒸馏水1∶1的稀释液或任何其他的商业的或自制的杂交缓冲液中。缓冲液还可以包含已知浓度的阳离子/阴离子或两性离子(zwittergents)或者其他的添加剂如肝素和聚氨基酸。
1-5μL热变性的DNA样品然后被加到上述溶液中，涡旋振荡该管然后在55℃或另外的温度(这取决于选择的INA的解链温度)温育20-60分钟。
样品被磁化，弃去上清液和用1×SSC/0.1％SDS在杂交温度从较早步骤开始洗涤珠两次，每次5分钟，在洗涤的间隙磁化样品。双重INA捕捉
INA#1通过INA的N末端或C末端胺连接到羧酸酯修饰的磁珠和洗涤除去未结合的INA。
INA/珠复合物然后使用合适的杂交和洗涤条件杂交到溶液中的靶DNA。
然后使用合适的方法从磁珠释放靶DNA并转移到含有靶向到DNA分子的相对端的第二INA/磁珠复合物的管中。
第二INA/珠复合物或寡核苷酸/珠复合物然后使用合适的杂交和洗涤条件杂交到溶液中的靶DNA。
互补到靶DNA的中央区域的第三INA或寡核苷酸能被用作检测分子。该检测分子可以以多种方式标记。
(i)INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用放射性同位素如P32或I125直接标记然后与靶DNA杂交。
(ii)INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA可以用荧光分子如Cy-3或Cy-5标记然后与靶DNA杂交。
(iii)胺修饰的INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA可以用任一种上述方法标记然后连接到羧酸酯修饰的已知大小的微球体上，然后洗涤该球以除去未结合的标记INA、PNA或寡核苷酸。这个珠复合物接着用来生产检测特定的DNA分子的信号放大系统。
(iv)INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA可以附着于用荧光或者放射性基团标记的树枝状聚合物分子，该复合物用来产生信号放大。
(v)INA，DNA，PNA，LNA，HNA，ANA，MNA，CNA以任一种上述方法标记和杂交到固相支持物上的靶DNA，可以使用单链特异的核酸酶例如绿豆核酸酶或S1核酸酶释放到溶液中。释放的检测分子可以在适合的装置中读取。
放射标记的检测球的制备
INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用分子如胺基、巯基基团或者生物素在3’或5’标记。
标记分子还可以具有结合在分子中第一标记物的相对端的第二个标记物如P32或I125。
这个双重标记检测分子可以使用杂双功能的接头如EDC共价连接到羧酸酯或例如已知大小的改性乳胶珠上。根据该分析还可以使用其他适合的基质。
未结合的分子能因此通过洗涤除去，留下包被有大量特异的检测/信号放大分子的珠。
接着这些珠与目的DNA样品杂交产生信号放大。
荧光标记的检测球的制备
INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用分子如胺基、巯基基团或者生物素在3’或5’标记。
标记分子还可以具有结合在分子中第一标记物的相对端的第二标记物如Cy-3或Cy-5。
这个双重标记检测分子现在可以使用杂双功能的接头如EDC共价连接到羧酸酯或例如已知大小的改性乳胶珠上。
未结合的分子能因此通过洗涤除去，留下包被有大量特异的检测/信号放大分子的珠。
接着这些珠与目的DNA样品杂交产生信号放大。
酶标记的检测球的制备
INA、DNA、PNA、LNA、HNA、ANA、MNA、CNA可以用分子如胺基、巯基基团在3’或5’标记。
标记分子还可以具有通过杂双功能的接头在分子中第一标记物的相对端结合的第二标记物，如生物素或其他的分子，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
这个双重标记检测分子现在可以使用杂双功能的接头如EDC共价连接到羧酸酯或已知大小的改性乳胶珠上。
未结合的分子能因此通过洗涤除去，留下包被有大量特异的检测/信号放大分子的珠。
接着这些珠与目的DNA样品杂交产生信号放大。
因此，通过结合分子如链亲和素或包含生色底物的酶促反应可达到信号放大。
INA寡聚体组合
在所有上述情况中，最初的杂交事件包括利用包被有与目的核酸互补的INA的磁珠。
第二杂交事件可以包括任一如上所述的方法。
这个杂交反应可以用互补到目的DNA、PNA的第二INA，或者互补到目的核酸的寡核苷酸或修饰的寡核苷酸来进行。由于在这些分析中荧光珠具有合宜的大小，携带＞106荧光染料分子，并且单个荧光珠可以容易地检测，该方法具有分析来自一个或几个细胞的一个或几个DNA分子灵敏度的潜力。
树枝状聚合物和适配子
树枝状聚合物是树枝样的分子，其可以以可控的方式通过化学方法人工合成，从而可以产生用特异分子标记的多层。它们从中心到外围或正好相反逐步合成。
控制树枝状聚合物结构和其产生的一个最重要参数是在每个步骤产生的分支的数目；这决定构造所需的分子需要的重复步骤的数目。
树枝状聚合物可以合成，包含放射性标记如I125或P32或荧光标记物如Cy-3或Cy-5以增强信号放大。
替代地，树枝状聚合物可以合成以包含用于连接修饰的INA、PNA或DNA分子的羧酸酯基团或任何其他的反应基团。
方法
使用固相支持体和磁珠检测甲基化的DNA
图1和图2分别显示使用固相支持物和磁珠通过夹心INA信号放大的本发明方法。尽管INA被举例说明作为图1和图2中的检测配体，应当理解其他的检测配体如寡核苷酸也可被用于这些方法。
提供微量滴定孔形式的固相支持体并包被有N-氧琥珀酰亚胺以帮助INA或其他的配体附着于孔。
互补到靶核苷酸序列第一部分的第一INA被加到孔中并且附着于该固相支持物。
亚硫酸氢盐处理的DNA然后被加到孔中，实现与INA的杂交以捕捉已经杂交到INA并随后结合到孔上的靶DNA。
然后洗涤所述孔以除去杂交溶液并且任何非杂交的DNA只留下捕捉在孔上的杂交DNA。
其次，互补到靶核苷酸序列第二部分的第二INA连接到具有荧光标记物的微球体珠。然后将第二连接的INA与已经结合到孔内的靶DNA杂交。然后洗涤该孔以除去未杂交的第二INA/微球体复合物，只留下INA/微球体复合物和与靶DNA序列相连的荧光标记物。
然后测量荧光以确定靶DNA的水平。
使用微球体检测甲基化的DNA
方法学
参考图3和图4，显示使用微球体检测甲基化的DNA。
用捕捉INA包被微量滴定
(i)捕捉INA(0.01-100pM每孔)的50mM磷酸盐缓冲液，1mMEDTA pH8.5(100μL)用来包被N-氧琥珀酰亚胺包被的微量滴定孔(Costar Cat#2498)，在4℃持续16-24小时。
(ii)微量板用100μL 50mM磷酸盐缓冲液，1mM EDTA pH8.5洗涤。
(iii)150μL 3％BSA，50mM磷酸盐缓冲液，1mM EDTA pH8.5被添加到各孔，板置于4℃备用。
用检测INA包被荧光染料
(i)荧光染料(Molecular Probes)超声处理5次，5秒以裂解任何聚集的物质。
(ii)检测探针INA在250μL超声处理的50mM 2[N-吗啉代]乙烷磺酸(MES)pH6.0中稀释到300pM到0.3pM的浓度范围，添加250μL超声处理的荧光染料，溶液在室温下放置30分钟。
(iii)0.5毫克1-乙基-3[3二甲胺丙基]碳化二亚胺[EDAC]，SigmaCat#E1769，被添加到样品中，样品在室温下暗处放置4-6小时，然后在4℃孵育16小时。
(iv)55μL 1M甘氨酸被添加到珠，珠在室温下放置2小时。
(v)所述珠以14,000rpm在台式离心机离心5-20分钟(取决于珠的大小，通常0.5μm珠需要5分钟而0.1μm珠需要20分钟)，丢弃上清液。
(vi)珠用500μL PBS/1％BSA洗涤两次，在洗涤步骤之间进行上述的离心。
(vii)珠然后重悬在200μL PBS/1％BSA中，在4℃下储存于暗处备用。
(viii)结合到所述珠的INA配体数目的变化可用于优化灵敏度和使本底水平最小化。
DNA杂交
(i)对照鲑鱼精子DNA或如Clark等所述(Clark SJ，Harrison J，Paul CL和Frommer M.High sensitivity mapping of methylated cytosines.Nucleic Acids Res.22：2990-2997(1994))以亚硫酸氢盐处理的DNA与连接到微量滴定孔上的INA配体杂交，然后添加到各孔。
(ii)DNA样品与100μL ExpressHybTM缓冲液(Clontech)混合，被加到孔中，所述滴定板用粘附膜覆盖或孔用矿物油(Sigma)覆盖用于长时保温，样品在45-60℃之间孵育1-16小时。
(iii)然后孔用150μL 2×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗涤两次，每次5-10分钟。
(iv)孔另外用150μL 0.1×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗涤5-10分钟，丢弃洗涤液。
(V)INA/荧光染料用100μL ExpressHybTM缓冲液(Clontech)稀释1/100，100μL样品被加到所述孔中。所述滴定板用粘附膜覆盖或孔用矿物油(Sigma)覆盖用于长时保温，在45-60℃之间孵育1-16小时。
(vi)然后孔用150μL 2×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗涤两次，每次5-10分钟。
(vii)孔另外用150μL 0.1×SSC/0.1％SDS在45-60℃洗涤5-10分钟，丢弃洗涤液。
(viii)最后用合适的激发/发射波长(黄色珠500/520)在Victor II荧光读板机测量每个孔具体珠的荧光强度。
(ix)从所有的读数中减去没有INA附着的孔所测量到的背景值。生产包被放射性同位素标记的珠的方法
(i)针对靶DNA或目的核酸区域合成特定的寡核苷酸(INA或PNA)。该寡核苷酸INA或PNA含有使用标准的化学方法合成(SigmaGenosys)的3′胺基。
(ii)然后使用如下γP32dATP使寡核苷酸(INA或PNA)5’激酶化：
寡核苷酸(20ng/μl)    1μl
×10PNK缓冲液       1μl
T4 PNK              1μl
γP32dATP          2μL
无菌水              5μL
(iii)样品在37℃孵育1小时然后被加热到95℃作用5分钟以灭活该酶。
(iv)0.1μM羧酸酯修饰的荧光珠(Molecular Probes Cat# F-8803)用无菌水1/10,000，1/100,000和1/1,000,000稀释，然后激酶化的寡核苷酸连接到如下的珠：
珠                           1μl
标记的寡核苷酸(INA或PNA)     3μL
50mM MES pH8.0               5μL
10mg/ml EDC(Pierce)          2μL
(v)然后在室温温育所述珠1小时以实现激酶化的寡核苷酸通过3’胺连接到珠上。
(vi)所述珠然后在微量离心机中以全速旋转15分钟以沉淀包被的珠。
(vii)除去上清液，用100μL PBS溶液洗涤所述珠，并离心同上。
(viii)除去上清液，所述珠重悬于50μL PBS。
(ix)然后用标准的闪烁计数器使用Cerenkov计数方案测量包被的珠的CPM。具有最高放射性的珠用作分析中的检测系统。
该方案的指导思想是生产具有最高比活的最小数量的珠，以便只需要很少的珠结合到靶序列就可产生可检测信号。
亚硫酸氢盐处理DNA
向2μg DNA中加入2μL(1/10体积)3M NaOH(6g溶于50ml水中，新鲜配制)使终体积为20μL。混合物在37℃温育15分钟。在高于室温的温度下温育可用于提高变性的效率。
温育后，添加208μL 2M偏亚硫酸氢钠(7.6g溶于20ml水或Tris/EDTA与416ml 10N NaOH；BDH AnalaR#10356.4D，新鲜配制)。样品用200μL矿物油覆盖。然后样品在55℃温育过夜。或者，样品可以在热循环控制装置上循环，温育大约4小时或过夜如下：步骤1，55℃/2小时在PCR机器上循环；步骤2，95℃/2分钟。步骤1可以在任何适合的温度从大约37℃到大约90℃下进行并且可以持续5分钟到16小时的不同时间。步骤2可以在任何适合的温度从大约70℃到大约99℃下进行并且可以持续大约1秒钟到60分钟或更长的不同时间。
在用偏亚硫酸氢钠处理以后，除去油，并且如果DNA浓度低的话添加1μL tRNA(20mg/ml)或2μL糖原。这些添加剂是可选择的并且可用于提高通过与靶DNA共沉淀而获得的DNA的产量，尤其是当DNA以低浓度存在时。
如同下述进行异丙醇清除处理：向样品添加800μL水，混合然后加入1毫升异丙醇。再次混合样品并在-20℃放置至少5分钟。样品在微量离心机离心10-15分钟并用80％ETOH洗涤小球两次，每次均进行涡旋振荡。该洗涤处理除去任何残留的与核酸一起沉淀的盐。
小球被干燥然后重悬于适合体积例如50μL的T/E(10mMTris/0.1mM EDTA)pH7.0-12.5中。pH10.5的缓冲液被认为特别有效。样品视需要在37℃到95℃温育1分钟到96小时，以悬浮核酸。
抗体方法
基因组中甲基化DNA序列的抗体选择
该方法在图3中显示并总结如下。
I.将针对5-甲基胞嘧啶的抗体包被至磁珠上。(A)
II.在洗涤除去未结合的抗体后，磁珠被加到基因组DNA。(B)
III.任何包含5-甲基胞嘧啶的DNA结合到包被有抗体的珠，将大多数未甲基化的DNA自由地留在溶液中。
IV.抗体/珠被洗涤产生纯的甲基化DNA序列群体，其能因此进行亚硫酸氢盐处理。(C)
多配体方法
使用嵌入核酸(INA)配体的多配体
一个优选的方法显示于图4。使用该方法如下检测目的序列：
I.INA，设计成目的序列的5’区域，连接到磁珠或可检测的颗粒上。(A)
II.INA/珠复合物与亚硫酸氢盐处理的DNA混合并洗涤以除去非靶DNA.(B)
III.然后添加第二INA、PNA或寡核苷酸(其被设计成目的序列的3’区域)。第二INA、PNA或寡核苷酸包含基因组中没有发现的独特的序列标签，其随后被用于检测。(c)
IV.然后洗涤样品，包含相同标签的第二INA被再次添加，并洗涤所述珠。(D)
V.添加第三和第四INA等，杂交并洗涤。(E)
VI.标签序列现在使用结合到INAs 1-4的标签序列的标记(荧光/放射性)INA、PNA或寡核苷酸来检测。(F)
另一优选的方法显示于图5。使用该方法如下检测目的序列：
I.INA偶联至设计成目的序列的5′区域的磁珠或可检测的颗粒。(A，B)
II.INA/珠复合物与亚硫酸氢盐处理的DNA混合并洗涤以除去非靶DNA.(C)
III.然后添加设计成目的序列的3′区域的第二INA/珠。第二INA/珠复合物被荧光标记或放射性标记用于检测。(D)
IV.然后洗涤样品和再次添加荧光或放射性标记的第三INA/珠复合物。(D)
V.添加第三和第四INA等，杂交并洗涤。
VI.使用所有检测珠复合物的总和实现信号放大。(E)
抗体捕捉多配体分析
本发明人发现针对5-甲基胞嘧啶的抗体(通常被用来使染色体染色)可用于捕捉或浓缩具有高甲基化区域的核酸。一旦捕捉，核酸可以按照本发明的方法分析。
该分析描述如下。
A.偶联5-甲基胞嘧啶抗体到磁珠上
I.0.1μL(0.5μg)5-甲基胞嘧啶的单克隆抗体(Oncogene Cat#NA81)被添加到125μL Dynal Pan小鼠IgG(cat#110.22)，根据厂家说明书洗涤。
II.样品在室温下摇动45分钟。
III.珠用PBS/0.1％牛血清白蛋白洗涤四次。
I.珠然后重悬于125μL PBS/0.1％BSA。
B.基因组DNA的预富集
I.根据厂家说明书用EcoR1和Hind III预消化的6.5μg基因组LNCaP DNA被添加到洗涤过的珠上。
II.样品在室温下摇动45分钟。
III.珠用PBS/0.1％牛血清白蛋白洗涤四次。
IV.珠然后重悬在40μL水中。
C.亚硫酸氢盐处理捕捉的DNA
I.20μL捕捉的DNA用亚硫酸氢盐处理如下。
II.2μL(1/10体积)3M NaOH。该混合物在37℃温育15分钟。
III.温育后，添加208μL 2M偏亚硫酸氢钠。样品用200μL矿物油覆盖。
IV.然后样品在55℃温育过夜。
V.在用偏亚硫酸氢钠处理后，除去油，加入1μL tRNA(20mg/ml).
VI.向样品添加800μL水，混合然后添加1毫升异丙醇。样品再次混合并在4℃放置30分钟。
VII.样品在微量离心机离心10-15分钟并用80％ETOH洗涤小球两次，每次均进行涡旋振荡。
VIII.小球被干燥然后重悬在50μL T/E(10mM Tris/0.1mMEDTA)pH10.5中。
IX.样品在72℃温育1小时。
D.PNA捕捉珠的制备
以下PNA被人工合成以识别GSTP！基因的甲基化序列(登记号：M244852)。
PNA 5’胺-CTA ACG CGC CGA AAC
I.10μL羧酸酯修饰的MagnabindTM珠(Pierce cat#21353)被转移至干净的1.5毫升管中，90μL PBS溶液被加到磁珠中。
II.混合珠然后磁化并弃去上清。珠用PBS洗涤两次，每次100μL并最后重悬在90μL 50mM MES缓冲液pH4.5中。
III.1μL 250μM PNA被添加到样品中，涡旋振荡管并在室温下放置10-20分钟。
IV.然后添10μL新鲜制备的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，样品经涡旋振荡和在室温或者4℃温育直至60分钟。
V.所述样品然后磁化，弃去上清液。
V1.所述珠通过添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封闭10分钟。
VII.该珠然后用PBS溶液洗涤两次，最后重悬于100μL PBS溶液中。
E.包被有PNA的捕捉珠杂交到抗体富集的亚硫酸氢盐处理的DNA
I.10μL PNA包被的珠随同5μL抗体富集的亚硫酸氢盐处理的DNA和35μL用蒸馏水1∶1稀释的ExpressHyb溶液(Clontech)一起被添加到新鲜的1.5毫升离心管中。
II.混合样品并在55℃放置1小时。
III.样品用×2SSC/0.1％SDS在55℃洗涤1次，磁化并丢弃上清液。
IV.样品另用×1SSC/0.1％SDS在55℃洗涤1次，磁化并丢弃上清液。
V.最后样品重悬于20μL ×1SSC/0.1％SDS。
F.激酶处理检测寡核苷酸
四个特定的检测寡核苷酸设计为用于最初的PNA捕捉区域下游的甲基化区域。这些引物的序列显示如下：
检测-15’-TAAATCACGACGCCGACCGCTCTT-胺3’(SEQ IDNO：1)
检测-25’-AAAACGCGAACCGCGCGTACTCA-胺3’(SEQ IDNO：2)
检测-35’-CCTAAAAACCGCTAACGACACTA-胺3’(SEQ IDNO：3)
检测-45’-TAAACCACGATATAAAACGACACTC-胺3’(SEQ IDNO：4)
合成的寡核苷酸激酶处理如下：
寡核苷酸          40ng
×10缓冲液        2μL
T4激酶            2μL
γP32            4pl
加水至            20μl
该反应37℃加热60分钟然后酶在95℃热变性处理5分钟。
G.连接该激酶化的寡核苷酸到荧光珠
I.5μL激酶化的检测寡核苷酸如下被偶联到1μL 10-7稀释的Molecular Probes羧酸酯荧光染料0.5μM(Cat#-F 8812粉红色)：
10-7荧光染料0.5μM        1μl
激酶化的检测寡核苷酸       5μl
50mM MES pH8.0             12μL
10mg/ml EDC(Sigma)         2μL
II.珠在室温放置1小时。
III.珠用SSC/0.1％SDS洗涤一次并重悬如下
IV.检测1.20μL×0.1SSC/0.1％SDS
V.检测2.10μL×0.1SSC/0.1％SDS
VI.检测3.10μL×0.1SSC/0.1％SDS
VII.检测4.10μL×0.1SSC/0.1％SDS
H.检测寡核苷酸杂交到PNA捕捉的抗体富集的亚硫酸氢盐处理的DNA
I.来自F节的珠被磁化并移出上清液。
II.47μL用蒸馏水1∶1稀释的ExpressHyb溶液(Clontech)被添加到样品中。
III.3μL各检测珠1-4(总体积12μL)被添加到样品中。
IV.样品在55℃保温1小时。
V.样品用×2SSC/0.1％SDS在55℃洗涤一次，磁化并丢弃上清液。
VI.样品另用×1SSC/0.1％SDS在55℃洗涤，磁化并丢弃上清液。
VII.最后珠重悬于5毫升InstaGel闪烁液，并且使用Cerenkov方案通过闪烁计数确定放射性。
结果
图6显示当比较不接受抗体的基因组DNA样品与抗体捕捉样品时的富集率。
图7显示使用抗体捕捉多配体分析的非PCR信号放大。结果显示使用下列DNA获得的信号：1.无抗体富集LNCaP DNA(甲基化DNA)，2.抗体富集的Du145 DNA(未甲基化的DNA)和3.抗体富集的LNCaP DNA(甲基化DNA)。
INA探针捕捉基因组DNA序列和使用PCR的检测
分析概括成图8。使用该方法目的序列检测如下：
I.针对亚硫酸氢盐转化的甲基化区域，或亚硫酸氢盐转化的未甲基化区域的INA，被设计为目的序列的5’区域，然后偶联到磁珠或任何固相上。
II.INA/珠复合物与亚硫酸氢盐处理的DNA混合并洗涤以除去非靶DNA。
III.捕捉的物质然后用作PCR原料检测捕捉位点下游的序列，其中阳性PCR表明捕捉到所需的序列。
IV.INA配体还可以被结合到任何可通过形状辨别的颗粒上，因此可以在一个反应管中进行成千上万的反应。
V.INA、PNA或寡核苷酸等等，连接于这种颗粒上以使INA1连接于形状1的颗粒...INA2连接于形状2的颗粒...INA3连接于形状3的颗粒...等等，所述颗粒然后全部放入一个管中等等用于随后的反应。
V1.INAs还可以物理方式结合到PCR板的孔，并且全部的反应在单个孔内完成。这允许试剂盒形式，其中产生的阳性信号可以通过在板中的位置而解码(用于甲基化/非甲基化)(参见以下图9用于琼脂糖凝胶试验结果)。
偶联胺修饰的核酸到磁珠上
I.10μL羧酸酯修饰的MagnabindTM珠(Pierce)被转移至干净的1.5毫升管中，90μL PBS溶液被加到磁珠中。
II.混合所述珠然后磁化并且弃去上清液。珠用PBS洗涤两次，每次100μL，最后重悬在90μL pH4.5的50mM MES缓冲液中或另外的由生产商提供的说明书确定的缓冲液。
III.1μL 250μM INA(浓度取决于由寡核苷酸杂交实验确定的选择的INA的比活)被添加到样品中，涡旋震动该管并在室温下放置10-20分钟。
IV.然后添加10μL新鲜制备的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，样品经涡旋振荡和在室温或者4℃温育直至60分钟。
V.样品然后被磁化，弃去上清液，如有必要所述珠通过添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封闭10分钟。
VI.该珠然后用PBS溶液洗涤两次，最后重悬于100μL PBS溶液中。
使用INA包被的磁珠杂交到基因组DNA
10μL INA包被的MagnabindTM珠被转移到干净的管和40μLExpressHybTM缓冲液(Clontech)或原液或蒸馏水1∶1的稀释液或任何其他的商业或自制的杂交缓冲液中。缓冲液还可以包含已知浓度的阳离子/阴离子或两性离子(zwittergents)或者其他的添加剂如肝素和聚氨基酸。
1-5μL热变性的DNA样品然后被加到上述溶液中，涡旋振荡该管并在55℃或另外的温度温育20-60分钟，所述温度取决于选择的INA的解链温度。
样品被磁化，弃去上清液和用1×SSC/0.1％SDS在杂交温度从较早步骤开始洗涤两次，每次5分钟，在洗涤的间隙磁化样品。
PCR扩增INA捕捉的DNA
如下所述在1μL处理的DNA，1/5体积最终重悬样品体积中完成PCR扩增。PCR扩增在25μL包含1μL亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的反应混合物中完成，使用Promega PCR master混合物，各引物为6ng/μl。用于扩增来自亚硫酸氢盐处理的DNA的GSTP1的链特异的巢式引物是GST-9(967-993)TTTGTTGTTTGTTTATTTTTTAGGTTT(F)GST-10(1307-1332)(SEQID NO：5)AACCTAATACTACCAATTAACCCCAT第一轮扩增条件(SEQ ID NO：6).
1μL第一轮扩增产物被转移至包含如下引物的第二轮扩增反应混合物：(R)GST-11(999-1027)GGGATTTGGGAAAGAGGGAAAGGTTTTTT(F)GST-12(1281-1306)(SEQ ID NO：7)ACTAAAAACTCTAAAAACCCCATCCC(R)(SEQ IDNO：8)。GSTP1的序列(登记号：M24485)显示引物的位置。PCR产物的样品在ThermoHybaid PX2热循环仪上在标准条件下扩增。
在每50毫升琼脂糖包含1滴溴化乙锭(CLP#5450)的1％TAE中制备琼脂糖凝胶(2％)。5μL PCR得到的产物用1μL 5X琼脂糖上样缓冲液混合并且使用潜水式水平电泳槽在125mA下用X1 TAE电泳。标志是低100-1000bp类型。在紫外线照射下使用Kodak UVldoc EDAS290系统目测凝胶。
图9显示INA捕捉和PCR方法的琼脂糖凝胶图像。特异于未甲基化的基因组DNA序列的INA配体被连接到磁珠上并与亚硫酸氢盐处理的基因组DNA混合。所述珠/DNA复合物被洗涤，结合的分子用作下游区域PCR的模板。泳道；标志，1，2，3，其中
泳道1：HepG2 DNA(已知在靶位点甲基化)，
泳道2：Du145 DNA(已知在靶位点未甲基化)，
泳道3：BL13 DNA(已知在靶位点未甲基化)。
结果表明使用针对结合到磁珠上的未甲基化靶核酸的INA配体，INA能够特异性捕捉未甲基化的亚硫酸氢盐处理的全部基因组DNA。在泳道1(HepG2)使用的基因组DNA是在INA针对的基因组座位处甲基化的。用于泳道2(Du145)和3(BL13)的基因组DNA是在INA针对的基因组座位处未甲基化的，导致在两个泳道都得到阳性PCR信号。此外，这个例子表明该方法可以通过PCR检测用于快速测定甲基化/未甲基化的靶核酸的存在。
使用甲基化混合物的INA配体的特异性
INA捕捉珠的制备
下列INA被人工合成以识别GSTP1基因的甲基化的序列和相同区域(登记号：M24485)未甲基化的版本。(Y表示假嵌入核苷酸)
甲基化的INA-1 5’胺-YA TCY GGC YGC GCY AAC YTA Y(SEQ ID NO：9)
未甲基化的INA-2 5’胺-CTA ACG CGC CGA AAC(SEQ IDNO：10)
I.10μL羧酸酯修饰的MagnabindTM珠(Pierce cat# 21353)被转移至干净的1.5ml管中，90μL PBS溶液被加到磁珠中。
II.混合珠然后磁化并弃去上清。珠用PBS洗涤两次，每次100μL并最后重悬在90μL 50mM MES缓冲液pH4.5中。
III.1μL 250μM PNA被添加到样品中，涡旋振荡管并在室温下放置10-20分钟。
IV.然后添10μL新鲜制备的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，样品经涡旋振荡和在室温或者4℃温育直至60分钟。
V.所述样品然后磁化，弃去上清液。
VI.所述珠通过添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封闭10分钟。
该珠然后用PBS溶液洗涤两次，最后重悬于100μL PBS溶液中。
INA配体杂交到合成的甲基化和未甲基化的GSTP1序列
两个合成的110bp寡核苷酸被设计为代表GSTP1基因甲基化和未甲基化的区域。
未甲基化的序列
5’AGGGAATTTTTTTTTGTGATGTTTTGGTGTGTTAGTTTGTTGTGTATATTTTGTTGTGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTTGGTTAGTTGTGTGGTGATTTTGGGGATTTTAG-3’(SEQ ID NO：11)
甲基化的序列
5’AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG-3’(SEQ ID NO：12)
然后以以下甲基化∶未甲基化的比例混合甲基化和未甲基化的序列：
100∶0％      25∶75％
99∶1％       10∶90％
95∶5％       5∶95％
90∶10％      1∶99％
75∶25％      0100％
50∶50％
杂交反应
I.40μL用蒸馏水1∶1稀释的ExpressHyb溶液(Clontech)被添加到5μL偶联的珠中。
II.添加5μL寡核苷酸混合物，并通过吸量管有力吹吸混合溶液以重悬所述颗粒。
III.样品然后在50℃温育30分钟以允许靶序列的结合。
IV.所述珠磁化并除去上清液。
V.所述珠然后用×2 SSC/0.1％SDS在50℃洗涤一次，5分钟。
VI.所述珠磁化并除去去上清液。
VII.所述珠另用×1 SSC/0.1％SDS在50℃洗涤一次，5分钟。
检测寡核苷酸的激酶化
对结合到甲基化或者未甲基化的合成寡核苷酸序列的3’区域的两个检测寡核苷酸(oligo)进行合成。
甲基化的检测子5’-AAA CTA ACA CAC CAA AAC ATC ACAAA-胺-3’(SEQ ID NO：13)
未甲基化的检测子5’-GAA CTA ACG CGC CGA AAC ATC GCGAA-胺-3’(SEQ ID NO：14)
寡核苷酸激酶化如下
寡核苷酸          100ng
×10缓冲液        2μl
T4激酶            2μl
γP32            4μl
加水至            20μl
反应在37℃加热60分钟，然后该酶在95℃加热变性5分钟。用PCR级水调整反应体积至55μL。
激酶化的寡核苷酸杂交到INA捕捉磁珠
I.洗涤过的INA捕捉珠在45μL用蒸馏水1∶1稀释的ExpressHyb溶液(Clontech)中重悬。
II.添加5μL激酶化的寡核苷酸，通过吸量管有力吹吸混合溶液以重悬所述颗粒。
III.样品然后在50℃温育30分钟以允许靶序列的结合。
IV.所述珠磁化并除去上清液。
V.所述珠然后用×2 SSC/0.1％SDS在50℃洗涤一次，5分钟。
VI.所述珠磁化并除去去上清液。
VII所述珠另用×1 SSC/0.1％SDS在50℃洗涤一次，5分钟。
VIII.所述珠磁化并除去去上清液。
IX.最后珠重悬于5毫升InstaGel闪烁液，并且使用Cerenkov方案通过闪烁计数确定放射性。
结果显示于图10和图11，其中分别显示INA针对未甲基化的和甲基化DNA的特异性。
INAs对比PNAs对比寡核苷酸的特异性
捕捉珠的制备
为确定INA对比PNA对比寡核苷酸的特异性，人工合成以下的探针。
INA探针 5’胺-YA TCY GGC YGC GCY AAC YTA Y(SEQ IDNO：15)
PNA探针 5’胺-ATC GCC GCG CAA CTA A(SEQ ID NO：16)
寡核苷酸探针 5’胺-AAT CCC CGA AAT CGC CGC GCA ACTAA(SEQ ID NO：17)
探针被人工合成以识别GSTP1基因甲基化的序列(登记号码：M24485)。
I.10μL羧酸酯修饰的MagnabindTM珠(Pierce cat#21353)被转移至干净的1.5毫升管中，90μL PBS溶液被添加到磁珠中。
II.混合珠然后磁化并弃去上清。珠用PBS洗涤两次，每次100μL并最后重悬在90μL 50mM MES缓冲液pH4.5中。
III.1μL 250μM PNA被添加到样品中，涡旋振荡管并在室温下放置10-20分钟。
IV.然后添加10μL新鲜制备的25mg/ml EDC溶液(Pierce/Sigma)，样品经涡旋振荡和在室温或者4℃温育直至60分钟。
V.所述样品然后磁化，弃去上清液。
VI.所述珠通过添加100μL 0.25M NaOH或0.5M Tris pH8.0而封闭10分钟。
VII.该珠然后用PBS溶液洗涤两次，最后重悬于100μL PBS溶液中。
珠/探针复合物杂交到合成的GSTP1序列
合成的110bp寡核苷酸被设计为代表GSTP1基因甲基化的区域。5’AGGGAATTTTTTTTCGCGATGTTTCGGCGCGTTAGTTCGTTGCGTATATTTCGTTGCGGTTTTTTTTTTGGTTTTTTCGGTTAGTTGCGCGGCGATTTCGGGGATTTTAG-3’(SEQ ID NO：18)
合成的寡核苷酸以1/10，1/100和1/1,000激酶化如下
寡核苷酸      2μL
×10缓冲液    2μL
T4激酶        2μL
γP32        4μL
加水至        20μL
该反应37℃加热60分钟然后酶在95℃热变性处理5分钟。
杂交反应
I.用蒸馏水1∶1稀释的ExpressHyb溶液(Clontech)40μL被添加到1.5毫升离心管中的5μL磁珠包被的探针中。
II.添加5μL激酶化的寡核苷酸，并通过吸量管有力吹吸混合溶液以重悬所述颗粒。
III.样品然后在55℃温育30分钟以允许靶序列的结合。
IV.所述珠磁化并除去上清液。
V.所述颗粒然后用×2SSC/0.1％SDS在55℃洗涤两次，每次5分钟。
VI.所述珠另用×1SSC/0.1％SDS在55℃洗涤一次，5分钟。
VII.除去上清液，最后珠重悬于5毫升InstaGel闪烁液，并且使用Cerenkov方案通过闪烁计数确定放射性。
图12显示PNA、INA和寡核苷酸样品与设计为GSTP1基因甲基化区域的合成的110bp寡核苷酸杂交。所述寡核苷酸按描述的方法稀释然后标记并与样品杂交。由此可见，INA产生与PNA探针相似的信号强度，如果不比其强度高的话。
图12显示当PNA、INA和寡核苷酸被设计为检测相同的基因组座位时产生的结果。PNA、INA和寡核苷酸配体与系列稀释的合成的亚硫酸氢盐转化的序列杂交。杂交后，洗涤样品以除去未结合的分子，然后定量测量保留的特异性结合的分子。可以看到INA产生比PNA更高的特异性和检测信号强度与常规的寡核苷酸相比增加15倍。使用阵列型杂交在固相支持物上比较INA配体对比寡核苷酸
为检测INA配体对比寡核苷酸的杂交，人工合成以下针对各种不同基因座位的INA探针，其符号如下。M＝甲基化序列检测，U＝未甲基化的序列检测。
探针      序列                          序列号
ABCB1-M   2GTTTATTAAGACGTTTTATATTTTA    19
ABCB1-U   2GTTTATTAAGATGTTTTATATTTTA    20
ABCG2-M   2TTTTTGGATGTTCGGGTTTTTTTAG    21
ABCG2-U   2TTTTTGGATGTTTGGGTTTTTTTAG    22
BRCA-M    2TTGGGTTTTTGCGTTTAGGAGGTTT    23
BRCA-U    2TTGGGTTTTTGTGTTTAGGAGGTTT    24
CD38-M    2GTAATTAGTTACGGAATTTTGAGGT    25
CD38-U    2GTAATTAGTTATGGAATTTTGAGGT    26
CFTR-M    2GAAAAGGTTAGCGTTGTTTTTAAAT    27
CFTR-U    2GAAAAGGTTAGTGTTGTTTTTAAAT    28
EZH2-M    2TTAGTTTGTTGCGGATTAAAATATA    29
EZH2-U    2TTAGTTTGTTGTGGATTAAAATATA    30
MAGEA2-M  2TTTATTTTTGTCGTGAATTTAGGGA    31
MAGEA2-U  2TTTATTTTTGTTGTGAATTTAGGGA    32
PRKCDBP-M  2GAAGGTTAATTTGGTTTGTTTGAGT   33
PRKCDBP-U  2GAAGGTTAATTTTGTTTGTTTGAGT   34
PTGS2-M    2AAAAGATATTTGGCGGAAATTTGTG   35
PTGS2-U    2AAAAGATATTTGGTGGAAATTTGTG   36
RASSF1-U   2TTATTGAGTTGTGGGAGTTGGTATT   37
RASSF1-M   2TTATTGAGTTGCGGGAGTTGGTATT   38
为将INA配体与寡核苷酸比较，人工合成相同的寡核苷酸序列。
通过10x多重反应在标准条件下使用Qiagen多重PCR试剂盒(Qiagen P/N 206143)从每个选择的基因组区域生成PCR产物。
偶联INA配体和寡核苷酸到固相支持物上
I.切割8cm×12cm区域的Biodyne C转移膜(Pall P/70155A)并且用0.1N HCI略加清洗。
II.膜在新鲜制备的EDC(Sigma)水溶液中浸15分钟。
III.在水中清洗该膜并且放入96孔点印迹装置。
IV.500ng INA和寡核苷酸在20μL PBS中稀释并且通过吸量管吸取到合适的孔中。
V.该膜在室温下放置10分钟然后施加真空使孔干燥。
VI.该孔然后用200μL PBS/0.1％Tween 20冲洗，洗涤之间施加真空。
VII.从印迹装置除去所述膜，膜上剩余活性位点用0.1N NaOH在室温下猝灭10分钟。
VIII.用蒸馏水清洗该膜并最后在使用前空气干燥30分钟。
P32标记的多重探针的制备
利用引物-基因标记系统(Promega Cat#U1100)制备放射性探针
PCR产物      2μl
PCR级水      21μl
样品在95℃加热5分钟，然后在冰上骤冷。
dNTP混合物    6μl
引物混合物    15μl
P32dATP      5μl
Klenow        1μl
探针在室温下放置1小时然后使用wizard DNA清除系统根据生产商的说明书纯化。
包被的膜的预杂交/杂交
I.膜在10毫升包含100μg/ml剪切的鲑鱼精DNA(Sigma)的ExpressHyb溶液(Clontech)的滚瓶中55℃以7rpm每分钟转动1小时。
II.探针煮沸5分钟，在冰上骤冷5分钟然后被加到膜上。
III.在瓶中55℃下以7rpm每分钟旋转过夜进行杂交。
清洗膜
I.所述膜然后以×2SSC/0.1％SDS在55℃洗涤两次，每次20分钟。
II.所述膜另用×1SSC/0.1％SDS在50℃涤一次，20分钟。
III.所述膜最后用×0.1SSC/0.1％SDS在55℃洗涤1次，20分钟。
IV.膜包裹在保鲜膜中并暴露于Molecular Dynamics磷屏成像仪。
使用INAs对比常规的寡核苷酸的杂交结果陈述于图13。顶部两行信号使用INAs产生。底端两排信号使用常规的寡核苷酸产生。从图13可以清楚地看出，使用INAs产生优良品质的杂交信号。
INA与PNA相比的优点
INA配体可以在标准的寡核苷酸平台上人工合成而PNA配体必须在专门的肽合成机器上合成。
PNA配体不能在标准的分子方法如PCR、反转录、实时PCR、等温扩增反应、延伸反应中用作引物。相反，INA配体可用于上述所有方法中使它们成为更有用的分子生物学工具。
INA配体被制成对核酸外切酶有抗性。
INA配体可以设计为选择性地结合到DNA而PNA配体结合到DNA和RNA。
INA配体还显示内源的荧光使它们在如实时PCR的应用中成为有用的分子，而PNA配体不具有该性质。
当和PNA配体对比时，INA配体还具有降低的自亲合力。
本发明人发现PNA配体还是相当“粘的”，这是因为它们似乎非特异性粘到表面上。当两个INA配体用于相同系统时尤其明显。1NA配体看来不产生这个问题。
总结
本发明的方法可以用于使用一个结合到固相支持物的配体(优选寡核苷酸或INA)和一个偶联到微球体的配体来检测任何DNA。可以使用天然的寡核苷酸或INAs，但由于INAs的特异性、稳定性和杂交率，其是优选的。
在一个具体的修改方案中，本发明的方法可用于区分已经用亚硫酸氢钠处理的DNA中甲基化胞嘧啶的存在。杂交的特异性可用于区分未与亚硫酸氢盐完全反应的分子(一个或多个胞嘧啶未变为尿嘧啶)以及区分CpG位点处甲基化的胞嘧啶(其仍然是胞嘧啶)和未甲基化的CpG位点，在此处胞嘧啶变为尿嘧啶。
在另一修改中，本发明方法可用于区分胞嘧啶未与亚硫酸氢盐试剂完全反应转变成尿嘧啶的DNA。
由于用亚硫酸氢盐处理通过转变所有的胞嘧啶(然而并非5-甲基胞嘧啶)为尿嘧啶而改变DNA序列，因此制备的特异INAs识别具有5甲基胞嘧啶的区域但不识别刚好没有5甲基胞嘧啶的相同序列。
本发明的方法还可以用于区分基因中不同的等位基因，其中寡核苷酸或INAs中的一种或两种序列将与一个等位基因很好地匹配，但与另一个则错配。
本发明的方法具有前述的众多应用，包括在设计用于迅速检测大量DNA样品甲基化状态的多阵列芯片中的具体应用。可检测的颗粒还可以用来按比例放大和使检测和筛选过程自动化。
应当理解该方法适用许多其他的状态和条件，其中不同的甲基化状态已经被发现在疾病或改变的细胞状态中起作用。仅仅一些受CpG甲基化影响的基因的例子显示于表3。很清楚本发明适合于检测或测量这种甲基化状态等。
本领域的专业人员应当理解，可以对特定的实施方案显示的发明进行许多的变化和/或修改，而不脱离广泛描述的本发明的精神实质和范围。因此本发明实施方案在各方面被认为是说明性的而非限制性的。
表3受CpG或CpNpG甲基化影响的基因的例子
  基因   位置   癌症   老化   评注
  APC   5q21   结肠癌、胃癌、食道癌   否
  BRCA-1   17q21   乳癌、卵巢癌   否
降钙素 11p15 结肠癌、肺癌、血癌 否   第一个发现在癌症中是甲基化的
E-钙粘蛋白 16q22.1   乳癌、胃癌、甲状腺癌、SCC、白血病、肝癌 否
雌激素受体 6q25.1 结肠癌、肝癌、心脏癌、乳癌、肺癌 是   在甲基化和表达缺失之间相关性良好
  H19   11p15.5   Wilms肿瘤   否   指纹基因
HIC1 19p13.3 前列腺癌、乳癌、脑癌、肺癌 是   潜在的癌症抑制因子
IGF2 11p15.5 结肠癌、AML 是   具有大的CpG岛
  MDGI   1p33-35   乳癌   否
  MGMT   10q26   脑癌、结肠癌、肺癌、乳癌   否
  MYOD1   11p15.4   结肠癌、乳癌、膀胱癌、肺癌   是
  N33   8p22   结肠癌、前列腺癌、脑癌   是   寡糖基转移酶
  P15   9q21   白血病、肺癌、结肠癌   否
P16 9q22 肺癌、结肠癌、淋巴癌、膀胱癌等 否   甲基化和缺失或其他突变以相同频率发生
  TIMP3   22q12.1   脑癌、肾癌   否
  WT1   11p13   乳癌、结肠癌、Wilms肿瘤   否
                         序列表
<110>人类遗传标记控股有限公司(Human Genetic Signature Pty Ltd)
<120>使用嵌入核酸检测核酸中甲基化改变的分析
<130>SCT053180-47
<160>38
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>human
<400>1
taaatcacga cgccgaccgc tctt 24
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Human
<400>2
aaaacgcgaa ccgcgcgtac tca 23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>Human
<400>3
ctaaaaacc gctaacgaca cta 23
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>Human
<400>4
taaaccacga tataaaacga cactc 25
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>Human
<400>5
tttgttgttt gtttattttt taggttt 27
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>Human
<400>6
aacctaatac taccaattaa ccccat 26
<210>7
<211>29
<212>DNA
<213>Human
<400>7
gggatttggg aaagagggaa aggtttttt 29
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>Human
<400>8
actaaaaact ctaaaaaccc catccc 26
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<400>9
 yatcyggcyg cgcyaacyta y 21
<
210>10
<211>15
<212>DNA
<213>Human
<400>10
ctaacgcgcc gaaac 15
<210>11
<211>110
<212>DNA
<213>Human
<400>11
agggaatttt tttttgtgat gttttggtgt gttagtttgt tgtgtatatt ttgttgtggt 60
tttttttttg gtttttttgg ttagttgtgt ggtgattttg gggattttag 110
<210>12
<211>110
<212>DNA
<213>Human
<400>12
agggaatttt ttttcgcgat gtttcggcgc gttagttcgt tgcgtatatt tcgttgcggt 60
tttttttttg gttttttcgg ttagttgcgc ggcgatttcg gggattttag 110
<210>13
<211>26
<212>DNA
<213>Human
<400>13
 aaactaacac accaaaacat cacaaa 25
<210>14
<211>26
<212>DNA
<213>Human
<400>14
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<211>21
<212>DNA
<213>Human
<400>15
yatcyggcyg cgcyaacyta y 21
<210>16
<211>16
<212>DNA
<213>Human
<400>16
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Claims (32)

1.一种检测样品中靶核酸存在的方法，包括：
用修饰未甲基化的胞嘧啶的试剂处理含核酸的样品；
向处理过的样品以嵌入核酸(INA)形式提供能够结合到核酸靶区域的检测配体，并允许检测配体与靶核酸结合足够的时间；以及
检测检测配体与样品中核酸分子的结合以表明靶核酸的存在。
2.权利要求1的方法，其中核酸获取自真核生物基因组、原核生物、病毒、线粒体核酸，其他细胞器中发现的核酸、细胞外核酸、DNA和RNA形式以及天然或人工的DNA或RNA衍生物。
3.权利要求2的方法，其中天然或人工的DNA和RNA衍生物选自INA，ANA，MNA，PNA，LNA，HNA，CNA，和其嵌合组合。
4.权利要求2的方法，其中所述核酸是基因组DNA。
5.权利要求1-4之一的方法，其中所述试剂选自亚硫酸氢盐、醋酸盐或柠檬酸盐。
6.权利要求5的方法，其中所述试剂是亚硫酸氢钠，该试剂在存在水的情况下将胞嘧啶修饰成尿嘧啶。
7.权利要求1-6之一的方法，其中INA是(S)-1-O-(4，4’-二甲氧基三苯基甲基)-3-O-(1-芘基甲基)-甘油的亚磷酰胺。
8.权利要求1-7之一的方法，其中在未处理的核酸中靶区域包括至少一个5’-甲基胞嘧啶。
9.权利要求1-7之一的方法，其中检测配体针对DNA中含CpG-或CpNpG的区域，其中N代表四种可能的碱基A，T，C或G之一。
10.权利要求9的方法，其中DNA中含CpG-或CpNpG的区域处于基因的调控区域，或任何调控元件的增强子区域，所述调控元件包括启动子、增强子、癌基因、逆元件、可移动序列，或活性被环境因素改变的其他调控元件，所述环境因素包括化学品、毒素、药物、辐射、合成或天然的化合物和微生物或其他的传染因子如病毒、细菌、真菌和朊病毒。
11.权利要求1到10之一的方法，其中在处理样品之前，核酸经过富集或选择步骤。
12.权利要求10的方法，其中富集或选择步骤选自包括超声和剪切的物理方法、酶消化、酶处理、限制性消化、核酸酶处理、Dnase处理、浓缩、抗体捕捉，包括酸消化或碱消化的化学方法及其组合。
13.权利要求11的方法，其中富集或选择步骤是用针对5’甲基胞嘧啶的抗体处理以获得甲基化的核酸样品。
14.权利要求1到13之一的方法，其中该方法通过向处理过的核酸以嵌入核酸(INA)形式提供能够区分核酸中甲基化和未碱甲基化胞嘧啶的检测配体而检测靶核酸的甲基化，从而检测检测配体与样品中核酸的结合是靶核酸甲基化程度的指示。
15.权利要求1到14之一的方法，其中能够识别靶核酸序列第一部分的捕捉配体结合到固相支持物上，从而处理过的核酸通过第一捕捉配体结合到支持物，结合的核酸然后暴露给能够识别靶核酸序列第二部分的检测配体，并使检测配体与结合在支持物上的靶核酸结合足够的时间，其中测量检测配体与结合到支持物的核酸的结合以确定样品中靶核酸的存在，其中至少一种捕捉配体或检测配体是INA配体。
16.权利要求15的方法，其中配体选自INA探针、肽核酸(PNA)探针、LNA探针、HNA探针、ANA探针、MNA探针、寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、单链DNA、RNA、适配子、抗体、蛋白、肽、其组合，和其嵌合的形式。
17.权利要求16的方法，其中捕捉配体选自INA探针、PNA探针和寡核苷酸探针。
18.权利要求15的方法，其中捕捉配体和检测配体都是INA配体。
19.权利要求15到18之一的方法，其中检测配体是能够区分DNA中甲基化和未甲基化胞嘧啶的INA配体，以及检测配体结合的程度或量是靶核酸甲基化程度的指示。
20.权利要求15到19之一的方法，其中支持物选自塑料材料、荧光珠、磁珠、成形粒子、板、微量滴定板、合成或天然膜、乳胶珠、聚苯乙烯、柱支持物、玻璃珠或载玻片、纳米管、阵列、纤维、有机和无机的支持物。
21.权利要求20的方法，其中支持物是磁珠、荧光珠、成形粒子、珠阵列或一孔或多孔的微量滴定板。
22.权利要求15到21之一的方法，其中多个捕捉配体排列于固相支持物上。
23.权利要求1到22之一的方法，其中INA检测配体具有附于其上的可检测标记。
24.权利要求23的方法，其中可检测的标记选自化学发光物质、荧光染料、放射性物质、酶、半抗原和树枝状聚合物。
25.权利要求1到24之一的方法，其中结合到INA配体的核酸被进一步加工或处理。
26.权利要求25的方法，其中核酸使用针对核酸区域的引物通过聚合酶链式反应扩增。
27.权利要求26的方法，其中引物是INA配体。
28.分析用修饰未甲基化胞嘧啶的试剂处理过的核酸的试剂盒，包括至少一种能够区分DNA中甲基化和未甲基化胞嘧啶的INA配体。
29.权利要求28的试剂盒，其中一种或多种INA配体固定于固相支持物上。
30.权利要求29的试剂盒，其中固相支持物选自塑料材料、荧光珠、磁珠、成形粒子、板、微量滴定板、合成或天然膜、乳胶珠、聚苯乙烯、柱支持物、玻璃珠或载玻片、纳米管、阵列、纤维、有机和无机的支持物。
31.权利要求28到30之一的试剂盒，进一步包括用于扩增处理过的DNA的引物。
32.权利要求31的试剂盒，其中引物是INA引物。
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