CN102971629B - 微阵列 - Google Patents

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Abstract

公开了使用三维或结构微阵列制备二维微阵列的方法。本发明涉及通过惰性材料在三维微阵列的表面结构上成层来形成限定的功能化区域。然后除去足量的所述惰性材料和足量的表面结构顶部以现出所述惰性材料内表面结构的限定区域。

Description

微阵列
技术领域
本申请涉及用于高灵敏度和选择性的检测/探测应用的二维和三维微阵列的开发。
具体地，本发明一般涉及样品中的化合物或靶分析物的检测，特别是但不仅是：测定样品中是否存在含特定碱基序列的核酸，定量样品中特定核酸碱基序列的数量，测定具体基因的启动子区域内甲基化的存在和/或程度，和多种因素对核酸甲基化的影响，这些因素包括环境、饮食或药物。
背景技术
多种行业对于检测和鉴定各种靶分析物，包括但不限于分子或蛋白质(包括抗体)的快速、精确且低成本方法的需求日益增长。具体地，对于能(若需要时)由非技术人员无需标准实验环境来进行的测试的需求有所增长。尽管传感器技术是快速扩展的技术领域，仍有多种问题妨碍现场测试和精确检测超越某些灵敏度限度。这些问题包括：读取仪器和/或传感方法的复杂特性，意味着往往需要可观的培训和专门技能；低灵敏度传感技术要求在检测可行前的靶分析物浓缩；需要容纳于实验室中的传感仪器的大尺寸以及相应的非便携特性；对于微生物而言靶物种生长至可测浓度所需的时间；能够发生所研究的反应或结合的表面区域和相应的低表面区域可用性；往往难以进行测量；以及最终对可供所得任意测定参照的参比标准的要求。
核酸(NA)检测和碱基对测定，以及基因启动子区域的甲基化存在或程度的测定都会受益于改进的传感器技术。NA检测和碱基对测定通常需要利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)，一种用于将少许拷贝核酸用酶促复制扩增几个数量级的方法。用于分析样品的后续方法取决于样品中的核酸量和该分析所需的细节。因此，这些方法复杂性各异，从简单的电泳凝胶到更复杂的质谱技术，前者给出样品与样品的比较，后者给出下至原子水平的细节。
DNA甲基化是在CpG双核苷酸(DNA中胞嘧啶核苷酸与鸟嘌呤核苷酸通过磷酸二酯键连接的区域)中胞嘧啶的5-碳上共价加成甲基基团。所述共价加成反应由DNA甲基转移酶催化。DNA甲基化通过改变基因表达而不改换DNA序列来影响细胞功能。在细胞分裂过程中，所述改变也可以是可遗传的。
基因的转录要求RNA聚合酶(执行复制过程的酶)与启动子(或表观遗传)区域的连接。基因的启动子区域含有特定的DNA序列和效应元件。启动子区域可含有多簇CpG二核苷酸，其可称作CpG岛或区域。若一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶碱基被甲基化，该启动子区域不再可用，防止所述基因的转录。因此甲基化的启动子区域不能使用，而未甲基化的启动子区域则可以。因此发现DNA甲基化在生物体的发育和正常功能以及疾病的发展中都起到重要作用，也因而成为深入研究的对象。
将DNA与各种条件(例如，疾病、表型等)关联的很多研究着重于DNA甲基化在DNA链的启动子区域中的作用。这是因为已显示表观遗传改变常见于癌症，且通常涉及DNA的甲基化过度和甲基化不足。甲基化过度指CpG区域的甲基化程度增高。其进而导致可遗传的转录沉默，且当肿瘤抑制物基因被沉默时，可导致癌细胞。肿瘤抑制物基因提供编码用于抗增殖信号和负责抑制有丝分裂与细胞生长的蛋白质。相比之下，甲基化不足是指基因组其它区域的甲基化降低。甲基化不足通常发生在正常情况下高度甲基化的重复性DNA中，由于原本被沉默基因表达的活化而导致转录增强和突变率提高。
已发现癌症中的DNA甲基化改变，特别是CpG区域的甲基化过度，发生在癌症发展的相对早期。因此，DNA甲基化可用作检测疾病如癌症的重要生物标记物。此外，由于甲基化后基因序列保存不变，通过甲基化而沉默的个体基因保持完整，因此能通过DNA甲基转移酶的小分子抑制剂来重新活化。
近期研究已表明，启动子区域的甲基化会受多种因素影响，包括饮食和环境因素。通常用质谱来测定甲基化的存在并定量DNA甲基化的变化，但这涉及多个预备步骤(例如，DNA的复制)且昂贵又耗时。
发明目的
本发明的目的是提供二维和三维微阵列用于高灵敏度和选择性的检测/探测应用。本发明的进一步或另一目标是提供测定特定分子或化合物是否存在于样品中和/或以任何方式被修饰的方法。本发明的进一步或另一目标是提供用于测定样品中是否存在包含特定碱基序列的核酸的方法。本发明的进一步或另一目标是使得含特定碱基序列的核酸的检测无需用PCR预浓缩。本发明的进一步或另一目标是提供通过对样品内含特定核酸碱基序列的核酸计数来定量的有用方法。本发明的进一步或另一目标是提供方法来测定基因的启动子区域中甲基化的存在和/或程度，和/或多种因素如环境、饮食或药物对核酸甲基化的影响。本发明的进一步或另一目标是至少为公众提供一种有用选择。
发明内容
本发明的第一方面提供用于测定感兴趣靶化合物在样品中的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包括多个限定的功能化区域的微阵列，所述限定的功能化区域是连接有感应剂的限定区域，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物；
b)将所述微阵列与至少部分样品接触；以及
c)通过对所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应的检测来测定感兴趣靶化合物的存在。
所述微阵列上的多个限定的功能化区域优选是在多个表面结构上的限定区域，其上连接有能对样品内的感兴趣靶化合物给出可检测传感器响应的感应剂。
能提供可检测响应的信号个体优选连接样品中的待检测靶化合物以形成混配样品，且所述限定的功能化区域中的感应剂给出的传感器响应通过所述信号个体与感应剂的连接来提供。
所述信号个体优选能提供可检测信号或响应的化学、生物或物理个体。
所述信号个体优选颗粒，且选自有色微珠、荧光微珠、磁性微珠或挡光微珠。
所述颗粒优选聚合物微珠，包括但不限于聚苯乙烯珠、PMMA珠和PET珠。
所述可检测传感器响应优选选自颜色、荧光、磁性或挡光。
所述可检测传感器响应优选能通过数码计数、重量测定、荧光、光学和/或电学手段来读取。
所述可检测传感器响应优选产生定量/定性、荧光、光学或颜色度量测定中的任意一种或其组合。
所述可检测传感器响应优选包括视觉响应、分光光度响应、荧光技术、电势或静电响应、磁性光折射、热、频率和数码响应。
所述可检测信号响应优选是数码的。
所述可检测信号响应优选产生定量或定性的测定。
所述样品优选是生物样品，包括但不限于组织样品、流体样品，或口腔擦拭物。在一种优选实施方式中，所述样品是包含核酸的生物样品。在另一实施方式中，所述样品是包含微生物，多肽或蛋白和/或抗体的生物样品。
本发明的第二方面提供用于测定感兴趣靶化合物在样品中的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供在基材上包括多个表面结构的微阵列，所述表面结构在表面结构顶部的限定功能化区域顶部连接有感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物；
b)将至少部分样品通过所述阵列；以及
c)通过对所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应的检测来测定感兴趣靶化合物的存在。
能提供可检测响应的信号个体优选连接样品中的待检测靶化合物以形成混配样品，且所述限定的功能化区域中的感应剂所给出的传感器响应通过所述信号个体与感应剂的连接来提供。
所述信号个体所连接的化合物优选是核酸单链的合成的互补拷贝。
所述信号个体优选能提供可检测信号或响应的化学、生物或物理个体。
所述信号个体优选颗粒，且选自有色微珠、荧光微珠、磁性微珠或挡光微珠。
所述颗粒优选聚合物微珠，包括但不限于聚苯乙烯珠、PMMA珠和PET珠。
所述可检测传感器响应优选选自颜色、荧光、磁性或挡光。
所述可检测传感器响应优选能通过数码计数、重量测定、荧光、光学和/或电学手段来读取。
所述可检测传感器响应优选产生定量/定性、荧光、光学或颜色度量测定中的任意一种或其组合。
所述可检测传感器响应优选包括视觉响应、分光光度响应、荧光技术、电势或静电响应、磁性光折射、热、频率和数码响应。
所述可检测信号响应优选是数码的。
所述可检测信号响应优选产生定量或定性的测定。
所述表面结构优选是微米至纳米大小的表面结构，其基本一致且彼此间隔均一。
或者，所述表面结构随机排列在所述微阵列上。
所述表面结构优选采用锥形或脊状形式。
各表面结构的限定的功能化区域优选是所述锥或脊的顶端。
所述表面结构的顶端优选在约1nm-1000μm。
所述表面结构的顶端优选在直径约1μm-20μm。
所述表面结构的顶端优选在直径约5μm-约15μm。
所述表面结构的顶端优选与所述信号个体的大小相同或更小。
所述表面结构的顶端优选彼此间隔约5nm-约20μm。
所述表面结构的顶端优选彼此间隔约1μm-约20μm。
优选每平方厘米有约250,000-约10亿个顶端。
优选每平方厘米以分辨率10μm含有约250,000个顶端。
所述微阵列优选包括基材并由塑料材料(包括PMMA、PET和PS)或金属如铝或陶瓷或氧化物或硅或光致抗蚀剂形成。
所述微阵列优选由聚合物基质形成。
用于测量目的，优选在基材的底面上连接或形成图案化层(patterned layer)以在光穿透微阵列处将光沿表面分散。
所述三维微阵列优选通过蚀刻、平版印刷法、热压印、纳米压印和注射成型或者通过连续成型技术(Continuous Forming Technology)方法(如WO2007/058548所述)形成。
所述限定区域优选用NH2或COOH官能团功能化。
优选包含启动子区域的一条或多条单链核酸或包含感兴趣的特定碱基序列的一条或多条单链核酸连接于所述NH2或COOH官能团。
优选有接头基团连接于所述NH2或COOH官能团。
所述接头基团优选是共价接头基团。
所述感应剂优选连接所述接头基团。
所述感应剂优选直接连接所述NH2或COOH官能团。
所述接头基团优选选自脂族化合物、PEG分子和聚合物、蛋白质或DNA链。
或者所述感应剂通过接头基团直接连接于所述表面结构的顶端。
所述感应剂优选生物识别基团或结合剂。
所述感应剂/靶化合物优选为生物结合或识别基团，选自抗体/抗原，DNA/DNA，DNA/蛋白质，蛋白质/蛋白质，蛋白质/受体，细胞/蛋白质和细胞/DNA结合对。
所述微阵列优选包括多个感应剂，各感应剂形成所述微阵列的分区。
各限定的功能化区域优选包括多个感应剂。
所述微阵列优选在所述限定的功能化区域间涂覆有惰性材料。
优选在涂覆前，用硫醇、蛋白质或PEG材料处理所述微阵列以确保涂层粘附。
所述惰性材料优选选自金或银或铬，聚合物或油。
用于涂覆目的的所述惰性材料优选是选自金、银或铬其中任意两种金属的组合。
所述惰性涂层的厚度优选在亚纳米至微米至毫米度量范围。
优选利用挥发、涂装、沉积、溅射、等离子体处理、喷涂、浸涂或旋涂来施加所述惰性材料。
所述微阵列优选包括二级惰性涂层。
所述二级惰性涂层优选是硫醇化合物。
所述样品优选是生物样品，包括但不限于组织样品、流体样品，或口腔擦拭物。在一种优选实施方式中，所述样品是包含核酸的生物样品。在另一实施方式中，所述样品是包含微生物，多肽或蛋白和/或抗体的生物样品。
本发明的第三方面提供用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的三维微阵列，所述微阵列包括：
a)包括多个表面结构的基材；
b)所述多个表面结构包括感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物，所述感应剂包括在各表面结构顶部上限定的功能化区域上。
能提供可检测响应的信号个体优选连接样品中的待检测靶化合物以形成混配样品，且所述限定的功能化区域中的感应剂所给出的传感器响应通过所述信号个体与感应剂的连接来提供。
所述可检测传感器响应优选选自颜色、荧光、磁性或挡光。
所述可检测传感器响应优选能通过数码计数、重量测定、荧光、光学和/或电学手段来读取。
所述可检测传感器响应优选产生定量/定性、荧光、光学或颜色度量测定中的任意一种或其组合。
所述可检测信号响应优选是数码的。
所述可检测信号响应优选产生定量或定性的测定。
所述表面结构优选是微米至纳米大小的表面结构，其基本一致且彼此间隔均一。
或者，所述表面结构随机排列在所述微阵列上。
所述表面结构优选采用锥形或脊状形式。
各表面结构的限定的功能化区域优选是所述锥或脊的顶端。
所述表面结构上限定的功能化区域优选在约1nm到1000μm之间。
所述表面结构上限定的功能化区域优选在直径约1μm-20μm。
所述表面结构上限定的功能化区域优选在直径约5μm-约15μm。
所述表面结构的顶端优选与所述信号个体的大小相同或更小。
所述表面结构上限定的功能化区域优选彼此间隔约5nm-约20μm。
所述表面结构上限定的功能化区域优选彼此间隔约1-约20μm。
优选每平方厘米有约250,000到约10亿个限定的功能化区域。
优选每平方厘米以分辨率10μm含有约250,000个限定的功能化区域。
所述微阵列优选包括基材并由塑料材料、金属、陶瓷或氧化物或硅或光致抗蚀剂形成。
所述塑料材料优选选自PMMA、PET和PS。
所述金属优选铝。
所述微阵列优选由聚合物基质形成。
所述基材优选厚度在约500μm-约2mm。
用于测量目的，优选在基材的底面上连接或形成图案化层以在光穿透微阵列处将光沿表面分散。
所述表面结构优选通过蚀刻、平版印刷法、热压印、纳米压印和注射成型或者通过如WO2007/058548所述连续成型技术(Continuous Forming Technology)方法形成。
所述表面结构的限定区域优选用NH2或COOH官能团功能化。
优选包含启动子区域的一条或多条单链核酸或包含感兴趣的特定碱基序列的一条或多条单链核酸连接于所述NH2或COOH官能团。
优选有接头基团连接于所述NH2或COOH官能团。
所述感应剂优选连接于所述接头基团。
所述感应剂优选直接连接NH2或COOH官能团。
所述接头基团优选是共价接头基团。
所述接头基团优选选自脂族化合物、PEG分子和聚合物、蛋白质或DNA链。
或者所述感应剂通过接头基团直接连接于所述限定的功能化区域。
所述感应剂优选生物识别基团或结合剂。
所述生物结合或识别剂优选形成抗体/抗原，DNA/DNA，DNA/蛋白质，蛋白质/蛋白质，蛋白质/受体，细胞/蛋白质和细胞/DNA结合对的部分。
所述三维微阵列优选包括多个感应剂组合，各感应剂组合形成所述微阵列的分区。
所述限定的功能化区域优选包括多个已连接的感应剂。
所述三维微阵列优选在所述限定的功能化区域间涂覆有惰性材料。
优选在涂覆前，用硫醇、蛋白质或PEG材料处理所述微阵列以确保涂层粘附。
所述惰性材料优选选自金或银或铬，聚合物或油。
所述惰性材料优选是金、银或铬的任意组合。
优选利用挥发、涂装、沉积、溅射、等离子体处理、喷涂、浸涂或旋涂来施加所述惰性材料。
所述涂层的厚度优选在亚纳米至微米至毫米度量范围。
所述微阵列优选包括二级惰性涂层。
所述二级惰性涂层优选是硫醇化合物。
本发明的第四方面提供用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的二维微阵列，所述微阵列包括：
a)包括多个限定的功能化区域的基材；
b)所述多个限定的功能化区域包括感应剂，所述感应剂能与样品中的感兴趣靶化合物连接。
能提供可检测响应的信号个体优选连接样品中的待检测靶化合物以形成混配样品，且所述限定的功能化区域中的感应剂所给出的传感器响应通过所述信号个体与感应剂的连接来提供。
所述可检测传感器响应优选选自颜色、荧光、磁性或挡光。
所述可检测传感器响应优选能通过数码计数、重量测定、荧光、光学和/或电学手段来读取。
所述可检测传感器响应优选产生定量/定性、荧光、光学或颜色度量测定中的任意一种或其组合。
所述可检测信号响应优选是数码的。
所述可检测信号响应优选产生定量或定性的测定。
所述限定的功能化区域优选大小基本一致且彼此间隔均一。
或者，所述限定的功能化区域随机安置在所述微阵列的表面上。
各限定的功能化区域优选直径在约1nm-1000μm。
各限定的功能化区域优选直径在约1μm-约20μm。
各限定的功能化区域优选直径在约5μm-约15μm。
各限定的功能化区域优选直径约10μm。
各限定的功能化区域优选直径约1μm。
各限定的功能化区域优选直径约500nm。
所述表面结构的顶端优选与所述信号个体的大小相同或更小。
所述限定的功能化区域优选彼此间隔约5nm-约20μm。
所述限定的功能化区域优选彼此间隔约1-约20μm。
所述限定的功能化区域优选彼此间隔约5-约15μm。
所述限定的功能化区域优选彼此间隔约10μm。
所述限定的功能化区域优选彼此间隔约1μm。
所述限定的功能化区域优选彼此间隔约5-约1000nm。
优选每平方厘米有约250,000到约10亿个限定的功能化区域。
优选每平方厘米以分辨率10μm含有约250,000个限定的功能化区域。
所述二维微阵列的基材优选平面基质、球形基质或管状基质。
所述二维微阵列优选由塑料材料包括PMMA、PET和PS，或金属如铝，或陶瓷或氧化物或硅或光致抗蚀剂或玻璃形成。
所述塑料材料优选选自PMMA、PET和PS。
所述金属优选铝。
所述微阵列优选由聚合物基质形成。
所述二维微阵列优选厚度在约500μm-2mm。
用于测量目的，优选在基材的底面上连接或形成图案化层以在光穿透微阵列处将光沿表面分散。
所述限定的功能化区域优选通过将惰性材料在三维微阵列的表面结构之间成层以形成平坦表面，然后通过蚀刻技术去除所述惰性材料的顶层以显露所述微阵列的基材的限定区域。
优选在所述惰性材料成层之前，用硫醇、蛋白质或PEG材料处理所述微阵列以确保所述惰性材料的粘附。
所述惰性材料优选选自金或银或铬，聚合物或油。
所述惰性材料优选是金、银或铬的任意组合。
优选利用挥发、涂装、沉积、溅射、等离子体处理、喷涂、浸涂或旋涂来施加所述惰性材料。
或者所述限定的功能化区域由平版印刷法、印刷技术或掩蔽技术形成。
所述限定区域优选用NH2或COOH官能团功能化。
优选包含启动子区域的一条或多条单链核酸或包含感兴趣的特定碱基序列的一条或多条单链核酸连接于所述NH2或COOH官能团。
优选接头基团连接于NH2或COOH官能团。
所述感应剂优选连接所述接头基团。
所述感应剂优选直接连接所述NH2或COOH官能团。
所述接头基团优选是共价接头基团。
所述接头基团优选选自脂族化合物、PEG分子和聚合物、蛋白质或DNA链。
或者所述感应剂通过接头基团直接连接于所述限定的功能化区域。
所述感应剂优选生物识别基团或结合剂。
所述生物结合或识别剂优选形成抗体/抗原，DNA/DNA，DNA/蛋白质，蛋白质/蛋白质，蛋白质/受体，细胞/蛋白质和细胞/DNA结合对的部分。
所述二维微阵列优选包括多个感应剂组合，各感应剂组合形成所述微阵列的分区。
所述限定的功能化区域优选包括多个已连接的感应剂。
所述微阵列优选包括所述限定的功能化区域之间的二级惰性涂层。
所述二级惰性涂层优选是硫醇化合物。
所述二级惰性涂层的厚度优选在亚纳米至微米至毫米度量范围。
本发明第三和第四方面所述的微阵列，其中
a)所述微阵列上待形成所述限定的功能化区域的区域首先被可移除的封闭材料(例如蜡)覆盖，然后将覆盖在可移除封闭材料中的区域之间的区域用惰性材料涂覆；
b)通过下述过程形成所述限定的功能化区域：(i)完全或部分去除所述惰性涂层以显现下方的基材从而产生限定区域，和(ii)将所述区域用感应剂功能化；以及
c)通过摩擦、磨蚀、加热、切削、电烧蚀、切片、电抛光、铁铣、激光或蚀刻技术去除所述惰性涂层。
本发明的第五方面提供用于测定样品中是否存在包含特定碱基序列的核酸的方法，所述方法包括：
a)在核酸样品中，若核酸为双链，则分离成单链；
b)混合核酸单链与信号个体偶联物以形成混配样品；
c)通过如本发明第三或第四方面所述使所述混配样品流过功能化
微阵列的表面并对结合的信号个体偶联物计数来测定是否存在所述包含
特定序列的核酸。
本发明的第六方面提供测定基因启动子区内甲基化程度的方法，所述方法包括：
a)在核酸样品中，若核酸为双链，则分离成单链；
b)处理所述核酸样品使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
c)混合核酸的单链与信号个体偶联物以形成混配样品；
d)通过如本发明第三或第四方面所述使所述混配样品流过功能化微阵列的表面并对结合的信号个体偶联物计数来测定所述启动子区的甲基化的存在和/或程度。
所述未甲基化胞嘧啶碱基优选通过用亚硫酸氢盐化学转化成尿嘧啶。
本发明第五和第六方面所述的方法，其中：
a)所述核酸单链优选在与所述信号个体偶联物混合之前功能化，其优选用末端羧基或氨基官能团功能化；
b)所述微阵列优选是本发明第三和第四方面所述的二维或三维微阵列，所述微阵列的限定区域优选通过连接一种或多种核酸单链来功能化；
c)所述信号个体偶联物优选由信号个体与互补化合物连接形成，所述互补化合物能(直接或间接地)结合微阵列限定功能化区域所连接的核酸单链；
d)所述混配样品优选利用合适pH的合适缓冲液制备，所述混配样品优选是水溶液；
e)所结合信号个体偶联物的数量优选通过视觉技术、分光光度技术、荧光技术、电势或静电技术、磁性光折射、热、频率和数码技术来确定。
本发明的第七方面提供功能化微阵列的多个限定区域的方法，以用于测定样品内是否存在某分子或化合物和/或所述分子或化合物是否以任何方式被修饰，所述方法包括使所述感兴趣的分子或化合物与本发明第三或第四方面所述的限定区域连接，并包括下列附加步骤：
a)形成信号个体偶联物并使所述偶联物与连接于限定的功能化区域的所述感兴趣分子或化合物连接；
b)洗去未与连接限定功能化区域的感兴趣分子或化合物结合的过量信号个体偶联物；
c)对所结合信号个体偶联物计数；
d)将用于本发明第五和第六方面的已结合信号个体偶联物脱离，仅留下连接所述限定功能化区域的感兴趣分子或化合物。
所述微阵列优选是本发明第三和第四方面所述的二维或三维微阵列，所述微阵列的限定区域优选通过连接感兴趣分子或化合物来功能化。
所述信号个体偶联物优选由信号个体与互补化合物连接形成，所述互补化合物能(直接或间接地)结合微阵列限定功能化区域所连接的感兴趣分子或化合物。
连接于所述限定功能化区域的感兴趣分子或化合物优选是与形成所述信号个体偶联物某部分的单链核酸为互补的单链核酸。
连接于所述限定功能化区域的感兴趣分子或化合物优选是肽、抗体或微生物(例如，病毒颗粒或细菌)。
所述过量信号个体偶联物优选通过用运载体溶液清洗所述微阵列表面来去除。
所述运载体溶液优选缓冲液。
所结合信号个体偶联物的数量优选通过视觉技术、分光光度技术、荧光技术、电势或静电技术、磁性光折射、热、频率和数码技术来确定。
所述结合的信号个体偶联物优选响应其环境变化而自限定的功能化区域脱离，所述环境变化包括但不限于所述水溶液的pH变化。
所述信号个体偶联物的脱离优选是可逆的。
该可逆性优选通过改变水溶液的pH实现。
该可逆性优选允许所述微阵列保存并使用多次。
所述微阵列优选保存于约4°C冰箱内。
在第七方面的优选实施方式中，本发明提供功能化微阵列的多个限定区域的方法，以用于测定样品内是否存在包含特定碱基序列的核酸和/或测定测定核酸单链的启动子区域内甲基化的存在和/或程度，所述方法包括使所述核酸单链与本发明第三或第四方面所述的限定区域连接，并包括下列附加步骤：
a)形成信号个体偶联物并使所述偶联物与连接于限定功能化区域的核酸连接；
b)洗去未与连接限定功能化区域的核酸结合的过量信号个体偶联物；
c)对所结合信号个体偶联物计数；
d)将用于本发明第五和第六方面的已结合信号个体偶联物脱离，仅留下连接于所述限定功能化区域的核酸。
所述核酸单链优选利用标准技术通过羧基或氨基连接于所述限定区域，所用技术包括但不限于DCC偶联。
在第八方面，第七方面所述的方法可包括使化合物连接于微阵列的限定区域并可包括下列附加步骤：
a)提供互补化合物并使所述互补化合物与连接于所述限定区域的化合物连接；
b)使信号个体与所述互补化合物连接而在所述限定区域上形成信号个体偶联物；
c)对所结合信号个体偶联物计数；
d)将所述信号个体偶联物脱离从而仅留下连接于所述限定区域的化合物。
优选以水溶液将信号个体在所述微阵列的表面结构上洗涤来形成所述信号个体偶联物。
所用信号个体优选为本发明第一和第二方面中所述的。
在第八方面的优选实施方式中，本发明第七方面所述的方法可包括使核酸单链与微阵列的限定区域连接并可包括下列附加步骤：
a)合成所述核酸的互补链并使所述互补链与所述已结合核酸连接；
b)使信号个体与所述互补链连接而在所述限定区域上形成信号个体偶联物；
c)对所结合信号个体偶联物计数；
d)将所述信号个体偶联物脱离从而仅留下连接于所述表面结构的核酸单链。
所述互补链优选利用核酸合成仪合成并用末端羧基或氨基功能化且通过所涉及核酸链的羧基和氨基之间的互补相互作用而结合核酸单链。
本发明的第九方面提供用于测定环境、饮食或药物对于核酸的潜在和/或实际影响的方法，所述方法包括使用本发明第六方面所述的方法确定核酸启动子区域内的甲基化程度。
附图说明
图1：以示意图形式显示三维微锥阵列基质的制备；
图2：以示意图形式显示所述三维微阵列表面结构的程式化描绘；
图3：显示从三维微阵列产生二维微阵列的图示表述的侧视图；
图4：显示从三维微阵列产生二维微阵列的图示表述的顶视图；
图5：以示意图形式显示数码生物传感(Digital Biosensing)的制备-单一夹心试验(Single“Sandwich”Assay)；
图6：以示意图形式显示数码生物传感的制备-多重夹心试验(Single“Sandwich”Assay)；
图7：以示意图形式显示用于如本发明一种实施方式中所详述微阵列的功能化的替代方法；
图8：以示意图形式显示如何按本发明一种实施方式中所详述使微阵列功能化；
图9：以示意图形式显示微阵列如何在图5所示功能化后用作检测器；
图10：以示意图形式显示微阵列如何在图7所示功能化后用作检测器；
图11：显示功能性三维微锥阵列的数码图像。
具体实施方式
本发明关注用于高灵敏度和选择性的检测/探测应用的二维和三维微阵列的开发。具体地，本发明一般涉及检测样品中的化合物也涉及测定样品中是否存在含特定碱基序列的核酸，定量样品中特定核酸碱基序列的数量，测定具体基因的启动子区域内甲基化的存在和/或程度，和多种因素对核酸甲基化的影响，这些因素包括环境、饮食或药物。
本发明在一般意义上提供用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包括多个限定的功能化区域的微阵列，所述限定的功能化区域是连接有感应剂的限定区域，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物；
b)将所述微阵列与至少部分样品接触；以及
c)通过对所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应的检测来测定感兴趣靶化合物的存在。
特别优选所述微阵列上的多个限定的功能化区域是多个表面结构上的限定区域。
因此，在更具体意义上，本发明提供用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供在基材上包括多个表面结构的微阵列，所述表面结构在各表面结构顶端或顶部的限定的功能化区域上连接有感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物；和
b)将至少部分样品通过所述阵列；以及
c)通过对所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应的检测来测定感兴趣靶化合物的存在。
本发明还提供：
1)用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的三维微阵列，所述微阵列包括：
a)包括多个表面结构的基材；
b)所述多个表面结构包括感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物，所述感应剂包括在各表面结构顶部上限定的功能化区域上；以及
2)用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的二维微阵列，所述微阵列包括：
a)包括多个限定的功能化区域的基材；
b)所述多个限定的功能化区域包括感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物。
显然，本发明所述的二维和三维微阵列可应用于前文所称用于测定样品中感兴趣靶化合物存在的方法中。
参见图1和2，本发明所述微阵列1的基材由厚度在约500μm到约2mm范围内的平坦底部2组成。就三维微阵列而言，限定的功能化区域采用从所述平坦底部凸出(图1,(B)，图2,(A))的表面结构3的形式(例如，“锥形”或“脊状”)。就二维微阵列而言，所述限定的功能化区域是平坦的传感器位点，并因而不从所述底部凸出。所述二维微阵列的平坦底部可以是平面基质、球形基质或管状基质。表面结构4的顶部和平坦的传感器位点在微阵列上形成限定的功能化区域，且包括能连接样品中的感兴趣靶化合物的感应剂。感应剂与所述靶化合物的连接导致或可以使其导致可检测的响应，从而那些限定的区域可“功能化”以给出传感器响应。
这些限定区域4优选是微米至纳米大小，其基本一致且彼此间隔均一。或者，这些限定的功能化区域是随机排列在所述微阵列表面上的微米至纳米大小的区域。
在优选实施方式中，所述微阵列是三维微阵列，其中均匀间隔的锥或脊形成所述基材的部分以使终端应用更精确。所述锥或脊的大小通常在底部直径约100nm到约10mm而顶端直径约1nm到约1000μm。如本领域技术人员所知，可有替代的顶端直径，包括从约1μm到约20μm和约5μm到约15μm。所述顶端也可小到直径约10μm，约1μm或约500nm。所述锥或脊以限定模式紧密堆积。例如，顶端大小为1μm的锥与其它顶端间隔1μm，这样将产生每平方厘米2500万个顶端的阵列，而以500nm间距与其它顶端隔开的500nm锥将产生每平方厘米1亿个顶端的阵列。所述锥或脊可彼此间隔约5nm到约20μm。所述锥或脊优选彼此间隔约1μm到约20μm。约5μm到约15μm，或约10μm，或约1μm，或约5nm到约1000nm的替代间距也可以。优选每平方厘米有分辨率为10μm的约250,000个功能化顶端到有约1亿个功能化顶端。所述限定的功能化区域(图1和2中标为4)将存在于所述锥或脊的顶端，使得这些区域的大小和间距以及所得功能化区域的数量反映那些间距和数量。因此，用户明确知晓所述微阵列表面上有多少功能化顶端。所述微阵列的总体尺寸可根据终端用户的需要而改变。这是本发明的主要优势。所述微阵列的尺寸区域通常在小到约10mm2到约150mm2范围内。可获得超出这一范围的尺寸区域。由图2C可见，在功能化所述限定区域后，也可通过微珠偶联物35与靶分析物的连接来检测样品中靶分析物的存在，所述微珠偶联物35能连接感应剂以给出传感器响应。下文将更详细讨论这一点。
在另一实施方式中，所述微阵列是二维微阵列(图1和2中未显示，最佳如图4所示)，其中所述平坦的限定功能化区域的大小在直径约1nm到约1000μm。所述平坦的限定功能化区域优选大小从约1μm到约20μm，或约5μm到约15μm。所述平坦的限定功能化区域也可小到直径约10μm，约1μm或约500nm。所述限定功能化区域以限定模式紧密堆积。例如，间隔1μm、直径1μm的限定功能化区域将产生每平方厘米2500万个限定功能化区域的阵列。所述限定的功能化区域理想上彼此间隔约1μm到约20μm。约5μm到约15μm，或约10μm，或约1μm，或约5nm到约1000nm的替代间距也可以。优选每平方厘米有分辨率为10μm的约250,000个功能化顶端直到有约1亿个限定功能化区域。均匀间隔的结果是，用户明确知晓所述微阵列表面上有多少限定功能化区域。与三维微阵列相同，二维微阵列的大小也可根据用户的终端需求而改变。
重要的是，所述限定功能化区域随机排列在所述微阵列表面上的情况下，在用户对所述微阵列的表面进行数字化扫描以前，所述微阵列表面上限定功能化区域的数量的确切定量都是未知的。而且，并非所有的限定区域都被功能化，尽管可能有意为之。因此，除非上下文明确另有所指，提及功能化应视为提及基本上所有限定区域的功能化以反映事实。
所述微阵列的基材可由塑料材料包括PMMA、PET和PS，或金属如铝，或陶瓷或氧化物或硅或光致抗蚀剂形成(图1(A))。不同于三维微阵列，二维微阵列也可由材料如玻璃制得。就成本和加工优势而言，所述微阵列的基材优选由聚合物基质制成。可用能加工表面结构的任何方法来加工所述三维微阵列的基材。例如，可采用蚀刻技术，平版印刷法、连续成型技术、热压印、纳米压印和注射成型。形成三维微阵列基材的优选方法是如WO2007/058548所述的连续成型技术。采用该方法时，可简易且低成本地大量制备所述基材。
所述二维微阵列可通过使惰性材料在三维微阵列的个体结构之间成层来形成平坦的表面。所述惰性材料优选金、银或铬。或者，所述惰性材料可以是聚合物或油。用多种不同涂覆方法中的任意一种来引入所述惰性材料，这些方法包括但不限于挥发、涂装、沉积、溅射、等离子体处理、喷涂、浸涂和旋涂。然后可采用蚀刻技术来去除惰性材料的顶部以产生平坦表面，其上露出基材的限定区域，从而这些限定区域可用作限定的功能化区域。形成二维微阵列的这种方法特别适于三维阵列的结构高度与涂层的厚度(亚纳米至微米至毫米)相同或低于该厚度的情形。然后，顶部涂层的去除将产生基本平坦的二维微阵列，阵列上具有可按需功能化的限定区域。图3和4显示从三维微阵列产生二维微阵列的图示表述(分别为侧视图和顶视图)。由图3可见，三维初始结构5在底部7上有多个表面结构6。如图3B可见，表面结构6之间的区域8被填以涂层9。如图3B还可见，涂层9还覆盖了表面结构6的顶部。为形成待功能化的限定区域，将涂层9的顶部去除(图3C)，表面结构6的顶部也被去除。这样在平坦表面上留下可按需功能化的限定区域10。此时微阵列是二维的。参见图4，显示图3的微阵列形成的顶视图。图4B显示表面结构6如何被涂层9覆盖(图4B)，然后部分除去涂层以留下可被功能化的限定区域10(图4C)。
形成二维微阵列的替代方法包括但不限于：平版印刷、印刷或掩蔽技术。但是，可以使用替代技术。在采用掩蔽技术时，将掩蔽元件以设定模式施用于平坦底部，然后将两者涂覆以惰性材料。随后去除掩蔽元件以留下具有未涂覆区域的基质。然后这些未涂覆区域可用作限定的功能化区域。
三维微阵列的表面结构(例如，锥或脊)或二维微阵列上的平坦限定区域形成基材的部分，产生基质，其上可产生限定的功能化区域。这种区域通过所述锥或脊的顶部(或顶端)的功能化或所述平坦区域的功能化来形成。
首先，将官能团连接到所述顶端或平坦的传感器位点。通常采用官能团如-NH2或-COOH。但是，可使用很多其它官能团，包括醛和硫醇等。然后优选将接头基团结合于所述NH2或COOH官能团。可采用很多不同的接头基团，包括但不限于脂族长链或短链，PEG分子和聚合物，蛋白质链或DNA链。所述接头基团可用多种技术来引入，包括但不限于等离子体处理和湿化学技术。
接着将感应剂固定化到(连接于)所述接头基团上。或者所述感应剂可不经接头直接连接于-NH2或COOH官能团，但接头的使用是优选项。感应剂选自生物识别基团或结合剂，并包括抗体/抗原，DNA/DNA，DNA/蛋白质，蛋白质/蛋白质，蛋白质/受体，细胞/蛋白质和细胞/DNA结合对等。根据用户想要检测的靶化合物/分子的性质来从中选择。因此，所述感应剂必需能用作感兴趣靶化合物/分子的生物识别基团或结合剂(即，与之连接)。
在前述顺序中，各层之间，也就是基材、官能团、接头和感应剂之间，采用共价连接以形成连接。共价连接是优选，但不是必需的。例如，在适当情况下，可采用非共价连接技术如静电吸收和基于电荷的吸收。
在因为感应剂的大小而使位阻对感应剂的连接造成困难时，可在所述限定功能化区域和感应剂之间插入额外的接头。所述感应剂也可直接结合于所述锥、脊顶端或平坦位点，只要所述基材的顶端或平坦传感器位点处纳入（如上所述优选为共价结合）有接头。
感应剂的添加使得所述微阵列能用作具有定量/定性、荧光、光学或色彩度量的测定结果的数码传感器。这是因为在靶分析物识别所述感应剂的时候，该分析物其本身结合感应剂或转而与感应剂连接，并因此转而与所述微阵列连接。微阵列上感应剂与分析物的这一连接导致或可以使之导致传感器响应并使得所连接分析物的数量得以‘计数’。因此，用户能精确地确定靶分析物在其样品中的比例。就传感器响应而言，优选定量/定性测定，因为它们能通过数码方式精确解读。
但是，靶分析物连接的程度也可采用很多其它技术来确定，包括但不限于重量测定、荧光、光学、色彩度量和/或电学(电势或静电)技术。优选数码测定时，可用市售微扫描仪(MicroScanner)，显微镜和/或数码成像来进行，可需要或无需光透过所述样品。可采用替代方法，正如本领域技术人员所知。在光透过样品的情形中，可能需要在基材下部连接或形成(通过蚀刻技术或前文讨论的类似技术)图案化层以使光沿表面漫射。不同波长光的使用可允许用户检测样品内的不同靶分析物和/或反应的发生和/或关于所结合靶分析物的信息，例如识别细胞类型或活力。
在一种实施方式中，本发明提供潜在有用的筛选方法，用于根据大小和/或形状来区分可能存在于样品中的靶分析物。例如，在结合于本发明所述微阵列的限定功能化区域上的感应剂时，靶分析物如细菌可显示特定的形状和/或大小。可通过使光透过微阵列并评估被所述靶分析物阻挡的限定功能化区域的数量来确定所述形状和/或大小。这可直接表明大小但间接表明形状，因为被阻挡的限定区域将有效形成形状。很可能所述靶分析物如细菌通常会以相同方式结合微阵列的限定功能化区域上的感应剂。因此，在结合于本发明所述微阵列的限定功能化区域上的感应剂时，同类靶分析物可能潜在地显现同样的大致形状和/或大小。本发明以此方式提供筛选方法，根据不同靶分析物的不同形状和/或大小用户可能能产生解决方案。此类筛选应用所采用的样品优选是稀样品，因为稀样品更能使用户根据靶分析物的形状和/或大小来对其加以区分。
不能直接观察靶分析物时，可通过简单的物理吸附技术或由不同的偶联化学技术通过共价连接将剩余感应剂与信号个体连接，信号个体的尺度为纳米到毫米并具有特定的性质，所述性质由所需响应决定(例如，色、荧光、磁、热、电或光阻挡)。反之，信号个体可以类似手段连接所述已结合的靶分析物。
所用信号个体优选与所述表面结构的顶端或(二维微阵列的)所述限定平坦区域大小相同或者更大。所述信号个体可以是任意形状且大小可以是能覆盖微阵列表面上的多个单独的限定区域。所述信号个体优选采用颗粒形式，例如发色、荧光、磁性或光阻挡微珠。在采用发色、荧光、或光阻挡颗粒时，可对微阵列所结合的颗粒数量进行计数。在采用不同形状的信号个体和/或不同大小的信号个体时，所述响应是视觉响应，即，用户能根据信号个体的大小和/或形状来检测不同靶分析物的存在。其它传感器响应包括定性或定量响应，例如冲浪测定，荧光响应，分光光度响应，电势响应或静电响应，磁性光折射，热以及频率响应。信号个体也可用于形成信号个体偶联物，后文将进一步详述。
另一实施方式中，本发明提供所存在靶分析物的性质的测定方法。例如，熟知单一类型的细菌可能有多种菌株。用户可用能结合多种菌株的感应剂将微阵列功能化，使得当功能化微阵列接触样品时，用户能在常规意义上测定样品内某一细菌的存在。然后，用户可以使所连接的细菌接触颗粒(例如，信号个体)，所述颗粒经过功能化能区分特定菌株。这可以通过用组合物来清洗连接有靶分析物/细菌的微阵列来实现，所述组合物包括能特异性结合特定菌株的信号个体。存在目标菌株时，所述颗粒将连接并给出传感器响应。
感应剂的选择使用户能操纵所述限定功能化区域以感应一种或多种靶分析物。例如，可有不同的感应剂连接于限定的功能化区域使得微阵列的不同分区拥有不同的感应剂。此外，如上所述的限定功能化区域的紧密堆积和相应的每平方厘米高数量限定功能化区域，产生高灵敏度的微阵列。例如并如上所述，在三维微阵列的表面结构顶端上各限定功能化区域连接有一个感应剂时，所有均彼此相隔1μm间距的1μm顶端将产生每平方厘米2500万个功能化顶端的阵列。类似地，顶端直径500nm时，所述阵列将含有10亿个限定功能化区域(即，功能化顶端)。高数量的限定功能化区域允许高通量的靶分析物筛选和/或分析。优选各限定功能化区域添加一种感应剂，因为这给出高度灵敏的传感器表面且允许对感应剂所连接的靶化合物/分析物直接数码计数。提高的灵敏度通过确保限定功能化区域与如上所述靶分析物或所连接颗粒相比大小相同或更小来实现。适当时，可采用较大的锥、脊顶端或平坦传感器位点以及由此得到的较大限定功能化区域，允许添加多个感应剂到所述限定功能化区域。其结果是形成与条带测试类似的传感器。例如，若三维微阵列的锥顶端大小(即，限定功能化区域)是200μm，且感应剂大小仅1μm，可形成包含数百万单独且相同的条带传感器的微阵列。尽管所连接化合物/分析物的单独计数可能不再可行，用户仍能检测其样品中靶的存在，且还可能进行实时检测实验。微阵列传感器表面的高灵敏度还可能允许单分子检测，特别是在实时限定功能化区域可制备成小于μm水平时。
通过用惰性材料涂覆微阵列的基材以使非特异性结合最低而实现三维微阵列灵敏度的进一步提高，使得能进行更精确的测定如数码计数。这可以参见图1和2。图1B显示初始未涂覆形式的表面结构3和底部2。然后，图1C整体显示微阵列的表面，其涂覆有合适惰性材料层11。然后，图1D显示通过从表面结构3的顶部去除涂层11以及表面结构3本身的部分来产生用于功能化的限定区域4。图1D的侧视图显示该过程如何产生限定区域4的模式。这也可见图2所示。为实现这一目的，用多种不同涂覆方法中的任意一种来将惰性材料引至基材表面，这些方法包括但不限于挥发、涂装、沉积、溅射、等离子体处理、喷涂、浸涂和旋涂。
如前文所述，当微阵列个体结构之间的区域被惰性材料完全填充时，可形成二维微阵列。
所述惰性材料本身可以是能产生非反应性表面的几乎任何东西，包括金属如金、银或铬，或聚合物，涂料和油。所述惰性材料也可由联合使用的金属组合物组成。根据所述微阵列的用途，所述惰性涂层的厚度范围可以在亚纳米至微米至毫米。在所述惰性材料的粘附成问题时，在涂覆惰性材料前，可以用基于硫醇的化合物、蛋白质或PEG分子/聚合物等来处理基材。在金涂覆且非特异性结合仍然成问题的情况中，可施用硫醇等的二级涂层以进一步减弱非特异性结合。
基材一旦涂覆后，优选处理基材以去除小的特定涂层区域，以允许微阵列限定区域的功能化(如上所述并图2(C)所示)并从而产生其相应的传感器性能。
在三维微阵列的情形中，优选锥形或脊状结构(或其它类似结构)的顶端被去除涂层(图1(D)，图2(B))。在二维微阵列的情形中，蚀刻技术可用于形成平坦的限定区域。优选从这些区域将涂层完全去除以露出下方的基材。或者，可以从这些区域仅去除部分涂层使得保留所述惰性材料的薄涂层。出乎意料地，发明人发现极薄涂层的存在不显著抑制所述限定区域的功能化。
可采用各种方法来去除锥或平坦限定区域(即，潜在的传感器位点)的涂层。但是，所用方法优选能从顶端去除精确大小和深度的惰性涂层。因此，在所述微阵列是三维微阵列时常常采用摩擦、磨蚀、加热、切削、电烧蚀、切片、电抛光、铁铣、激光或蚀刻技术。
相反地，也可采用掩蔽技术以确保任何惰性涂层仅终结于三维微阵列基材的侧面和谷区(而非顶端)。采用该技术，可通过将基材倒置浸入蜡溶液来掩蔽或保护所述锥或脊，或者用来产生所述表面结构的模表面(其可在顶端具有孔径)可用作掩体。若掩蔽化合物或模表面在其顶端没有允许进行功能化的孔径，则随后将其除去。可采用掩蔽或蚀刻技术或平版印刷法、印刷技术来去除二维微阵列限定区域的涂层。
金是优选的惰性涂覆材料。但是，在采用该材料时优选施用二级硫醇涂层以进一步降低非特异性结合。蒸发技术提供将金涂层施加到基材的理想方法。
金覆盖的三维微阵列传感器可用于“竞争”或“抑制”实验的数码生物传感，特别是当小分子化合物(或分析物)如抗生素、类固醇激素、药物残基和小蛋白质类或DNA样品是所需靶化合物时。
例如，参见图5，金覆盖的三维微阵列20已用于抗体/乳抗生素或Ab/Ag对的“竞争试验”。锥顶端22去除金涂层21(图5,(A))后，在硼酸盐缓冲剂(pH8.5)用针对抗生素的抗体Y（25）将这些顶端功能化，所述抗体被固定在微阵列的表面上(图5,(B))。然后，微阵列在放置过夜后接触含2%OVA的PBS溶液以防止或消除发生于剩余金涂覆表面上的非特异性结合。此时微阵列20(图5(B))即可用作传感器。
然后将含已知乳蛋白23的乳溶液流过该微阵列。该已知乳蛋白是抗体Y（25）应当结合的靶分析物。该蛋白浓度低时，观察到很少结合(图5,(C-1))。相反地，浓度高时观察到许多结合(图5,(C-2))。
然后使图5(C-1)和(C-2)的微阵列接触带色微珠/抗蛋白质抗体偶联物24，其通过不同表位结合或连接于表面所结合的乳蛋白23(图5,(D-1)和(D-2))。微珠24用作提供可检测信号的信号个体。当很少分析物23结合时，观察到许多微珠/抗体偶联物24的连接，反之亦然。然后进行该微阵列的数码试验(图5,(E-1)和(E-2))。这涉及对带色微珠/抗体偶联物的数量或空余锥顶端的数量的直接计数。所述乳蛋白的浓度与带色微珠的数量成比例(夹心试验)，但与空余锥顶端的数量成反比。因此，高比例的带色珠将表明高浓度的靶分析物，反之亦然。
在采用“抑制”试验形式时，固定化于微阵列表面上的是小分析物分子(例如，乳抗生素作为靶分子)。抑制试验形式中的传感器表面可多次再生用于多次测定，而竞争试验通常作为一次性传感器仅使用一次。
上述方法可以标准形式重复，由此使功能化的微阵列接触含靶分析物的溶液。这些在识别时结合感应剂，并在光透过该微阵列时，具有结合了靶分析物的感应剂的限定功能化区域将被靶分析物有效阻挡，从而能对“变暗”区域进行数码计数。
金覆盖的三维微阵列传感器还可用于多重“夹心”试验数码生物传感形式，该形式中用户希望检测大的靶化合物或分析物如蛋白质、病毒细胞和细胞。此类分析物通常有针对感应剂的多个连接位点(称为表位)。
例如，参见图6，三种不同抗体25、26、27(在区域X、Y和Z)被以设定位置固定化在微阵列20的无金且功能化的锥顶端22表面上(图6,(B-1))，或被随机固定化在锥顶端22表面上(图6,(B-2))。
然后使微阵列20接触含2%OVA的PBS以阻断金表面21上的任何非特异性结合。然后将3中不同的大分析物28、29、30接触传感器表面。它们结合其对应的抗体25、26、27(图6，(C-1)和(C-2))。
此后，三种带色微珠/抗体偶联物31、32、33分别结合所述3种不同的大分析物28、29、30(夹心试验)以形成传感器表面上的多色试验(图6，(D-1)和(D-2))。
然后可以通过对这3种不同的带色微珠31、32、33分别计数或通过进行数码、重量、荧光或电学测定来确定所述3种分析物28、29、30的样品浓度。分析物28、29、30的浓度与传感器表面上的带色微珠31、32、33的数量(图6，(E-1)和(E-2))直接成比例，使得夹心试验形式通常比竞争或抑制试验形式更灵敏。此类多重分析形式还可应用于进行小分子分析物数码生物传感的“竞争”或“抑制”试验。
在本发明的优选实施方式中，二维和三维微阵列可用于测定感兴趣的分子或化合物是否存在于样品中和/或以任何方式被修饰。所述分子或化合物可以是任意生物或化学性质，例如，包括但不限于：核酸，肽或蛋白质，微生物(包括但不限于朊病毒、病毒、细菌)，抗体或任意类型的小化学分子。本发明可用来检测的修饰类型的示例包括但不限于：结构改变，取代，转录后和翻译后修饰(包括糖基化)和核酸的甲基化。
本发明可用于多种应用，包括诊断和法医学应用，例如鉴定特定核酸序列(包括可能是疾病信号的核酸序列中的突变)的存在与否，或可能与疾病关联的甲基化模式。
说明书以下部分着重于靶化合物为核酸分子的分析。但是，应理解所描述的大体方法可用于如上描述的其它分子或其它靶化合物。因此，技术人员了解本发明具有多种用途。
为确定样品内是否存在某分子或化合物和/或所述分子或化合物是否以任何方式被修饰，首先将感兴趣样品与信号个体偶联物(其形成详述于下文)混合以形成混配样品。然后使混配样品穿过二维或三维微阵列的表面并对所结合信号个体偶联物的数量进行计数。所述混配样品优选是水溶液并以合适pH用合适缓冲液如PBS制备。pH优选在约4.0到约9.0之间，更优选在约7.0到约7.5之间。所述信号个体偶联物优选仅结合混配样品内的感兴趣分子或化合物以形成信号个体偶联物复合体。
因此，本发明提供测定样品中是否存在包含特定碱基序列的一种或多种核酸(例如，DNA或RNA链)的方法。类似地，本发明提供测定核酸甲基化的存在和/或程度的方法，优选基因启动子内或启动子周围(本文中称作启动子区域)的甲基化。包含甲基化启动子区域的基因不能用于转录目的。
用于测定样品中是否存在包含特定碱基序列的一种或多种核酸的方法必需进行下列预备步骤。首先，采集核酸样品。所述核酸可获自任意合适的生物材料，包括但不限于组织样品、流体样品或口腔擦拭物。所述核酸是双链时，用已知技术分离成单链。第二，将单链与信号个体偶联物(其形成见下文所述)混合以形成水性混配样品。使所述混配样品流过上文所述的单一(若所述试验是针对单一碱基序列)或多重(若所述试验是针对超过一种碱基序列)功能化的二维或三维微阵列。
用于测定核酸甲基化的存在和/或程度的方法也构成本发明的一个方面，并包括下列预备步骤。首先，如上文就本发明第一方面的第一优选实施方式所述从合适生物材料采集核酸样品。所述核酸是双链时，用已知技术分离成单链。第二，处理核酸单链内的启动子区域使得存在的所有未甲基化的胞嘧啶碱基被转化为尿嘧啶。未甲基化胞嘧啶向尿嘧啶的转化优选由化学转化实现，由此将未甲基化的胞嘧啶碱基在与亚硫酸氢盐反应时磺化并脱氨(Nucleic AcidsResearch,(1996)24卷24期，5064-5066页)。已知亚硫酸氢盐仅与未甲基化的胞嘧啶碱基反应。因此，启动子区域内存在的任何甲基化胞嘧啶碱基保持不变。第三，将经处理的核酸单链与信号个体偶联物(其形成见下文所述)混合以形成水性混配样品。完成这些步骤后，用上文所述的单一(若所述试验是针对单一启动子类型)或多重(若所述试验是针对超过一种启动子类型)功能化的二维或三维微阵列来对胞嘧啶碱基是否经过转化并因此未经甲基化进行测定。
参见图7-10，可使用下列关键词：
感兴趣的启动子区域或碱基序列(P1)：
—
信号个体：
信号个体偶联物：
或
信号个体偶联物/核酸复合体：
或
含P1的核酸：
就本发明涉及核酸检测的目的而言(并参见图7)，二维和三维微阵列的限定区域分别可按下列方法功能化(该微阵列除限定区域外的其余表面优选已涂覆有惰性材料)：
a)将含有感兴趣的启动子区域或特定碱基序列的一种或多种核酸单链结合于所述限定区域(图7,(B));
b)形成信号个体偶联物并随后在微阵列的限定区域上洗涤使得所述偶联物连接所述已结合的核酸(图7,(C))；
c)洗除未与核酸结合的过量信号个体偶联物以使用户能确定结合于微阵列限定区域的信号个体偶联物的数量或对其计数；以及
d)使所结合的信号个体偶联物脱离仅留下步骤(a)中结合于微阵列限定区域的核酸(图7,(D)；
e)此时所述区域为包含已知含量和类型的感应剂(核酸)的限定功能化区域。
可用标准技术将包含感兴趣的启动子区域或其它碱基序列的多种核酸通过羧基或氨基基团结合于限定区域。二环己基碳二亚胺(DCC)偶联提供用于此目的的合适技术的示例。如前文所述，可以采用其它偶联技术，包括使用接头分子。类似地，可仅用包含感兴趣的启动子区域或其它核酸序列的一种核酸来功能化各限定区域。
与靶分析物的检测相关联，上文广泛描述了对核酸以外的分子或化合物感兴趣时用于功能化微阵列并形成信号个体偶联物的广泛方法。只要考虑感兴趣化合物的性质，技术人员不难了解用于将此类化合物或分子连接于平坦的传感器位点、表面结构和信号个体的适当化合物和条件。
信号个体偶联物优选通过使信号个体与含感兴趣启动子区域或其它碱基序列的核酸的合成互补拷贝连接而形成。所述核酸的互补拷贝优选采用核酸合成仪来合成，并功能化所述信号个体连接的末端官能团。或者，所述互补拷贝采用重组技术获得。合适的末端官能团的示例包括羧基或氨基基团。二环己基碳二亚胺(DCC)偶联提供用于将互补拷贝与信号个体偶联的合适标准技术的示例。
所述信号个体可以是能提供可检测信号或响应的任何化学、生物或物理个体。合适化学个体的示例包括但不限于：化学小分子、荧光团、化学发光标签或聚合物。也可采用聚合形成化学反应或系列反应，所述反应用来形成能连接并提供信号个体的已知个体。合适生物个体的示例包括但不限于：细菌、病毒或生物材料的集合(例如，多条DNA链的集合，或叶绿素)。合适物理个体的示例包括但不限于颗粒或微珠等。在优选实施方式中，信号个体是物理个体如带色微珠、荧光微珠、磁性微珠或光阻挡微珠。优选采用由聚合材料形成的微珠，因为它们易于以多种形式(包括带色、磁性和荧光)和多种功能(例如，羧基化或氨基化)获得。合适的聚合微珠的示例包括聚苯乙烯珠、PMMA珠和PET珠。
所述颗粒或珠优选为纳米到毫米尺寸，使得微阵列的限定区域与信号个体相比大小相同或更小。这将允许限定功能化区域和颗粒之间的优选1:1比率，与限定功能化区域所结合的含启动子区域或碱基序列的核酸的数量无关，这一点进而有助于后续传感应用中使用的所结合信号个体偶联物数量的精确定量。该精确定量也使用户能确定是否有任何未活化的限定区域。或者，所述颗粒或珠可以显著大于微阵列的限定区域并可以是任意形状。
所结合的信号个体偶联物的数量优选使用关于靶分析物检测的上文所述技术来确定。这些技术包括但不限于：视觉(光学)技术，荧光技术，电学技术，磁性光折射技术，热和频率响应和数码技术。其它合适技术的示例包括但不局限于分光光度技术。因此，所用的信号个体应当优选根据所用的技术具有特定性质。就本发明这一实施方式和如上所述的目的而言，优选的技术和响应是数码的，使用户能对所结合颗粒的数量进行计数。
所述信号个体偶联物优选作为水溶液在微阵列的限定功能化区域上洗涤，并优选采用标准技术经羧基或氨基连接于包含启动子区域或碱基序列的已结合核酸，形成非共价双螺旋。此后通过用运载体溶液(通常为缓冲液)清洗从表面位点去除过量信号个体偶联物，然后进行所结合信号个体偶联物数量的定量。可以在考虑所用信号个体的性质的情况下由任何适当技术进行所结合信号个体偶联物的检测和定量。举例而言，若微阵列是单一功能化的，则优选采用光阻挡微珠来实现计数，使得光穿透微阵列时能通过对限定功能化区域显示被照亮或被阻挡数量的计数来确定所结合微珠的数量。若传感器是多重功能化的，则优选用带色微珠实现计数，使得能确定微阵列上存在的各不同颜色的数量。所结合的信号个体偶联物然后通过改变水溶液的pH值得以脱离，并随后用于如上文所示和下文所述的核酸分子分析。
参见图8，本发明提供的用于功能化二维或三维微阵列的限定区域的替代方法包括下列步骤：
a)采用标准技术将包含感兴趣的靶启动子或其它碱基序列的一种或多种核酸单链通过羧基或氨基结合于平坦的传感器位点或表面结构，即，微阵列的限定区域，所述技术包括但不限于DCC偶联(图8,(A))；
b)合成所述包含感兴趣启动子或其它碱基序列的核酸的互补链(本文定义为互补链)并通过所涉及核酸链的羧基或氨基之间的互补相互作用连接所述已结合的核酸(图8,(B))；
c)使信号个体与所述互补链连接以形成信号个体偶联物(图8,(C))；
d)对所结合信号个体偶联物的数量计数；以及
e)使所述信号个体偶联物脱离以用于核酸分子的分析，仅留下结合于微阵列的平坦传感器位点或表面结构的核酸(图8,(D))。
于前述功能化方法相同，所述互补链可以采用核酸合成仪来合成(或用例如重组技术来产生)并用末端羧基或氨基官能团功能化。类似地，优选的信号个体如上所述。优选以水溶液将信号个体在所述微阵列的表面结构上洗涤来形成所述信号个体偶联物。然后用标准技术将信号个体通过羧基或氨基结合于功能化的互补链，所述技术包括但不限于DCC偶联。如前文所述功能化方法，对所结合信号个体偶联物的数量计数。
同样，上文关于靶分析物的检测广泛描述了对非核酸的分子或化合物感兴趣时按本发明的这一替代方法所述的微阵列功能化与信号个体偶联物形成，技术人员不难了解所用的合适化合物和条件。
在上述各功能化方法中涉及信号个体偶联物脱离的最后步骤优选为可逆的。这可提供多种益处。首先，如上所述，脱离的信号个体偶联物此后可用于核酸分子的分析。其次，信号个体偶联物的脱离使得微阵列可用作检测器。就是说，发明人发现用含感兴趣启动子区域或碱基序列的所连接核酸来功能化二维或三维微阵列的限定区域使得能对基因启动子区域内甲基化的存在和/或程度进行后续分析或者能检测特定碱基序列。此外，最后步骤的可逆性有助于传感器应用期间信号个体偶联物数量的定量。
本发明的一种实施方式中，微阵列作为传感器的用途涉及将混配的水性样品流过所述微阵列(图9)，所述样品中含有来自待分析样品的核酸单链和脱离自阵列的信号个体偶联物(如前所述)。优选并如上所述，通过将脱离的信号个体偶联物与核酸样品在合适缓冲液并在合适pH下(优选pH为7.0)混合来形成所述混配样品。所述合适样品优选含有感兴趣的启动子区域或其它核酸碱基序列。
在替代实施方式中，只将未反应的偶联物流过微阵列(图10)。例如，将样品与信号个体偶联物混合，分离出未结合样品的信号个体偶联物并使其流过微阵列。
在混配样品中，优选信号个体偶联物仅结合感兴趣的碱基序列或感兴趣启动子区域内的甲基化胞嘧啶碱基，在亚硫酸氢盐处理中甲基化碱基不会被转化成尿嘧啶。通过互补碱基配对之间的相互作用实现这一选择性。信号个体偶联物与核酸单链的结合导致混配样品内形成信号个体偶联物/核酸复合体。功能化微阵列随后接触混配样品时，只有那些未结合的信号个体偶联物可供结合微阵列上的功能化限定区域。然后用户能用上述计数对结合于限定区域的信号个体偶联物的数量计数。或者，如上所述，将混配样品分离成其组成部分，即复合物和信号个体偶联物，并随后仅将游离的信号个体偶联物流过微阵列的限定区域。信号个体偶联物与功能化平坦传感器位点或表面结构的结合优选是可逆的，因为可逆结合使微阵列能重复利用并保存，优选通过改变水溶液的pH来实现该可逆性。按上述方法功能化的微阵列优选保存于4°C。
在和由微阵列的功能化所确定的信号个体偶联物的已知数量相比时，未反应信号个体偶联物数量的减少将表示存在感兴趣的碱基序列。类似地，未反应信号个体偶联物数量的减少将表示基因的启动子区域有一些程度的甲基化。结合没有变化将表示不存在感兴趣碱基序列或者基因启动子区域未甲基化。
从而该功能化微阵列的定性和定量特性将允许检测特定核苷酸序列或测定甲基化的存在和/或程度。功能化微阵列的定性和定量特质还允许用户确定特定基因的启动子区域是否可用于转录。测定甲基化的存在和/或程度的能力还允许用户确定不同因素的影响，这些因素包括但不限于环境因素、饮食或药物。
对微阵列表面上结合或连接的信号个体偶联物数量的精确计数能力是本发明的重要方面，因为该能力允许直接定量样品内存在的核酸链数量。例如，若样品中的感兴趣启动子仅有一处且已甲基化，则微阵列所结合的信号个体偶联物的数量将等于样品中核酸链的数量。意外的是，发明人还发现，由于所述方法的灵敏度本发明消除了用例如PCR等技术来扩增样品内核酸的需求，尽管某些应用时可能仍然选择采用扩增技术。这是本发明的重要方面，因为核酸的复制或扩增耗时并可能导致多种误差。复制需求的消除限制了误差出现的可能性。此外，所述方法本身允许用户确定样品中的DNA浓度。
如前文所述，并采用前述技术，通过用惰性材料涂覆三维微阵列的基材来实现微阵列的限定功能化区域(即，二维微阵列的平坦位点或三维微阵列上表面结构的顶端/顶部)的灵敏度提高。这样使非特异性结合减到最少并允许更精确的测定例如数码计数(如图1,(C)和(D)所示)。
最后，由于微阵列用作传感器平台，本发明还允许同时试验包含多个启动子区域、其它核酸区域、基因和/或基因组的多种核酸(或一种或多种其它化合物)。可用微阵列进行多种试验，微阵列的表面被以均一或随机方式用各种适当的互补基因或基因组来功能化。
总之，能将感应剂或核酸与二维或三维微阵列表面上的感应剂直接连接或通过接头基团间接连接的结果是，可能凭借每平方厘米的大量个体平坦传感器位点或表面结构得出的高灵敏度来实现单分子检测和核酸分子的分析。可以优选用惰性材料涂覆二维或三维微阵列的基材以确保高灵敏度的实现并消除非特异性结合。优选用金作为惰性涂覆材料。
实施例
实施例1：珠偶联物固定化于三维微阵列的表面。
按照图5的示意图所示过程，并参见图11，用带色珠偶联物为靶分析物进行下列实验：
采用由PMMA聚合物基质制备并涂覆以金21的三维微阵列20(图11,(A))。测得锥顶端直径为100μm。通过磨蚀去除锥顶端22的金，然后将-NH2官能团连接到由露出的锥顶端22所形成的限定区域处所显露的PMMA聚合物表面。从而在露出的锥顶端22处形成限定功能化区域。这通过使微阵列的表面与含1-20%乙二胺的DMSO接触5-20分钟得以实现。然后将该表面用IPA清洗并在氮气N2下干燥。随后在室温振荡下使该表面与含2%GA的碳酸钠缓冲液(pH9.2)接触2小时。然后用水洗涤。通过使微阵列表面在室温振荡下与含2%1,6-己二胺的碳酸钠溶液(pH9.2)接触2小时然后水洗来实现后续的接头基团连接。在用含EDC和NHS的MES缓冲液(pH6.8)活化微-PS-CO2H珠(直径8μm)后，在硼酸缓冲液(pH8.5)中用该珠连接NH2-功能化的表面(图5)。此后，这种NH2-功能化的传感表面可用于感应剂(例如，抗体、DNA等)的连接。例如，端部表面NH2基团可经GA接头与蛋白质NH2基团连接。这通过在硼酸缓冲液(pH8.5)中将感应剂加载到微阵列表面并放置过夜得以实现。然后进行PBS缓冲液清洗。然后使该表面接触微珠偶联物36(图2,(C)中图示为35，并如图11,(B)和(C)所示)，所述微珠偶联物包含感应剂的适当结合伙伴(例如，抗原DNA等)，从而测试该三维微阵列的功能运行。进行数码测定以确定微珠偶联物36的结合程度。使光透过样品来实现这一测定。光被阻挡时，连接有微珠偶联物且其数量能用市售微扫描仪、显微镜或/和数码成像来数码计数。图11(D)显示呈现被阻挡区域的数码结果的示意图。
实施例2和3：下文实施例中的方案1和2分别显示实施例2和3所述方法的示意图。方案1的步骤(1)-(4)是前文讨论的微阵列制备步骤，且适用于实施例2和3。方案1中提供了这两个方案中组分A到G的解释。
实施例2：蛋白质大分子的夹心试验
方案1的步骤(5)-(7)显示大鼠IgG的夹心试验。所用三维微阵列直径100μm并由PMMA基质形成。去除锥顶端的金并将-NH2官能团引至各锥顶端后，将锥顶端与戊二醛在PBS缓冲液(pH7.4)中进一步反应使-CHO官能团与功能化的锥顶端结合。然后用含市售抗大鼠IgG(二抗)(R5128，西格玛公司(Sigma))的PBS溶液与锥顶端反应过夜以将抗大鼠IgG固定化在所述顶端。将微阵列用PBS清洗后，用含不同浓度市售蛋白质(大鼠IgG)(P1922，西格玛公司)的PBS溶液与顶端的抗大鼠IgG于40°C反应1小时。最后，在PBS清洗微阵列以后，用涂覆有抗大鼠IgG的微粒的悬液与基质在40°C下进一步反应1小时以将微珠连接到所述锥顶端。PBS清洗并温和干燥所述基质后，蛋白质分析物(大鼠IgG)的浓度与顶端所连接的微珠数量成比例，此时微珠数量能用市售的微扫描仪、显微镜和/或数码成像来数码计数。
方案1：大蛋白质的夹心试验
A:PMMA；B:铬；C:金；D:抗大鼠IgG(二抗)；E:抗孕酮(P4)抗体(mAb)(一抗)，也作为蛋白质分析物(大鼠IgG)；F:微珠；G:孕酮(P4)。
实施例3：类固醇小分子的抑制试验
方案1的步骤(5)、(8)和(9)显示小分子的抑制试验。向三维微锥阵列(直径100μm)PMMA基质的锥顶端引入-CHO官能团后，按文献方法制备含孕酮-PEG-NH2(P4-PEG-NH2)的PBS(pH7.4)溶液(J.S.Mitchell等，AnalyticalBiochemistry,2005,343:125-135)，将该溶液与锥顶端反应过夜以使类固醇孕酮(P4)固定化在微锥的顶端。用PBS清洗基质后，将固定量的市售单克隆抗孕酮抗体(mAb，一抗)(P1922，西格玛公司)与不同的标准孕酮(P4)PBS溶液(pH7.4)于40°C混合1小时。然后将所得混合物与连接于顶端的孕酮(P4)结合。该反应在40°C进行1小时。最后，在PBS清洗基质以后，用涂覆有抗大鼠IgG的微粒的悬液与基质在40°C下进一步反应1小时以将微珠连接到所述锥顶端。PBS清洗并温和干燥所述基质后，类固醇(孕酮)的浓度与顶端所连接的微珠数量成反比，然后微珠数量能用市售的微扫描仪、显微镜和/或数码成像来数码计数。
方案2：小分子的抑制试验
实施例4：DNA杂交
下面显示的方案3是实施例4中所述方法的示意图。方案2由新步骤(10)-(12)提供方案1和2所示步骤(5)开始的替代路径。就方案1所提供的解释适用于方案3。
方案3：DNA杂交
三维微锥顶端的-CHO功能化，H2O清洗和N2干燥后，将含给定序列的连接有胺的合成12碱基寡核苷酸[H2N-(CH2)6-CCTAATAACAAT]的磷酸盐缓冲液(pH7.0)在微锥顶端固定化过夜，然后用5X SSC，H2O清洗并N2干燥。
杂交前，用Na2BH4处理戊二醛活化的基质。首次杂交如下进行：固定有12碱基DNA的微锥顶端与合成的靶DNA(27个碱基，5’-GGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3’)于PBS杂交缓冲液(8x PBS,pH7.0)中杂交24小时，然后用2x SSC清洗。通过使经杂交的微锥顶端与连接有DNA的微粒[15个碱基，3’-TTATAACTATTCCTA-(CH2)6-NHCO-微粒]在同一杂交缓冲液(8x PBS)中进一步反应5-24小时来进行二次杂交。最后，将连接有微粒的基质用8x PBN缓冲液(0.3M NaNO3和PBS,pH7.0)清洗数次。还通过用市售微扫描仪、显微镜和/或数码成像的数码计数来进行靶DNA(27个碱基)的定量。靶DNA的浓度与基质的微锥顶端上的微粒成比例。
由于微阵列用作传感器平台，本发明还允许同时试验包含多个启动子区域、其它核酸区域、基因和/或基因组的多种核酸(或一种或多种其它化合物)。可用微阵列进行多种试验，微阵列的表面被以均一或随机方式用各种适当的互补基因或基因组来功能化。
如前文所述，通常使用能特异性结合用户想要检测的靶分析物的感应剂。为避免与涂覆表面的非特异性结合，使微阵列于室温振荡下与含2%OVA的PBS接触2小时。然后用PBS洗涤。此后微阵列即可使用。
由于微阵列用作传感器平台，本发明还允许同时试验包含多个启动子区域、其它核酸区域、基因和/或基因组的多种核酸(或一种或多种其它化合物)。可用微阵列进行多种试验，微阵列的表面被以均一或随机方式用各种适当的互补基因或基因组来功能化。
前文描述了本发明，包括其优选形式。技术人员能易见的改动和变化旨在包含于所述发明的精神和范围内。
除非说明书和权利要求书中明确说明，术语‘包括’、‘包含’等应被认为是包括性含义，而不是排他性或穷举性含义，也就是说，其含义是“包括但不限于”。
说明书中对任何现有技术的引用并非也不应视为承认或以任何形式暗示该现有技术在世界上任何国家中构成公知知识的一部分。

Claims (16)

1.一种用于测定样品中感兴趣靶化合物的存在的三维微阵列，所述微阵列包括：
a)包括多个表面结构的基材,所述表面结构由基材形成并从基材凸出；
b)所述多个表面结构包括感应剂，所述感应剂能连接样品中的感兴趣靶化合物，所述感应剂包括在各表面结构顶部上限定的功能化区域上，和
c)所述微阵列在限定的功能化区域之间涂覆有惰性材料。
2.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构采用锥形或脊状形式。
3.如权利要求1或2所述的三维微阵列，其特征在于，每平方厘米有250,000到10亿个限定的功能化区域。
4.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，所述微阵列由塑料材料、金属、陶瓷、氧化物、硅或光致抗蚀剂形成。
5.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，用于测定目的在基材的底面上连接或形成有纹理层使光在其穿透微阵列处沿表面分散。
6.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，所述表面结构优选通过蚀刻、平版印刷法、热压印、纳米压印、注射成型或者通过如WO2007/058548所述的连续成型技术方法形成。
7.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，所述感应剂是包含感兴趣的特定碱基序列的一种或多种核酸单链。
8.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，所述感应剂被选择作为抗体/抗原、DNA/DNA、DNA/蛋白质、蛋白质/蛋白质、蛋白质/受体、细胞/蛋白质和细胞/DNA结合对的部分来连接所述靶化合物。
9.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，所述微阵列包括在所述惰性材料下的硫醇、蛋白质或PEG材料层。
10.如权利要求1所述的三维微阵列，其特征在于，所述惰性材料利用挥发、沉积、溅射、等离子体处理、喷涂、浸涂或旋涂来施用。
11.一种用于测定感兴趣靶化合物在样品中的存在的方法，所述方法包括步骤：
a)提供权利要求1-10中任一项所述的微阵列；
b)将所述微阵列与至少部分样品接触；和
c)通过对所述靶化合物与所述感应剂连接的可检测响应的检测来测定感兴趣靶化合物的存在。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可检测响应选自视觉响应、电势或静电响应、热、频率和数码响应。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可检测响应能通过数码计数、重量测定、光学和/或电学手段来读取。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可检测响应产生定量和/或定性度量测定。
15.用于测定样品中是否存在包含特定碱基序列的核酸的方法，所述方法包括：
a)在核酸样品中，若核酸为双链，则分离成单链；
b)将核酸的单链与信号个体偶联物混合形成混配样品；
c)通过将所述混配样品流过已功能化的如权利要求1-10中任一项所述的微阵列的表面来测定是否存在包含特定碱基序列的核酸；以及
d)对所结合信号个体偶联物计数。
16.一种用于测定基因启动子区内甲基化程度的方法，所述方法包括：
a)在核酸样品中，若核酸为双链，则分离成单链；
b)处理所述核酸样品使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
c)混合核酸的单链与信号个体偶联物以形成混配样品；
d)通过将所述混配样品流过已功能化的如权利要求1-10中任一项所述的微阵列的表面来测定启动子区域中甲基化的存在和/或程度；以及
e)对所结合信号个体偶联物计数。
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