JP2005507491A

JP2005507491A - アレイを使用して分子の二次修飾を決定する方法

Info

Publication number: JP2005507491A
Application number: JP2002585607A
Authority: JP
Inventors: ジェームズギルモア; スティーブンダニエル; リックウィーズ
Original assignee: シグマ−ジェノシスリミテッド
Priority date: 2001-05-02
Filing date: 2002-05-02
Publication date: 2005-03-17
Also published as: WO2002088324A2; EP1384068A4; EP1384068B1; AU2002259137A1; ATE408816T1; CA2446255A1; WO2002088324A3; DE60228947D1; EP1384068A2

Abstract

本発明は、「アレイ」形式を利用して、標的分子、例えばポリペプチドの、「翻訳後修飾」などの複数の二次修飾を同時に検出するための方法を提供する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年5月2日に出願された米国仮出願第60/288,285号の利益を主張するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は、一般に細胞生物学、プロテオミクス、およびポリペプチドアレイ、または「バイオチップ」技術に関する。特に、本発明は、アレイ、例えばタンパク質マイクロアレイを使用して、分子の「翻訳後」修飾などの二次修飾を測定かつ解析するための方法に向けられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
タンパク質および多糖を含む生体分子は、しばしば修飾されて（例えば、翻訳後に修飾される）、分子を活性化、不活性化、または標的化する。これらの状態は、生物学的意義がありうる。例えば、主要な細胞周期制御因子のポリペプチドp53のリン酸化は、その活性を調節する。また、シグナル伝達経路の活性化因子のMAPKの活性は、リン酸化によって修飾される。もう1つの例は、M(r)21kDaのサイクリックAMP-調節リンタンパク質ARPP-21は、細胞質体および基底神経節のニューロンの末端に濃縮されている。Ser(55)がリン酸化されたARPP-21の検出のための選択的なリン酸化状態特異的抗体を使用して、ドーパミンD1受容体の活性化を示すことができ；D2受容体の活性化によって、ARPP-21のリン酸化の減少が生じる（例えばCaporaso (2000) Neuropharmacology 39: 1637-1644を参照されたい）。
【０００４】
生体分子の二次修飾、例えばタンパク質の翻訳後修飾を測定することにより、研究者は疾患の理解を得ることができ、潜在的な診断マーカーを回収することができ、また治療のための標的を作製することができる。
【発明の開示】
【０００５】
概要
本発明は、アレイを使用して標的分子の二次修飾を検出するための方法を提供する。マイクロアレイの使用により、試料分析物の複数の二次修飾特徴、例えば翻訳後修飾されたポリペプチドを同時に解析および検出することができる。本発明は、以下の工程を含む標的分子の二次修飾を検出するための方法を提供する：
(a)複数のバイオサイト（biosite）であって、それぞれのバイオサイトは、基質表面に固定された複数の捕獲プローブを含むバイオサイトを含むアレイを提供する工程；
(b)標的分子を提供する工程；
(c)捕獲プローブが結合した標的分子に特異的に結合することができる検出プローブであって、前記検出プローブは特異的に標的プローブに結合する検出プローブを提供する工程；ならびに
(d)標的分子をアレイと接触させ、かつ検出プローブを標的分子と接触させて、どのバイオサイトが結合した標的分子および検出プローブを含むかを検出することにより、標的分子の二次修飾を検出する工程。
【０００６】
本発明の1つの側面において、二次修飾は、リン酸化を含む。標的分子は、ポリペプチド（ペプチド、ペプチド模倣体、その他同種のものを含む）を含むことができる。二次修飾は、翻訳後修飾を含むことができる。二次修飾は、アミノ酸残基のリン酸化を含むことができ；アミノ酸残基は、セリン、チロシン、およびスレオニンからなる群より選択することができる。二次修飾は、アミノ酸残基への脂質部分の付加を含むことができる。二次修飾は、アミノ酸残基へのサッカライド部分の付加を含むことができる。
【０００７】
本発明の別の側面において、標的分子は脂質、核酸、および炭水化物からなる群より選択することができる。炭水化物は、多糖であることができる。捕獲プローブは、ポリペプチドを含むことができる。ポリペプチドは、抗体を含むことができる。捕獲プローブは、小分子を含むことができる。捕獲プローブは、第1のドメインはがアレイに固定化された核酸に特異的にハイブリダイズし、第2のドメインが特異的に標的分子に結合する2つのドメインを含むキメラ分子にハイブリダイズしたアレイに固定化された核酸を含む。
【０００８】
本発明の方法の別の側面において、検出プローブは、放射性部分、比色部分、生物発光部分、蛍光性部分、および化学発光部分からなる群より選択される検出可能な部分を含む。
【０００９】
1つの側面において、どのバイオサイトが、結合した標的分子および検出プローブを含むかを検出することは、基質表面を走査することと、いずれかのまたは十分な検出プローブがそれぞれのバイオサイトに固定されたかどうかを決定することとを含む。基質表面の走査は、光学的なまたは電気的な装置によって行うことができる。1つの側面において、基質表面は、未修飾分子を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトおよび修飾された分子を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトを含むことができる。本方法は、未修飾分子を検出することができる検出プローブおよび修飾された分子を検出することができる検出プローブの使用を含むことができる。
【００１０】
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は、添付の図面および下記の説明に記載される。その他の特徴、目的、および本発明の効果は、記載および図面から、並びに請求の範囲から明らかであろう。
【００１１】
本明細書に引用した全ての刊行物、特許、特許出願、GenBank配列、およびATCC寄託物は、全ての目的のために参照により明白に組み入れられる。
【００１２】
種々の図面における同様の参照シンボルは、同様のエレメントを示す。
【００１３】
詳細な説明
本発明は、「アレイ」または「マイクロアレイ」形式を利用して、試料中の分子の「翻訳後修飾」など、複数の二次修飾を同時に検出するための方法を提供する。これは、「標的分子」（すなわち、抗原）がアレイに結合している際に、標的分子の修飾されたエピトープを特異的に認識する二次リポーター分子を使用することによって達成される。修飾は、例えばポリペプチドのリン酸化またはグリコシル化、または分枝多糖の修飾（例えば、トリミング）でありうる。翻訳後修飾は、天然の細胞プロセスによるものであってもよく、誘導プロセス、例えば薬剤、癌原性物質、照射、誘導還元もしくは酸化などによるものであってもよい。
【００１４】
このマイクロアレイの形式により、構造または形態における二次的変化、例えば翻訳後修飾について複数の抗原（分析物として）の同時解析（スクリーニング）を行うことができる。さらに、マイクロアレイにこの形式を適用することにより、存在する分析物の量、コンホメーション、および修飾状態などの試料分析物の複数の特徴を同時に決定することができる。
【００１５】
定義
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野における当業者によって通常理解される意味を有する。本明細書において使用される以下の学術用語は、他に特定しない限り以下の意味を有する。
【００１６】
本明細書において使用される、「アレイ」または「マイクロアレイ」または「タンパク質アレイ」または「プロテオームアレイ」または「バイオチップ」の用語は交換可能に使用され、以下に詳細を議論するように、これらの装置の全ての既知のバリエーションを含む。
【００１７】
「バイオサイト」は、反応基質または基材の上面に沈着した生体分子または捕獲プローブを意味する。適切な条件下で、会合、例えば特異的な結合またはハイブリダイゼーションが、プローブと標的分子の間で生じうる。生体分子の成分鎖と標的分子の間では、相互作用または反応が生じる可能性があるので、生体分子の成分鎖は、バイオサイトを形成する。アレイあたりのバイオサイトの最大数は、アレイまたはアレイ内の反応容器のサイズに依存し、プローブ沈着技術（例えばプリンティング）、プローブの性質、結合を評価するためおよび／または体積を決定するために使用される手段、またはバイオサイトの形（質の制御のため）に依存して変更してもよい。例えば、アレイにおけるバイオサイトのサイズは、付随する検出器／イメージング装置の実際に用いる光学分割に依存するであろう。例えば、16（4×4アレイ）バイオサイトのアレイは、最終的に反応容器全体の底を形成するハイブリダイゼーション基質または基材に沈着させてもよい。この例では、それぞれのバイオサイトは、直径約25〜200ミクロン（μm）の円を含んでいてもよい。したがって、16バイオサイトアレイについては、16×200μm直径領域のそれぞれが、プローブサイズおよびウェルサイズに非常に依存した濃度の、ハイブリダイゼーション基質（基材）に付着した均一なプローブフィールドを含む。それぞれの25〜200μm直径領域は、何百万ものプローブ分子を含みうる。また、16の種々のバイオサイト（プローブ部位）のそれぞれは、1つのタイプのプローブを含みうる。したがって、反応チャンバーあたり16バイオサイト（4×4アレイ）を含むアレイにおいては、16の種々のプローブタイプをアッセイすることができる。もう1つの例としては、4つの別々の10×10アレイ（400バイオサイト）を、400バイオサイトのそれぞれの間に十分な間隔をとって、96ウェルマイクロタイタープレートの1つのウェルに適合するように作製することができる。この10×10形式に関し、単一の反応チャンバー内で400のハイブリダイゼーション実験が可能であり、38,400（96×400）のアッセイ／ハイブリダイゼーションをほぼ同時に行いうる。
【００１８】
「基質」は、バイオサイトまたはプローブが沈着される基質を意味する。「基質」は、限定されるものではないが、例えばポリビニル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ビニル、その他のプラスチック、ガラス、SiO₂、その他のシラン、ナイロン膜、金、またはプラチナなどの様々な物質から選択される。以下に記載されたさらなる例を参照されたい。固体表面は誘導体化することができ、例えば、チオール誘導体化されたバイオポリマーおよび有機チオールを金属固体基質に結合することができる。例えば、米国特許第5,942,397号を参照されたい（より多くの例については下記を参照されたい）。
【００１９】
「固定された」の用語は、プローブが、いずれかの手段またはいずれかの方法；例えば、可逆的または不可逆的結合、共有結合性または非共有結合性の付着などで表面（例えば基質）に付着しうることを意味する。
【００２０】
「検出プローブ」の用語は、電子的または視覚的な方法を含むいずれかの手段によって直接的または間接的に検出することができるいずれの分子も意味し；したがって、検出プローブは、特異的に標的プローブに結合する第一の分子、および第一の分子に結合する第二の分子を含む2つの分子を含むことができる。1つの態様において、検出プローブは標的分子を含み、例えば、標的分子は放射性P³²によってリン酸化されたポリペプチドである（捕獲分子は、翻訳後修飾を含むエピトープに結合する）；例えば、米国特許第5,538,858号を参照されたい。
【００２１】
「ダイナミックレンジ」の用語は、感受シグナルの最大値と最小値との間の差を意味する。「特異性」の用語は、ある分子（例えば、タンパク質または小分子）の、第二の分子を認識および区別する能力（第二の分子に「特異的に」結合することによる）を意味する。「感受性」の用語は、バックグランドのシグナルを超えて認識することができる最小のシグナルを意味する。「バックグランド」の用語は、ノイズおよび／または非特異的結合によって生じたシグナルを意味する。例えば、バックグランドは、捕獲抗体がアレイ上にプリントされていない場合に決定することができる。「分解」の用語は、タンパク質の構造上の確証が減少することを意味し、例えばアミノ酸配列の欠失または変化によるものである。「マーカー」の用語は、向きを容易に認識することができるようなパターンにプリントされた捕獲抗体を意味する。「ハウスキーパー」の用語は、試料間で濃度または組成がほとんど変化しないと考えられる、試料に存在する抗原を意味する。「溶液」の用語は、様々な緩衝液および／または試料から構成され、タンパク質アレイに適用される液体または半流動体を意味する。
【００２２】
「抗体」の用語は、エピトープに特異的に結合することができる、免疫グロブリン遺伝子もしくは免疫グロブリン遺伝子群、またはその断片もしくは同等物によって実質的にコードされたペプチドまたはポリペプチドを指す。例えばFundamental Immunology, Third Edition, W. E. Paul, ed., Raven Press, N. Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267-73; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97を参照されたい。抗体断片は、化学的にまたは組換えDNA法を利用することのいずれかにより、単離または新規合成されうることが、当業者には理解されるであろう。また、抗体の用語は、抗体全体を修飾して産生された、または組換えDNA法を使用して新規に合成された、「キメラ」抗体のいずれをも含む。典型的には、このようなキメラ抗体は「ヒト化抗体」、すなわち、エピトープ結合部位は免疫化哺乳動物（マウスなど）から作製され、構造上のフレームワークはヒトから作製したものである。また、免疫グロブリンは、ファージディスプレイライブラリーおよびそのバリエーションを使用して作製することができる。翻訳後修飾されたポリペプチドに結合する抗体またはその他の分子は、当業者に周知であり、例えば米国特許第6,008,024号；第5,763,198号；第5,599,681号；第5,580,742号を参照されたい。
【００２３】
核酸およびポリペプチドプローブ
本発明は、固定された捕獲分子を含むアレイであって、ポリペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチド（および多糖または小分子）を固定することができるアレイを提供する。また、「検出プローブ」は、ポリペプチド、核酸、またはオリゴヌクレオチド（および多糖または小分子）であることができる。例えば、ポリペプチドは、オリゴヌクレオチドに結合させ、次にアレイ表面に固定された核酸に特異的にハイブリダイズさせることによって、アレイ基質表面に固定することができる（例えば米国特許第6,083,763号を参照されたい）。これらのプローブは、インビトロまたはインビボで作製および発現させることができ、本発明の装置または実施に使用されるポリペプチドを作製および発現するいずれの手段を使用することもできる。本発明は、科学文献および特許文献に詳しく記載されている当業者に既知のいずれの方法またはプロトコールと合わせて実施することもできる。
【００２４】
本発明の核酸、例えばアレイのプローブ、例えばRNA、cDNA、ゲノムDNAの断片のいずれかは、様々な供与源から単離し、遺伝的に設計し、増幅し、および／または組換えて発現することもできる。哺乳動物細胞に加えて、例えば、細菌、酵母、昆虫、または植物の系を含む、どのような組換え発現系を使用することもできる。または、これらの核酸は、例えば、Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886-7896; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859；米国特許第4,458,066号に記載されたように、周知の化学合成技術によってインビトロで合成することもできる。
【００２５】
例えば、配列の変異の作製、サブクローニング、標識プローブ、シーケンシング、ハイブリダイゼーション、およびその他同種のものなどの、核酸操作のための技術は、科学文献および特許文献に詳しく記載されており、例えば、Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993)を参照されたい。
【００２６】
捕獲プローブおよび検出プローブは、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、その他の短いポリマー、または有機分子を含みうる。アミノ酸を使用する場合は、市販されており、形成反応（支持体表面に対する関連表面の結合）によって変化しないという事実により、別の態様として、メチルエステルを使用することができる。「ペプチド模倣体」は、対応する組成物、例えば本発明の結合表面に使用されるペプチド、オリゴペプチド（例えばオリゴヒスチジン、オリゴアスパラギン酸、オリゴグルタミン酸、ポリ-(his)₂(gly)₁、およびポリ-(his)₂(asp)₁）、ポリペプチド、イミダゾール誘導体、または同等物の、実質的に同じ構造的および／または機能的な特徴を有する合成化学化合物を含む。模倣体は、完全に合成非天然アミノ酸類似体から構成されるもの、または部分的に天然ペプチドアミノ酸であり部分的に非天然アミノ酸類似体であるキメラ分子のいずれでもありうる。また、模倣体は、任意の量の天然アミノ酸の保存的置換を、このような置換が実質的に模倣体の構造および／または活性を変えない限り、取り入れることができる。個々のペプチド模倣体残基は、ペプチド結合によって、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、もしくはN,N'-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）などのその他の化学結合または結合手段によって結合することができる。従来のアミド結合（「ペプチド結合」）結合基に代わりうる結合基は、例えばケトメチレン（例えば、-C(=O)-CH₂-または-C(=O)-NH-）、アミノメチレン（CH₂NH）、エチレン、オレフィン（CH=CH）、エーテル（CH₂-O）、チオエーテル（CH₂-S）、テトラゾール（CN₄-）、チアゾール、レトロアミド（retroamide）、チオアミド、またはエステルを含む（例えばSpatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, p 267-357, Marcell Dekker, NYを参照されたい）。
【００２７】
アレイまたは「バイオチップ」
本発明は、「翻訳後修飾」などの二次修飾について、複数の抗原（分析物として）を同時解析（スクリーニング）するための方法を提供する。本発明に使用されるアレイは、複数の標的エレメントまたは「捕獲プローブ」を具備し、それぞれの固定された標的エレメントは、ある定められた量の1つまたは複数の、ポリペプチドもしくは核酸分子またはプローブを含む。捕獲プローブは、本発明の方法において翻訳後修飾の存在を解析するための分子である標的分子に対して結合（直接的または間接的に）させるための固体表面に固定されている。バイオサイトは、固体表面において種々のサイズおよび種々の密度で配置されてもよい。本発明の方法は、全体的にあるいは部分的に、以下に記載されたようなアレイ、結合成分、および方法のデザインを取り入れることができる。例えば、米国特許第6,197,503号；第6,174,684号；第6,156,501号；第6,093,370号；第6,087,112号；第6,087,103号；第6,087,102号；第6,083,697号；第6,080,585号；第6,054,270号；第6,048,695号；第6,045,996号；第6,022,963号；第6,013,440号；第5,959,098号；第5,856,174号；第5,843,655号；第5,837,832号；第5,770,456号；第5,723,320号；第5,700,637号；第5,695,940号；第5,556,752号；第5,143,854号；また、例えば、国際公開公報第99/51773号；国際公開公報第99/09217号；国際公開公報第97/46313号；国際公開公報第96/17958号；国際公開公報第89/10977号を参照されたい；また、例えばJohnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32; Epstein (2000) Current Opinion in Biotech. 11: 36-41; Mendoza (1999) "High-throughput microarray-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)," Biotechniques 27: 778-788; Lueking (1999) Protein microarrays for gene expression and antibody screening," Anal. Biochem. 270: 103-111; Davies (1999) "Profiling of amyloid beta peptide variants using SELDI protein chip arrays," Biotechniques 27: 1258-1261を参照されたい。
【００２８】
基質に対するプローブの沈着
本発明は、「捕獲プローブ」を含む複数のバイオサイトを基質に固定することによってアレイを作製するために提供される。プローブは、当該技術分野において既知のいずれの方法または方法の組合せ、例えばインクジェット式などのpizo-電気的なプロセスおよび系、ロボット沈着、フォトリソグラフィーによるインサイチュー合成、マイクロシリンジの使用、または連続フロー・バンドル・マイクロキャピラリープロセス（例えば、米国特許第6,083,763号を参照されたい）を使用して、基質に「沈着」または「固定」することができる。本発明の作製または使用に、全体的にもしくは部分的に組み入れることができるアレイ製作方法は、例えば米国特許第6,197,503号；第6,177,238号；第6,164,850号；第6,150,147号；第6,083,763号；第6,048,695号；第6,010,616号；第5,599,695号；第5,919,523号；第5,861,242号；第5,770,722号；第5,750,669号；第5,143,854号に記載されたものを含む。
【００２９】
基質表面
本発明に使用されるアレイは、硬質、半硬質、または軟質材料の基質表面を含みうる。基質表面は平らまたは平面状で、ウェル、盛り上がった領域、刻まれた溝、細孔、ビーズ、フィラメント等として形成することもできる。基質は、「捕獲プローブ」を直接的または間接的に結合することができるどのような物質であることもできる。例えば、適切な材料は、紙、ガラス（例えば、米国特許第5,843,767号を参照されたい）、セラミック、石英もしくはその他の結晶性基質（例えばヒ化ガリウム）、金属、メタロイド、ポリアクリロイルモルホライド、種々のプラスチックおよびプラスチックコポリマー、ナイロン（商標）、テフロン（商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（4-メチルブテン）、ポリスチレン、ポリスチレン／ラテックス、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニル酪酸塩）、ポリビニリデンジフルオライド（PVDF）（例えば、米国特許第6,024,872号を参照されたい）、シリコーン（例えば、米国特許第6,096,817号を参照されたい）、ポリホルムアルデヒド（例えば、米国特許第4,355,153号；第4,652,613号を参照されたい）、セルロース（例えば、米国特許第5,068,269号を参照されたい）、酢酸セルロース（例えば、米国特許第6,048,457号を参照されたい）、ニトロセルロース、種々の膜およびゲル（例えば、シリカエアロゲル、例えば米国特許第5,795,557号を参照されたい）、常磁性もしくは超常磁性の微小粒子（例えば、米国特許第5,939,261号を参照されたい）などを含みうる。プローブが固定されるその他の化合物に適用するために、基質を誘導体化することもできる。反応性の官能基は、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられる。シラン（例えば、モノおよびジヒドロキシアルキルシラン、アミノアルキルトリアルコキシシラン、3-アミノプロピル-トリエトキシシラン、3-アミノプロピルトリメトキシシラン）は、アミン官能基と反応するためのヒドロキシル官能基を提供しうる。
【００３０】
検出プローブおよび装置
検出プローブは、例えば、放射性、比色性、生物発光性、蛍光性、もしくは化学発光性のどのような検出可能部分も、または別の光子検出可能部分も含みうる。また、標的分子が捕獲プローブに特異的に結合する場合、検出プローブは、標的分子に特異的に結合するどのような分子をも含む。検出プローブは、ポリペプチド、脂質、小分子、多糖、核酸、またはその組合せを含みうる。蛍光、生体発光もしくは化学発光、または放射線は、例えば、当該技術分野において周知の、例えば米国特許第6,225,670号；第6,211,524号；第6,197,928号；第6,197,499号；第6,194,731号；第6,194,223号；第6,191,852号；第6,191,425号；第6,132,983号；第6,087,476号；第6,060,261号；第5,866,348号；第5,094,939号；第5,744,320号；第5,631,734号；第5,192,980号；第5,091,652号に記載されたようなアッセイ法および装置を使用して、検出並びに定量することができる。
【００３１】
二次修飾（例えば翻訳後修飾）について解析するための分子に対する「検出プローブ」の結合は、任意の検出装置を使用したいずれの方法でも行うことができ、例えば、基質表面を走査して、何らかのまたは十分な検出プローブが基質表面領域のバイオサイトに接着された分子に結合しているかどうか決定する。これらの機能は、どのような装置でも、例えば光学的または電気的な装置によっても行うことができる。
【００３２】
例えば、あるイメージングシステムは、近位電荷結合素子（CCD）検出/イメージングであることができ；これは、その固有の多用性により、化学発光、蛍光、および放射性の標的分子検出、高処理量、および高感度を可能にすることができる。この検出/イメージング装置は、CCDアレイ、MOSアレイ光伝導体、CMOSアレイ光伝導体、電荷インジェクション装置（CID）、薄膜トランジスタアレイ光伝導体、アモルファスシリコンセンサー、フォトダイオードアレイ、およびその他同種のもの等の、複数の固相イメージング装置を含むレンズのないイメージングアレイを含みうる。
【００３３】
本発明の装置および方法は、例えば、米国特許第6,197,503号；第6,197,498号；第6,150,147号；第6,083,763号；第6,066,448号；第6,045,996号；第6,025,601号；第5,599,695号；第5,981,956号；第5,698,089号；第5,578,832号；第5,632,957号に記載されたような検出装置のデザインを、全体的にもしくは部分的に組み入れる。
【００３４】
実施例
以下の実施例は、実例を示すために提供されるが、請求の範囲の発明を限定しない。
【００３５】
実施例1：アレイ形式の方法を使用する二次構造修飾の決定
タンパク質マイクロアレイの製作および試料の解析を含む、本発明の方法を実施するための例を提供する。
【００３６】
スライド調製。標準的なウェルのガラススライド（例えばGENOMETRIX16（商標）ガラススライド）をきれいにし、シラン処理した。アレイを、キャピラリープリンターで調製したスライドにプリントした。プリント溶液は、プリント緩衝液（0.1Mの炭酸緩衝液、pH9.5+5%グリセロール）に1：1以上になるよう希釈した適切な抗原からなる。リン酸化MAPKおよび非リン酸化MAPK抗原（例えば、米国特許第5,405,941号および第5,663,314号を参照されたい）は、Upstate Laboratories (Syracuse, NY)から購入し、段階希釈でプリントした。抗リン酸特異的MAPK抗体は、Upstate Laboratoriesから購入した。これらのアレイに使用した位置マーカーおよびポジティブ対照マーカーは、150Tg/mlのプリント濃度で使用したウサギIgGであった(Fitzgerald Industries International, Inc, Concord, MA; #31-RGG0)。プリントの質について、プリント後にスライドを視覚的に調べた。
【００３７】
マイクロアッセイ。4℃で一晩貯蔵後、まず、試料ウェルを3回リンスし、次いでシェーカプレートにおいて室温で1時間、ブロッカーのカゼイン(#37528ZZ, Pierce Chemical Co., Rockford, IL)でブロックした。ブロッカーのカゼインをウェルから吸い出し、適切な抗体溶液（PBSで希釈したもの）をそれぞれの試験ウェルに添加した。アレイプレートを湿気のあるチャンバーに配置して37℃で2時間インキュベートした。試料をインキュベーション後、プレートを乾燥器から取りだして、ブロッカーのカゼインで3回洗浄した。次いで、ビオチン化された抗ヒツジ(Jackson Labs, Bar Harbor, Maine)抗体をすべてのウェルに加えた。ビオチン化された抗体をALEXA546（商標）結合ストレプトアビジン(Molecular Probes, Eugene OR)によって検出した。試料を湿度のあるチャンバーでもう一度、37℃において1時間半インキュベートした。
【００３８】
完成したアッセイスライドを、Packard LUMONICS（商標）Scannerを利用してイメージ化した。最後に、保存したTIFFイメージをソフトウェア（例えば、カスタム・ドットスコアリング・ソフトウェア、Genometrix Genomics, Inc., The Woodlands, TX）を利用して分析した。ソフトウェアは、利用した濃度測定値からバックグランドを自動的に差し引くようになっている。ドットスコア値を使用して、抗原濃度、対、濃度測定のグラフを構築した。リン酸特異的抗体からのシグナル強度を、リン酸化および非リン酸化MAPKに対してプロットした。
【００３９】
アレイまたは「アレイ地図」におけるバイオサイトの特異性は、図1に記載してある：マーカー1〜4−ヒツジIgGマーカー10mcg/ml；マーカー5−100mcg/ml非リン酸ERK；マーカー6〜8−5の1：1希釈；マーカー9−100mcg/mlリン酸ERK；マーカー10〜12−9の1：1希釈系列。
【００４０】
アレイのデザインには、段階希釈を使用してプリントしたERKのリン酸を有するエピトープおよびリン酸を有しないエピトープを組み入れた（図1）。抗リン酸特異的MAPK抗体をアレイに適用し、直接蛍光を使用してイメージ化した。図2は、アレイからのこれらの蛍光イメージの表示であり；イメージは、抗リン酸特異的MAPKの特異性を示した。シグナル強度の量をアレイにおけるそれぞれのエレメントについて決定した。図3は、ERK1リン酸の濃度を要約したデータおよび標準曲線を表すグラフである。
【００４１】
2つのMAPKエピトープ間の識別量は、濃度に依存し、より高い濃度のリン酸MAPKでは、より高いシグナル強度を与え、したがって、より大きい解像度を与える。しかし、2つのエピトープは、試験した全ての範囲において識別することができた。したがって、これらの実験は、本発明の方法がマイクロアレイプラットフォームを使用して、抗原特異的なエピトープを識別することができることを示す。
【００４２】
本発明のいくつかの態様を記載した。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の修飾がなされてもよいことは理解されるであろう。したがって、その他の態様も、請求の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】実施例1に記載した例示的な方法に使用されるアレイにおけるバイオサイトの特異性を図式的に記載する。
【図２】実施例1において詳細に記載したように、本発明のアレイ形式の方法を使用した、抗リン酸特異的MAPK抗体の特異性を示すアレイのイメージの表示である。
【図３】実施例1に詳細に記載したように、ERK1リン酸濃度および標準曲線を要約したデータを表すグラフである。

Claims

以下の工程を含む、標的分子の二次修飾を検出するための方法：
(a)複数のバイオサイトであって、それぞれのバイオサイトは、基質表面に固定された複数の捕獲プローブを含む、バイオサイトを含むアレイを提供する工程；
(b)標的分子を提供する工程；
(c)捕獲プローブが結合した標的分子に結合することができる検出プローブを提供する工程；ならびに
(c)標的分子をアレイと接触させ、検出プローブを標的分子と接触させて、どのバイオサイトが、結合した標的分子および検出プローブを含むかを検出する工程。
二次修飾がリン酸化を含む、請求項1記載の方法。
標的分子がポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
二次修飾が翻訳後修飾を含む、請求項3記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基のリン酸化を含む、請求項3記載の方法。
アミノ酸残基が、セリン、チロシン、およびスレオニンからなる群より選択される、請求項5記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基への脂質部分の付加を含む、請求項4記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基へのサッカライド部分の付加を含む、請求項4記載の方法。
標的分子が脂質、核酸、および炭水化物からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
炭水化物が多糖である、請求項9記載の方法。
捕獲プローブがポリペプチドを含む、請求項1記載の方法。
ポリペプチドが抗体を含む、請求項11記載の方法。
捕獲プローブが小分子を含む、請求項1記載の方法。
第1のドメインがアレイに固定化された核酸に特異的にハイブリダイズし、第2のドメインが特異的に標的分子に結合する、2つのドメインを含むキメラ分子にハイブリダイズしたアレイに固定化された核酸を捕獲プローブが含む、請求項1記載の方法。
検出プローブが、放射性部分、比色部分、生物発光部分、蛍光性部分、および化学発光部分からなる群より選択される検出可能な部分を含む、請求項1記載の方法。
どのバイオサイトが固定された標的分子および検出プローブを含むかを検出する工程が、基質表面を走査し、検出プローブがバイオサイトで固定されているかどうかを決定することを含む、請求項1記載の方法。
走査が光学的または電気的な装置によって行われる、請求項16記載の方法。
基質表面が、未修飾分子を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトおよび修飾された分子を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトを含む、請求項1記載の方法。
検出プローブを提供する工程が、未修飾分子を検出することができる検出プローブおよび修飾された分子を検出することができる検出プローブの使用を含む、請求項1記載の方法。
以下の工程を含む、標的分子の二次修飾を検出するための方法：
(a)複数のバイオサイトであって、少なくとも1つのバイオサイトは、基質表面に固定された複数の捕獲プローブを含む、バイオサイトを含むアレイを提供する工程；
(b)標的分子を提供する工程；
(c)検出プローブを提供する工程；
(d)標的分子をアレイと接触させ、検出プローブを標的分子と接触させる工程；ならびに
(e)どのバイオサイトが、結合した標的分子および検出プローブを含むかを検出する工程。
二次修飾がリン酸化を含む、請求項20記載の方法。
標的分子がポリペプチドを含む、請求項20記載の方法。
二次修飾が翻訳後修飾を含む、請求項22記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基のリン酸化を含む、請求項22記載の方法。
アミノ酸残基が、セリン、チロシン、およびスレオニンからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基への脂質部分の付加を含む、請求項23記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基へのサッカライド部分の付加を含む、請求項23記載の方法。
標的分子が脂質、核酸、および炭水化物からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
炭水化物が多糖である、請求項28記載の方法。
捕獲プローブがポリペプチドを含む、請求項20記載の方法。
ポリペプチドが抗体を含む、請求項30記載の方法。
捕獲プローブが小分子を含む、請求項20記載の方法。
第1のドメインがアレイに固定化された核酸に特異的にハイブリダイズし、第2のドメインが特異的に標的分子に結合する、2つのドメインを含むキメラ分子にハイブリダイズしたアレイに固定化された核酸を捕獲プローブが含む、請求項20記載の方法。
検出プローブが、放射性部分、比色部分、生物発光部分、蛍光性部分、および化学発光部分からなる群より選択される検出可能な部分を含む、請求項20記載の方法。
どのバイオサイトが固定された標的分子および検出プローブを含むかを検出する工程が、基質表面を走査し、検出プローブがバイオサイトで固定されているかどうかを決定することを含む、請求項20記載の方法。
走査が光学的または電気的な装置によって行われる、請求項35記載の方法。
基質表面が、未修飾分子を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトを含む、請求項20記載の方法。
基質表面が、二次修飾を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトを含む、請求項20記載の方法。
検出プローブを提供する工程が、未修飾分子を検出することができる検出プローブおよび修飾された分子を検出することができる検出プローブの使用を含む、請求項20記載の方法。
以下の工程を含む、標的分子の二次修飾を検出するための方法：
(a)少なくとも1つのバイオサイトが基質表面に固定された複数の捕獲プローブを含む、複数のバイオサイトを有するアレイを提供する工程；
(b)アレイを標的分子と接触させる工程；
(c)標的分子を検出プローブと接触させる工程；ならびに
(e)どのバイオサイトが結合した標的分子および検出プローブを含むかを検出する工程。
二次修飾がリン酸化を含む、請求項40記載の方法。
標的分子がポリペプチドを含む、請求項40記載の方法。
二次修飾が翻訳後修飾を含む、請求項42記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基のリン酸化を含む、請求項43記載の方法。
アミノ酸残基が、セリン、チロシン、およびスレオニンからなる群より選択される、請求項44記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基への脂質部分の付加を含む、請求項43記載の方法。
二次修飾がアミノ酸残基へのサッカライド部分の付加を含む、請求項43記載の方法。
標的分子が、脂質、核酸、および炭水化物からなる群より選択される、請求項40記載の方法。
炭水化物が多糖である、請求項48記載の方法。
捕獲プローブがポリペプチドを含む、請求項40記載の方法。
ポリペプチドが抗体を含む、請求項50記載の方法。
捕獲プローブが小分子を含む、請求項40記載の方法。
第1のドメインがアレイに固定化された核酸に特異的にハイブリダイズし、第2のドメインが特異的に標的分子に結合する、2つのドメインを含むキメラ分子にハイブリダイズしたアレイに固定化された核酸を捕獲プローブが含む、請求項40記載の方法。
検出プローブが、放射性部分、比色部分、生物発光部分、蛍光性部分、および化学発光部分からなる群より選択される検出可能な部分を含む、請求項40記載の方法。
どのバイオサイトが固定された標的分子および検出プローブを含むかを検出する工程が、基質表面を走査し、検出プローブがバイオサイトで固定されているかどうかを決定することを含む、請求項40記載の方法。
基質表面の走査が、光学的または電気的な装置によって行われる、請求項55記載の方法。
基質表面が、未修飾分子を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトおよび修飾された分子を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトを含む、請求項40記載の方法。
基質表面が、二次修飾を検出することができる捕獲プローブを含むバイオサイトを含む、請求項40記載の方法。
検出プローブを提供する工程が、未修飾分子を検出することができる検出プローブおよび修飾された分子を検出することができる検出プローブの使用を含む、請求項40記載の方法。