KR20040010041A - 단백질 활성의 스크리닝을 위한 고밀도 단백질 어레이 - Google Patents

단백질 활성의 스크리닝을 위한 고밀도 단백질 어레이 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조밀하게 패킹된 반응 웰(well)을 포함하는, 단백질 기능의 대규모 연구에 유용한 단백질 칩에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 단백질 칩을 사용하여 단백질 시료 내에 또는 하나의 단백질 칩 상에 존재하는 단백질의 존재, 양 및/또는 기능을 동시에 분석하는 방법, 또는 그 칩 상의 각각의 단백질에 대한 프로우브(probe)들의 혼합물 중에서 각각의 프로우브의 존재, 상대 특이성 및 결합 친화도를 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 고밀도 저부피 화학 반응에 상기 단백질 칩을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 칩 기판으로 유용한 폴리머 및 단백질 칩의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질 칩 기판의 유도체화(derivatization)에 유용한 화합물에 관한 것이다.

Description

단백질 활성의 스크리닝을 위한 고밀도 단백질 어레이{HIGH DENSITY PROTEIN ARRAYS FOR SCREENING OF PROTEIN ACTIVITY}
전 게놈(genome)의 서열로써 다량의 오픈 리딩 프레임(open reading frames)(ORFs)을 동정하게 된다. 현재, mRNA 발현 패턴 및 유전자 파괴 표현형(phenotypes)에 의해 유전자 기능을 이해하기 위해 상당한 노력이 기울여지고 있다. 이러한 노력으로 부분적으로는 중요한 진전이 있어 유전자 칩 기법에 의해 단일 실험으로 수천의 유전자 서열을 분석할 수 있는 능력을 갖게 되었다. 그러나, 유전자 기능에 대한 많은 정보는 인코딩된 단백질의 생화학적 활성의 분석으로부터 나온다.
현재는 이러한 유형의 분석들은 한번에 단일 단백질을 연구하는 개개의 조사자들에 의해 수행된다. 이것은, 생화학적 활성에 기초한 단백질을 정제 및 동정하는데 수년이 걸릴 수 있기 때문에 매우 시간이 소모되는 방법이다. 전체 게놈 서열의 입수는 게놈에 의해 인코딩된 매 단백질에 대한 생화학적 분석을 수행하는 것을 가능하게 한다.
이 목적을 위해서는 단일 단백질 칩을 사용하여 수백 또는 수천의 단백질 시료를 분석하는 것이 유용하다. 이러한 접근은 다량의 데이터를 생성하여 분석할 수 있는 고생산성 실험에 매우 알맞다. 96 또는 384 웰을 가진 마이크로적정판이 그동안 당 분야에 알려져왔다. 그러나, 이들 판의 크기(최소한 12.8 cm x 8.6 cm)는 웰의 밀도가 충분히 높지 않기 때문에 이들 판은 대규모 단백질 분석에는 적합하지 않다.
상기 기재한 바와 같이, 예를 들면 WO 89/10977에 기재된 바와 같은, DNA 합성 및 하이브리드화 반응에 사용하기 위해 다른 어레이 형태가 고안되었다. 그러한 이들 어레이는, 특징부들간에 상호 오염될 경향이 있는 편평한 표면상에서 제작되기 때문에 분리된 부피로 단백질 분석을 하는데는 부적합하다.
편평한 표면 상의 올리고뉴클레오티드 어레이 (피아제의 문헌[Pease et al., "Light-generated oligonuclotide arrays for rapid DNA sequence analysis," PNAS 91: 022-5026] 참조)에서부터 채널 어레이(미국 특허 제 5,843,767호 참조), 채널에 의해 연결된 웰 어레이(코헨 등의 문헌[Cohen et al., 1999, "A microchip-based enzyme assay for protein kinase A," Anal Biochem. 273:89-97)에 이르기까지 다양한 어레이를 제조하는데는 광식각사진술(photolithographic technique)이 적용되어 왔다. 또한, 미세제작 및 미세사진식각 기법은 반도체 제작 분야에서 널리 알려져 있다 (예를 들면 문헌[Moreau,Semiconductor Lithography: Principals, Practices and Materials, Plemum Press, 1988] 참조).
최근에, 발아 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 생화학적 게놈분석의 잠재적인 유용성을 가지고 고안된 다량의 단백질 발현 방법이 개발되었다. ORFs는,GAL프로모터를 사용하고 단백질을 폴리히스티딘(예를 들면 HISX6) 라벨에 융합하는 발현 벡터내로 클로닝되었다. 따라서, 이 방법은 약 2000개의 효모 단백질 융합물의 발현을 제작하고 동정하는데 사용되어 왔다 (헤이만등의 문헌[Heyman et al., 1999, "Genome-scale cloning and expression ofindivisual open reading frames using topoisomerase I-mediated ligation," Genome Res. 9:383-392] 참조). 재조합 방법(recombination strategy)을 이용하여 효모 ORFs의 약 85%가CUP1프로모터(구리에 의해 유도가능)를 함유하는 벡터에서 GST 코딩 영역을 가진 프레임에서 클로닝되어, GST 융합 단백질을 생성하였다 (마르첸 등의 문헌[Marzen et al., 1999, "A biochemical genomics approach for identifying genes by the activity of their products," science 286:1153-1155] 참조). 마르첸 등은 몇가지 생화학적 활성을 위한 융합 단백질(예를 들면 포스포디에스테라제 및 Appr-1-P-프로세싱 활성)의 수집을 스크리닝하기 위해 풀링(pooling) 방법을 사용하였으며, 이들 활성을 인코딩하는 관련 유전자를 동정하였다. 그러나, 다수의 개개의 단백질 시료를 분석하는 방법은 기술되지 않았다.
따라서, 선행 기술의 칩 및 방법에 비해 비용 및 시간 상의 잇점을 얻기 위해 칩 상에 웰이 조밀하게 패킹된 단백질 칩이 필요하다.
상기 또는 이하 본원에서 인용된 문헌의 인용은 그러한 문헌이 본원에 대한 선행기술로 이용될 수 있다고 허락하는 것으로 간주되어서는 안된다.
[발명의 개요]
본 발명은 단백질 작용의 대규모의 연구에 유용한 단백질 칩, 즉 고상 지지체 상의 위치적으로 접근 가능한 단백질 어레이에 관한 것이고, 여기서 단백질 칩은 조밀하게 패킹된 반응 웰을 포함한다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 시료에 있는 단백질의 존재, 양 및/또는 기능을 분석하는데 단백질 칩을 사용하는 방법에관한 것이다. 본 발명은 또한 고밀도 및 저체적 화학 반응에 단백질 칩을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 칩 기판으로서 유용한 폴리머 및 단백질 칩의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 단백질 칩의 유도체화 반응에 유용한 화합물에 관한 것이다.
일 실시태양에 있어서, 본 발명은 유리 슬라이드(이에 국한되지 않는다)와 같은 편평한 표면을 포함하는 단백질 칩을 제공한다. 조밀한 단백질 어레이는 화학 반응과 분석이 행해질 수 있도록, 예를 들어, 유리 슬라이드 위에 제작되어, 단백질의 존재, 양 및/또는 기능을 대규모 병렬 분석할 수 있도록 한다. 특정 실시태양에서, 평면 어레이는 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTS) 결합제를 통해 그 표면에 결합된 단백질을 가진다.
또한, 다른 특정 실시태양에 있어서, 본 발명은 단백질 칩에 화학 반응 및 분석이 행해질 수 있는 조밀하게 패킹된 웰을 제공함으로써 종래의 방법 및 장치의 불편하고 제한적인 면을 극복하여, 단백질의 존재, 양 및/또는 기능의 대규모 병렬 분석을 할 수 있도록 한다.
한번씩(one-by-on)의 분석보다 어레이 분석이 갖는 일반적인 이점은 많은 단백질-프로우브 상호작용을 동시에 동정하고, 이들 상호작용의 상대적인 친화도를 결정하는 능력을 포함한다. 프로우브의 복합 혼합물을 칩에 적용하는 것의 이점은, 세포에서의 그의 더 많은 환경에서의 상호작용을 검출하는 능력, 및 많은 잠재적인 리간드를 동시에 평가하는 능력을 포함한다.
일 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 상기 다수의 물질은 적어도 ㎠당 100개의 다른 물질로 이루어진다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위의 다수의 다른 물질, 또는 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자(각각의 다른 단백질 또는 분자는 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)를 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 상기 다수의 다른 단백질 또는 분자는 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%로 이루어진다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 상기 고상 지지체는 세라믹, 비결정질 실리콘 카바이드, 캐스팅가능한 산화물, 폴리이미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌 및 실리콘 엘라스토머로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 실시태양에 있어서, 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 기질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 상기 다수의 다른물질은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 결합제를 통해 상기 고상 지지체에 결합된다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체의 표면 위에 다수의 웰을 포함하는 어레이이고, 상기 웰의 밀도는 적어도 100웰/㎠이다.
본 발명은 또한 고체 표면 위에 100웰/㎠ 보다 큰 밀도를 나타내도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 어레이를 캐스팅하는 단계를 포함하는, 고상 지지체의 표면 위에 다수의 웰을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 100웰/㎠ 보다 큰, 고체 표면 위의 웰 밀도를 산출하도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 제 2 주형을 캐스팅하고, 상기 제 2 주형으로부터 적어도 하나의 어레이를 캐스팅하는 단계를 포함하는, 고상 지지체의 표면 위에 다수의 웰을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 이때 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 100개의 다른 물질로 이루어지며, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 다수의 다른 단백질, 또는 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자(각각의 다른 단백질 또는 분자는 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 이때 상기 다수의 단백질 및 분자는 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%로 이루어지고, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 이때 상기 고상 지지체는 세라믹, 비결정질 실리콘 카바이드, 캐스팅가능한 산화물, 폴리이미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌 및 실리콘 엘라스토머로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 상기 다수의 다른 물질은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 결합제를 통해 상기 고상 지지체에 결합되며, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 위치시키는 단계를 포함하는, 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 이때 상기 다수의 물질은 적어도 ㎠당 100개의 다른 물질로 이루어지며, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
특정 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 위치시키는 단계를 포함하는, 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 이때 상기 다수의 물질은 적어도 ㎠당 100개의 다른 물질로 이루어지고 상기 고상 지지체는 유리 슬라이드이며, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자(각각의 다른 단백질 또는 분자는 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)를 위치시키는 단계를 포함하는, 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 이때 상기 다수의 다른 단백질 또는 분자는 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%로 이루어지며, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자(각각의 다른 단백질 또는 분자는 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)를 위치시키는 단계를 포함하는, 위치적으로 접근 가능한 어레이를 이용하는 방법으로서, 이때 상기 다수의 다른 단백질 또는 분자는 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%로 이루어지고 상기 고상 지지체는 유리 슬라이드이며, 프로우브와 상기 어레이를 접촉하고 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 표면 위에 100웰/㎠ 보다 큰 웰의 밀도를 나타내도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 어레이를 캐스팅하고, 고상 지지체 위의 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 웰 내에 있음)을 상기 웰 내에 위치시키는 단계를 포함하는, 위치적으로 접근 가능한 어레이를 제조하는 방법이다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 표면 위에 100웰/㎠ 보다 큰 웰의 밀도를 산출하도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 제 2 주형을 캐스팅하고, 상기 제 2 주형으로부터 적어도 하나의 어레이를 캐스팅하고, 고상 지지체에 결합되지 않은 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 기질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 다른 웰 내에 있음)을 상기 웰 내에 위치시키는 단계를 포함하는, 위치적으로 접근 가능한 어레이를 제조하는 방법이다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 표면 위에 100웰/㎠ 보다 큰 웰의 밀도를 나타내도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 제 2 주형을 캐스팅하고, 상기 제 2 주형으로부터 적어도 하나의 어레이를 캐스팅하고, 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 다른 웰 내에 있음)을 상기 웰 내에 위치시키는 단계를 포함하는, 위치적으로 접근 가능한 어레이를 제조하는 방법이다.
[정의]
본 명세서에 사용된, "단백질"은 전-길이의 단백질, 단백질의 일부 또는 펩타이드를 나타낸다. 단백질은 유기체, 바람직하게는 박테리아, 효모, 곤충 세포 또는 포유류 세포에서 재조합 과발현하여 제공되거나, 더 큰 단백질의 분절화를 통해 생성되거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "작용성 도메인"은 원하는 작용 활성을 제공하기에 필요하고 충분한 단백질의 도메인이다. 작용성 도메인의 예는 그 중에서도 특히, 키나제, 프로테아제, 포스파타제, 글리코시다제, 아세틸라제, 트랜스퍼라제 또는 다른 효소 활성을 나타내는 도메인을 포함한다. 작용성 도메인의 다른 예는 DNA, RNA, 단백질, 호르몬, 리간드 또는 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 도메인들을포함한다.
본 명세서에 사용된 "프로우브"는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 또는 단백질에 결합하는 화학 시약을 나타낸다. 프로우브의 예는 그 중에서도 특히, 다른 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, 소분자 기질 및 반응 억제제, 약제 후보, 수용체, 항원, 호르몬, 스테로이드, 인지질, 항체, 공통인자, 사이토카인, 글루타티온, 면역 글로불린 도메인, 탄수화물, 말토스, 니켈, 디하이드로트립신 및 비오틴을 포함한다.
칩 위의 각각의 단백질 또는 프로우브는 각각의 단백질 또는 프로우브의 존재가 고상 지지체 위의 그의 위치로부터 결정될 수 있도록 상기 고상 지지체 위의 알려지고 예정된 위치에 놓이는 것이 바람직하다. 또한, 상기 단백질 또는 프로우브는 고상 지지체 위에서 위치적으로 접근 가능한 어레이를 형성한다.
본 원은 2000년 5월 4일자로 출원된 미국 가출원 제 60/201,921호 및 2000년 7월 27일 자로 출원된 미국 가출원 제 60/221,034호를 미국 특허법 제119조 하에 우선권으로 주장하며, 이들 각각을 그 전체로서 본원에 참고로 인용한다.
본 발명은 등록 번호 DARPA/ONR R13164-41600099 및 NIH(미국 국립위생연구소) RO1CA77808하에 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부가 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
본 발명은 조밀하게 패킹된 반응 웰(well)을 포함하는, 단백질 기능의 대규모 연구에 유용한 단백질 칩에 관한 것이다. 본 발명은 상기 단백질 칩을 사용하여 단백질 시료 내에 또는 하나의 단백질 칩 상에 존재하는 단백질의 존재, 양 및/또는 기능을 동시에 분석하는 방법, 또는 그 칩 상의 각각의 단백질에 대한 프로우브(probe)들의 혼합물 중에서 각각의 프로우브의 존재, 상대 특이성 및 결합 친화도를 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 고밀도 저부피 화학 반응에 상기 단백질 칩을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 칩 기판으로 유용한 폴리머 및 단백질 칩의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질 칩 기판의 유도체화(derivatization)에 유용한 화합물에 관한 것이다.
도 1a: 기술된 재조합 방법을 사용하여 119개 효모 단백질 키나제를 갈락토스-유도성GAL10프로모터의 제어하에 GST 융합 단백질을 생성하는 고 복제URA3발현 벡터에서 클로닝하였다. GST::키나제 제작물은 이. 콜라이로 구제되고, 각각의 제작물의 5'-말단에서의 서열을 결정하였다. 전체의 과정은 돌연변이가 발견될 때까지 반복되었다.
도 1b: 기술한 바와 같이 정제된 GST::키나제 융합 단백질의 면역블롯. 세 번의 시도로부터 106개 키나제 단백질을 정제하였다. 반복된 시도에도 불구하고,119개 GST 융합의 마지막 14개는 면역블롯팅 분석(예를 들어, 별표를 붙인 레인에서의 Mpsl)에 의해 검출되지 않았다.
도 2a: 키나제 연구에서 사용된 단백질 칩은 개략적으로 나타낸 다음의 공정으로 제조되었다. 아크릴 마스터 주형 위에 폴리디메틸실록산(PDMS)을 부었다. 경화 후, 웰을 포함한 칩을 벗기고 이를 유리 슬라이드 위에 장착시켰다. 다음, 칩의 표면을 유도체화한 다음 단백질을 웰에 결합시켰다. 웰을 우선 1% BSA로 블로킹한 후33P-γ-ATP와 완충제를 첨가하였다. 30℃에서 30분 동안 배양 후에, 단백질 칩을 광범위하게 세척하고, X-선 필름과 50㎛의 해상도를 가지고 정량분석가능한 분자 역학 형광영상기(Molecular Dynamics PhosphorImager)에 노출시켰다. 12개의 기질에 대하여, 각각의 키나제 분석을 적어도 두 번 반복하였고, 나머지 5개의 기질에 대해서는 분석을 한 번 수행하였다.
도 2b: 단백질 칩의 확대 사진.
도 3: 단백질 칩 및 키나제 분석 결과. 모든 칩 위의 위치 I9는 네가티브 대조용의 신호를 나타낸다. 위치 B4에 있는 Mpsl는, 웨스턴 블롯에서는 가시적 신호가 검출되지 않았지만(도 1b), 모든 12개 키나제 반응에서 강한 키나제 활성을 나타내었다.
도 4a: 단백질 키나제 반응의 정량 분석. 분자 역학 형광영상기(Molecular Dynamics PhosphorImager)를 사용하여 키나제 활성을 결정하였으며, 그 데이터는 엑셀(Exel) 스프레드시트로 출력되었다. 다음으로, 키나제 신호를, 네가티브 대조용에 대하여 그 데이터를 표준화하여 배수(fold) 증가로 변환시켰다. 4개의 반응에서 119개의 키나제의 신호가 로그 스케일로 나타내어져 있다. 배수 증가는 1에서 1000 배 범위이다.
도 4d: 기질의 특이성을 결정하기 위하여, 특이성 지수(SI)를 다음의 식을 사용하여 계산하였다.
SIir=Fir/[Fi1+Fi2+·····+Fir)/r]
여기서
i는 사용된 키나제를 나타내고,
r은 기질을 나타내며,
Fir은 GST 단독과 비교한 기질 r 상의 키나제 i의 배수 증가를 나타낸다. 키나제 특이성의 몇가지 예는 SI가 3보다 클 때 도시한다.
도 5a: 폴리(Tyr-Glu)키나제의 작용 특이성과 아미노 서열 사이의 상관관계를 나타내는 키나제 코어 도메인 다중 서열 어레이로부터 유도된 계통도. 기질로서 폴리(Tyr-Glu)를 사용할 수 있는 키나제가 흔히 서열 비교 덴드로그램 상의 특정 영역에 위치한다. 폴리(Tyr-Glu)를 효과적으로 포스포릴화할 수 있는 키나제는 음영(shading)으로 나타내어진다. 이 기질을 약하게 사용하는 두 개의 키나제는 박스 내에 나타내어진다. 폴리(Tyr-Glu)를 포스포릴화할 수 없는 Rad53 및 Ste7은 별표로 나타내어진다. 도시된 바와 같이, 이 키나제 중의 70%는 4개의 서열 그룹(동그라미)에 놓여있다.
도 5b: 토끼 근육 포스포릴라제 키나제(PHK)28의 구조. 기질로서 폴리(Tyr-Glu)를 사용할 수 있는 키나제에서 우선적으로 발견된 3개의 기본 잔기 및 메티오닌(Met) 잔기의 위치가 나타내어진다. 아스파라긴(Asp) 잔기는 폴리(Tyr-Glu)를 사용하지 않는 키나제에서 대개 발견된다.
도 6: 단백질 칩 제조공정에서의 리소그래피 단계의 단면도.
a. 산화막의 한쪽 측면 위에 실리콘으로 된 두 개의 막을 가진 실리콘 웨이퍼.
b. 상부에 저항 마스크층을 가진 실리콘 웨이퍼.
c. 식각 공정은 표면이 상기 저항 마스크에 의해 보호되지 않는 실리콘을 제거한다. 식각의 깊이는 산화막의 위치에 의해 제어된다. 즉 식각 공정에서 상기 산화막은 제거되지 않는다.
d. 마스크 층이 제거되고 식각된 실리콘 웨이퍼가 남는다.
e. 단백질 칩 재료를 상기 주형에 적용한다.
f. 경화 후, 단백질 칩을 상기 주형으로부터 제거한다. 단백질 칩은 상기 주형에 대해 네가티브인 형상을 갖는다.
도 7: 단백질 칩 위에서의 키나제/억제제 분석 결과.
인간 단백질 키나제 A(PKA), 인간 지도 키나제(MAPK), 3개의 효모 PKA 동족체(TPK1, TPK2 및 TPK3), 및 2개의 다른 효모 단백질 키나제(HSL1 및 RCK1)를, 특정 인간 PKA 반응 억제제, PKIα 또는 MAPK 반응 억제제, SB202190의 다른 농도를 사용하여 2개의 기질(즉, PKA를 위한 단백질 기질과 보통 사용되는 키나제 기질,MBP)에 대하여 시험하였다. 도시된 바와 같이, PKIα는 기질로서 펩타이드와 MBP 둘다를 사용하여 PKA 활성을 특이적으로 억제하였다. 그러나, SB202190는 PKA 활성 억제 효과를 보이지 않았다. 또한, PKIα는, 시험된 상기 3개의 효모 PKA 동족체(TPK1, TPK2, TPK3) 또는 나머지의 다른 두 개의 효모 단백질 키나제, HSL1 및 RCK1을 억제하지 않았다는 것이 흥미롭다.
본 발명은 단백질 작용의 대규모의 연구에 유용한 단백질 칩, 즉 고상 지지제 위에 위치적으로 접근 가능한 단백질 어레이에 관한 것이고, 여기서 단백질 칩은 조밀하게 팩킹된 반응 웰을 포함한다. 위치적으로 접근 가능한 어레이는 각각의 프로우브 또는 단백질의 존재가 상기 어레이 위에 그의 위치로부터 결정될 수 있도록 상기 고상 지지체 위의 알려지고 미리 결정된 위치에 각각의 관심 프로우브 또는 단백질이 위치되도록 하는 구성을 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 하나의 시료에 있는 단백질의 존재, 양 및/또는 기능을 분석하는데 단백질 칩을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고밀도 및 소체적 화학 반응에 단백질 칩을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 칩 기질로서 유용한 폴리머 및 단백질 칩의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 단백질 칩의 유도체화 반응에 유용한 화합물에 관한 것이다.
일 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 상기 다수의 물질은 적어도 ㎠당 100개의 다른 물질로 이루어진다. 일 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 100에서 1,000개 사이의 다른 물질로 이루어진다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 1,000에서 10,000개 사이의 다른 물질로 이루어진다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 10,000에서 100,000개 사이의 다른 물질로 이루어진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 100,000에서 1,000,000개 사이의 다른 물질로 이루어진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 1,000,000에서 10,000,000개 사이의 다른 물질로 이루어진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 10,000,000에서 25,000,000개 사이의 다른 물질로 이루어진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 25,000,000개의 다른 물질로 이루어진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 10,000,000,000개의 다른 물질로 이루어진다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 10,000,000,000,000개의 다른 물질로 이루어진다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 이때 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 100개의 다른 물질로 이루어지며, 상기 고상 지지체는 유리 슬라이드이다.
다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 이때 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 약 30 내지 100개의 다른 물질로 이루어진다. 특정실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 30개의 다른 물질로 이루어진다. 보다 특정한 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 30에서 50개의 다른 물질로 이루어진다. 다른 특정 실시태양에 있어서, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 50에서 100개의 다른 물질로 이루어진다.
여러 특정 실시태양에 있어서, 본 발명은 고상 지지체 위에 다수의 다른 단백질, 또는 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자(각각의 다른 단백질 또는 분자는 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이이고, 상기 다수의 다른 단백질 또는 분자는 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%, 75%, 90% 또는 95%로 이루어진다. 예를 들면, 이러한 유기체는 진핵성 또는 전핵성이고, 바람직하게는 포유동물, 인간 또는 인간 이외의 동물, 영장류, 생쥐, 쥐, 고양이, 개, 말, 소, 닭, 효모, 드로소필라 시.엘레간스(Drosophila C. elegans) 등의 균류가 될 수 있다. 이런 형태의 흥미로운 생물학적인 활성은 효소 활성(예를 들어, 키나제 활성, 프로테아제 활성, 포스파타제 활성, 글리코시다제, 아세틸라제 활성 및 다른 화학적 그룹 전달 효소 활성), 핵산 결합성, 호르몬 결합성 등이 있으며, 이에 국한되지 않는다.
단백질 칩의 제작
본 발명의 어레이에서 웰의 밀도를 가진 단백질 칩은 종래의 미세제작 또는 미세사진식각술을 사용하여 찍어내거나 제분 또는 식각을 해 온 마스터 주형으로부터 캐스팅되는 것이 바람직하다. 바람직하게는 종래의 미세사진식각술 및 물질을 마스터 주형의 생산에 이용한다. 마스터 주형을 한 번 생산하면, 마스터 주형은 다음에 단백질 칩 자체를 주형하는데 직접적으로 사용될 수 있다. 이와는 달리, 제 2 또는 제 3 주형을 마스터 주형으로부터 캐스팅하여 이 제 2 또는 3 주형으로부터 단백질 칩을 캐스팅할 수 있다.
마스터 주형은 미세제작 또는 미세사진식각술에 적합한 어떠한 물질(실리콘, 유리, 석영, 폴리이미드 및 폴리디메틸메타크릴레이트(루사이트(Lucite))가 바람직함)로부터 제작될 수 있다. 미세사진식각술을 위해, 바람직한 물질은 실리콘 웨이퍼이다.
적당한 마스터, 제 2 또는 제 3 주형이 생산되기만 하면, 단백질 칩이 캐스팅된다. 단백질 칩은 다공성 또는 비다공성 고상 지지체를 비롯한 캐스팅에 적당한 임의의 고상 지지체 내에서 캐스팅될 수 있다. 세라믹, 비결정질 실리콘 카바이드, 경화시 SiO2캐스트를 생산하는 캐스팅가능한 산화물, 폴리이미드, 폴리디메틸메타크릴레이트 및 폴리스티렌이 바람직한 고상 지지체이고, 실리콘 엘라스토머 물질이 가장 바람직하다. 실리콘 엘라스토머 물질 중에 폴리디메틸실록산(PDMS)이 가장 바람직한 고상 지지체이다. 실리콘 엘라스토머 물질의 이점은 그의 유연한 성질로 인해 주형으로부터 제거되는 것이 쉽다는 점이다.
도 6은 본 발명에 따른 단백질 칩 위에 고밀도의 웰 어레이를 구현하는데 유용한 방법의 일예를 나타낸다. 실리콘으로 이루어진 막들 사이에 끼워진 산화막을 가진 실리콘 웨이퍼를 제공한다(도 6a). 절연체상 실리콘 또는 SOI 웨이퍼로 알려진 이들 웨이퍼는 주로 웨이퍼 공급 회사(예를 들어, 벨레 메드 리써치(Belle Mead Research, 미국 뉴저지 벨레 메드 소재) 및 버지니아 세미콘덕터(Virginia Semiconductor, 미국 버지니아 프레드릭스버그 소재))로부터 입수된다.
실리콘 웨이퍼는, 이어서 식각 공정을 통해 패터닝되고 식각된다 (도 6b-d). 매설 산화막은 매우 효과적인 식각 정지제로서 역할을 하여 웨이퍼 전체에 걸쳐 매우 균일한 식각 깊이를 갖게 한다. 식각 깊이는 식각 공정에 대해 독립적이고 단지 상부 실리콘 막의 두께에 의해서 결정된다.
습식 화학 식각 공정(예를 들어, KOH 또는 테트라-메틸하이드라진(TMAH)를 사용함)이 이용될 수 있다. 그러나, 이 기술은 실리콘 웨이퍼의 결정 배향에 좀 더 의존한다. 따라서, 반응성 이온 식각(RIE)에서 희박 기체(전형적인 SF6)를 사용하는 기술이 바람직하다. RIE 식각 기술은 실리콘 웨이퍼의 결정 배향에 독립적인실리콘 내의 매우 비등방성의 웰을 구현할 수 있다. 코박스(G. Kovacs)의 문헌[Micromachined Transducers Sourcebook, Academic Press(1998)] 및 마도우(M. Madou)의 참고문헌[Fundamental of Microfabrication, CRC Press(1997)]은 식각 기술의 배경을 제공한다.
원하는 웰 모양의 조합을 얻기 위해 단일 칩에 두 가지 형태의 미세사진식각술을 이용할 수 있다. 습식-화학 식각은 U-모양의 웰을 제공하는 등방성 공정인 반면에, RIE는 사각의 하부의 웰을 제공하는 비등방성 공정이다.
마스터 주형을 구현하기 위해 웨이퍼를 식각한 후에, 이를 단백질 칩을 캐스팅하는데 이용할 수 있다(도 6e-f). 이들 구조물은 단백질 칩 또는 그 자체가 단백질 칩의 추가적인 캐스팅이 일어나는 제 2 또는 3 주형일 수 있다.
따라서, 일 실시태양에 있어서, 고상 지지체의 포면 위에 다수의 웰을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이의 제조 방법은, 100웰/㎠보다 큰 고상 표면 위의 웰의 밀도를 산출하도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 어레이를 캐스팅하는 것을 포함한다. 다른 실시태양에 있어서, 고상 지지체의 표면 위에 다수의 웰을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이의 제조 방법은, 100웰/㎠보다 큰 고상 표면 위의 웰의 밀도를 산출하도록 설계된 상기 미세제작된 주형으로부터 어레이를 캐스팅하고, 제 2 주형으로부터 적어도 하나의 어레이를 캐스팅하는 것을 포함한다. 또 다른 실시태양에 있어서, 위치적으로 접근 가능한 어레이의 제조 방법은, 액상 캐스팅 물질로 주형을 덮고 캐스팅된 물질이 굳을 때까지 경화하는 것을 포함한다. 액상 캐스팅 물질은 바람직하게는 실리콘 엘라스토머이고, 가장 바람직하게는 폴리디메틸실록산이다. 이들 위치적으로 접근 가능한 어레이 중에서, 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질을, 각각의 다른 물질이 고상 지지체 위의 다른 웰에 위치되도록 위치시킬 수 있다.
단백질 칩의 특징
본 발명의 단백질 칩은 물리적인 치수에 있어서 제한되지 않고 편리한 어떠한 치수를 가질 수 있다. 현재의 실험 장치와의 호환성을 위하여, 단백질 칩은 표준 현미경 슬라이드의 크기 또는 더 작은 것이 바람직하다. 두 개의 칩이 현미경 슬라이드 위에 딱 맞는 크기의 단백질 칩이 가장 바람직하다. 또한, 질량 분석계의 시료 챔버 내에 맞는 크기의 단백질 칩이 바람직하다.
본 발명의 단백질 칩 내의 웰은 직사각형, 정사각형 또는 타원형과 같은 임의의 형상을 가질 수 있고, 원형이 바람직하다. 단백질 칩 내의 웰은 정사각형 또는 원형 바닥면, V-형 바닥면 또는 U-형 바닥면을 가질 수 있다. 정사각형 바닥면은 비등방성인 바람직한 반응성 이온 식각(RIE) 공정이 정사각형 바닥의 웰을 제공하기 때문에 약간 바람직하다. 웰 바닥의 형상은 특히 칩에서 균일할 필요는 없고, 칩 상에서 수행되는 특별한 시험이 요구하는 바에 따라 바뀔 수 있다.
본 발명의 단백질 칩 내의 웰은 임의의 폭-두께 비를 가질 수 있는데, 약 10:1과 약 1:10 사이의 폭-두께 비가 바람직하다. 본 발명의 단백질 칩내의 웰은 임의의 체적을 가질 수 있는데, 1 pl과 5μl 사이의 체적이 바람직하며, 1nl과1μl 사이의 체적이 좀 더 바람직하다. 웰의 가장 바람직한 체적은 100nl과 300nl 사이이다. 밀도가 매우 큰 웰을 가진 단백질 칩의 경우, 웰의 바람직한 체적은 10 pl과 100 nl 사이이다.
본 발명의 단백질 칩은 다양한 웰 밀도(웰/㎠)를 가질 수 있다. 바람직한 웰의 밀도는 약 25웰/㎠과 약 10,000,000,000,000웰/㎠ 사이이다. 레이저 분쇄 루사이트의 마스터 주형으로부터 캐스팅된 단백질 칩 위의 웰의 밀도는 일반적으로 1웰/㎠과 2,500웰/㎠ 사이이다. 적당한 분쇄 기구는 직경이 100㎛만큼 작고 100㎛ 떨어진 웰을 생성한다. 습식-화학 미세사진식각술에 의해 식각된 마스터 주형으로부터 캐스팅된 단백질 칩은 일반적으로 50웰/㎠과 10,000,000,000웰/㎠ 사이의 웰 밀도를 가진다. 습식-화학 식각은 깊이 10㎛이고 10㎛ 떨어진 웰을 생성하고, 이에 따라 직경이 10㎛보다 작은 웰을 생성한다. 습식-화학 미세사진식각술에 의해 식각된 마스터 주형으로부터 캐스팅된 단백질 칩은 일반적으로 100웰/㎠과 25,000,000웰/㎠ 사이의 웰 밀도를 가진다. 광학식각술과 병행한 RIE는 직경 500nm이고 500nm 떨어진 웰을 생성한다. RIE와 병행한 전자빔식각술의 사용은 직경 50nm이고 50nm 떨어진 웰을 생성한다. 균등한 간격을 둔 이 크기의 웰은 10,000,000,000,000웰/㎠의 밀도를 가진 단백질 칩을 생성한다. 바람직하게는, RIE는 직경 20㎛이고 20㎛ 떨어진 웰을 생성하기 위해 사용된다. 균등하게 간격을 가진 이 크기의 웰은 25,000,000웰/㎠의 밀도를 나타낸다.
상술된 미세제작 및 미세사진식각술은 560㎛ 또는 280㎛의 웰 크기와 약 1mm의 간격을 가진 실리콘 웨이퍼를 습식-화학적으로 식각하는데 성공적으로 사용된다. 웰 및 간격의 상기 조합은 각각 약 410,000웰/㎠과 약 610,000웰/㎠의 어레이를 생성한다. 웰 크기 및 간격이 균등할 때, 약 3.19 백만 웰/㎠과 12.75 백만 웰/㎠을 가진 단백질 칩이 생성된다.
일 실시태양에 있어서, 어레이는 고상 지지체의 표면 위에 다수의 웰을 포함하고, 웰의 밀도는 적어도 100웰/㎠이다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 100과 1000웰/㎠ 사이이다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 1000과 10,000웰/㎠ 사이이다. 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 10,000과 100,000웰/㎠ 사이이다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 100,000과 1,000,000웰/㎠ 사이이다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 1,000,000과 10,000,000웰/㎠ 사이이다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 10,000,000과 25,000,000웰/㎠ 사이이다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 적어도 25,000,000웰/㎠이다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 적어도 10,000,000,000웰/㎠이다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 웰의 밀도는 적어도 10,000,000,000,000웰/㎠이다.
단백질 칩의 이용
일 실시태양에 있어서, 본 발명은 유리 슬라이드(이에 국한되지 않는다)와 같은 편평한 표면(평면)을 포함하는 단백질 칩을 제공한다. 조밀한 단백질 어레이는 화학 반응과 분석이 행해질 수 있도록, 예를 들어, 유리 슬라이드 위에 제작되어, 단백질의 존재, 양 및/또는 기능을 대규모 병렬 분석할 수 있도록 한다. 단백질 또는 프로우브는 고상 지지체의 편평한 표면에 공유 또는 비공유 결합된다. 단백질 또는 프로우브는 고상 지지체의 편평한 표면에 직접 결합될 수도 있고, 또는 결합제 분자 또는 화합물을 통해 고상 지지체에 결합될 수도 있다. 상기 결합제는 고상 지지체의 표면을 유도체화하여 고상 지지체의 표면에 대한 단백질 또는 프로우브의 결합을 용이하게 한다. 상기 결합제는 단백질 또는 프로우브를 고상 지지체의 표면에 공유 또는 비공유 결합시킬 수 있다. 또한, 상기 결합제는 무기 또는 유기 분자일 수 있다. 바람직한 결합제는 아민이 없는 화합물이다. 결합제 중에서 가장 바람직한 것은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 (GPTS)이다.
또한, 다른 특정 실시태양에 있어서, 본 발명의 단백질 칩은 편평한 표면의 어레이에 비해 몇 가지 이점을 갖는다. 즉, 웰을 사용함으로써 웰의 함량과 관련된 상호오염 경향을 배제 또는 감소시킨다. 편평한 표면에 비한 또하나의 이점은 증대된 신호-대-노이즈 비이다. 웰은 보다 많은 양의 반응 용액을 보다 조밀한 구조에서 사용할 수 있도록 하며, 따라서, 보다 센 신호가 가능하다. 또한 웰은 칩으로부터 반응 용액이 증발되는 속도를 편평한 표면 어레이에 비해 감소시키며, 이로써 보다 긴 반응시간을 허용한다.
편평한 표면에 대한 웰의 또하나의 이점은 웰의 사용으로 인해 칩상의 각 웰 마다 고정되고 제한된 양의 프로우브를 사용함으로써 연관 연구(association studies)가 가능하다는 것이다. 이에 반해 편평한 표면의 사용은 보통 전체 기판을 따라 불규칙적인 프로우브의 적용을 수반한다. 브로우브의 혼합물 중의 프로우브가 높은 친화성과 낮은 특이성을 갖는 경우, 기판을 따라 프로우브 혼합물을 불규칙적으로 적용하는 것은 높은 친화도의 프로우브를 가진 많은 단백질을 포화시키게 될 것이다. 이러한 포화는 혼합물 중의 다른 프로우브의 검출을 효과적으로 제한한다. 웰을 사용함으로써 칩 상의 개개의 웰에 제한된 양의 프로우브를 적용할 수 있다. 따라서, 개개의 단백질에 적용되는 프로우브의 양이 조절될 수 있으며, 다른 단백질의 경우 프로우브가 다를 수 있다 (다른 웰에 위치됨).
단백질 칩이 상술한 바와 같이 제조되면, 이를 분석 또는 다른 화학적 반응에 이용할 수 있다. 분석의 경우, 일반적으로 단백질 또는 프로우브를 웰에 위치시킬 것이다. 단백질 또는 프로우브의 존재 또는 부재는 단백질 칩에 대한 단백질 또는 프로우브 각각의 적용에 의해 검출될 것이다. 단백질-프로우브 상호작용은 이하에서 몇가지 기술하는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 가시화할 수 있다.
본 발명에 유용한 단백질은, 다양한 천연 단백질 중 하나에 규정된 도메인이 결합된 융합 단백질 또는 천연의 비-융합 단백질일 수 있다.
또하나의 실시태양에서, 소낭, 엔도솜(endosome), 세포억제성 기관(subcellular organelle) 및 멤브레인 절편과 같은 (이에 국한되지 않음) 단백질-함유 세포 물질을 단백질 칩 상에, 예를 들면 웰에 위치시킬 수 있다. 또 하나의 실시태양에서는, 전 세포를 단백질 칩 상에(예를 들면 웰에) 위치시킬 수 있다. 또하나의 실시태양에서는 단백질, 단백질-함유 세포 물질 또는 전 세포를 단백질 칩 상의 고상 지지체에 결합시킨다.
단백질은 단백질 칩상에 위치시키기 전에 또는 위치시키는 중에 특정 단백질에 결합하는 시약을 사용(단백질 칩 상에 미리 위치시킴)함으로써 정제할 수도 있다. 표준 기법(예를 들면 친화성 또는 컬럼 크로마토그래피)에 의해 또는 원심분리 시료를 단리(예를 들면 P1 또는 P2 분획)함으로써 부분 정제된 단백질-함유 세포 물질 또는 세포를 수득할 수 있다.
또한, 단백질, 단백질-함유 세포 물질 또는 세포는, 단백질 칩 상에 위치시키기 전에 또는 도중에 인공 또는 천연 멤브레인에 식재될 수 있다. 또하나의 실시태양에서, 단백질, 단백질-함유 세포 물질 또는 전 세포는 세포외(extracellular) 매트릭스 성분 (예를 들면 콜라겐 또는 기본박막(basal lamina))에 식재될 수 있다. 본 발명의 단백질은 용액 형태일 수 있으며, 또는 고상 지지체의 표면에 결합되거나 (예를 들면 웰에 또는 편평한 표면 상에서) 또는 고상 지지체의 웰에 위치된 기질 (예를 들면 비드)에 결합될 수 있다.
웰에 단백질 또는 프로우브를 위치시키는 것은 임의의 분배 수단, 예를 들면 버블 제트 또는 잉크 제트 프린터 헤드를 사용하여 수행할 수 있다. 미세피펫 분배기가 바람직하다. 단백질 또는 프로우브의 배치는 수동으로 수행할 수도 있고 또는 기계에 연결된 컴퓨터를 사용하여 자동화할 수도 있다.
웰이 자체-용기인 경우, 단백질 또는 프로우브는 고상 지지체의 표면에 결합될 필요가 없지만, 오히려 간단히 웰에 위치되거나 웰에 위치된 기질(예를 들면 비드)에 결합될 수 있다. 다른 물질로는 니트로셀룰로즈 입자, 유리 비드, 플라스틱 비드, 자석 입자 및 라텍스 입자가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 달리, 단백질 또는 프로우브는 웰에서 고상 지지체의 표면에 고상 지지체의 편평한 표면에 공유 또는 비공유 결합된다. 단백질 또는 프로우브는 고상 지지체의 표면에 직접 결합될 수도 있고 (웰에서), 또는 결합제 분자 또는 화합물을 통해 고상 지지체에 결합될 수도 있다. 상기 결합체는 고상 지지체의 표면을 유도체화하여 고상 지지체의 표면에 대한 단백질 또는 프로우브의 결합을 용이하게 한다. 상기 결합제는 단백질 또는 프로우브를 고상 지지체의 표면에 공유결합시킬 수도 있고 또는 비공유 상호작용을 통해 결합시킬 수도 있다. 또한, 상기 결합제는 무기 또는 유기 분자일 수 있다. 바람직한 결합제는 아민이 없는 화합물이다. 결합제 중에서 가장 바람직한 것은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 (GPTS)이다.
웰 표면에 비공유결합된 단백질 또는 프로우브는, 예를 들면 수소 결합, 반데르발스 결합, 정전성 또는 금속-킬레이트 배위결합과 같이 다양한 분자간 상호작용을 이용하여 웰 표면에 결합될 수 있다. 또한, DNA-DNA, DNA-RNA 및 수용체-리간드 상호작용이 비공유 결합을 이용하는 상호작용 유형이다. 예를 들면 수용체-리간드 상호작용은 항체와 항원간, DNA-결합 단백질과 DNA, 효소와 기질, 아비딘(또는 스트렙타비딘)과 비오틴(또는 비오틴화된 분자)간의 상호작용, 및 지질-결합 단백질과 인지질 멤브레인 또는 소낭간의 상호작용을 포함한다. 예를 들면, 단백질은, 웰의 표면에 결합되는 기질에 대해 친화성을 갖는 융합 단백질 도메인으로 발현될 수 있다. 융합 단백질 결합에 적절한 기질로는 트립신/안하이드로트립신, 글루타티온, 면역글로불린 도메인, 말토스, 니켈 또는 비오틴 및 그의 유도체가 포함되며, 이들은 소 췌장(bovine pancreatic) 트립신 억제제, 글루타티온-S-트란스퍼라제, 항원, 말토스 결합 단백질, 폴리-히스티딘 (예를 들면 HisX6 tag) 및 아비딘/스트렙타비딘에 각각 결합한다.
단백질 칩에서의 분석
일 실시태양에 있어서, 단백질 칩은 화학발광성 또는 형광성을 생성하는 표준 효소 분석법에 의해 분석에 사용된다. 다양한 단백질 및 분자 변형체의 검출은 예를 들면 광발광, 비-단백질 기질을 사용하는 형광, 효소 착색 현상(development), 질량분석 신호 마커 및 올리고뉴클레오티드 태그(tag)의 증폭(예를 들면 PCR에 의해)을 이용하여 달성한다. 따라서, 단백질/프로우브 상호작용은 특히 화학발광법, 형광법, 방사표지법 또는 원자력현미경에 의해 검출될 수 있다. 어레이에서 특정 요소에 결합하는 프로우브는 또한 직접 질량분석계에 의해 동정될 수 있다. 예를 들면, 어레이 원소로부터 프로우브를 해리하는 비-분해성 방법에 의해 용액 중으로 방출된 프로우브를 질량분석계에 의해 동정할 수 있다 (예를 들면 WO 98/59361 참조). 또하나의 예로는, 어레이 요소로부터 효소 분해에 의해 용액내로 방출된 펩타이드 또는 다른 화합물들을 질량분석계로 동정할 수 있다.
분석법의 유형은 몇가지의 카테고리로 나뉘어진다. 첫 번째 예로는, 어레이 상의 각 웰을, 결합이 검출되고 정량되는 단일 브로우브에 노출시킨다. 이 분석법의 결과는, 1) 방사활성적으로 표지된 리간드와 자동방사사진술(autoradiography) 및/또는 형광영상기 분석을 이용하는 방법, 2) 합텐(hapten)의 결합에 이어 이를 형광표지 또는 효소표지된 항체 또는 비오틴 또는 스트렙타비딘과 같은 고 친화성합텐 리간드로 검출하는 방법, 3) 질량분석법, 4) 원자력 현미경, 5) 형광 분극화 방법, 6) 롤링 서클 증폭-검출 방법 (해치 등의 문헌 [Hatch et al., 1999, "Rolling circle amplification of DNA immobilized on solid surfaces and its application to multiplex mutation detection"' Genet. Anal. 15(2):35-40] 참조), 7) 경쟁 PCR (피니 등의 문헌[Fini et al., "Development of a chemiluminescence competitive PCR for the detection and quantification of parvovirus B19 DNA using a microplate luminometer", Clin Chem. 45(9):1391-6]; 크루즈 등의 문헌[Kruse et al., 1999, "Detection and quantitative measurement of transforming growth factor-betal(TGF-betal) gene expression using a semi-nested competitive PCR assay", Cytokine 11(2): 179-85]; 권쓰너 등의 문헌 [Guenthner and Hart, 1998, "Quantitative, competitive PCR assay for HIV-1 using a microplate-based detection system", Biotechniques 24(5):810-6]참조), 8) 비색법, 및 9) 생물학적 분석법, 예를 들면 바이러스 적정기를 포함하는 방법에 의해 가시화되며, 이에 국한되는 것은 아니다.
두 번째 예로서, 어레이 상의 각 웰을, 예를 들면 몇 가지의 공급원으로부터 프로우브를 풀링하는 것을 비롯하여, 결합이 검출되고 정량되는 여러 개의 프로우브에 동시에 노출시킨다. 이 분석법의 결과는 1) 질량분석법, 2) 원자력 현미경법, 3) 적외선 또는 형광 표지된 화합물 또는 단백질, 4) 증폭가능한 올리고뉴클레오티드, 펩타이드 또는 분자 질량 표지물, 및 5) 단백질의 효소 활성의 자극 또는 억제 등을 포함하는 방법에 의해 가시화되며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 어레이의 위치적으로 접근가능한 특성 때문에 프로우브의 혼합물로부터 정보가 수집된다. 즉 단백질 칩상의 공지된 위치에 규정된 단백질을 위치시키는 것을 통해 결합된 단백질이 어디에 결합하는 지에 대한 정보가 알려진다. 원한다면, 다음으로, 결합을 입증하는 어레이상의 위치를 개개의 프로우브로 탐색하여 관심이 있는 특정 상호작용을 동정할 수 있다.
또한, 예를 들면 단백질 칩을 세포 추출물로 배양함으로써 유용한 정보를 얻을 수 있으며, 이때 칩 상의 각 웰은 반응 혼합물을 함유하여 원하는 효소활성을 분석하게 되며, 다수의 다른 효소 및/또는 기질 활성이 분석되고, 이로써 특정 효소 활성의 세포 목록을 동정 및 측정할 수 있게 된다. 유사하게, 단백질 칩을 전 세포 또는 플라즈마 멤브레인의 제제로 배양하여 예를 들면 멤브레인-결합된 단백질 또는 분자의 발현 또는 세포 표면 단백질 또는 분자의 결합 특성을 분석할 수 있다. 단백질 칩상의 특정 위치에 결합하는 세포, 세포상의 마커 또는 세포에 의해 분비된 물질은 당분야에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 예를 들면 항원 어레이를 함유하는 단백질 칩은 B-세포 또는 T-세포로 스크리닝될 수 있으며, 이때 항원은 합성 항원, 조직-특이성 항원, 질병-특이성 항원, 병원균의 항원 및 자가이식 조직의 항원으로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 항원 또는 림프구에 의해 인지된 항원성 결정인자는 항원에 의해 세포의 활성화가 어레이상의 어느 위치에서 일어나는지를 확정지음으로써 결정될 수 있다. 림프구 활성화는 항체 합성 검출,3H-티미딘의 혼입의 검출 또는 측정, 항원 인지 및 활성화에 의해 유도되거나 억제되는 분자(예를 들면 IgD, C3b 수용체, IL-2 수용체, 트란스페린(transferrin) 수용체, 멤브레인 클래스 II MHC 분자, CD23, CD38, PCA-1 분자, HLA-DR)를 동정하고 발현된 및/또는 분비된 사이토카인을 동정하기 위해 표지된 항체를 가진 세포 표면 분자 의 탐색을 비롯한 다양한 수단에 의해 분석될 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
또하나의 예로서, 추정 미토겐의 어레이를 함유하는 단백질 칩으로 세포를 배양함으로써 특정 세포-유형에 대한 미토겐을 결정할 수 있으며, 이는 개체 세포와 위치적으로 접근가능한 어레이를 접촉시키는 단계 (이때, 상기 어레이는 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질을 포함하고, 상기 각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있으며, 상기 다수의 물질은 적어도 ㎠당 100개의 다른 물질로 이루어진다), 세포 내에서 미토겐의 활성이 유도되는 고상 지지체상의 위치를 검출하는 단계를 포함한다. 세포 분할은 예를 들면 세포에 의한3H-티미딘의 혼입을 검출 또는 측정함으로써 분석할 수 있다. 세포는 동일한 세포 유형의 것(즉, 동족체성 개체)일 수도 있고 다른 세포 유형의 것일 수도 있다.
또 하나의 예로써, 단백질 칩상의 단백질의 세포 흡인성(uptake) 및/또는 처리성(processing)을 예를 들면 방사활성으로 표지된 단백질 기질을 사용하고 세포에 의한 방사활성 기질의 흡인 또는 방사활성 기질 농도의 감소를 측정함으로써 분석할 수 있다. 이 분석법은 진단용 또는 치료용 목적으로 사용될 수 있다. 당 분야의 숙련된 자들은 세포의 상호작용의 다양한 형태를 검출하기 위해 많은 적합한 분석법을 이용할 수 있다.
이렇게 몇 가지의 분류의 프로우브의 사용으로 세포 작용의 대규모 또는 총괄적인 분석을 제공할 수 있다. 특히 하나 또는 몇가지의 스프린은 세포, 조직, 기관 또는 시스템의 생리적 상태 또는 세포 유형의 "흔적(footprint)"을 동정하는 기초가 될 수 있다. 예를 들면 다양한 세포 유형(모르폴로지성 또는 작용성)이 단백질 칩에 의해 결정되는 세포 활성 또는 발현 패턴에 의해 분화될 수 있다. 이러한 접근은 또한, 예를 들면 세포 사이클의 다양한 상태, 질병 상태, 변경된 생리적 상태 (예를 들면 저산소증), 치료(예를 들면 약제 치료) 전 또는 후의 생리적 상태, 생체대사 상태, 분화(differentiation) 또는 현상(development) 상태, 환경적 자극(예를 들면 빛, 열)에 대한 응답성, 세포-세포 상호작용, 세포-특이성 유전자 및/또는 단백질 발현, 및 질병-특이성 유전자 및/또는 단백질 발현을 결정하는데 사용될 수 있다.
효소 반응을 수행할 수 있으며 본 발명의 단백질 칩을 사용하여 효소 활성을 측정할 수 있다. 특정 실시태양에 있어서, 칩상의 단백질 또는 단백질들의 효소활성을 조절하는 화합물을 동정할 수 있다. 예를 들면, 단백질 칩의 웰에서 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 효소 반응 혼합물로 배양하는 것에 의해 (이때 예를 들면 효소 활성시에 형광성으로 되는 기질로부터 신호가 생성된다) 효소 활성 수준의 변화를 검출하고 정량화한다. 화합물의 존재와 부재 간의 차이가 나타난다. 또한, 다른 단백질의 효소 활성 상에 미치는 화합물의 영향에서의 차이도 단백질 칩내의 시료들에서 및 칩들간의 이들의 상대적인 영향을 비교함으로써 쉽게 검출된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 고밀도 단백질 칩을 사용하는 다양한 전략을 이용하여 단백질의 다양한 물리적 및 기능적 특성을 결정할 수 있다. 예를 들면 단백질 칩을 사용하여, 항체로 탐색함으로써 존재하는 단백질의 존재여부 및 양을 측정할 수 있다. 하나의 실시태양에서, GST 융합 단백질의 폴리디메틸실록산(PDMS) 칩을 탐색하여 단백질의 존재여부 및/또는 그의 활성의 정도를 결정할 수 있다. 단백질은 발광법, 화학발광법, 형광법 또는 화학형광법과 같은 표준 검출 분석법을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들면 관심있는 단백질에 대한 1차 항체를 형광 표지된 이차 항체에 의해 인식하고, 이를 이어서 광원으로 형광성 생성물을 여기시키고 후속 형광성을 검출하는 장치(예를 들면 분자역학 스캐너)로 측정한다. 보다 큰 감도를 위해서는, 관심있는 단백질에 대한 1차 항체를 알칼리성 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소에 결합된 이차 항체에 의해 인식시킨다. 발광성 기질 (화학발광의 경우) 또는 형광성 기질 (화학형광의 경우)의 존재하에서의 효소 절단은 예를 들면 분자역학스캐너를 사용하여 검출 및 정량될 수 있는 고도의 발광성 또는 형광성 생성물을 생산한다. 달리, 형광 표지된 이차 항체의 신호를, 알칼리성 포스파타제-결합된 또는 양고추냉이 퍼옥시다제-결합된 3차 항체를 사용하여 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 단백질 칩 상에서 또한 단백질 키나제, 포스파타제, 프로테아제,글리코시다제, 아세틸라제 또는 다른 그룹 전달 효소의 기질의 동정을 수행할 수 있다. 예를 들면, 다양한 다른 프로우브를 단백질 칩에 결합시키고 특정 효소(들)에 대해 기질로 작용하는 그들의 능력, 예를 들면 단백질 키나제에 의해 포스포릴화되는 그들의 능력을 분석한다. 키나제 활성 검출 방법의 예로는 방사활성 표지물(예를 들면33P-ATP 및35S-γ-ATP) 또는 포스포아미노산에 결합되는 형광성 항체 프로우브의 사용이 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 방사성 표지된 형광물질의 단백질내로의 혼입은 하나의 분석에서 키나제 활성을 나타내지만, 또하나의 분석에서는 포스파타제 활성을 나타내는 방사 표지된 형광물질의 매질 내로의 방출도를 측정할 수 있다. 또하나의 예에서는, 표준 분석법 (예를 들면 질량 분석계, 형광표지된 펩타이드 분절에 대한 항체 또는 형광 표지된 기질로부터의 형광신호의 소실)을 사용하여 프로테아제 활성에 의해 생성되고 매질 중으로 방출되는 펩타이드 분절을 동정함으로써 프로테아제 활성을 검출할 수 있다. 이와 같이, 당분야의 숙련가들에게 공지된 몇가지 방법 및 많은 독립적인 검출 수단을 사용하여 그룹-전달 효소의 활성을 쉽게 분석할 수 있다.
단백질 칩을 사용하여 특정 키나제, 프로테아제, 핵산 결합 특성, 뉴클레오티드 가수분해, 호르몬 결합성 및 DNA 결합성과 같은 특정 활성을 가진 칩상 단백질을 동정할 수 있다. 따라서, 상기 칩을 원하는 활성의 존재를 나타내게 될 프로우브로 탐색할 수 있다. 예를 들면, DNA 결합성이 관심있는 활성인 경우, DNA-결합 단백질 후보물질을 함유하는 칩을 DNA로 탐색한다.
단백질 어레이의 경우 단백질 또는 핵산 리간드인 프로우브(천연 또는 합성)에 대한 조사를 단백질 칩상에서 병행 수행할 수 있다. 프로우브는 세포, 단백질-함유 세포 물질, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 소분자 기질, 약제 후보, 수용체, 항원, 스테로이드, 인지질, 항체, 면역 글로불린 도메인, 글루타티온, 말토스, 니켈, 디하이드로트립신 또는 비오틴일 수 있다. 달리, 프로우브는 키나제, 포스파타제, 프로테아제, 글리코시다제, 아세틸라제 및 기타 그룹 전달 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소의 억제제 또는 기질일 수 있다. 칩상의 단백질을 핵산 또는 단백질 프로우브로 배양한 후 결합된 핵산 또는 단백질 프로우브를 질량분석계로 동정할 수 있다 (레이키 등의 문헌[Lakey et al., 1998, "Measuring protein-protein interactions", Curr Opin Struct Biol. 8:119-23] 참조).
단백질 칩을 사용하여, 병원균(예를 들면 바이러스, 박테리아, 진균 또는 기생충과 같이 감염성 질병 유발체)으로부터 목표 단백질 또는 회복성 또는 비회복성 환자의 면응응답에서 항원으로서 작용하는 비정상 세포 (예를 들면 신생 종양세포, 질병걸린 세포 또는 손상된 세포)로부터의 목표 단백질의 존재를 결정할 수 있다. 예를 들면 환자로부터 분리된 림프구를 사용하여, 단백질 칩 상에서 병원균 단백질의 어레이를 포함하는 단백질 칩을 스크리닝할 수 있다. 일반적으로, 이들 스크리닝법은 고상 지지체 위에 다수의 잠정적 항원을 포함하는 (이때, 각각의 다른 항원은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있으며, 다른 항원의 밀도는 최소한 100개의 다른 항원/㎠ 임) 위치적으로 접근가능한 어레이를 다수의 림프구와 접촉시키는단계, 및 림프구 활성화가 일어나는 고상 지지체상의 위치를 검출하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 림프구는 어레이 상에서 병원균의 단백질과 접촉되며, 이후 항원 또는 항원들의 혼합물에 의한 B-세포 또는 T-세포의 활성화를 분석함으로써 병원균으로부터 유도된 목표 항원을 동정한다.
달리, 단백질 칩을 사용하여, 예를 들면 잠정적 항원의 어레이를 스크리닝하여 환자의 B-세포 및/또는 T-세포의 목표를 동정함으로써 면역 응답성을 특징지울 수 있다. 예를 들면, B-세포를 잠정적 항원(즉, 항원 결정 인자를 가진 분자)의 어레이로 배양하여 체액-기본 면역성에 대한 항원 목표물을 동정할 수 있다. 항원은 예를 들면 자기이식 조직, 공지된 또는 비공지된 항원의 수집물 (예를 들면 병원성 미생물의), 조직-특이성 또는 질병-특이성 항원 수집물 또는 합성 항원으로부터 유도될 수 있다.
또하나의 실시태양에 있어서는, 환자로부터 단리된 림프구를 사용하여 환자 자신의 조직으로부터 유도된 단백질의 어레이를 포함하는 단백질 칩을 스크리닝할 수 있다. 그러한 스크리닝법은 자가면역 또는 알러지-유발 단백질의 기질을 동정할 수 있으며, 이로써 자가면역 또는 알러지 반응을 진단하고/하거나 잠정적 목표 약제 후보를 동정할 수 있다.
또하나의 실시태양에서는, 본 발명의 단백질 칩을 사용하여 B-세포 또는 T-세포를 활성화할 수 있는 물질을 동정한다. 예를 들면 림프구를 칩상에서 시험 분자 또는 단백질의 어레이와 접촉시키고 림프구 활성화를 분석하여 림프구의 B-세포 또는 T-세포 또는 아종(예를 들면 세포독성 T-세포)을 활성화하는 일반능력을 가진물질을 동정한다.
항원 인식에 의한 B-세포 활성화의 유도는 항체 합성,3H-티미딘의 혼입, 표지된 항체의 새로 발현 또는 억제된 세포 표면 분자에 대한 결합, 및 B-세포 활성화 지시 인자(예를 들면 사이토카인)의 분비를 비롯한 다양한 수단에 의해 분석될 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 유사하게, 본 발명의 단백질 칩을 사용하는 스크리닝에서 다양한 분석법에 의해 T-세포 활성화를 결정할 수 있다. 예를 들면51크롬의 방출 분석법은 항원의 인식 및 후속 세포독성 T-세포의 활성화를 검출할 수 있다 (팔라디노 등의 문헌[Palladino et al., 1987, Cancer Res. 47:5074-9] 및 블라체르 등의 문헌[Blachere et al., 1993, J. Immunotherapy 14:352-6] 참조).
본 발명의 단백질 칩을 사용하여 항체 제제의 특이성을 측정할 수 있으며, 이 방법은 (a) 고상 지지체 위에 다수의 잠정적 항원을 포함하는 (이때, 각각의 다른 항원은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있으며, 다른 항원의 밀도는 최소한 100개의 다른 항원/㎠ 임) 위치적으로 접근가능한 어레이를 항체 제제와 접촉시키는 단계, 및 항체 제제 중의 항체에 의한 결합이 일어나는 고상 지지체상의 위치를 검출하는 단계를 포함한다. 항체 제제는 Fab 분절, 항혈청, 및 모노클론성, 다중클론성, 키메라성, 단일쇄, 인간화된 또는 합성 항체일 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들면 항혈청은 항원의 질병-특이성, 조직-특이성 또는 다른 규정된 수집물을 스크리닝하고 항원이 인식되는 지를 결정함으로써 특징지워질 수 있다. 특정 실시태양에서는, 유사 또는 관련 항원을 가진 단백질 칩 어레이를 모노클론성 항체로 스크리닝하여, 모노클론성 항체가 어레이상의 어느 항원에 결합하는지를 결정함으로써 특이 정도를 평가한다.
단백질 칩을 복합 단백질 혼합물, 예를 들면 세포 추출물로 처리하고 단백질 활성을 결정함으로써 특이적 세포 활성의 목표가 존재하는지를 분석할 수 있다. 예를 들면 다른 키나제 어레이를 함유하는 단백질 칩을 화합물 (예를 들면 약제)로 처리된 세포로부터의 세포 추출물과 접촉시키고 키나제 활성을 분석할 수 있다. 또하나의 예로서, 다른 키나제 어레이를 함유하는 단백질 칩을 세포 분화의 특정 상태의 세포(예를 들면 플루리포텐트(pluripotent)) 또는 특정 생체대사 상태의 세포(예를 들면 유사분열성)로부터의 세포 추출물과 접촉시키고 키나제 활성을 분석할 수 있다. 예를 들면 약제 존재 또는 부재하의 세포, 또는 몇가지의 분화된 상태의 세포, 또는 다른 생체대사 상태의 세포들을 비교하는 상기 분석으로부터 얻어진 결과는 다양한 조건들 간의 세포의 생리적인 변화와 관련된 정보를 제공할 수 있다.
달리, 많은 다른 단백질 (예를 들면 펩타이드 라이브러리)을 함유하는 본 발명의 단백질 칩을 복합 단백질 혼합물(예를 들면 세포 추출물)로 처리한 후 칩상의 단백질에 대한 변형을 분석함으로써 특이성 세포 활성의 목표가 존재하는지를 분석할 수 있다. 예를 들면 다른 단백질의 어레이를 함유하는 단백질 칩을 화합물 (예를 들면 약제)로 처리된 세포로부터의 세포 추출물과 접촉시키고 키나제, 포스파타제, 프로테아제, 글리코시다제, 아세틸라제 및 기타 전달 효소 활성에 대해 분석할수 있다. 또하나의 예로서, 다른 단백질 어레이를 함유하는 단백질 칩을 세포 분화의 특정 상태의 세포(예를 들면 pluripotent) 또는 특정 생체대사 상태의 세포(예를 들면 유사분열성)로부터의 세포 추출물과 접촉시킬 수 있다. 예를 들면 약제 존재 또는 부재하의 세포, 또는 몇가지의 분화된 상태의 세포, 또는 다른 생체대사 상태의 세포들을 비교하는 상기 분석으로부터 얻어진 결과는 이들 조건하에서 세포에 미치는 생리적인 영향과 관련된 정보를 제공할 수 있다.
단백질 칩은 잠정적인 리간드 분자에 대한 수용체, 바이러스 수용체 및 오르판(orphan) 수용체에 대한 리간드를 비롯하여 생물학적으로 관심있는 특이성 분자에 결합하는 프로우브를 동정하는데 유용하다.
단백질 칩은 또한 그 칩 위의 단백질에서 DNA 결합 또는 RNA 결합을 검출하고, 결합 특이성을 결정하는데 유용하다. 또한, RNA-결합 또는 DNA-결합 단백질(예를 들어, 징크-핑거 단백질)의 특정한 부분은 이들 단백질의 어레이를 핵산 서열로 스크리닝하고, 결합 특이성과 결합력을 결정함으로써 단백질을 사용하여 연구될 수 있다.
비슷한 생물학적인 존재의 작용, 리간드 결합, 또는 효소 활성에서의 차이점을 나타내는 단백질의 동정은 본 발명의 단백질 칩으로 분석될 수 있다. 예를 들면, 다른 대립 유전자로부터 유도된 단백질 이소폼에서의 차이점이 서로 상대적인 이들의 활성을 위해 시험된다.
고밀도 단백질 칩은 약제 발견, 약의 작용 모드의 분석, 약제 특이성 및 약의 독성 추정을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 약제에 결합하는 단백질의 존재및 그들의 상대적인 친화도는, 칩 상의 단백질을 다른 시험 조건에서 약 또는 약제 후보로 배양하고, 어레이 위에서의 약제의 결합 위치를 결정하고 각각의 다른 단백질에 의해 결합된 약제의 양을 측정하여 약제 특이성을 결정함으로써 분석될 수 있다. 달리, 결합성 분석보다 생물학적인 활성이 분석되는 생화학적 분석을 같은 칩 위나 동일한 제 2의 칩 위에서 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 단백질 칩을 사용하는 이들 형태의 시험은 약제 특이성을 연구하고, 약제의 잠재적인 부작용을 예측하며, 약제를 분류하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 단백질 칩은 약제 후보의 복잡한 라이브러리를 스크리닝하기에 적당하다. 특히, 칩 위의 단백질은 약제 후보의 라이브러리으로 배양될 수 있고, 다음으로 예를 들어, 결합된 성분은 질량 분석법에 의해 동정될 수 있으며, 이는 특정 집합의 단백질에 선택적으로 결합하거나 몇 개 또는 모든 칩 위의 단백질에 결합하는 모든 라이브러리 요소의 동시 동정하게 한다. 또한, 어레이 내에서의 다른 단백질에 대한 약제 후보의 상대적인 친화력이 결정될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 단백질 칩은 이전에 관찰된 상호작용, 효소 활성 또는 생물학적인 반응에 대한 잠재적인 반응 억제제, 촉매, 조절제, 또는 증강제의 존재 하에 탐색에 사용될 수 있다. 이 방법으로, 본 발명의 단백질 칩을 사용함으로써 예를 들면, 약제의 결합 방해, 또는 특정 부류의 단백질에서 바이러스 또는 생리적 작용제의 파열이 분석될 수 있다.
본 발명의 단백질 칩은 예를 들어, 전세포, 세포 추출물 또는 조직 균질화액과 같은 복잡한 단백질 혼합물에 의해 다수의 목표의 변형에 대한 약제의 영향을결정하는데 이용될 수 있다. 약제의 실효과는 약제 처리된 세포, 조직 또는 추출물을 가진 하나 또는 그 이상의 단백질을 스크리닝함으로써 분석될 수 있어, "용법 표시(signature)"를 약제 처리된 상태에 제공할 수 있고, 처리되지 않은 상태의 "용법 표시"와 비교할 때 예를 들어, 효력, 독성 및 부작용에 대하여 예상치를 만들 수 있다. 더욱이, 약제의 시간 의존적인 영향은 예를 들어, 약제를 세포, 세포 추출물, 조직 균질화액 또는 전 유기체에 첨가하고, 다양한 처리 시간대에서 단백질 칩에 약제 처리된 세포 또는 추출물을 적용함으로써 분석될 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝이 본 발명의 단백질 칩으로 배양함으로써 수행될 수 있다. 양성 클론의 결합은 여러 가지 알려진 종래의 기술(예를 들어, 질량 분석법)에 의해 결정될 수 있어서, 흥미있는 클론을 인코딩하는 DNA가 표준 방법(참조, 예를 들어, 아메스 등의 논문[Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-86]; 케틀레보로우프 등의 논문[Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-8]; 페르식 등의 논문[Persic et al., 1997, Gene 187:9-18])으로 동정된 후에 흥미있는 클론을 동정하게 된다. 이 방법에서, 칩은 그 칩 위의 특정 단백질에 결합하는 표면 요소를 가진 세포를 선택하는데 유용하다. 선택적으로, 파지 디스플레이 라이브러리는 라이브러리의 위치적으로 접근 가능한 어레이가 생성되도록 칩에 결합될 수 있고, 후에 어레이가 프로우브의 다른 혼합물로 반복적으로 스크리닝될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 분석 관리를 수행하기 위한 키트를 제공한다. 특정 실시태양에 있어서, 본 발명의 키트는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 어레이를포함한다. 이러한 키트는 또한 하나 또는 그 이상의 용기 내에 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 시험하는데 유용한 시약, 프로우브와 단백질 또는 분자의 상호작용을 분석하는데 유용한 시약, 흥미 있는 생물학적 활성을 가진 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 분석하는데 유용한 시약, 및/또는 하나 또는 그 이상의 프로우브, 단백질 또는 다른 분자를 포함한다. 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 분석하거나, 프로우브와 단백질 또는 분자 사이의 상호작용을 분석하는데 유용한 시약은 각각의 웰이나 단백질 칩 위의 선택된 웰 내에 담겨질 수 있다. 이러한 시약은 용액 또는 고체 상태일 수 있다. 시약은 흥미 있는 분석을 수행하기 위해 요구된 단백질 또는 분자, 또는 프로우브이거나 둘 다를 포함할 수 있다.
일 실시태양에 있어서, 키트는 하나 또는 그 이상의 단백질 칩 (즉, 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있고, 상기 다수의 물질은 적어도 ㎠당 100개의 다른 물질로 이루어짐)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이), 및 하나 또는 그 이상의 용기 내에 하나 또는 그 이상의 프로우브, 시약 또는 다른 분자를 포함한다. 어레이의 물질은 고상 지지체 위의 웰 표면에 결합될 수 있다. 다른 실시태양에 있어서, 키트 내의 단백질 칩은 고상 지지체의 웰에 이미 결합된 단백질 또는 프로우브를 가질 수 있다. 또 다른 실시태양에 있어서, 키트 내의 단백질 칩은, 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 시험하거나, 프로우브의 상호작용 및 단백질 또는 분자를 시험하는데 유용하며 이미 고상 지지체의 웰에 부착된 시약또는 반응 혼합물을 가질 수 있다. 또 다른 실시태양에 있어서, 시약은 고상 지지체의 웰에 결합되는 것이 아니라 하나 또는 그 이상의 용기 내에 담겨 고상 지지체의 웰에 첨가될 수 있다. 또 다른 실시태양에 있어서, 키트는 또한 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 시험하기 위한 용액 반응 혼합물을 수용하는 하나 또는 그 이상의 용기를 포함한다. 또 다른 실시태양에 있어서, 키트는 하나 또는 그 이상의 시험을 수행하는데 유용한 흥미 있는 프로우브, 단백질 또는 분자, 및/또는 다른 시약이 결합될 수 있는 기질(예를 들어, 비드)을 포함한 후, 결합된 프로우브, 단백질 또는 다른 시약을 가진 기질이 칩의 웰 내에 위치될 수 있다.
다른 실시태양에 있어서, 키트 내의 하나 또는 그 이상의 단백질 칩은, 고상 지지체의 웰에 결합된 흥미 있는 생물학적 활성을 가진 단백질을 가진다. 다른 실시태양에 있어서, 키트 내의 하나 또는 그 이상의 단백질 칩은, 고상 지지체의 웰에 결합된, 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적 활성을 가진 모든 발현된 단백질 중의 적어도 50%, 75%, 90% 또는 95%를 가진다. 특정 실시태양에 있어서, 키트 내의 하나 또는 그 이상의 단백질 칩은, 고상 지지체의 웰에 결합된, 유기체(예를 들어, 특정한 종의)의 게놈 내에서 모든 발현된 키나제, 포스파타제, 글리코시다제, 프로테아제, 아세틸라제, 다른 그룹 전이 효소, 핵산 결합 단백질, 호르몬-결합 단백질 또는 DNA-결합 단백질의 적어도 50%, 75%, 90% 또는 95%를 가진다.
단백질 칩에 유용한 단백질
유기체에서의 재조합 과발현으로부터 제조되거나, 더 큰 단백질의 절편화를통해 생산되거나, 또는 화학적으로 합성된 전-길이의 단백질, 전-길이의 단백질의 일부 및 펩타이드를 본 발명에서 단백질 칩을 형성하는데 이용한다. 단백질이 과발현된 유기체는 박테리아, 효모, 곤충, 인간, 및 쥐, 생쥐, 고양이, 개, 돼지 소 및 말과 같은 비인간 포유동물이 있으며, 이에 국한되지 않는다. 또한, 한정된 도메인이 여러 천연 또는 합성 단백질 중의 하나에 겹합된 융합 단백질이 유용하다. 본 발명에 사용된 단백질은 단백질 칩의 웰에 결합되거나 위치되기 전에 정제되거나, 단백질 칩의 웰에 미리 결합되거나 위치된 시약의 사용을 통해 결합 중에 정제될 수 있다. 이 시약은 일반적으로 단백질을 특이적으로 결합하거나, 특정 그룹의 단백질에 결합되는 것들을 포함한다. 단백질은 단백질 칩에 부착 전 또는 부착시에 인공적이거나 자연의 멤브레인(예를 들어, 리포솜, 멤브레인 소낭) 내에 끼워질 수 있다. 달리, 단백질은 단백질 칩의 웰 내로 공급될 수 있다.
본 발명의 단백질 칩에 사용된 단백질은 바람직하게는 종래 공지된 방법으로 발현될 수 있다. 양질의 단백질의 발현을 단순화시키고 바이러스 쇼크를 발생 및 증폭시킬 필요성이 없는 비-세포용해성 단일-벡터 곤충 발현 시스템(인비트로겐(Invitrogen, 미국 캘리포니아 칼스바드 소재)으로부터 인섹트셀렉트 시스템(InsectSelect system, catalog no. K800-01)이 바람직한 발현 시스템이다. 이 시스템 내의 바람직한 벡터는 pIB/V5-His TOPO TA 벡터(catalog no. K800-20)이다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 생성물을 제조자가 기술한 프로토콜을 사용하여 이 벡터 내로 직접적으로 클로닝한 후 발현된 단백질을 정제하는데 사용될 수 있는 N-말단 히스티딘(His) 라벨로 단백질을 발현시킨다.
라이프테크(Lifetech, 미국 메릴랜드 락빌 소재)로부터 입수가능한 BAC-TO_BACTM시스템 (곤충 세포 내의 또하나의 진핵 발현 시스템)이 또한 바람직한 발현 시스템이다. BAC-TO_BACTM시스템은 동종 재조합을 이용하는 것이 아니라 이. 콜라이에서 위치-특이성 전위에 의존함으로써 재조합 태형바이러스(baculovirus)를 발생시킨다. 유전자 발현은 고 활성의 폴리헤드린 프로모터에 의해 이루어지고, 따라서 감염된 곤충 세포 내에 세포 단백질의 25%까지 나타낼 수 있다.
실시예 I: 단백질 칩을 이용한 효모 단백질 키나제의 분석
A. 소개
하기 실시예는 단백질 칩 제조 및 본 발명의 단백질 칩을 사용하는 방법의 다양한 측면을 예시한다. 본 발명의 단백질 칩 기술은 다량의 시료를 신속하게 분석하는데 적합하며, 따라서 이 방법은 거의 모든 효모 단백질 키나제의 분석에 적용되었다. 단백질 키나제는 단백질의 포스포릴화를 촉진하여 기본 세포 기능, 예를 들면 세포 사이클 조절, 신호 전달, DNA 복제, 유전자 전사, 단백질 전사 및 에너지 대사(metabolism)7를 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 완전한 게놈 서열의 입수는 유기체로 인코딩된 모든 단백질 키나제를 분석하고 그들의 시험관내 기질을 결정하는 것을 가능하게 한다.
효모 게놈은 서열화되었으며, 길이가 100 코돈보다 큰 약 6200개의 오픈 리딩 프레임을 함유한다. 이들 중 122개가 단백질 키나제를 인코딩하는 것으로 예측된다. 이들 단백질 키나제 유전자 중 24개는 전에는 연구되지 않았다8. 두 개의 히스티딘 단백질 키나제를 제외하고는 모든 효모 단백질 키나제가 Ser/Thr 계의 일원이며, 세린/트레오닌 및 티로신을 포스포릴화하는 7개의 단백질 키나제는 보고되었지만 티로신 키나제 계 일원은 존재하지 않는다8.
본 발명의 단백질 칩 기술의 개발로써, 본원에 기술된 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애로부터 거의 모든 단백질 키나제의 생화학적 활성에 대한 고생산성 분석이 수행되었다. 사용된 단백질 칩은 현미경 슬라이드의 상부에 놓인 실리콘 엘라스토머 시트 중의 300 nl 웰의 일회용 어레이였다. 상기 웰의 고밀도 및 소규모는 많은 개개의 시료의 고생산성 배치 처리 및 동시 분석을 가능하게 하여 단지 소량의 단백질만을 필요로한다. 본 발명의 단백질 칩을 사용하여, 사카로마이세스 세레비지애 키나제 단백질 (총 119개의 다른 키나제)을 글루타티온-S-전사효소(GST)에 융합시켜 효모 중에서 과발현시킨 다음 정제하여 그들의 17개의 다른 물질을 포스포릴화시키는 능력을 분석하였다. 전에는 특징지워지지 못한 키나제 24개중 18개를 비롯하여 거의 모든 시험 키나제(93%)가 하나 이상의 기질 상에서 대조용보다 최소한 5배 이상 높은 활성을 나타내었다. 32개의 키나제는 하나 또는 두 개의 기질의 우선적인 포스포릴화를 나타내었다. 27개의 키나제는 폴리(Tyr-Glu)를 쉽게 포스포릴화하였다. 이들 키나제 중 단지 5개만이 전에 이중 기능 키나제(즉, 이들은 Ser/Thr 및 Tyr 둘다를 포스포릴화 함)로서 분류되었었기 때문에, 이러한 발견은 어느 키나제가 티로신 잔기를 포스포릴화할 수 있는 지에 대한 지식을 크게 확장시켜준다. 흥미롭게도, 이들 이중 특이성 키나제는 흔히, 촉매적 영역 근처에 있는 공통의 아미노산 잔기를 공유한다. 이 결과는 본 발명의 단백질 칩 기술이 단백질 생화학적 활성의 고생산성 스크리닝 및 전체 프로테옴의 분석에 유용함을 나타낸다.
B. 방법
1. 세포 배양, 제작 및 단백질 정제
허드슨 등의 문헌9의 재조합 방법을 사용하여 119 내지 122개의 효모 단백질 키나제를, 갈락토스-유도가능한GAL10프로모터의 조절하에 GST 융합 단백질을 생산하는 고복사URA3발현 벡터(pEG(KG))내로 클로닝하였다10. 간단하게는, 각각의 ORF의 말단에 대해 보완적인 프라이머(이들 프라이머의 말단은 통상의 20 bp 서열을 함유함)를 리서치 제네틱스(Research Genetics)에서 구입하였다. 제2의 PCR 단계에서, 상기 벡터와 동족체인 서열을 가함으로써 이들 생성물의 말단을 변형시켰다. 말단에 상기 벡터 서열을 함유하는 PCR 생성물을 상기 벡터와 함께pep4효모 균주(몇가지 효모 프로테아제가 결여됨)내로 변형시키고, Ura+콜로니를 선택하였다. 이. 콜라이(E. Coli) 중에서 플라스미드를 구제하여, 제한효소분해에 의해 입증하고, 상기 벡터에 대해 보완적인 프라이머를 사용하여 상기 벡터-삽입정션(junction)을 방해하는 DNA 서열을 결정하였다. GST::Cla4 제작물의 경우, 아미노 말단 코딩 영역에서 폴리(A) 연장영역(stretch)에서 프레임-이동 돌연변이를 동정하였다. 리딩 프레임을 유지하는 수집물을 발견하기 위해 3개의 독립적인 클론이 필요하였다. 이들 유전자 중 5개의 경우 두 개의 중첩되는 PCT 생성물을 수득하여 효모 세포내로 도입되었다. 동정된 플라스미드는 키나제 단백질 정제를 위해 pep4 효모 스트레인 내로 재도입하였다.
96 웰 포맷을 사용하여 시료를 제조하기 위해, 2ml 웰을 함유하는 박스에서 세포 0.75 ml를 라피노즈 함유 매질 중에서 O.D.(600) 약 0.5로 배양시켰다 (각 균주당 두개의 웰을 사용하였다). 갈락토스를 최종 농도가 4%가 되도록 가하여 단백질 발현을 유도하고 세포를 4시간 동안 배양하였다. 동일 균주의 배양물들을 합하여 세포용해 완충액 500 ㎕로 일회 세척하고 세포용해 완충액 200㎕에 재현탁한 다음 100㎕의 냉각된 유리 비드를 함유하는 96 x 0.5 ml 플레이트(도트 사이언티픽(Dot Scientific), 미국)으로 이송하였다. 4℃에서 반복 교반함으로써 박스내에서 세포를 용해시키고, 96웰 포맷에서 글루타티온 비드 및 표준 프로토콜20을 사용하여 이들 균주로부터 GST 융합 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질의 쿠마지(Coomasie) 변형 패턴과 안티-GST 항체를 사용한 면역블롯 분석법에 의해 얻어진 패턴을 비교함으로써 5개의 정제된 GST::키나제 단백질(Swel, Ptk2, Pkh1, Hog1, Pbs2)의 순도를 결정하였다. 이 결과는 정제된 단백질이 90% 이상의 순도를 가짐을 보여주었다. Hog1의 활성화된 형태를 정제하기 위해, 유도 과정의 최종 5분에 0.4 M NaCl로 상기 세포를 처리하였다. 단백질 키나제 활성은 최소한 2개월 동안 -70℃에서 전혀 또는 거의 손실없이 안정하였다.
2. 칩 제작 및 단백질 결합
실리콘 엘라스토머, 폴리디메틸실록산(PDMS)(다우케미칼, 미국)으로부터 칩을 제작하였으며, 이는 미세제작된 주형 상에서 캐스팅되었다. 액체 PDMS를 주형위로 붓고 경화(65℃에서 최소한 4시간)후에 재사용가능한 주형으로부터 유연성 실리콘 엘라스토머 어레이 시트를 박리시켰다. PDMS는 미세사진식각술에 의해 제작된 구조물 상에서 쉽게 캐스팅될 수 있지만, 본원에 기술된 키나제 분석을 위해, 주형은 적절한 컴퓨터-조절식 레이저 분쇄 기구로 패터닝된 아크릴 시트로부터 제조되었다.
30개의 다른 어레이 상에서 시험되었다. 시험된 변수들은 웰의 폭과 깊이 (100 ㎛ 내지 2.5 mm 범위의 폭, 100㎛ 내지 1 mm 범위의 깊이), 웰간의 간격(100㎛ 내지 1 mm), 구조(직사각형 어레이 또는 최대한 가까이 패킹됨) 및 웰 형상(정사각형 대 원형)이었다. 레이저로 분쇄된 아크릴 주형의 사용은 다양한 변수의 많은 원형(prototype) 주형을 구현하는 빠르고 저렴한 방법이다.
웰에 단백질을 최대한으로 결합시키는 조건을 결정하기 위해 PDMS를 5M H2SO4, 10 M NaOH, 과산화수소 또는 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 결합제 (GPTS)(알드리치, 미국)로 처리하였다11, 12. GPTS 처리는 처리되지 않은 PDMS나 다른 방법으로 처리된 PDMS에 비해 웰에 단백질을 훨씬 많이 흡착시켰다. 간단히는, 실온에서 100% EtOH로 3회 세척한 후, 상기 칩을 1% GPTS 용액(95% EtOH, 16 mM HOAc)에 침지하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 95% EtOH로 3회 세척한 후, 이 칩들을 진공하에 2시간 동안 135℃에서 경화시켰다. 경화된 칩들은 건조 아르곤 중에서 수개월 동안 저장할 수 있다. 이 칩에 단백질을 결합시키기 위해, 웰에 단백질 용액을 가하고 얼음 상에서 1 내지 2 시간 동안 항온처리하였다. 냉 HEPES 완충액(10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.0)으로 3회 세정한 후, 웰을 PBS 중의 1% BSA(시그마, 미국)로 얼음상에서 1시간 이상동안 블록킹하였다. GPTS의 사용으로 인해 1차 아민기를 가진 시약의 사용은 피하였다.
처리된 PDMS에 결합될 수 있는 단백질의 농도를 결정하기 위해, 효소의 계대 희석법을 이용하여 칩에 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 항-마우스 Ig(아머스햄(Amersham), 미국)를 결합시켰다. PBS로 광범위하게 세척한 후 향상된 화학발광(ECL) 검출법을 이용하여 결합 항체를 검출하였다. 8 x 10-9㎍/㎛2이하의 단백질이 표면에 결합될 수 있으며, 최소 8 x 10-13㎍/㎛2의 단백질이 면역스테이닝(immunostaining) 방법에 의한 검출에 필요하다.
3. 면역블롯팅, 키나제 분석 및 데이터 획득
면역블롯 분석은 문헌에 기술된 바와 같이 수행하였다34.33P-γ-ATP를 사용하여 GST::단백질 키나제를 시험관내 키나제 활성에 대해 시험하였다13. 자동포스포릴화 분석에서, GPTS-처리된 PDMS에 GST::키나제를 직접 결합시키고, 적합한 완충액 중에서33P-γ-ATP로 시험관내 반응을 수행하였다. 기질 반응을 위해, GPTS를 통해 웰에 기질을 결합시키고, 웰을 HEPES 완충액으로 세척하고 1% BSA로 블록킹한 다음 키나제,33P-γ-ATP 및 완충액을 가하였다. 총 반응 부피는 반응당 0.5 ㎕이하로 유지하였다. 30℃에서 30분간 항온처리한 후, 칩을 광범위하게 세척하고, X-선 필름과 분자 역학 형광영상기(Molecular Dynamics PhosphorImager) 둘다(50 ㎛의 분리능을 가지며 정량적임)에 노출시켰다. 12개의 기질의 경우, 각각의 키나제 분석을 최소한 2회 반복하였으며, 나머지 5개의 경우 상기 분석과정을 한 번 수행하였다.
기질 특이성을 결정하기 위해 하기 수식을 사용하여 특이성 지수(SI)를 산출하였다.
SIir=Fir/[Fi1+Fi2+....+Fir)/r]
상기 식에서,
I는 사용된 키나제의 ID를 나타내고,
r은 기질의 ID를 나타내며,
Fir는 GST 단독에 비해 기질 r 상에서의 키나제 i의 배수 증가를 나타낸다.
4. 키나제 서열 정열 및 계통발생도
고넷(Gonnet) 250 스코어링 매트릭스(scoring matrix)36를 사용하여 CLUSTAL W 알고리즘35을 가진 107개의 단백질 키나제의 코어 키나제 촉매 도메인 서열에 기초한 다중 서열 정렬을 만들었다. SWISS-PROT37, PIR38및 GnBank39데이터베이스로부터 키나제 촉매 도메인 서열을 입수하였다. 아직 그의 촉매성 도메인이 동정되지 않은 키나제(DBF4/YDR052C 및 SLN1/YIL147C)의 경우, BLOSUM 50 스코어링 매트릭스42를 사용하여 FASTA 알고리즘40. 41으로 세팅된 데이터에서 다른 키나제 서열들을 가진 정렬로부터 프로우브성 키나제 서열을 유도하였다. 11개의 코어 촉매 서브도메인43에 상응하는 단백질 서열을 상기 정렬로부터 발췌하여 PROTPARS44프로그램으로 발생계통도를 제작하였다 (도 5a).
5. 단백질 칩 데이터의 기능적 그룹화
실험실 데이터에 있어서 단백질 키나제들간의 적합한 기능적 관계를 가시화하기 위해, 12개의 다른 물질을 포스포릴화하는 능력에 기초하여 키나제들을 계층화하였다(2000년 8월 17일자로 웹 사이트 http://bioinfo.mbb.yl.edu/genome/ yeast/chip 에서 입수가능한 데이터). 각각의 기질에 대한 107개의 단백질 키나제의 -/+ 활성에 상응하는 프로필을 [0,1]의 이진수로 기록하였다. 실험적인 프로필간의 쌍식(pairwise) 해밍(Hamming) 거리로부터 매트릭스를 유도하였으며, 뿌리없는 발생계통데이터들을, PHYLIP 소프트웨어 팩키지44의 FITCH 프로그램 34에서 이행되는 피치-마골리아쉬 최소-면적 평가법(Fitch-Margoliash least-squares estimation method)45을 사용하여 계산하였다. 각각의 경우 분류명의 입력 명령은 랜덤화하여 데이터 세트의 조직화에 있어 고유의 바이어스를 무효화하였으며, 계통도 구조의 광범위한 재정렬을 통해 최적의 계통도를 수득하였다.
C. 결과
1. 효모 키나제 클로닝 및 단백질 정제
재조합-직접(directed) 클로닝 방법9을 사용하여, 갈락토스-유도성GAL10프로모터(도 1a)의 조절 하에 GST 융합 단백질을 생산하는 고복제 발현벡터(pEG(KG)에서 122개의 효모 단백질 키나제 유전자의 전체 코딩 영역을 클로닝하였다. 이. 콜라이 내로 GST::키나제 제작물을 구제한 다음 각 제작물의 5'-말단에서의 서열을 결정하였다. 이 방법을 사용하여 122개의 효모 단백질 키나제 유전자의 119번을 프레임내에서 클로닝하였다. 클로닝되지 않은 3개의 키나제 유전자는 매우 큰 것이다 (4.5-8.3 kb).
GST::키나제 융합 단백질을 효모 중에서 과잉생산하고, 클로타티온 비드 및 표준 프로토콜11을 이용하여 50 ml 배양액으로부터 정제하였다. Hog1의 경우, 유도의 최종 5분에 효모 세포를 고 염(high salt)으로 처리하여 효소를 활성화시켰으며, 나머지 키나제의 경우는 합성 매질(URA-/라피노스)를 사용하였다. 항-GST 항체를 사용하여 모든 119개의 융합물을 면역블롯 분석한 결과, 효모 균주의 105개는 검출가능한 GST::키나제 융합 단백질을 생산하였으며, 대부분의 경우는 융합물들이 완전한 길이였다. 출발 배양액 ml당 융합 단백질 1㎍ 이하를 수득하였다 (도 1b). 그러나, GST::키나제 시료 119개 중 14개는 면역블롯 분석에 의해 검출되지 않았다. 아마도, 이들 단백질은 사용된pep4프로테아제-결함 균주에서 안정적으로 과잉생산되지 않거나 이 방법을 사용하여서는 정제되지 않는 불용성 응집물을 형성할 수도 있을 것이다. 이 방법은 성공적이었지만 배양액 50 ml를 사용하는 GST 융합 단백질의 정제는 시간 소모적인 방법이어서 수천 개의 시료를 제조하는데는 적용될 수 없다. 따라서, 96웰 포맷에서 세포를 증식시키는 방법을 개발하였다 (방법 단락 참조). 이 방법을 사용하여, 119개의 GST 융합물을 제조하여 50 ml 방법에 비해 출발 배양액 ml 당 약 2배 높은 수율로 6시간 내에 정제하였다.
2. 단백질 칩 설계
단백질 칩을 개발하여 119개의 효모 단백질 키나제(도 2)의 고 생산성 생화학적 분석을 수행하였다. 이 칩은 일회용 실리콘 엘라스토머 폴리디메틸실록산(PDMS)11중의 웰 어레이로 이루어져 있다. 이러한 웰 어레이는 후속 배치 가공 중에 물리적으로 분리된 채로 남아있는 단일 칩 상에 작은 부피의 다른 프로우브들이 조밀하게 패킹되게 한다. 결합제 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPTS)12를 사용하여 단백질을 웰에 공유결합으로 결합시켰다. 8 x 10-9㎍/㎛2이하의 단백질이 표면에 결합될 수 있다 (방법 단락 참조).
단백질 키나제 분석을 위해, 단백질 칩 기술은 표준 시료 취급 및 기록 장비와 호환될 수 있도록 구성하였다. 방위원소 표지(33P)를 사용하여 하기에 기술하는 키나제 분석 및 수동 부하, 다양한 어레이 구조물을 시험하였다. 하기 칩들이 최상의 결과를 나타내었다:1.8 mm 피치를 가진 10 x 14 직사각형 어레이 구조물에서의 1.4 mm 직경 및 300 ㎛ 깊이 (약 300 nl) 을 가진 원형 웰. 이들 어레이 12개의 마스터 주형을 제작하여, 단백질 키나제 분석을 위해 다량의 어레이를 반복적으로 캐스팅하였다. 칩들을, 취급을 위해 현미경 슬라이드의 상부에 위치시키고 (도 2a 참조), 이들 어레이들을 표준 현미경 슬라이드의 1/3 보다는 약간 많이 덮고 슬라이드 당 2개의 어레이들을 보통 사용하였다 (도 2b 참조). 각 웰에 단백질을 위치시키기 위해 수동 피펫 방법을 사용하였지만 자동화된 기술을 사용할 수도 있다. 또한, 이 단백질 칩 구조물은 또한, 예를 들면 인단백질에 형광표지된 항체를 사용한 후 면역형광성을 검출함으로써 다른 표지 방법에 사용할 수도 있다.
3. 단백질 칩을 사용한 대량 키나제 분석
33P-γ-ATP 및 17개의 다른 칩을 이용하여, 모든 119개의 GST::단백질 키나제를 17 가지의 다른 분석법으로 시험관내 키나제 활성13에 대해 시험하였다. 각각의 칩은 다음과 같이 다른 물질을 사용하여 분석하였다.
1) 자가포스포릴화,
2) 소 히스톤 H1(통상의 키나제 기질),
3) 소 카제인 (통상의 기질),
4) 미에린 기본 단백질 (통상의 기질),
5) Axl2 말단-GST (Axl2는 발아와 관련된 트랜스멤브레인 인단백질이다),
6) Rad9(DNA 결함 체크포인트와 관련된 인단백)15,
7) Gic2 (발아와 관련된 인단백)16,
8) Red1(염색체 접합에 중요한 감수분열 단백질 키나제)17,
9) Mek1 (염색체 접합에 중요한 감수분열 단백질 키나제)18,
10) 폴리(티로신-글루타메이트 1:4) (폴리(Tyr-Glu), 티로신 키나제 기질)19,
11) Ptk2(소분자 이송 단백질)20,
12) Hsl1(세포 주기 조절과 관련된 단백질 키나제)21,
13) Swi6(G1/S 조절과 관련된 인전사(phosphotranscription) 인자)22,
14) Tub4 (미세관 핵형성과 관련된 단백질)23,
15) Hog1 (삼투조절과 관련된 단백질 키나제)24,
16) Hog1 (키나제의 불활성 형태),
17) GST (대조용).
자동포스포릴화 분석의 경우 처리된 PDMS 웰에 키나제를 직접 결합시키고,33P-γ-ATP를 가하였다. 기질 반응을 위해, 웰에 기질을 결합시키고, 이어서 키나제 및33P-γ-ATP을 가하였다. 반응이 완결된 후, 슬라이드를 세적하고 포스포릴화 신호를 얻어 고분리능 형광영상기로 정량분석하였다. 실시한 예는 도 3에 나타내었다. 키나제 활성을 동정하기 위해 정량된 신호를 GST 대조용에 대한 배수 증가로 전환시켜 추가의 분석을 위해 플롯팅하였다 (도 4a).
도 4a에 나타낸 바와 같이, 대부분(93.3%)의 키나제는 최소한 하나의 기질의 경우 기준치에 비해 5배 이상의 활성을 나타내었다. 기대한 대로, Hrr25, Pbs2 및 Mek1은 그의 공지된 기질25-27을 포스포릴화하였으며, Swi6은 GST 대조용에 비해 400배, Hog1은 10배, Red1은 10배 높은 활성을 나타내었다. 이 분석의 결과는, 히스티딘 키나제(Sln1, Yil042c) 및 인지질 키나제 (예를 들면 Mec1)을 비롯하여, 전에는 연구되지 않았던 24개의 예측된 단백질 키나제 중 18개가, 몇가지의 비통상적인 키나제가 그러하듯이8, 하나 이상의 기질을 포스포릴화함을 입증하였다.
기질 특이성을 결정하기 위해, 특정의 키나제의 활성을 추가로 모든 기질에 대한 그의 활성의 평균치에 대해 표준화하였다. 몇가지의 예를 도 4b에 나타내었다. 모든 데이터는 웹 사이트 http://bioinfo.mbb.yl.edu/genome/yeast/chip에서 입수가능하다. 32개의 키나제가 특정의 기질 상에서 특이성 지수 (SI, 방법 단락 참조)가 2 이거나 그 이상인 기질 특이성을 나타내었다. 예를 들면 효모 세포의 발아와 관련된 단백질인 Axl2의 C-말단은 다른 단백질에 비해 Dbf20, Kin2, Yak1 및 Ste20에 의해 우선적으로 포스포릴화된다. 흥미롭게도 이전의 연구는 Ste20이 Axl2와 유사하게 발아에 정통으로 관련되며,ste△/cla4 ts 돌연변이는 완전 분극화된 악틴 패치 또는 케이블28을 개시 또는 형성할 수 없음을 발견하였다. 또하나의 예는 역시 발아16와 관련된 인단백 Gic2이다. Ste20 및 Skm1은 Gic2를 강하게 포스포릴화한다 (도 4b 참조). 전의 연구에서는 Cdc42가 Gic2, Cla429, Ste20 및 Skm1과 상호작용한다고 제시하였다. 본 발명의 연구는 Cdc42가 Ste20 및/또는 Skm1을 보충함으로써 Gic20의 포스포릴화를 촉진하는 기능을 할 수 있는 가능성을 제기하였다.
4. 효모는 많은 이중 특이성 키나제를 함유한다
특히 관심있는 것은 이중 특이성 키나제, 즉 Ser/Thr 및 티로신 둘다를 포스포릴화하는 효소들이다. 서열 분석에 기초하여 단지 2개의 효모 단백질 키나제가 단백질 키나제의 Ser/Thr 군에 속하지만, 이 연구시에는 7개의 단백질 키나제 (Mps1, Rad53, Swe1, Ime2, Ste7, Hrr25 및 Mck1)가 이중 특이성 키나제인 것으로 보고되었다19. Swe1, Mps1, Ime2 및 Hrr25는 폴리(Thr-Glu)를 쉽게 포스포릴화하지만 Ste7, Rad53 또는 Mck1에 대한 티로신 키나제 활성은 검출되지 않았다. Mck1은 상기 분석 중 어느 것에서도 강한 활성을 나타내지 않았으나 Ste7 및 Rad53은 다른 분석에서 매우 활성이었다. 따라서, 이들의 폴리(Tyr-Glu) 포스포릴화에 대한 무능력은 이들이 일반적으로 매우 약한 티로신 키나제이거나 또는 최소한 폴리(Tyr-Glu) 기질에 대해서는 약하다는 것을 나타낸다. 후자의 가능성에 일치되게 폴리(Tyr-Glu) 기질은 Rad53에 대해 매우 불량한 기질임이 확인되었다 (참고문헌 19). 흥미롭게도, 23개의 다른 키나제 또한 효과적으로 폴리(Tyr-Glu) 기질을 기질로 사용함을 발견하였으며, 이는 시험관내에서 작용할 수 있는 효모 중에 최소한 27개의 키나제가 이중 특이성 키나제로서 있음을 의미한다. 이들 중 하나인 Rim1은 최근에 그의 생체내 기질 Ime2 상에서 Tyr 잔기를 포스포릴화함을 발견하였으며, 이는 그것이 진정한 이중 특이성 키나제임을 나타낸다30. 요약하면, 이 실험은 이중 특이성 키나제로서 작용할 수 있는 키나제의 수를 대충 3배로 하였으며 그러한 키나제로서 분류되는 것들 중 몇가지에 대해 의문을 제기하였다.
5. 작용 특이성과 폴리(Tyr-Glu)키나제의 아미노 서열간의 상관관계
효모 단백질 키나제의 대규모 분석은 단백질 키나제와 다른 것의 작용성 관계를 비교할 수 있게 한다. 폴리(Tyr-Glu)를 포스포릴화하는 키나제 중 많은 것들이 그들의 아미노 서열 면에서 서로 관련이 있음을 알았다. 70%의 폴리(Tyr-Glu)는, 키나제가 그들이 보존된 단백질 키나제 도메인의 서열 유사성을 기초하여 서로에 대해 조직화된 덴드로그램(dendrogram) 상에서, 별개의 4개의 그룹으로 나누어진다 (도 5a). 추가의 아미노산 서열 조사는, 기질로서 폴리(Tyr-Glu)를 사용하지 않는 키나제(세개는 리신이고 하나는 메티오닌이다)에 대한 폴리(Tyr-Glu) 키나제 부류에서 우선적으로 발견되는 4가지의 아미노산 유형을 나타내며, 하나의 잔기(아스파라긴)는 기질로서 폴리(Tyr-Glu)를 쉽게 사용하지 않는 키나제에 우선적으로 위치되며 (도 5b 참조), 이는 기질 인식에 역할을 담당할 수 있다.
D. 토의
1. 단백질 키나제의 대량 분석
본 실험은 신규의 단백질 칩 기법을 이용하여 17개의 다른 물질에 대한 119개의 단백질 키나제의 활성을 특징지웠다. 특정의 단백질이 특정의 단백질 키나제에 대해 바람직한 기질이고 거꾸로 많은 단백질 키나제가 특정 기질에 대해 바람직함을 발견하였다. 이 연구에 있어 하나의 관심사항은, 원하는 효소 이외의 키나제가 본 발명의 제제를 오염시키는 것이 가능하다는 것이다. 심하게 위반되었다고 할 수는 없지만, 항-GST를 사용한 쿠마지 오염 및 면역블롯 오염에 의한 본 시험 시료 중 5개의 분석은 GST 융합물이 아닌 본원 제법에서 검출가능한 밴드를 나타내지 않았다(방법 단락 참조).
시험관내 분석은 시험관내 특정 키나제에 대한 기질이 생체내 동일 키나제에 의해 포스포릴화됨을 보증하는 것은 아님을 주지하여야 한다. 대신에, 이들 실험은 특정 단백질이 특정 키나제에 대한 기질로서 제공될 수 있음을 나타내며, 이는 추가의 분석을 가능하게 한다. 이러한 점에서, 이 분석법은 후보물질 상호작용이 검출되는 2-하이브리드 연구와 유사하다. 이 과정이 생체내에서 정상적으로 일어나는지 결정하기 위해서는 추가의 실험이 필요하다.
많은 기질이 생체 내에서 진정한 기질일 것이라는 생각과 일치되게 3개의 키나제, Hrr25, Pbs2 및 Mek1이 그의 공지된 기질을 포스포릴화함을 상기 방법에 의해 관찰하였다. 또한, 많은 키나제 (예를 들면 Ste20)가 그의 생체내 기질(예를 들면 Axl2)과 동시에 존재한다. 따라서, 본 시험관내 분석에서 기질을 포스포릴화하는 많은 키나제가 생체내에서도 그럴것으로 기대된다.
대부분의 키나제는 본 발명 분석법에서 활성이었지만 몇 개는 그렇지 않았다. 아마도, 이들 후자의 키나제 제제는 충분한 양의 활성화제가 없거나 또는 활성화 조건하에서 정제되지 않았다. 예를 들면 상기 분석에서는 활성이 아니었던 Cdc28은 그의 활성화 사이클린이 결여되어 있었다. Hog1의 경우는, 세포를 고 염으로 처리하여 효소를 활성화하였다. 거의 모든 키나제 제제가 활성을 나타내지 않았으므로 상기 제제 중의 최소한 몇가지 효소는 적절히 활성화되고/되거나 필요한 공통인자를 함유할 것으로 예상된다. 본래의 유기체 중의 이들 효소의 과잉 발현은 활성 효소를 고수율로 얻는데 크게 기여한다.
단백질 칩 상의 분석법을 사용하여, 폴리(Tyr-Glu)를 사용하는 많은 키나제를 동정하였다. 많은 키나제들의 대량 분석은 폴리(Tyr-Glu) 키나제와 특정 아미노산 서열의 작용 특이성을 상관짓는데 새로운 시도를 가능하게 하였다.폴리(Tyr-Glu)를 포스포릴화하는 키나제의 잔기의 대부분은 기본 잔기를 포함한다. 이것은, 키나제 잔기와 Glu 잔기 간에 정전기성 상호작용이 있다면 기대될 수 있다. 그러나, 나머지 다른 잔기의 몇가지의 역할은, 폴리(Tyr-Glu)을 포스포릴화하는 키나제에 대한 Met 잔기 및 그렇지 않은 키나제에 대한 Asn과 같이 자명하지는 않다. 이들 키나제 잔기는 다른 메카니즘으로 기질 특이성을 부여할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 추가의 기질의 분석은 또한 모든 단백질 키나제의 단백질 키나제 서열과 작용 특이성간의 상관관계를 허용한다.
2. 단백질 칩 기법
다량의 시료의 신속한 분석외에 본원에 기술된 단백질 칩 기법은 통상의 방법에 비해 상당한 잇점을 갖는다.
1) 칩-기본 분석은 높은 신호-대-노이즈 비율을 갖는다. 단백질 칩을 사용하여 신호-대-노이즈 비율이 통상의 마이크로적정판 분석에서 관찰되던 것(데이타는 나타내지 않음)에 비해 훨씬 높은(10배 보다 큼) 것을 알았다. 아마도 이것은,33P-γ-ATP가 PDMS를 마이크로적정판 만큼 결합하지 않는다는 사실 때문일 것이다.
2)필요한 물질의 양이 매우 적다. 반응부피가 384-웰 마이크로적정판에 사용되는 양의 1/20 내지 1/40 이다 (각 반응에 20 ng 미만의 단백질 키나제가 사용되었다).
3) 단백질 칩을 사용하는 효소 분석은 극히 감도가 높다. 면역블롯 분석에의해서는 단지 105개의 융합물이 검출가능하였지만, 최소한 하나의 기질에 대해 기준치에 비해 5배 이상의 효소활성을 나타내었다. 예를 들면 Mps1은, 면역블롯 분석에 의해서는 검출되지 않았지만, 대부분의 키나제 분석에서 가장 강한 활성을 일관되게 나타낸다. (도 1b 및 3a 참조).
4) 마지막으로, 상기 칩은 비싸지 않다 (재료비가 각 어레이에 대해 8센트 미만이다). 미세제작된 주형 또한 제조하기 용이하면서도 저렴하다.
단백질 키나제 분석에 더하여, 이 단백질 칩 기법은 또한, ATP 및 GTP 결합 분석, 뉴클레아제 분석, 헬리카제 분석 및 단백질-단백질 상호작용 분석과 같은 많은 다양한 추가의 분석에 적용가능하다. 최근에는, 독립적인 연구에서, 피지키 (Phizicky) 등은 훨씬 약한CUP1프로모터6하에서 효모 단백질을 GST 융합물로서발현시켰다6. 이들의 클론의 품질은 확정되어 있지 않지만, 이들은 융합 단백질을 함유하는 효모 균주의 풀(pool)을 사용하여 생화학적 활성을 동정할 수 있었다. 본 발명의 단백질 칩 방법의 이점은 모든 시료를 단일 실험으로 분석할 수 있다는 점이다. 또한, 본 실험은 시료를 분리하는 이점을 가진 웰을 이용하였지만, 다른 분석에는 또한 편평한 PDMS 칩 및 유리 슬라이드를 사용할 수도 있다 (이들은 표준 파이닝(pinning) 기구 마이크로어레이어와 함께 사용할 수 있다는 이점이 있다). 이 기법은 또한, 관심있는 유전자 생성물의 효소 활성을 활성화하거나 억제하는 화합물을 스크리닝하는 고생산성 약제 스크리닝을 용이하게 하는데 적용될 수 있다. 이들 분석은 단백질 수준에서 수행하게 될 것이므로 결과는 단백질의 분자 기능에대해 보다 직접 적이고 의미가 있는 것이 될 것이다.
본 발명자들은 통상 입수가능한 시료 취급 및 기록 장비를 사용하여 특이적 단백질 키나제 분석용 단백질 칩 기법을 구체화하였다. 이 목적을 위해, 어레이 치수는 미세제작된 실리콘 엘라스토머 구조물32과 함께 용이하게 사용할 수 있는 치수에 비해 약간 크게 하였다. 본 발명자들은 미세사진식각술로 제작된 주형을 사용하여 본원에서 보고한 것보다는 2승(two order) 작은 크기의 특징부를 가진 PDMS 구조물을 캐스팅하였으나, 반면 다른 사람들은 미세제작된 구조물에서 미크론 이하의 특징부 크기를 보고하였다. 이 결과는 미세제작된 단백질 칩의 웰 밀도가 몇 승 크기만큼 쉽게 증가될 수 있음을 나타낸다. 본원 발명의 단백질 칩 기법은 쉽게 치수조정가능하다.
결론적으로, 단백질 생화학적 활성의 고생산성 스크리닝을 위해 저렴한 일회용 단백질 칩이 개발되었다. 그 유용성은, 17개의 다른 물질의 포스포릴화를 위해 분석된 사카로마이세스 세레비지애로부터 119개의 단백질 키나제의 분석을 통해 입증되었다. 이 단백질 칩은 수백개의 단백질 시료의 동시 측정을 가능하게 한다. 칩 기법의 기본으로서의 미세제작된 웰 어레이의 사용은 어레이 밀도를 쉽게 몇승 증가시킬 수 있게 한다. 적절한 시료 취급 및 측정 기법의 개발로, 본원의 단백질 칩을 수천 내지 수백만의 시료의 동시 분석에 적합하게 할 수 있다.
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실시예 II: 단백질 칩을 사용한 효모 단백질 키나제 활성의 분석
A. 소개
하기 실시예는 예시목적을 위한 것으로, 단백질 키나제 활성을 분석하는데본 발명의 단백질 칩을 사용하는 다양한 방법들을 제공하는 세가지의 프로토콜(protocol)을 제시한다.
1. 단백질 키나제 활성의 분석 방법
(i) 자동포스포릴화 활성
(1) 단백질 칩을 실온에서 100% EtOH로 3회 세척하였다. 이어서, 이 칩을 실온에서 교반하며 1 시간동안 결합제 GPTS(95% EtOH 중의 1%)로 코팅하였다. 100% EtOH로 3회 세척한 후 상기 칩을 130℃에서 1.5 시간동안 진공하에서 건조하였다.
(2) GST::효모 단백질 키나제를 최소한 한 시간 동안 항온처리함으로써 웰당 하나의 키나제 종으로 단백질 칩의 웰에 결합시켰다. 상기 칩을 1% BSA로 추가로 블로킹하였다.
(3) 각 웰에 키나제 완충액 및33P-γ-ATP 프로우브를 가하고 30℃에서 30분간 배양하였다. 포스포릴화 반응이 완결된 후 상기 칩을 광범위하게 세척하였다.
(4) 자동포스포릴화를 나타내는 특이성33P-γ-ATP 신호를 형광영상기로 검출 및 정량하였다.
(ii) 키나제 활성-프로토콜 I
(1) 단백질 칩을 실온에서 100% EtOH로 3회 세척하였다. 이어서, 이 칩을 실온에서 교반하며 1 시간동안 결합제 GPTS(95% EtOH 중의 1%)로 코팅하였다. 100% EtOH로 3회 세척한 후 상기 칩을 130℃에서 1.5 시간동안 진공하에서 건조하였다.
(2) 기질(예를 들면 GST::효모 단백질)을 최소한 한 시간 동안 항온처리함으로써 상기 칩에 결합시켰다. 상기 칩을 1% BSA로 추가로 블로킹하고 칩을 세척하였다.
(3) 단백질 칩의 각 웰에 다른 단백질 키나제를 키나제 완충액 및33P-γ-ATP 프로우브와 함께 가하고 30℃에서 30분간 배양하였다. 포스포릴화 반응이 완결된 후 상기 칩을 광범위하게 세척하였다.
(4) 자동포스포릴화를 나타내는 특이성33P-γ-ATP 신호를 형광영상기로 검출 및 정량하였다.
(iii) 키나제 활성-프로토콜 II
(1) 단백질 칩을 실온에서 100% EtOH로 3회 세척하였다. 이어서, 이 칩을 실온에서 교반하며 1 시간동안 결합제 GPTS(95% EtOH 중의 1%)로 코팅하였다. 100% EtOH로 3회 세척한 후 상기 칩을 130℃에서 1.5 시간동안 진공하에서 건조하였다.
(2) 기질(예를 들면 GST::효모 단백질)을 최소한 한 시간 동안 항온처리함으로써 상기 칩에 결합시켰다. 상기 칩을 1% BSA로 추가로 블로킹하고 칩을 세척하였다.
(3) 단백질 칩의 각 웰에 다른 단백질 키나제를 키나제 완충액 및33P-γ-ATP 프로우브와 함께 가하고 30℃에서 30분간 배양하였다. 포스포릴화 반응이 완결된 후 상기 칩을 광범위하게 세척하였다. 상기 칩을 실온에서 암실 조건하에 밤새 요오도아세틸-LC-비오틴으로 배양하였다.
(4) 세척한 후, 상기칩을 형광-표지된 아비딘으로 탐색하여 포스포릴화 신호를 검출하였다.
(5) 이어서, 상기 칩을, 약 300-400 미크론의 증대된 초점 깊이를 가진 렌즈로 변형시킨 악손 제네픽스 (Axon Genepix) 4000A 스캐너를 사용하여 스캐닝하였다. 상기 변형은, 그렇지 않으면 초점면 밖에 있게 될, 슬라이드(예를 들면 본 발명의 PDMS 마이크로어레이) 상에 올려진 면의 스캐닝을 가능하게 한다. 상기 변형된 악손 제네픽스 4000A를 사용하여 어레이를 스캐닝하여 형광 신호를 얻어 정량하였다.
실시예 III: 단백질 칩을 사용한 단백질-단백질 상호작용 분석
관심있는 단백질 ("탐색 단백질")을 이. 콜라이중에서 재조합 발현시키고 표준 프로토콜을 사용하여 표지된 융합 단백질로서 그로부터 정제하였다. 목표 단백질을 칩의 웰에 각 웰 마다 달리하여 결합시켰다. 칩의 각 웰에 정제된 탐색 단백질을 도입하고 수시간 이상 동안 배양하였다. 칩을 세척하고, a) 탐색 단백질에 대한 항체 또는 b) 융합 단백질 상의 표지물에 대한 항체로 탐색하였다. 상기 항체는 Cys3 또는 Cys5와 같은 형광 표지물로 표지된 것으로, 1차 항체를 검출하는 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 검출된다.
하기 실시예는 예시용으로만 제공되는 것으로, 프로테아제, 뉴클레아제 또는 G-단백질 수용체를 분석하는데 본 발명의 단백질 칩을 사용하는 방법을 제공한다. 단백질-단백질 상호작용은 일반적으로 하기 방법 또는 그와 유사한 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
A. 프로테아제 활성의 분석
프로테아제 활성은 하기 방법으로 분석된다. 우선, C-말단 또는 N-말단 질량분석계 라벨이 결합된(단, 상기 라벨의 분자량은 그 단백질의 모든 표지된 절단 생성물이 검출될 수 있도록 충분히 커야 한다), 다양한 아미노산 조합으로 이루어진 단백질 프로우브를 제조한다. 상기 단백질 프로우브를 단백질 칩에 결합된 프로테아제와 37℃에서 접촉시킨다. 적절한 시간동안 37℃에서 배양하고, 아세토니트릴 및 삼불화아세트산으로 세척한 후, 질량분석계를 사용하여 단백질 분해 생성물을 검출함으로써 프로테아제 활성을 측정한다. 이 분석은 단백질 칩에 결합된 프로테아제의 단백질 분해활성 및 특이성 둘다와 관련된 정보를 제공한다.
프로테아제 활성 분석을 위한 또다른 하나의 신속한 분석법은 칩에 공지된서열의 단백질을 결합시키는 것이다. 칩에 결합되어 있지 않은 말단에 기질 단백질을 형광표지시킨다. 관심있는 프로테아제를 사용한 배양시, 형광성 표지물은 단백질 분해시에 소실되어, 형광성의 감소가 프로테아제 활성의 존재 및 정도를 나타낸다. 단백질 기질들이 칩의 웰에 위치된 비드에 결합되어 있는 이와 동일한 어레이 유형을 수행할 수 있다.
B. 뉴클레아제 활성의 분석
단백질 프로우브/기질 대신 핵산 프로우브/기질을 사용하는 것을 제외하고는 프로테아제 활성에 대해 상술한 바와 동일한 방법으로 뉴클레아제 활성을 분석한다. 이와 같이, 뉴클레아제 활성이 없어진 형광 표지된 핵산 분절들을 형광성에 의해 검출하거나 또는 질량분석계에 의해 핵산 분절들을 직접 검출할 수 있다.
C. G-단백질 결합된 수용체의 분석
또다른 분석 유형으로서, G-단백질 결합된 수용체를 결합하는 화합물이 동정될 수 있다. 우선, G-단백질 수용체를 GST 융합 단백질(C-말단은 일반적으로 결정 프로우브 특이성과 관련이 없기 때문에 GST 부분이 G-단백질의 C-말단에 결합되어 있음)로서 클로닝한다. 상기 G-단백질::GST 융합 단백질을 바람직하게는 클루타티온과 함께 웰에 결합시킨다. 이어서 G-단백질 수용체를 조합 화학 라이브러리 또는 펩타이드 라이브러리와 같은 화합물의 혼합물로 배양한다. 세척한 후 결합 프로우브를 예를 들면 25% 아세토니트릴/0/05% 삼염화아세트산의 첨가에 의해 용리시킨다. 용리된 물질을, 이어서 MALDI 질량 분석계에 부하하여, 결합된 프로우브의 특성을 동정한다.
실시예 IV: 단백질 칩을 사용한, 특이 억제제에 의한 단백질 키나제 억제의 분석
하기 설명은 단지 예시를 위한 것으로, 단백질 키나제의 단백질 키나제 억제제에 대한 감도를 조사하는데 본 발명의 단백질 칩을 사용하는 방법을 제공한다. 단백질-단백질 상호작용은 일반적으로 하기 방법 또는 그와 유사한 방법을 사용하여 분석할 수 있다.
실온에서 1시간 동안 단백질 칩 상의 GPTS-처리된 마이크로웰의 표면에 기질을 결합시킨 후 1% BSA 및 100 mM 트리스(Tris) pH 7.5로 블로킹하고, TBS 완충액으로 3회 세척하였다.33P-γ-ATP의 존재하에 상기 마이크로웰에 키나제와 다양한 농도의 키나제 억제제를 가하였다. 포스포릴화 반응을 30℃에서 30분간 수행하였다. 상기 반응을 완료한 후, 단백질 칩을 실온에서 광범위하게 TBS 완충액으로 세척한 후 건조하였다. 단백질 칩을 X-선 필름 또는 형광영상기에 노출시킴으로써 포스포릴화 신호를 얻었다.
인간 단백질 키나제 A(PKA), 인간 지도 키나제(MAPK), 3개의 효모 PKA 동족체 (TPK1, TPK2 및 TPK3), 및 두 개의 다른 효모 단백질 키나제(HSL1 및 RCK1)을 두 가지의 기질 (즉, PKA에 대한 단백질 기질 및 통상 이용되는 키나제 기질, MBP)에 대해 다양한 농도의 PKIα(특이성 인간 PKA 억제제) 또는 SB202190(MAPK 억제제)를 사용하여 시험하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, PKIα는 시험된 3개의 효모 PKA 동족체(TPK1, TPK2, TPK3) 또는 나머지 두 개의 효모 단백질 키나제(HSL1 및 RCK1)를 억제하지 못하였다. 또한, SB202190은 PKA 활성을 억제하지 못하였다.
실시예 V: 유리 표면 상의 키나제 분석
1. 유리 슬라이드(피셔(Fisher), 미국)를 28-30% 수산화암모늄에 실온에서 교반하면서 밤새 침지시켰다.
2. 상기 슬라이드를 초순수로 각 5분동안 4회 세정한 다음 다량의 100% 에탄올(EtOH)로 세정하여 물을 완전히 제거하였다. 이어서 상기 슬라이드를 95% 에탄올로 3회 세정하였다.
3. 상기 슬라이드를 95% 에탄올 중의 1% 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(GPST) 용액, 16 mM 아세트산(HOAc)에 침지하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 슬라이드를 95% 에탄올로 실온에서 3회 세정하였다.
4. 상기 슬라이드를 135℃에서 2시간동안 진공하에 경화시켰다. 냉각 후 상기 슬라이드를, 사용하기 전에 아르곤 중에 수개월동안 저장할 수도 있다.
5. 얼음 상의 96-웰 PCT 기판상에 각 단백질 기질(40% 글리세롤 중의) 약 10㎕씩 어레이시켰다. 수동 스폿팅 장치(V&P 사이언티픽, 미국)를 사용하여, 상기 GPTS-처리된 유리 슬라이드 상에 실온에서 상기 시료 각각을 약 3 nl씩 스폿팅하였다. 하나의 실시태양에서는, 단일 슬라이드에 768가지의 시료를 스폿팅한다. 상기 슬라이드를 밀폐된 크린룸에서 실온에서 1시간동안 항온처리하였다.
6. 슬라이드를 10 ml의 블로킹 완충액(100 mM 글리세린, 100 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl)으로 실온에서 한 시간 동안 블로킹하였다. 상기 슬라이드를 TBS 완충액(50 mM 트리스, pH 8.0, 150 mM NaCl)으로 3회 세척한 후 150 rpm에서 5분동안 스파이닝하여 건조하였다
7. 슬라이드 상의 기질 표면을 하이브리웰 실링 시스템(HybriWell Sealing System)(Chleicher & Schuell, 독일)으로 덮고, 얼음 상에서 상기 기질에 단백질 키나제 및 표지제로서33P-γ-ATP를 함유하는 키나제 혼합물 40 ㎕를 가하였다.
8. 상기 반응물을 습실에서 30℃에서 30분간 항온처리하였다. 밀폐부를 슬라이드로부터 박리하고, 슬라이드를 50 mM EDTA를 함유하는 다량의 PBS 완충액에 침지하였다. 상기 슬라이드를 동일 완충액으로 실온에서 15분씩 3회 더 세척하였다. 세척된 슬라이드를 이어서 킴 와이프(Kimwipe)로 건조하였다.
9. 신호를 얻기 위해, 형광영상기 스크린 및 이미지퀀트(ImageQuant) 소프트웨어를 사용하여 분석한 데이터에 상기 슬라이드를 노출시켰다.
인용 참고문헌
본원에 인용된 모든 참고문헌은, 각각의 공보 또는 특허 또는 특허출원이 모든 목적을 위해 그 전체로서 참고로 인용된 것과 동일한 정도로, 그 전체로서 본원에 모든 목적을 위해 참고로 인용한다.
본 발명의 진의 및 범주에서 벗어나지 않고도 당업자들은 본원의 다양하게 변경 및 변화시킬 수 있음은 자명하다. 본원에 기술된 실시태양들은 단지 예로써 제공한 것으로, 본 발명은 첨부된 특허청구범위 및 그의 등가 범위로만 한정된다.

Claims (105)

  1. 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질을 포함하며, 이때 각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위에서 다른 위치에 있으며, 다수의 다른 물질이 ㎠당 적어도 100개의 다른 물질로 이루어진, 위치적으로 접근가능한 어레이.
  2. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 100 내지 1,000개의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  3. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 1,000 내지 10,000개의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  4. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 10,000 내지 100,000개의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  5. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 100,000 내지 1,000,000개의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  6. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 1,000,000 내지 10,000,000개의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  7. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 10,000,000 내지 25,000,,000개의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  8. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 25,000,000개 이상의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  9. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 10,000,000,000개 이상의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  10. 제 1 항에 있어서, 다수의 다른 물질이 ㎠당 10,000,000,000,000개 이상의 다른 물질로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  11. 제 1 항에 있어서, 고상 지지체가 유리 슬라이드임을 특징으로 하는 어레이.
  12. 제 1 항에 있어서, 고상 지지체의 표면상의 다른 웰에 각각 다른 물질이 있음을 특징으로 하는 어레이.
  13. 제 12 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 고상 지지체의 표면에 결합되어 있음을 특징으로 하는 어레이.
  14. 제 12 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 고상 지지체의 표면에 결합되어 있지 않음을 특징으로 하는 어레이.
  15. 제 12 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 용액으로 있음을 특징으로 하는 어레이.
  16. 제 12 항에 있어서, 각각의 웰이 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 분석하기 위한 시약을 포함함을 특징으로 하는 어레이.
  17. 고상 지지체 위에 다수의 다른 단백질, 또는 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자(각각의 다른 단백질 또는 분자는 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하며, 이때 상기 다수의 다른 단백질 또는 분자가 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%로 이루어지는, 위치적으로 접근 가능한 어레이.
  18. 제 17 항에 있어서, 다수의 다른 단백질 또는 분자가 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 75%로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  19. 제 17 항에 있어서, 다수의 다른 단백질 또는 분자가 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 90%로 이루어짐을 특징으로 하는 어레이.
  20. 제 17 항에 있어서, 유기체가 박테리아, 효모, 곤충 및 포유동물로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 어레이.
  21. 제 17 항에 있어서, 관심있는 생물학적 활성을 가진 발현 단백질이 키나제, 포스파타제, 프로테아제, 글리코시다제, 아세틸라제, 트랜스퍼라제, 다른 그룹 전달 효소, 핵산 결합 단백질, 호르몬 결합 단백질 및 DNA 결합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 어레이.
  22. 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하며, 이때 상기 고상 지지체가 세라믹, 비결정질 실리콘 카바이드, 캐스팅가능한 산화물, 폴리이미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌 및 실리콘 엘라스토머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 위치적으로 접근 가능한 어레이.
  23. 제 22 항에 있어서, 고상 지지체가 실리콘 엘라스토머임을 특징으로 하는 어레이.
  24. 제 23 항에 있어서, 고상 지지체가 폴리디메틸실록산임을 특징으로 하는 어레이.
  25. 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하며, 이때 상기 다수의 다른 물질이 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 결합제를 통해 상기 고상 지지체에 결합되는, 위치적으로 접근 가능한 어레이.
  26. 고상 지지체의 표면 위에 적어도 100웰/㎠의 밀도로 다수의 웰을 포함하는 어레이.
  27. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 100 내지 1,000웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  28. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 1,000 내지 10,000웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  29. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000 내지 100,000웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  30. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 100,000 내지 1,000,000웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  31. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 1,000,000 내지 10,000,000웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  32. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000,000 내지 25,000,,000웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  33. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 25,000,000개 이상의 웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  34. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000,000,000개 이상의 웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  35. 제 26 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000,000,000,000개 이상의 웰/㎠임을 특징으로 하는 어레이.
  36. 제 26 항에 있어서, 웰에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의다른 물질이 존재하며, 각각의 다른 물질은 다른 위치에 있음을 특징으로 하는 어레이.
  37. 제 36 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 고상 지지체의 표면에 결합되어 있음을 특징으로 하는 어레이.
  38. 제 37 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 고상 지지체의 표면에 공유결합되어 있음을 특징으로 하는 어레이.
  39. 제 38 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 고상 지지체의 표면에 결합제에 의해 결합되어 있음을 특징으로 하는 어레이.
  40. 제 39 항에 있어서, 결합제가 3-글리시독시프로필트리메톡시실란임을 특징으로 하는 어레이.
  41. 제 36 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 고상 지지체의 표면에 비-공유적으로 결합되어 있음을 특징으로 하는 어레이.
  42. 제 36 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 고상 지지체의 표면에 결합되어 있지 않음을 특징으로 하는 어레이.
  43. 제 36 항에 있어서, 다른 웰 중의 각각 다른 물질이 용액으로 있음을 특징으로 하는 어레이.
  44. 제 26 항에 있어서, 각각의 웰이 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 분석하기 위한 시약을 포함함을 특징으로 하는 어레이.
  45. 제 26 항에 있어서, 웰의 부피가 1pl 내지 5 ㎕ 임을 특징으로 하는 어레이.
  46. 제 26 항에 있어서, 웰의 부피가 1nl 내지 1 ㎕ 임을 특징으로 하는 어레이.
  47. 제 26 항에 있어서, 웰의 부피가 100 nl 내지 300 nl 임을 특징으로 하는 어레이.
  48. 제 26 항에 있어서, 웰의 바닥면이 정사각형, 원형, V-형 또는 U-형임을 특징으로 하는 어레이.
  49. 고상 표면 위에 100웰/㎠ 보다 큰 웰 밀도를 나타내도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 어레이를 캐스팅하는 단계를 포함하는, 고상 지지체의 표면 위에 다수의 웰을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이의 제조 방법.
  50. (a) 고체 표면 위의 웰 밀도가 100웰/㎠ 보다 크도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 제 2 주형을 캐스팅하는 단계, 및
    (b) 상기 제 2 주형으로부터 적어도 하나의 어레이를 캐스팅하는 단계를 포함하는, 고상 지지체의 표면 위에 다수의 웰을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이의 제조 방법.
  51. 제 49 또는 50 항에 있어서, 어레이 캐스팅 단계가 추가로
    (a) 주형을 액상 캐스팅 물질로 덮는 단계, 및
    (b) 캐스팅된 물질을 고체가 될 때까지 경화시키는 단계
    를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 100 내지 1,000웰/㎠ 임을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 1,000 내지 10,000웰/㎠임을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000 내지 100,000웰/㎠임을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 100,000 내지 1,000,000웰/㎠임을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 1,000,000 내지 10,000,000웰/㎠임을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000,000 내지 25,000,000웰/㎠임을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 25,000,000개 이상의 웰/㎠ 임을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000,000,000개 이상의 웰/㎠임을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 49 내지 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 웰의 밀도가 10,000,000,000,000개 이상의 웰/㎠임을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 49 또는 50 항에 있어서, 어레이가 실리콘 엘라스토머로부터 캐스팅됨을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 49 또는 50 항에 있어서, 어레이가 폴리디메틸실록산으로부터 캐스팅됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 51 항에 있어서, 액상 캐스팅 물질이 실리콘 엘라스토머임을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 51 항에 있어서, 액상 캐스팅 물질이 폴리디메틸실록산임을 특징으로 하는 방법.
  65. 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 사용하며, 이때 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 100개의 다른 물질로 이루어지고,
    (a) 프로우브와 상기 어레이를 접촉하는 단계, 및
    (b) 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  66. 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 사용하며, 이때 상기 다수의 단백질 또는 분자는 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%로 이루어지고,
    (a) 프로우브와 상기 어레이를 접촉하는 단계, 및
    (b) 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  67. 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자,전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 사용하며, 이때 상기 고상 지지체는 세라믹, 비결정질 실리콘 카바이드, 캐스팅가능한 산화물, 폴리이미드, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌 및 실리콘 엘라스토머로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
    (a) 프로우브와 상기 어레이를 접촉하는 단계, 및
    (b) 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  68. 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)을 포함하는 위치적으로 접근 가능한 어레이를 사용하며, 이때 상기 다수의 다른 물질은 3-글리시독시프로필트리메톡시실란 결합제를 통해 상기 고상 지지체에 결합되고,
    (a) 프로우브와 상기 어레이를 접촉하는 단계, 및
    (b) 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  69. 제 65 내지 68 항 중의 어느 한 항에 있어서, 프로우브가 효소 기질 또는 억제제임을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 프로우브가 키나제, 포스파타제, 프로테아제, 글리코시다제, 아세틸라제 및 기타 그룹 전달 효소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소의 억제제 또는 기질임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 65 내지 68 항 중의 어느 한 항에 있어서, 프로우브가 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 소분자 기질, 약제 후보, 수용체, 항원, 스테로이드, 인지질, 항체, 글루타티온, 면역 글로불린 도메인, 말토스, 니켈, 디하이드로트립신 및 비오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 65 내지 68 항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질/프로우브 상호작용 검출이 질량분석법에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 65 내지 68 항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질/프로우브 상호작용 검출이 화학형광, 형광, 방사 표지 및 원자력현미경법으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 방법에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
  74. (a) 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질을 위치시키는 단계 (이때, 상기 다수의 다른 물질은 ㎠당 적어도 100개의 다른 물질로 이루어지고, 각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음),
    (b) 프로우브와 어레이를 접촉하는 단계, 및
    (c) 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는,
    위치적으로 접근가능한 어레이의 사용 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 고상 지지체가 유리 슬라이드임을 특징으로 하는 방법.
  76. (a) 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질을 위치시키는 단계 (이때, 각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있으며, 상기 다수의 단백질 또는 분자는 유기체의 게놈에서 같은 형태의 생물학적인 활성을 가진 모든 발현된 단백질의 적어도 50%로 이루어짐),
    (b) 프로우브와 상기 어레이를 접촉하는 단계, 및
    (c) 단백질/프로우브 상호작용을 검출하는 단계를 포함하는,
    위치적으로 접근가능한 어레이의 사용 방법.
  77. 제 76 항에 있어서, 고상 지지체가 유리 슬라이드임을 특징으로 하는 방법.
  78. (a) 고상 표면 위에 100웰/㎠ 보다 큰 웰의 밀도를 나타내도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 어레이를 캐스팅하는 단계, 및
    (b) 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질을 위치시키는 단계 (이때, 각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)를 포함하는, 위치적으로 접근가능한 어레이의 제조 방법.
  79. (a) 고상 표면 위에 100웰/㎠ 보다 큰 웰의 밀도를 나타내도록 설계된 미세제작된 주형으로부터 제 2 주형을 캐스팅하는 단계,
    (b) 상기 제 2 주형으로부터 적어도 하나의 어레이를 캐스팅하는 단계, 및
    (c) 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질을 위치시키는 단계 (이때, 각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있음)를 포함하는, 위치적으로 접근가능한 어레이의 제조 방법.
  80. (a) 고상 지지체 위에 다수의 잠정적 항원을 포함하는 (이때, 각각의 다른 항원은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있으며, 다른 항원의 밀도는 최소한 100개의 다른 항원/㎠ 임) 위치적으로 접근가능한 어레이를 다수의 림프구와 접촉시키는 단계, 및
    (b) 림프구 활성화가 일어나는 고상 지지체상의 위치를 검출하는 단계
    를 포함하는, 림프구를 활성화하는 항원의 동정 방법.
  81. 제 80 항에 있어서, 림프구가 환자로부터 유도된 것임을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 80항에 있어서, 항원이 병원균의 항원, 자기이식 조직의 항원, 조직-특이성 항원, 질병-특이성 항원 및 합성 항원으로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 80항에 있어서, 림프구 활성화가 항체 합성을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 80항에 있어서, 림프구 활성화가 림프구에 의한3H-티미딘의 혼입을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  85. 제 80항에 있어서, 림프구 활성화가 림프구 활성화에 의해 유도되거나 억제되는 세포 표면 분자의 발현을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  86. 제 80항에 있어서, 림프구 활성화가 림프구 활성화에 의해 유도된 분리된 분자의 발현을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 80항에 있어서, 림프구 활성화가51크롬의 방출을 측정함으로써 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  88. (a) 고상 지지체 위에 다수의 잠정적 항원을 포함하는 (이때, 각각의 다른 항원은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있으며, 다른 항원의 밀도는 최소한 100개의 다른 항원/㎠ 임) 위치적으로 접근가능한 어레이를 항체 제제와 접촉시키는 단계, 및
    (b) 항체 제제 중의 항체에 의한 결합이 일어나는 고상 지지체상의 위치를 검출하는 단계를 포함하는, 항체 제제의 특이성 결정 방법.
  89. 제 88항에 있어서, 항체 제제가 항혈청, 모노클론성 항체 또는 다중클론성 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 88항에 있어서, 항체 제제가 Fab 분절, 키메라성, 단일쇄, 인간화된 또는 합성 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  91. 제 88항에 있어서, 항체 결합이, 상기 항체 제제 중의 항체를 결합하는 형광표지된 2차 항체 제제와 어레이를 접촉시키고, 비결합된 2차 항체를 제거하고, 어레이상에서 결합된 표지물을 검출하는 것에 의해 검출됨을 특징으로 하는 방법.
  92. (a) 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전 세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질(이때, 상기 각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위의 다른 위치에 있으며, 상기 다수의 물질의 밀도는 ㎠당 최소한 100개의 다른 물질이다)을 포함하는, 위치적으로 접근가능한 어레이를 개체 세포와 접촉시키는 단계, 및
    (b) 세포내에서 미토겐의 활성이 유도되는 고상 지지체상의 위치를 검출하는 단계를 포함하는, 미토겐 동정 방법.
  93. (a) 상기 고상 지지체 표면 상에 다수의 웰을 ㎠당 최소한 100개의 밀도로 포함하는 하나 이상의 어레이, 및
    (b) 하나 이상의 용기 내의 하나 이상의 프로우브, 시약 또는 다른 분자
    를 포함하는 키트.
  94. 제 93항에 있어서, 상기 하나 이상의 용기가 단백질의 생물학적 활성을 분석하는데 유용한 시약을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  95. 제 93항에 있어서, 상기 하나 이상의 용기가 프로우브와 단백질간의 상호작용을 분석하는데 유용한 시약을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  96. 제 94 또는 95항에 있어서, 시약이 용액 형태임을 특징으로 하는 키트.
  97. 제 94 또는 95항에 있어서, 시약이 고체 형태임을 특징으로 하는 키트.
  98. 제 94 또는 95항에 있어서, 시약이 어레이의 각각의 웰에 담기는 것을 특징으로 하는 키트.
  99. 제 94 또는 95항에 있어서, 시약이 어레이의 선택된 웰에 담기는 것을 특징으로 하는 키트.
  100. 제 93항에 있어서, 상기 하나 이상의 용기가 단백질 또는 분자의 생물학적 활성을 분석하기 위한 용액 반응 혼합물을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  101. 제 100 항에 있어서, 상기 하나 이상의 용기가 상기 생물학적 활성을 분석하기 위한 하나 이상의 기질을 포함함을 특징으로 하는 키트.
  102. (a) 고상 지지체 위에 단백질, 상기 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 분자, 전세포 및 단백질 포함 세포 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다수의 다른 물질 (각각의 다른 물질은 상기 고상 지지체 위에서 다른 위치에 있으며, 다수의 다른 물질은 ㎠당 최소한 100개의 다른 물질로 이루어짐)을 포함하는 하나 이상의 위치적으로 접근가능한 어레이, 및
    (b) 하나 이상의 용기 내의 하나 이상의 프로우브, 시약 또는 다른 분자
    를 포함하는 키트.
  103. 제 102 항에 있어서, 기질이 고상 지지체 상의 웰의 표면에 결합되어 있음을 특징으로 하는 키트.
  104. 제 103 항에 있어서, 기질이 단백질이고, 단백질이 유기체에서 동일 유형의 생물학적 활성을 가진 모든 발현 단백질의 최소한 50%임을 특징으로 하는 키트.
  105. 제 104 항에 있어서, 기질이 단백질의 작용성 도메인을 포함하는 단백질 또는 분자이고, 단백질 또는 분자가 키나제, 포스파타제, 프로테아제, 글리코시다제, 아세틸라제, 핵산 결합 단백질 및 호르몬 결합 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택됨을 특징으로 하는 키트.
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