JP2004506201A - 機能性生体分子のマイクロアレイおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
特に興味の生体高分子がマイクロアレイで支持体表面に結合する場合に、それらの高分子と相互作用する能力のある化合物の同定を容易にするための製品および方法を開示する。本発明の観点は結合化学、ペプチド標識、抗体の調製、適用などに関する。
Description
【0001】
関連する出願
本出願は米国仮出願第60/222,763号(2000年8月3日出願)に基づいて優先権を主張するものであり、その開示は参照によって本明細書に援用される。
【0002】
技術分野
本発明は診断化学および分析化学の分野、特に複雑な化学的サンプルまたは生物学的サンプルをスクリーニングして、サンプル中の成分を特定の結合要素に結合するその能力に基づいて同定、単離、または定量するための装置に関する。本発明は特に、生物学的に重要な結合要素、または生物学的に重要なリガンドに結合する結合要素のアレイ、好ましくはマイクロアレイ、の生成および使用に関する。
【0003】
発明の背景
複雑な化学的サンプルもしくは生物学的サンプル、または多数の化合物を効率的にスクリーニングするための機能性生体分子の高密度アレイを構築するために、結合要素を固体支持体上に固定化する必要がある。当該分野において固体支持体に生物学的分子を結合させるための種々の方法が知られている。一般に、Affinity Techniques, Enzyme Purification : Part B, Meth. Enz. 34(W.B. JakobyおよびM. Wilchek編, Acad. Press, N.Y. 1974)およびImmobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Adv. Exp. Med. Biol. 42(R. Dunlap編, Plenum Press, N.Y., 1974)を参照されたい。例えばArenkovらは、タンパク質をその機能を保持しつつ固定化する方法について記載しているが、これは微細加工(microfabricated)ポリアクリルアミドゲルパッドを使用してタンパク質を捕捉し、その後、微量電気泳動(microelectrophoresis)によってマトリクスを通ずる拡散を促進することによるものである(Arenkovら(2000), Anal Biochem 278 (2):123−31)。また特許文献は、固体支持体に生物学的分子を結合させる多くの異なる方法を記載している。例えば米国特許第4,282,287号は、ビオチン、アビジン、および増量剤の多層の連続的適用によってポリマー表面を修飾する方法について記載している。米国特許第4,562,157号は、光化学反応性アリールアジドへの結合によって表面に生化学的リガンドを結合させるための方法について記載している。アジドの放射線照射によって反応性ナイトレンが生成されるが、これは溶液中で高分子と不可逆的に反応し、それによって共有結合が形成される。しかしながら、ナイトレン中間体は反応性が高いため、非特異的反応によって結合効率の低下および多くの潜在的に好ましくない生成物の生成の両方が起こる。米国特許第4,681,870号は、シリカマトリクス上に遊離のアミノ基またはカルボキシル基を導入する方法を記載しており、ここではそれらの基をそれに続いてカルボジイミドの存在下でタンパク質に共有結合させてもよい。更に、米国特許第4,762,881号は、固体基質にポリペプチド鎖を結合させるための方法について記載しているが、これは光感受性非天然型(unnatural)アミノ酸基をポリペプチド鎖に導入し、生成物を低エネルギー紫外線に暴露することによるものである。
【0004】
しかしながら、複合サンプル中の成分を同定、単離、および/または定量し、多数の化合物を種々の異なる結合パートナーに結合するその能力に基づいてスクリーニングする、より効率的で製造が容易なアレイ系が今なお必要とされている。
【0005】
発明の概要
本発明は、興味の結合要素を基質に固定化し、サンプル分析物と相互作用させて結合させることができる、マイクロアレイ・アッセイ系を提供する。マイクロアレイは、天然または合成化合物の大型ライブラリーをスクリーニングし、結合要素の天然の結合パートナーを同定し、そして診断的または治療的目的であり得る非天然型結合パートナーを同定するのに有用である。本発明は、これまでその特異的結合活性を保持しながら高密度アレイに導入することができなかったscFvのような抗体または抗体フラグメントのマイクロアレイを提供するのに特に有用である。本発明はまた、それらのマイクロアレイの使用法、それらのアレイに有用な抗体または抗体フラグメントのためのエピトープの選択法、そしてマイクロアレイで実施したアッセイから得られるデータの分析法を提供する。
【0006】
好ましくは、固定化した結合要素はシリコンベースのチップまたはガラススライドのような固体支持体上に配列させてアレイとする。支持体の表面は、更なる結合化学に使用できる少なくとも1つの反応性化学基を有するように選択するか、またはそのように化学的に誘導する。必要により、フレキシブルな分子リンカーを支持体および結合要素間に挿入してもよい。それらのリンカーの例にはウシ血清アルブミン(BSA)分子、マレイミド、およびビニルスルホン基がある。
【0007】
本発明のある態様では、結合要素の、その同族リガンドへの結合に関与する領域と、支持体に結合される領域とを分離するように、結合要素を支持体に固定化する。好ましい態様では、2つの領域は2つの異なる末端であり、結合要素を操作して、末端の1つを介して支持体上のリンカー分子への共有結合を形成させるようにする。それらの共有結合はシッフ塩基結合、マイケル付加によって生成される結合、またはチオエーテル結合によって形成してもよい。特に好ましい態様では、抗体フラグメントを操作して、そのカルボキシル末端に還元されたシステインを含むようにする。
【0008】
好ましい態様では、マイクロアレイはcm2当たり少なくとも1000スポットの密度の固定化され、なおかつ機能性を有する結合要素のアレイを含む。ある態様では、乾燥を防ぐために、固定化した結合要素の層にグリセロールのような保水剤を添加することを本発明は提供する。他の態様では、基質表面にBSAのようなブロッキング剤溶液を添加することを本発明は提供する。
【0009】
別の観点では、本発明は、標識が抗原と抗体または抗体フラグメントとの結合に干渉しないような抗原の標識方法を提供する。好ましい態様では、プロテアーゼ消化後に抗原をその末端アミンで標識する。特に好ましい態様では、抗原をトリプシンで消化した後、スクシンイミジルエステル色素で標識する。
【0010】
更なる観点では、本発明は候補となるタンパク質を多数のペプチドにフラグメント化することによってリン酸化されたタンパク質を検出する方法を提供し、ここでペプチドの1つは既知の、または疑いのあるリン酸化部位を含み、抗体または抗体フラグメントを使用して、リン酸化部位に近いエピトープによってペプチドを選択する。
【0011】
更に別の観点では、本発明はタンパク質−タンパク質相互作用を調節する小分子の同定法を提供する。この観点によれば、捕捉タンパク質を支持体表面に結合させ、そのリガンドおよび少なくとも1つの小分子に暴露する。次いで捕捉タンパク質とリガンドとの間の結合の存在または不在を検出して、小分子の調節作用を確認する。好ましい態様では、同じ細胞経路で作用する捕捉タンパク質のマイクロアレイを支持体表面に結合させ、これら全てのタンパク質に対する小分子の調節作用の概要を同時に得る。
【0012】
更に別の観点では、本発明は支持体表面に捕捉分子を結合させて、全細胞溶解物のような溶液中に含有される細胞オルガネラを捕捉させることによって、細胞事象を研究する方法を提供する。
【0013】
本発明のこれらおよび他の観点は以下の詳細な開示および好ましい態様の説明によって当業者に明らかとなる。
発明の詳細な説明
本発明は一部には、天然に存在する、または人工的に製造した生体高分子のアレイ(特にマイクロアレイ)を製造する新規の方法の発見に依存し、それを使用してサンプル(生物学的サンプルおよび人工サンプルの両方を含む)をスクリーニングし、固定化した結合要素と結合するそれらのサンプル中の分子を同定、単離、または定量してもよい。このため、本発明は生物学的高分子と相互作用する能力のある化合物を同定するための、膨大な数の化合物のハイスループット・スクリーニングを可能にする方法および製品を提供する。
【0014】
本発明は免疫アッセイにおいて特に有意に適用され、これによって抗体および同様の分子を使用する広範かつ効率的なスクリーニングが可能となる。抗体は長い間、タンパク質機能の確認、遺伝子発現の空間時間的パターンの同定、タンパク質−タンパク質相互作用の同定、そしてin vitroおよびin vivoでの表現型ノックアウトによる標的の確認において非常に重要な役割を果たしてきた。しかしながら、個々の抗体は生物学的サンプル由来の個々のタンパク質をモニタリングするのに有用であるのに対し、本発明はハイスループット分析用にフォーマットした抗体、抗体フラグメント、または抗体様結合要素の大型アレイの生成を提供する。この技術によって正常および疾病状態の血清、細胞、および組織由来の多数のタンパク質の広範なプロファイリングが可能となるが、これは有力な診断および薬剤発見の手段となる。
【0015】
本発明のある観点は、(特に捕捉タンパク質または抗体フラグメントの場合)化学リンカーを介して生体分子を固体支持体に結合させ、その分子の生体機能は保持する方法の改善に関する。
【0016】
I .基質/支持体
本発明のマイクロアレイは基質または支持体上に形成する。これらの基質の特性は意図する使用によって種々に変化しうるが、形状、原料、および基質表面の修飾に関する基本的な考慮事項を以下に記載する。
【0017】
A .形状
本発明の基質は本質的にいずれの形状で形成してもよい。基質は実質的に平面(planar)またはフラットな表面を少なくとも1つ有するのが好ましいが、凹凸(indentation)、隆起(protuberances)、階段状、隆線(ridge)、テラス状(terraces)などを含んでもよい。基質はシート、ディスク、チューブ、円錐、球状、凹表面、凸表面、ストランド、ストリング、またはこれらおよび他の幾何学的形状のいずれかを組み合わせた形状であってもよい。いくつかの基質表面を組み合わせて本発明を利用してもよい。一例は、分析物を含有するサンプルを、本発明に従って両表面上に形成したマイクロアレイを有する2つの平面基質表面間に挟むものである。
【0018】
B .原料
種々の原料(有機もしくは無機、または両方の組み合わせ)を本発明の支持体として使用できる。好適な基質原料には、限定される訳ではないが、ガラス、セラミック、プラスチック、金属、合金、炭素、紙、アガロース、シリカ、石英、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリアミド、およびゼラチン、並びに他のポリマー支持体、他の固形物質支持体、またはフレキシブル膜支持体がある。基質として使用してもよいポリマーには、限定される訳ではないが、以下がある:ポリスチレン;ポリ(テトラ)フルオロエチレン(PTFE);ポリビニリデンジフルオライド;ポリカーボネート;ポリメチルメタクリレート;ポリビニルエチレン;ポリエチレンイミン;ポリオキシメチレン(POM);ポリビニルフェノール;ポリラクチド、ポリメタクリルイミド(PMI);ポリアルケンスルホン(PAS);ポリプロピレン;ポリエチレン;ポリヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA);ポリジメチルシロキサン;ポリアクリルアミド;ポリイミド;および種々のブロック・コポリマー。基質は原料(水透過性であってもなくても)を組み合わせて多層状で含有することもできる。基質の好ましい態様は表面Si−OH機能性を有する平らな(plain)2.5 cm×7.5 cmのガラススライドである。
【0019】
C .表面の調製/反応基
リンカーによる結合または結合要素による直接の結合を可能にするために、基質表面に初期処理を行って好適な反応基を生成する必要がある。それらの反応基には以下のような単純な(simple)化学部分がある:アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート、アルデヒド、エステル、エーテル(例えばチオエーテル)、アミド、アミン、ニトリル、ビニル、スルフィド、スルホニル、ホスホリル、または同様の化学反応基。あるいはまた、反応基は更に複雑な部分を含有してもよく、それらには、限定される訳ではないが、以下がある:マレイミド、N−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド、ニトリロトリ酢酸、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル(例えばブロモアセチル、ヨードアセチル)、活性化カルボキシル、ヒドラジド、エポキシ、アジリジン、スルホニルクロリド、トリフルオロメチルジアジリジン、ピリジルジスルフィド、N−アシル−イミダゾール、イミダゾールカルバメート、ビニルスルホン、スクシンイミジルカルボネート、アリールアジド、無水物、ジアゾアセテート、ベンゾフェノン、イソチオシアネート、イソシアネート、イミドエステル、フルオロベンゼン、ビオチン、およびアビジン。それらの反応基を機械的、物理的、電気的、または化学的方法によって基質上に配する技術は当該分野で十分知られており、例えば米国特許第4,681,870号に記載されているが、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0020】
高密度アレイとするために、支持体表面に反応基を高密度で“詰め込む(pack)”必要があり得る。ガラス表面の場合の好ましい方法は、まず強酸のような試薬で表面を“ストリッピング(strip)”し、その後表面に反応基を適用または再適用するものである。
【0021】
ガラス表面の場合、反応基はシラン、Si−OH、酸化ケイ素、窒化ケイ素、第1級アミン、またはアルデヒド基でもよい。アルデヒド含有シラン試薬で処理したスライドは多くの結合要素を固定化するのに好ましく、TeleChem International(Cupertino, CA)から“SuperAldehyde Substrates”の商品名で販売されている。これらのスライド表面上のアルデヒド基はタンパク質上の第1級アミンと容易に反応してシッフ塩基結合を形成する。典型的なタンパク質はその表面上に多くのリジン残基を、そして一般により反応性の高いα−アミンをそのN末端に表示するので、それらをスライドに種々の配位で結合させることができ、それによってタンパク質の種々の側を溶液中で他のタンパク質または小分子と相互作用させることができる。タンパク質のような結合要素をこれらのアルデヒドスライド上に配置した後、ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するバッファーをスライドに適用し、分析物とスライド上の未反応アルデヒド基とのその後の非特異的結合を阻害してもよい。
【0022】
II .リンカー
基質上の反応基の初期処理が終了すれば(必要により)、必要によってリンカー分子を基質の表面に添加して、更なる結合化学に好適となるようにしてもよい。
【0023】
ここで使用するところの“リンカー”という用語は、既に基質上にある反応基と後に固定化する結合要素とを共有結合させる化学部分を意味し、これは基質上の反応基と結合要素間の連続的な連結を形成させる化学結合のバックボーンを有し、そのバックボーンに沿って多数の自由に回転する結合を有する。リンカーは好適な種類の化合物から選択してもよく、有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール、アミンなどのポリマーまたはコポリマーを含んでもよい。例えば、ヒドロキシカルボン酸、アミノカルボン酸、またはジカルボン酸、例えばグリコール酸、乳酸、セバシン酸、またはサルコシンのポリマーまたはコポリマーを使用してもよい。あるいはまた、飽和または不飽和炭化水素、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、糖類などのポリマーまたはコポリマーを使用してもよい。好ましくはリンカーは、結合される結合要素がサンプル溶液中の分子と自由に相互作用して有効な結合を形成できるのに好適な長さである。
【0024】
本発明のリンカーは少なくとも2つの反応基、すなわち基質に結合する第1の反応基および結合要素に結合する第2の反応基を含有する。2つの反応基は同じ化学部分であってもよい。リンカーの少なくとも2つの反応基は基質上の反応基の上に記載した化学部分のいずれかを含んでもよい。また、好ましい第2の基はマレイミド基を含有する。リンカーの第2の基の別の好ましい態様は、ビニルスルホン基である。これらの基の親水性は、バッファー水溶液中で更なるアッセイを行う際に、タンパク質のような分析物による非特異的結合を制限する助けとなると信じられる。
【0025】
リンカーを基質表面に結合させる方法は既に基質上にある反応基および選択されるリンカーによって種々であり、当業者に適宜に考慮されるように、変化する。例えば、リンカーのトリクロロシリル基またはトリサルコキシ基と支持体表面上のヒドロキシル基との間の反応を介してシロキサン結合を形成してもよい。
【0026】
リンカーは分枝または非分枝であってもよいが、リンカーのこの構造的特性、そして他の構造的特性は結合要素の関連機能(例えばリガンド−抗リガンド相互作用)に立体化学的に干渉すべきでない。
【0027】
当業者に既知の保護基を使用してリンカーの末端基の望ましくない反応、または早期の反応を防止してもよい。例えば米国特許第5,412,087号(参照により本明細書に組み込まれる)はリンカーのチオール基上の光によって除去できる保護基の使用について記載している。
【0028】
好ましい態様では、リンカーはBSA分子を含む。それらの態様の一例はマイクロアレイの作製に好適なBSA−NHSスライドである。いくつかの適用には好適であるが、アルデヒド基で機能化し、更にBSAでブロッキングしたスライドは、ペプチドまたは小タンパク質をアレイ化する場合には好適でなく、おそらくこれはBSAが興味の分子を不明瞭にするためである。それらの適用にはBSA−NHSスライドが好ましい。図1Aおよび1Bにそれらのスライドの作製方法を示す。まずBSAの分子単層をガラススライドの表面に結合させる。図1Aに具体的に示すように、ヒドロキシル基を有するガラススライド10をアミノプロピルトリエトキシシランでシラン化し(段階1)、その後N,N’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化する(段階2)。次に、スライド上の活性化したアミノ基をリンカー20(BSA)と共有結合させる(段階3)。次いでBSAの表面をN,N’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化し(段階4)、これによって活性化したカルバメートおよびエステル、例えばN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)基が得られる。図1Bに関連して、BSA上の活性化したリジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸残基は結合要素30(ここでは捕捉タンパク質)上の表面アミンと容易に反応し(段階5)、尿素共有結合またはアミド共有結合を形成する。次いで、残存するBSA上の反応基をグリシンでクエンチングする(段階6)。結果として、結合要素30(ここでは捕捉タンパク質)がリンカー20(ここではBSA分子)を介して支持体10に固定化される。BSAでブロッキングしたアルデヒド機能性を有するスライドに比較して、BSA−NHS基質上に配列させたタンパク質またはペプチドはBSA単層の上部に表示され、溶液中の高分子へアクセスしやすくなる。
【0029】
III .結合要素
本発明の結合要素は種々の異なるタイプの天然に存在する、または合成の分子(生物学的重要性を有するもの(“生体分子”)を含む)のいずれかから選択してもよい。
【0030】
例えば結合要素には天然に存在する分子または分子フラグメント、例えば核酸、核酸類似体(例えばペプチド核酸)、多糖類、リン脂質、捕捉タンパク質(糖タンパク質、ペプチド、酵素、細胞受容体、および免疫グロブリン(例えば抗体、抗体フラグメント)を含む)、抗原、天然に存在するリガンド、他のポリマー、そして上記のいずれかの組み合わせがありうる。また、標準的な化学合成によって、またはスプリット・アンド・プール(split−and−pool)ライブラリーもしくはパラレル合成から生成させる天然産物様化合物を結合要素として利用することも企図される。
【0031】
A .抗体および抗体フラグメント
抗体および抗体フラグメントは結合要素として好ましい候補である。これらには抗原結合フラグメント(Fab)、Fab’フラグメント、ペプシンフラグメント(F(ab’)2フラグメント)、scFv、Fvフラグメント、単一ドメイン抗体、dsFvs、Fdフラグメント、およびダイアボディー(diabodies)、並びに完全長ポリクローナルまたはモノクローナル抗体がある。抗体様フラグメント、例えば修飾したフィブロネクチン、CTL−A4、およびT細胞受容体もここに同様に企図される。マイクロアレイの形成後は、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインを利用して抗体または抗体フラグメントによって認識される特異的な抗原決定基を有する分子をスクリーニングしてもよい。
【0032】
好ましい態様では、細胞の転移事象および細胞表面発現を研究するために、表面受容体の細胞内部移行の引き金となるファージディスプレイされたscFvを大型非免疫ファージライブラリーから直接選択することができ、これはファージ粒子を細胞から回収し、増幅することによって行う。参照:Becerrilら(1999), Biochem Biophys Res Commun. 255(2):386−93(参照により本明細書に組み込まれる)。
【0033】
B .受容体
天然に存在する生物学的受容体、またはそれらの受容体を合成もしくは組換えによって修飾した変異体を本発明の結合要素として使用してもよい。結合要素として使用できる受容体の種類には細胞外マトリクス受容体、細胞表面受容体、および細胞内受容体がある。受容体の具体的な例にはフィブロネクチン受容体、フィブリノーゲン受容体、マンノース6−リン酸受容体、erb−B2受容体、およびEGF(上皮成長因子)受容体がある。
【0034】
C .受容体リガンド
同様に、天然に存在する生物学的受容体リガンド、またはそれらのリガンドを合成もしくは組換えによって修飾した変異体を結合要素として使用し、それらの特異的結合パートナーまたは他の非天然型結合パートナーをスクリーニングしてもよい。それらのリガンドの種類にはホルモン、成長因子、神経伝達物質、抗原があり、またファージディスプレイすることができる。
【0035】
D .基質/リンカーへの結合のための修飾
当業者に明白なように、結合要素を修飾して共有結合または非共有結合を介する基質表面上の反応基または基質に結合したリンカーの第2の反応基への結合を容易にしてもよい。それらの修飾の例として、求核性S−、N−、およびO−含有基を付加してリンカーへのマイケル付加反応を介する固体支持体への結合要素の結合を容易にしてもよい。
【0036】
結合要素の結合親和性を保持するために、結合要素を修飾して、結合要素の同族リガンドとの相互作用に関与する領域から分離した領域で支持体基質に結合するようにするのが好ましい。結合要素が第1の末端でそのリガンドに結合する場合、結合要素を第2の、もしくは反対の末端、または末端間のいずれかの位置で支持体へ結合させることがそのような解決策となりうる。結合要素がscFvである好ましい態様では、本発明はscFvを求電子性リンカー(例えばマレイミド基)との結合を介して、scFvの抗原結合活性に干渉することなく、ガラススライド表面に結合できるような修飾方法を提供する。実施例C(i)に詳述するこの方法によれば、まずscFvを操作してそのカルボキシ末端がシステイン残基を含有するようにし、これはその後マレイミド基のような求電子性リンカーと共有結合を形成することができる。同様に、結合要素のN−末端を操作して支持体表面への結合のための反応基を含有させることができる。
【0037】
E .基質/リンカーへの結合
結合要素を基質表面上またはリンカー上の反応性末端基に結合させる方法にはチオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、カルバメート結合、尿素結合、エステル結合、カーボネート結合、エーテル結合、ヒドラゾン結合、シッフ塩基結合のような結合、および(例えばイオン性または疎水性相互作用を介する)非共有結合を形成する反応が含まれる。反応の形態は当然、基質/リンカーおよび結合要素の両方にある可能な反応基に依存する。
【0038】
以下の実施例の項に記載するように、マイケル付加を利用してガラススライドに化合物を結合させてもよく、平らなガラススライドを誘導体化して、マレイミド基で高密度に機能化した表面を得てもよい。次いでチオール基を含有する化合物(例えばカルボキシ末端にシステインを含有するように修飾したscFv)をマレイミドと反応させてチオエーテル結合を形成してもよい。
【0039】
IV .マイクロアレイの形成
ある観点では本発明は、基質上に直接、またはリンカーを介して固定化した結合要素のアレイ(高密度マイクロアレイを含む)の作製法を提供する。本発明の方法によれば、非常に高密度の(cm2当たり100スポットを超える、好ましくは1,000スポットを超える、そして更に好ましくは2,000スポットを超える密度の)マイクロアレイを、高密度の反応基を生成するように機能化した、または反応基を有する高密度のリンカーの付加によって機能化した支持体表面上に生体分子を結合させることによって生成することができる。
【0040】
A .スポッティング
本発明のマイクロアレイは多くの方法によって製造してもよく、それらには少量の反応物を基質表面上の特定の位置に施与する“スポッティング”がある。スポッティングの方法には、限定される訳ではないが、以下がある:マイクロフルイディクス・プリンティング、マイクロスタンピング(例えば米国特許第5,515,131号および米国特許第5,731,152号参照)、マイクロコンタクト・プリンティング(例えばWO96/29629 号参照)、およびインクジェット・ヘッド・プリンティング。一般に、分配装置はサンプル沈着量を制御するためのキャリブレーション手段を含み、支持体表面に関してサンプルを移動および配置させるための構造を含んでもよい。
【0041】
( i )容量/スポットサイズ
結合要素毎のアレイに分配される液体の容量は意図されるアレイの使用法および利用できる装置によって変化する。好ましくは1回の分配での容量は100 nL未満、より好ましくは10 nL未満、そしてもっとも好ましくは約1 nLである。得られるスポットのサイズも同様に変化し、好ましい態様では、これらのスポットは直径20,000μm未満、より好ましくは直径2,000μm未満、そして最も好ましくは直径約150−200μmである(平方センチメートル当たり約1600スポットとなる)。
【0042】
( ii )粘性の添加物
1個の結合要素のスポットに相当するアレイのスポットサイズを、溶液の粘性を高めるグリセロールまたはトレハロースのような媒質の添加によって低減し、それによって溶液の拡散を防止してもよい。親水性基質表面上の疎水性境界は、アレイを含むスポットのサイズを制限する役割を果たせる。
【0043】
結合要素の溶液に湿潤剤を添加することによって、基質表面上に生成した後のマイクロアレイの脱水を効果的に予防してもよい。酸化、またはタンパク質の場合は変性と同様に、脱水によって結合要素に化学的または立体化学的変化が起こりうるので、湿潤剤の添加によってマイクロアレイを保存および安定化し、scFvのような結合要素の機能性を保持することができる。例えば好ましい態様では、scFvを40%グリセロールを含有するリン酸バッファー(PBS)溶液中でマレイミド誘導体化したガラスに結合させる。グリセロールによって持続的に水分が補給され、変性が防止される。
【0044】
( iii )ブロッキング剤
ブロッキング剤の溶液をマイクロアレイに適用して、結合要素に結合していない反応基による非特異結合を防止してもよい。例えばウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、または脱脂乳の溶液をブロッキング剤として使用し、その後のアッセイにおけるバックグラウンド結合を低減してもよい。
【0045】
( iv )ロボット工学
好ましい態様では、高精度コンタクト・プリンティングロボットを使用して少量の溶解した結合要素をマイクロタイタープレートのウェルから採取し、約1 nLの溶液を基質(例えば化学的に誘導体化したガラス顕微鏡スライド)の表面上の規定の位置に反復して運搬する。それらのロボットの例にはGMS 417アレイヤー(Affymetrix(Santa Clara, CA)から販売されている)およびスプリット・ピン・アレイヤー(split pin arrayer)(http://cmgm.stanford.edu/pbrownからダウンロードできる説明書に従って行う)がある。化学的に誘導体化したガラス顕微鏡スライドはカスタムメイドのスライドサイズの反応容器を使用して調製するのが好ましく、これによってスライドの片面に均一に溶液を適用することができ、これについては実施例の項に示し、検討する。これによってスライド上に化合物の超小型のスポットが形成される。しかしながら、当業者に評価されるように本発明は1 nL容量の溶液の運搬、特定のロボット装置の使用、または化学的に誘導体化したガラススライドの使用に限定されるものではなく、また、ピコリットルまたはそれ以下の容量を運搬できるような別の運搬手段を使用することもできる。従って、高精度アレイロボットに加え、化合物を運搬するための他の手段を使用することができ、それには、限定される訳ではないが、インクジェットプリンター、圧電プリンター、および小容量のピペッティング・ロボットがある。
【0046】
B . in situ 光化学
基質表面上の分子のアレイまたはマイクロアレイの形成において、in situ光化学を光活性化反応基と組み合わせて使用してもよく、この基は基質表面上、リンカー上、または結合要素上に存在してもよい。それらの光活性化基は当該分野で周知である。
【0047】
C .標識
結合要素を蛍光、放射性、染色、および他の物理的または化学的な標識またはエピトープでタグ化してもよい。ある好ましい態様では標識の定量が可能であり、これはその後のアッセイに大きな利点となる。
【0048】
好ましい態様では、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマー部分を含有する蛍光色素を使用する。
V .アッセイサンプル
固体支持体上での結合要素のマイクロアレイの形成の際、大量のサンプルを結合アッセイのために支持体表面に適用してもよい。それらのサンプルの例を以下に示す:
A .体液/組織および生検サンプル
本発明のマイクロアレイを使用してアッセイするサンプルは種々の生理学的、環境、または人工の供給源から得てもよい。特に、生理学的サンプル、例えば患者または生体の体液をアッセイサンプルとして使用してもよい。それらの体液には、限定される訳ではないが、以下がある:唾液、粘液、汗、全血、血清、尿、生殖液(genital fluids)、糞便、骨髄、血漿、脊髄液、心膜液、胃液、腹腔液(abdominal fluids)、腹水、胸膜液、および他の身体部分からの抽出液、そして他の腺からの分泌液。あるいはまた、培養液中で増殖させた細胞から得た生物学的サンプルを利用してもよい。それらのサンプルには細胞物質の溶解および分画によって得られた上清、全細胞溶解物、または細胞画分がある。
【0049】
B .細胞抽出物
細胞抽出物およびその画分(生物学的存在から直接得たものおよび人工的環境で増殖させたものを含む)を使用して特定の結合要素に結合する細胞溶解物中の分子をスクリーニングすることもできる。
【0050】
C .正常サンプルと疾病サンプル
上記のサンプルのいずれかを正常な、または疾病を有する生物学的存在からの細胞集団から誘導してもよい。
【0051】
D .処理サンプルと未処理サンプル
上記のサンプルのいずれかを、有害または有益のいずれかであると信じられる、または疑われる化合物または他の処理により処理をした、または処理していない細胞集団から誘導してもよく、処理および非処理集団間の差異を使用して処理の効果を評価してもよい。
【0052】
E .標識
所定のサンプル中の特定の分子を修飾して後の検出を可能にしてもよく、これは当業者に知られる技術、例えば蛍光、放射性、染色、および他の物理的または化学的標識の使用によって行う。好ましい態様では、親水性ポリマー部分(例えばポリエチレングリコール(例えばフルオレシン−PEG2000−NHS))を含有する蛍光色素を使用する。標識はサンプル中の分析物を直接標識するか、または分析物を認識する親和性タグを標識するか(間接標識)によって行うことができる。異なる蛍光色素でサンプル分析物を直接標識することにより、同一スポットから複数のアッセイを行うことが可能となる(例えば標的タンパク質の発現レベルおよびリン酸化レベルの測定)。分析物がファージディスプレイ・リガンドである場合、リガンドと結合要素のマイクロアレイとの間の結合を検出するためにファージをあらかじめ標識してもよい。
【0053】
直接標識法では、長い間、サンプルの過剰標識が深刻な問題であると認識されてきた。タンパク質の過剰標識はタンパク質複合体の凝集を引き起こす可能性があり、これによって非特異的染色が起きる傾向がある;また、抗体のエピトープ認識機能の崩壊によって抗体の抗原に対する特異性が低下し、これによってシグナルの喪失が起こりうる。当該分野で周知のように、過剰標識を低減するために、標識過程の反応時間を短縮するか、または基質:標識比を増加させる必要がある。過剰標識の解決策は、まず全タンパク質を消化してペプチドとし、その後ペプチドの末端を標識し、これによって内部エピトープの標識を回避することである。このように、過剰標識を心配することなく標識過程を完了させ、従って研究者は標識過程にわたってより完全に制御しうる。更に、ペプチド上の可能性のある標識部位が既知である場合は、内部エピトープを認識する親和性試薬を介してペプチドを捕捉した後、標識されたペプチドを定量することが可能である。この方法を適用して、細胞抽出物中の全タンパク質から消化した標識されたペプチドを定量し、タンパク質発現レベルの定量分析を行う。
【0054】
好ましい態様では、全タンパク質をトリプシンで消化し、その後スクシンイミジルエステル色素(例えばCy3、Cy5、またはAlexa色素)によって標識を行う。スクシンイミジルエステル色素は第1級アミン(例えばリジン中のもの)を標識する。トリプシンはリジンの後で開裂し、C−末端にリジンを有するペプチドを生成する。従って、トリプシン消化から得られるペプチドは2つの種類に分けられる:リジンを含有せずN−末端に第1級アミンを有するもの、およびC−末端にリジンを有し、従って両末端に第1級アミンを有するもの。いずれのペプチドも内部リジンを有しない。結果として、スクシンイミジルエステル色素は内部エピトープを標識することなく、トリプシンペプチドをその末端でのみ標識する。
【0055】
別の態様では、トリプシン以外のプロテアーゼを使用して全タンパク質を消化してもよく、この場合も捕捉するペプチドが内部リジンを含有しない限りスクシンイミジルエステル色素を標識に使用する。そのように、ここでも選択されたペプチドの末端のみが標識される。それらのペプチドを優先的パニングペプチド(preferential panning peptide)として使用してもよい。優先的パニングペプチドを利用するために、まずペプチドに対して免疫グロブリンを産生させる。次に(例えば全細胞溶解物からの)サンプルを特定のパニングペプチドを生成するような単一のプロテアーゼまたは複数のプロテアーゼの組み合わせで消化し、ペプチドのライブラリーを得る。次いでこれらのペプチドをスクシンイミジルエステル色素で完全に標識する。大過剰量の反応性標識試薬を使用して非リジン含有ペプチドの完全な標識を確実にしてもよい。次いで、標識されたペプチドを免疫グロブリンに適用して捕捉する。
【0056】
優先的パニングペプチド上の標識の量は既知であるため、アフィニティー捕捉後に検出される標識シグナルの量によって所定のサンプル中のそれらのペプチドの量を定量することができる。ある標的タンパク質のプロテアーゼ消化から得られるそれらのパニングペプチドの数がわかれば、その数を容易にサンプル中の標的タンパク質の量に換算することができる。リジン以外のアミノ酸をこの方法で使用するための標的とすることもできる。例えば、限定された数の天然または付加したシステインを含有するタンパク質を選択または構築して、還元されたチオールを介して、マレイミドが結合した色素(例えばマレイミド結合したAlexa488(Molecular Probes、Eugene, Oregonから市販されている))で標識してもよい。
【0057】
抗原分析物の間接標識を、後の検出のために(例えば放射性原子、蛍光分子で)標識した2次抗体または抗体フラグメントを使用してサンドイッチ方式で行ってもよい。好ましい態様では、抗原に対する蛍光標識した2次抗体によって抗体のマイクロアレイに結合する抗原を検出し、抗原を標識することは不要である。更なる好ましい態様では、2次抗体は抗体フラグメントをディスプレイする標識したファージ粒子である。M13のようなファージを使用する標準的なファージディスプレイ技術を使用してscFvのような抗体フラグメントを含むファージ抗体をしてもよい。これによって、ファージディスプレイ抗体ライブラリーからのサンドイッチ検出のための試薬の、相対的に簡易および迅速な製造が可能となる。ファージ抗体が、固定化した捕捉抗体が抗原上で認識するものとは異なるエピトープを認識することを確実にするために、ファージディスプレイライブラリーからの選択を以下のような方法で実施してもよい:(1)捕捉の目的でマイクロアレイに固定化したのと同一の抗体で試験管をコーティングする、(2)試験管をブロッキングし、抗原を添加し、コーティングした抗体で捕捉する、(3)洗浄後、ファージ抗体ライブラリーを試験管内でパニングする。単離したファージ抗体(またはポリクローナルファージ抗体)は捕捉抗体が認識するエピトープとは別のエピトープとのみ結合し、従ってサンドイッチ検出方式に理想的である。
【0058】
F .接触時間
上記の方法に従って調製した表面にサンプルを暴露して結合アッセイを行うことができる。まずそれらの表面をサンプル溶液に暴露し、次いでそれぞれの具体的なアッセイに好適な時間インキュベートするが、これは予想される結合反応に必要とされる時間に大きく依存する。この過程を反復して、同時にまたは連続的に複数のサンプルを適用することができる。一般に複数サンプルの連続的な適用には間に洗浄を行う必要がある。
【0059】
VI .結合アッセイ
上記の方法に従って調製した表面を使用して、表面に結合した結合要素に高い親和性を有するサンプル中の分子をスクリーニングすることができる。特異的結合は、サンプル中の標的分子を標識する方法によって(もしあるなら)、多くの異なる方法で検出および測定してもよい。一般的な例はオートラジオグラフィーの技術を使用して、放射性同位元素であらかじめ標識した分子の結合を検出するものである。
【0060】
好ましい態様では、蛍光色素(Cy5)を使用して所定のサンプル中のタンパク質を標識した後、サンプルを機能性scFvのマイクロアレイをプリントしたスライド表面に適用した。インキュベーションおよび洗浄後、スライド表面を乾燥し、分子動力学STORMまたはArrayWorxTM光学測定器(Applied Precision, Seattle, WA)でイメージ化した。
【0061】
別の好ましい態様では、CY3のような蛍光色素で標識した2次抗体を、結合にあずかる第1の抗体を後に検出するために使用した。
当該分野で知られる種々の検出方法(いくつかをあげると、例えば質量分析、表面プラスモン共鳴(surface plasmon resonance)、および光学分光法)を本発明に使用して、結合標的が全く標識されなくても結合を検出することができる。
【0062】
VII .アッセイ結果の分析
A .サンプル中の存在/不在の検出
本発明を使用して生物学的サンプルにおける、興味の分子への結合パートナーの存在または不在を確認することができる。
【0063】
B .サンプル間の比の測定
異なる細胞集団における(例えば正常および疾病状態間での)遺伝子およびタンパク質発現の比を比較によって計算できる。
【0064】
VIII .適用/実用
本発明によって研究できる生物学的に重要な分子には、限定される訳ではないが、シグナル伝達、アポトーシス、二量体化、遺伝子調節、細胞周期および細胞周期チェックポイント、そしてDNA損傷チェックポイントに関与するものがあるので、本発明は生物科学および医学の研究に広く適用できる。
【0065】
通常の技術を有する当業者にも評価されるように、タンパク質アレイは、タンパク質と生体高分子以外の別な種類の分子との間の相互作用を検出するのにも有用であり得る。例えば本発明のアレイは、いくつかあげると触媒、物質研究、情報保存、分離科学の分野でも有用であり得る。
【0066】
A .標的の発見
通常の技術を有する当業者に評価されるように、非常に高い空間密度を有するタンパク質のアレイの生成によって、所定のタンパク質集団および生体高分子間に起こる結合および/または活性化事象の検出が容易になる。従って本発明は、ある観点では、分子パートナーを同定し、生物学的に重要な高分子の結合標的を発見する方法を提供する。パートナーは、興味のある特定の高分子に結合して興味のある生体高分子を活性化または阻害する能力のあるタンパク質であってもよい。一般に、この方法は以下を含む:(1)上記のような1つ以上のタンパク質のアレイを提供し、ここでタンパク質のアレイはcm2当たり少なくとも1,000スポットの密度を有し;(2)アレイを1つ以上の型の興味のある生体高分子と接触させ;そして(3)特定のタンパク質および高分子パートナー間の相互作用を測定する。
【0067】
特に好ましい態様では、本発明のアレイを使用して遺伝生化学の研究のための化合物を同定する。伝統的な遺伝学では、DNA配列における不活性化(例えば欠失または“ノックアウト”)または活性化(例えば腫瘍発生性)変異のいずれかを使用して、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の機能を研究する。遺伝生化学はそのかわりに小分子の使用を含むが、この小分子はそれらが結合するタンパク質の機能を変更し、それによってタンパク質の機能を不活性化または活性化するものである。当然、これはもっとも最近認可された小分子薬剤の作用の基礎である。本発明は、“チップ様”技術を開発して小分子および興味のある特定のタンパク質の間の相互作用の迅速な検出を確実にすることを含む。本発明の方法および組成物を使用して、遺伝生化学の研究に使用するための小分子リガンドを同定することができる。通常の技術を有する当業者に認識されるように、本発明の組成物および方法を、高密度のタンパク質フォーマットを必要とする他の目的に利用することができる。
【0068】
B .シグナル変換
本発明で実施される結合アッセイの別の好ましい態様は、小分子によるタンパク質−タンパク質相互作用の変調(modulation)の研究である。これらのアッセイでは種々の分子による同族の結合の促進または競合のいずれかを測定し、種々の条件下での結合動力学の観点の理解を深める。代表的な態様では、捕捉タンパク質を支持体表面上に結合させてマイクロアレイを成し、同族リガンドを添加して捕捉タンパク質に結合させる。捕捉タンパク質およびその同族リガンド間の結合をモニタリングし、薬剤候補となりうる小分子が存在する場合としない場合とで比較する。好ましい態様では、捕捉タンパク質の、種々の小分子の作用を受ける種々のリガンドとの種々の相互作用を、マイクロアレイチップ上で多重様式で調査する。
【0069】
タンパク質相互作用は多くの場合、結合モチーフと呼ばれる場合もあるドメインを通して起こる。タンパク質相互作用の制御に有効な小分子が作用すると最も考えられるのはこれらの領域においてである。しかしながら、ファミリー内のタンパク質は結合モチーフの形成に関与する相同配列を共有する傾向があり、これらのモチーフを含有するタンパク質は多くの場合、同様の機能を有する。それらのタンパク質機能を制御する薬剤のスクリーニングにおける問題はこれらのスクリーニングにおいて特異性を得ることであり、これはタンパク質の結合モチーフファミリーのあいだで標的が同様の構造であり、同様の結合特性を有するためである。ここに開示するタンパク質マイクロアレイ技術によって、多数のモチーフ含有タンパク質ファミリーメンバーを制御するための小分子の特異性の測定の段階が効率的かつ容易に反復できるものになり、薬剤スクリーニングの工程が非常に容易になる。
【0070】
代表的な態様では、細胞アポトーシスに影響を及ぼすことが知られているBcl−2ファミリーの制御を研究する。これらのタンパク質は4つのBcl−2相同領域(BH1−4)の組み合わせと相同性を共有する。Bcl−2ファミリータンパク質は、ミトコンドリアおよび小胞体で膜の挙動およびイオンチャンネル機能を制御することによって細胞をアポトーシスから保護するか、またはアポトーシスを促進するように機能する。抗アポトーシスファミリーのメンバーであるBcl−2、Bcl−XL、およびMcl−1は4つのドメイン全てを含有する。プロアポトーシス(pro−apoptotic)メンバーの最大の群であるBad、Bik、Bid、Bag−1、HRK、およびNoxaはBH−3ドメインのみを含有し、プロアポトーシスタンパク質であるBaxおよびマルチドメインプロアポトーシスタンパク質はBH−1、BH−2、およびBH−3ドメインを含有する。
【0071】
本発明の方法を使用してアポトーシス制御タンパク質のファミリー全体の機能を制御する小分子をスクリーニングすることができる。それらの小分子はBH−3タンパク質の機能を擬態して薬剤候補として役立ちうる。図3Aおよび3Bに関連して、Bcl−2ファミリーのアポトーシス制御タンパク質からの組換え融合タンパク質を標準的な方法で調製し、上記のようなBSA−NHSガラススライドまたはアルデヒド誘導体化ガラススライド10上にリンカー20を介して結合要素30としてプリントしてマイクロアレイとしてもよい。これらのタンパク質(例えば完全長Bcl−XLタンパク質)のリガンド80を、小分子90(例えばBcl−2ファミリータンパク質BAKからのBH−3含有ペプチドまたはBH−3含有ペプチドを擬態する小分子)の不在下または存在下で添加してもよい。リガンド80を蛍光色素(例えばCy5)で標識してもよい。プリントされるタンパク質、リガンド、または小分子の濃度は単独で、または他と組み合わせて変化しうる。その後スライドをArrayworxスキャナーのような光学測定器を使用して測定し、そして/または市販の質量分析チップを使用して質量分析によって確認してもよい。結合したリガンドから得られるシグナルの増加または減少を使用して小分子の制御の役割が亢進的制御か抑制的制御かに関わらず、図表化することができる。本発明の方法を使用して、複数の捕捉分子、複数のリガンド、および複数の小分子を単一のアレイ支持体(例えば96ウェルプレート)上で並行してスクリーニングすることができ、薬剤スクリーニングの効率が非常に向上する。より詳細な例は実施例のE(iii)に見られる。
【0072】
シグナル変換の研究における本発明の適用の別の例は、マルチドメインを含有するBcl−2ファミリーメンバーのBH−4領域を介するアポトーシス経路においてタンパク質−タンパク質結合を阻害する小分子のスクリーニングである。
【0073】
C .タンパク質発現
現在まで、標識した細胞抽出物におけるマイクロアレイに基づくタンパク質の検出に関する報告は発表されていない。細胞表面タンパク質の標識および検出によって複数の細胞表面抗原の並行したプロファイリングが可能となる。細胞表面分子のプロファイリングにおける技術水準はフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によるものであり、現在は1つのサンプルで2−5個の異なる抗原をプロファイリングできる。理論的には抗体アレイによって無数の抗原の検出が可能である。更に、抗体アレイは細胞内タンパク質およびタンパク質修飾(例えばリン酸化)を発現と並行して検出できる可能性を有する。
【0074】
代表的な態様では、c−ErbB2、EGFR、およびトランスフェリン受容体のような細胞表面タンパク質に対するモノクローナル抗体を、GMS417アレイヤーによってBSA−NHSスライド上に配列させる。類表皮ガン細胞系A−431または乳ガン細胞系SK−BR−3のようなガン細胞系からの生きた細胞をサンプル細胞として使用してもよい。好ましくは細胞表面タンパク質を、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマー部分を含有し、良好な特異性を示し、低バックグラウンドであり、細胞内のタンパク質を標識しない色素で標識する。それらの色素の一例はShearwaterから販売されているフルオレセイン−PEG2000−NHS色素である。標識および洗浄した後、細胞を溶解する(例えばSDS中で)。次いで、総標識タンパク質を抗体マイクロアレイ上でインキュベートして結合を起こさせ、その後スライドを光学測定器でスキャニングする。結果として、A−431細胞系はEGFRを過剰発現するがErbB2はしないことが確認された。同様に、SK−BR−3細胞系はErbB2を過剰発現するがEGFRはしないことが確認された。
【0075】
D .翻訳後修飾
タンパク質機能は多くの場合、(いくつかをあげると)ミリストイル化(myristoylation)、ゲラニル−ゲラニル化、もしくはファルネシル化によって得られるような糖複合体、脂質アンカーの添加のような翻訳後修飾によって、またはリン酸化によって制御される。リン酸化または脱リン酸化によるタンパク質機能の制御は細胞のシグナル変換の中核をなす。
【0076】
本発明の方法を使用して翻訳後修飾事象の研究またはリン酸化部位の同定ができる。好ましい態様では、scFvのような抗体フラグメントをマトリックス支援レーザー脱離イオン化(Matrix−Assisted Laser Desorption/Ionization;MALDI)チップにプリントしてタンパク質中の既知のリン酸化部位、および疑いのあるリン酸化部位のリン酸化を検出する。反応性表面であるMALDI質量分析表面へのタンパク質の結合は米国特許第6,020,208号に記載されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。チップはCiphergen Biosystems(Freemont, CA)から市販されている。代表的な態様では、アポトーシスタンパク質Bcl−2、Bad、およびカスパーゼ9に対するリン特異的抗体を反応性表面MALDIチップに結合させ、これらのタンパク質のリン酸化されたフラグメントの選択的捕捉に使用する。チップを飛行時間型質量分析を使用して、質量を分析することができる。
【0077】
本発明の方法は更に、質量分析と合わせて組換え1本鎖抗体(scFv)を使用し、既知または未知のリン酸受容残基上におけるリン酸化事象の発生を検出する新しい方法を提供する。この方法は近接リン親和性マッピング(proximal phospho−affinity mapping)と呼ばれており、作製が困難であることが知られているIMACの使用またはリン特異的抗体の使用によらない別の方法として役立つ。
【0078】
図2に関連し、この方法の態様は組換え1本鎖抗体(scFv)、ポリクローナル抗体、またはモノクロール抗体30を使用するが、これはリン酸化部位70そのものの代わりに、リン酸化部位70がリン酸化について確認されているか、またはその疑いがあるかに関わらず、部位70に近接する同一抗原上のエピトープ50を認識するように設計されている。エピトープ50は、エピトープ50とリン酸化部位70との間の距離がリン酸化事象によって抗体認識が妨害されないようなものである限り、5−10アミノ酸程度まで近接していてもよい。それらの抗体または抗体フラグメント30(リンカー20を介して支持体表面10に結合している)は抗原(例えばトリプシンペプチド)がリン酸化されているかいないかに関わらず、抗原60を認識する。代表的な態様では、トリプシンもしくはV8のようなプロテアーゼを使用して、またはCNBrのような非酵素法によってペプチドを生成する。これによってペプチドフラグメントが生成され、これはその独自のサイズによって同定できる。これらのフラグメントの中に既知の、または予測されるリン酸化部位を含有する標的フラグメント60がある。1本鎖抗体または伝統的な抗体を、標準的なパニング方法を使用して、トリプシンフラグメント60中のリン酸化部位70に近接するエピトープ領域50に相当する合成ペプチドに対してパニングまたは免疫化する。エピトープ50はわずか3−7アミノ酸から成る。生成される抗体または抗体フラグメントをMALDI反応性チップに結合させた捕捉分子として使用してもよい。次いでチップを使用して、リン酸化を示す特徴的な質量変化を検出してもよい。この方法によって並行した精製/同定およびリン酸化の分析が可能となるため、リン酸化のスクリーニングための価値のある検出手段となる。また、この方法に従って生成される抗体または抗体フラグメントはリン酸化状態および非リン酸化状態のいずれでも標的ペプチドを認識するので、この方法はリン酸化に影響を及ぼす事象および条件の研究にも有用である。
【0079】
特に好ましい態様では、ペプチド60を以下のように選択する:まず、タンパク質の配列情報を含有するデータベースでサーチしてキナーゼ基質のコンセンサス配列を標的タンパク質中に配する。次いで、種々のプロテアーゼの消化マップの比較によってそれらのコンセンサス配列を含有するペプチドを選択する。約20アミノ酸のペプチドが好ましい。最後に選択したペプチド上のキナーゼ基質コンセンサス配列以外のエピトープを選択して抗体または抗体フラグメントを産生させる。
【0080】
E .細胞オルガネラ
本発明の方法を使用して全細胞抽出物または全細胞抽出物の画分からの細胞オルガネラを捕捉することもできる。好ましい態様では、ミトコンドリア膜と独自に会合する電圧依存性アニオンチャンネル(“VDAC”)受容体を認識する抗体を前述のようにプリントした後、緑色蛍光を結合させたチトクロームc発現ミトコンドリアを捕捉させる。電位差特性を有する色素を使用して無傷の電圧グラジエントを有するミトコンドリアを特異的に標識することができる。異なる状態の細胞からの捕捉されたミトコンドリアまたは他のオルガネラの検出を使用してアポトーシスまたは他の細胞事象の発生を示すことができる。
【0081】
F .その他
本発明の方法を他の適用、例えば組織タイピング、疾病診断、および治療の評価に使用してもよい。遺伝的障害が明らかになりうる患者からの生物学的サンプル(WO89/11548号。参照によって本明細書に組み込まれる)を本発明に使用してもよい。同様に、本発明を使用して所定のサンプルにおけるタンパク質発現の異常、抗原または毒物の存在を検出することができる。更に、本発明の方法を使用して、薬剤、医薬リード化合物、または環境因子の変化への暴露に対する生体、組織、または個々の細胞からの応答を評価することもできる。
【0082】
実施例
A .基質表面の調製
( i )ガラススライドのストリッピングおよび反応基の再充填の方法
好ましい方法の一例は以下の通りである:まず平らなガラススライド(例えばVWR Scientific Products)をピラニア(piranha)溶液(濃H2SO4および30% H2O2の70:30 v/v 混合液)中、室温で12時間洗浄する。(注:“ピラニア”溶液はいくつかの有機物質と激しく反応するので、十分注意して操作すべきである)。水で完全に洗浄した後、スライドをシラン溶液(例えば95%エタノール中の3−アミノプロピルトリエトキシシランの3%溶液)で処理する。また、スライドの処理の前に、シラン溶液を少なくとも10分間撹拌して加水分解およびシラノール形成をさせてもよい。次いでスライドをエタノールまたは同様の溶液に軽く浸漬し、遠心分離して過剰のシラノールを除去する。その後、吸収されたシラン層を硬化させる(例えば115℃で1時間)。冷却後、スライドをエタノールまたは同様の溶液で洗浄して未結合の試薬を除去する。
【0083】
単純な半定量的方法を使用してスライド表面上のアミノ基の存在を確認することができる。アミノ誘導体化したスライドを5 mLの50 mM 重炭酸ナトリウム(pH8.5)で簡単に洗浄する。その後スライドを、0.1 mMのスルホ−スクシンイミジル−4−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−ブチレート(s−SDTB;Pierce, Rockford, IL)を含有する50 mM 重炭酸ナトリウム(pH8.5)5 mLに浸漬し、30分間激しく撹拌できる。(s−SDTB溶液の調製は3.03 mgのs−SDTBを1 mLのDMFに溶解し、50 mM 重炭酸ナトリウム(pH8.5)で50 mLに希釈して行う)。30分間インキュベートした後、スライドを20 mLの蒸留水で洗浄し、その後5 mLの30%過塩素酸で処理することができる。橙色の溶液となれば、これはスライドがアミンでうまく誘導体化されたことを示す;未処理のガラススライドでは色の変化が見られない。酸処理によって遊離される4,4’−ジメトキシトリチルカチオン(E498nm=70,000 M−1cm−1)の定量はおおよそnm2当たり2アミノ基の密度を示す。
【0084】
B .基質へのリンカーの付加
( i )リンカーとしての BSA
ウシ血清アルブミン(BSA)の固定化層の表面上に活性化されたアミノ基およびカルボキシル基をディスプレイするBSA−NHSスライドを以下のように製作した:10.24 gのN,N’−ジスクシンイミジルカーボネート(100 mM)および6.96 mlのN,N’−ジイソプロピルエチルアミン(100 mM)を400 mlの無水N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。30枚のポリリジンスライド(例えばCMT−GAPスライド(Corning Incorporated, Corning, NY))はその表面にアミノ基をディスプレイするが、これをこの溶液に室温で3時間浸漬した。これらのスライドを95%エタノールで2回洗浄し、その後1% BSA(w/v)を含有するリン酸バッファー溶液(PBS)(pH7.5)400 mlに室温で12時間浸漬する。スライドを更にddH2Oで2回、95%エタノールで2回洗浄し、200 gで1分間遠心分離して過剰の溶媒を除去した。次いで100 mMのN,N’−ジスクシンイミジルカーボネートおよび100 mMのN,N−ジイソプロピルエチルアミンを含有するDMFの400 mlにスライドを室温で3時間浸漬した。スライドを95%エタノールで4回洗浄し、上記のように遠心分離してBSA−NHSスライドを得た。スライドはデシケーター中で真空下、室温で保存し、2ヶ月まで顕著な活性の喪失が見られなかった。
【0085】
( ii )リンカーとしてのマレイミド( malemido )
マレイミド誘導体化したスライドを以下のように製造した:平らなガラススライドの表面を実施例A(i)に記載するように“充填”(例えば再シラン化)した後、得られたスライドをスライドサイズのポリジメチルシロキサン(PDMS)反応容器に移した。それぞれのスライドの片面を50 mM重炭酸ナトリウムバッファー(pH8.5)中の20 mM N−スクシンイミジル3−マレイミドプロピオネートで3時間処理した(この溶液の調製は、N−スクシンイミジル3−マレイミドプロピオネートをDMFに溶解し、バッファーで10倍に希釈して行った)。インキュベーション後、プレートを蒸留水で数回洗浄し、遠心分離で脱水し、室温で真空下、更なる使用まで保存した。得られたスライド表面はマレイミド末端を有する。
【0086】
C .結合要素の調製
( i )システイン標識した scFv の製造および精製
scFv C6.5はヒト腫瘍抗原c−erbB−2の細胞外領域に1.6×10−10 MのKdで結合する。抗体をSchierら(1996), J. Mol. Biol. 255(1):28−43に記載されるようなアフィニティー選択法を使用して単離した。
【0087】
その後scFv C6.5の遺伝子をpUC−119−(Hexa−His)−Cys発現ベクターにサブクローニングし、これによってscFvのCOOH−末端にヘキサ−Hisタグ、次いで1個のシステインが付加された。タンパク質を発現させ、固定化した金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用して精製した。C6.5の結合親和性変異体を相補的結合領域(CDR)の変異誘発によって作製し、誘導変異体の親和定数[C6.5ML 3−4(Kd=3.4×10−9)およびC6.5 G98(Kd=1.6×10−9)]をBiaCoreを使用して測定した(Schierら, 1996bに記載される)。システインタグを付したscFv C6.5、C6.5 ML3−4、およびC6.5 G98を使用してガラス表面に化学的に結合させたscFvによるリガンドの捕捉を証明した。これらのscFvのCOOH末端システインの還元されたスルフヒドリルによってチオールが生成され、これを使用してマレイミド基で機能化したガラス表面にscFvを結合させることができる。
【0088】
( ii )マレイミドリンカーにコンジュゲートさせるための scFv の還元
精製したscFvを5 mMシステアミン(SIGMA)を使用して25℃で1時間還元し、P10スピンカラムを使用してリン酸バッファー溶液(PBS)(pH7.0)に交換した。
【0089】
D .マイクロアレイを使用するアッセイ
( i )蛍光のスキャニングスライド
Array WoRoxTMスライドスキャナー(AppliedPrecison, Issaquah, WA)を使用してスライドをスキャニングした。スライドをピクセル当たり5μmの解像度でスキャニングした。入射光および放射光のいずれにもダブルフィルターを使用した。フルオレセインの蛍光はFITC/FITC 励起/放射フィルターセットを使用して観察し、Cy3の蛍光はCy3/Cy3 励起/放射フィルターセットを使用して観察し、Cy5の蛍光はCy5/Cy5 励起/放射フィルターセットを使用して観察した。
【0090】
E .マイクロアレイの適用
( i ) scFv 修飾したガラス表面上での標識したペプチドの親和捕捉
細胞表面タンパク質の定常状態トリプシン開裂を、SKBR3(ヒト乳ガン)またはSKOV3細胞について、TPCK処理したトリプシンを使用して4℃で行った。トリプシン消化物をMALDI質量分析法を使用して測定したが、SKOV3細胞について図4Aに示す。約0.5μlの消化物をMALDI表面に負荷し、以下から成るマトリクスで包埋した:ケイ皮酸飽和50%アセトニトリル、0.5%トリフルオロ酢酸(Triflour and acetic acid)。消化物をプロテアーゼ阻害剤で処理し、トランスフェリン受容体のエクトドメインに対する精製した6×His−scFv 1μgと共にインキュベートした。Ni−NTAセファロースビーズを使用してscFv−ペプチド複合体を消化物から精製した。ビーズを洗浄した後、上記のケイ皮酸マトリクスに包埋した。マトリクスで溶出したペプチドの質量分析を行った(図4Bに示す)。エピトープを含有するトリプシンペプチドを、EXPASYシリーズ(suite)からのペピデント(pepident)プログラムを使用して同定した。コントロール実験のために、CHO細胞で発現したHAタグ化したトランスフェリン受容体を、セファロースビーズに結合した抗HA IgGを使用して免疫沈降させた。精製したタンパク質を、HAペプチドを使用してビーズから脱離し、固定化したTPCK処理トリプシンで消化した。scFvエピトープを含有するペプチドをH7 scFvを使用して精製し、上記のように質量分析を行ったが、これを図4Cに示す。トランスフェクトしたトランスフェリンタンパク質はそのアミノ末端にHAエピトープ配列を含有する(細胞内ドメイン)。このタグは細胞外特異的標識のためのコントロールとして役立つ。
【0091】
精製したトランスフェリン受容体および細胞表面タンパク質のトリプシン消化物を第1級アミン反応性色素NHS−CY−5で標識し、PBSに対して透析した。次いで標識したペプチドを、10 mg/mlのBSAおよび0.05% Tween 20を含有するPBSで0.2 mg/mlの濃度に希釈し、トランスフェリン受容体に対するscFv(H7)で誘導体化したガラススライドの表面上でインキュベートした。加湿チャンバー内で一晩、4℃でインキュベートした。CY−5標識されたペプチドの結合を、蛍光スキャナーを使用して測定した。図4Dに実験結果を示すが、これはトランスフェリン受容体が種々の濃度のH7 scFvに結合することを示している。HAエピトープは細胞内ドメイン上にあるので、ここでは抗HA IgGがネガティブコントロールとなる。
【0092】
( ii )マレイミド誘導体化したガラススライドに結合した scFv の機能性の試験
マレイミド誘導体化したガラススライド表面上のスポットの輪郭を疎水性のペンで描いてサンプルが分散しないようにした後、実施例C(ii)に記載するように還元したscFv 1.0μgを、加湿チャンバーにおいて4℃で12時間、ガラス表面に結合させた。チオールを含有する末端システインは、おそらくチオエーテル結合によって、マレイミド基に容易に結合する。チトクロームcおよびBcl−2に対するモノクローナル抗体、および末端システインを含有しないscFvを2−イミノチオラン・HCl(トラウト試薬)で処理して表面に暴露したリジンにスルフヒドリル残基を導入した。その後これらの抗体を上記のように還元し、コントロールとして使用した。結合後、スポットの洗浄を、2% BSA、0.05% Tween 20、および1.0 mM β−メルカプトエタノールを含有するPBSを用いて、25℃で15分間、3回行った。同族リガンドまたはネガティブコントロールを、2% BSA、0.05% Tween 20を含有するPBS中、10.0 pMから0.01 pMの範囲の濃度で好適なスポットに添加し、加湿チャンバーにおいて4℃で2時間インキュベートした。
【0093】
ある場合には、40%グリセロールをスポット混合物に添加し、scFvのマイクロアレイ化を容易にしたが、これはサンプルがサブマイクロリットルの容量でスポッティングした場合でも乾燥しないためである。scFv C6.5およびscFvF5では、40%グリセロールはscFv結合の機能に不利な効果を有さなかった。
【0094】
scFv 6.5の同族リガンドは精製したerbB−2受容体である。erbB−2の組換えエクトドメインを標準的な方法を使用してCHO細胞から発現させ、精製した。NHS−CY5単機能色素(AMERSHAM)を使用して、色素/タンパク質の最終モル比5.0でタンパク質を標識した。標識化反応は0.1 M炭酸ナトリウムバッファー中、25℃で30分間実施し、P10スピンカラムを使用してPBSに交換した。コントロールとして使用した他のタンパク質(Bcl−2、チトクロームc、およびBSA)は上記のようにCY−5で同様に標識した。標識したタンパク質を、ファージ生成した抗体またはモノクローナル抗体のいずれかでの免疫沈降によって免疫原性について試験し、その後ガラスに結合したscFvのリガンドとして使用した。erbB−2タンパク質を2% BSAを含有するPBS Tween20中、1μMから1 pMの範囲で、加湿チャンバーにおいて25℃で2時間インキュベートした。CY5標識したerbB2をネガティブコントロールとして使用した。
【0095】
インキュベーション後、サンプルをPBS、0.05%Tween 20で2分間、3回、そしてPBSで1回洗浄した。サンプルを乾燥させた後、分子動力学STORM上で640 nmの励起光を使用してイメージ化した。
【0096】
( iii )シグナル変換における小分子
Bcl−2ファミリーのアポトーシスを制御するタンパク質からの組換え融合タンパク質を標準的な方法で調製し、BSA−NHSガラススライドまたはアルデヒド誘導体化ガラススライドのいずれかにプリントした。タンパク質は、40%グリセロール含有バッファー中、ミリリットル当たり200から20マイクログラムの濃度範囲でプリントした。プリンティングは記載のようにGMS 417リング・アンド・ピン・プリンターを使用して行った。プレートに捕捉タンパク質サンプルを負荷した;GMS417プリンターでのプリンティングのための96ウェルプレート。タンパク質を反応性スライド上、わずかに水分を補給した条件下、4℃で12時間インキュベートした。結合反応が完了した後、PBSおよび蛍光色素で標識した同族リガンドの変異体でスライドを洗浄した。Arrayworx光学測定器を使用して検出した。
【0097】
プリントしたタンパク質はBcl−XLおよびBAXのGST融合体、および6×ヒスチジンタグ化したBcl−XLであった。これらのタンパク質のリガンドは完全長のBcl−XLタンパク質およびBcl−2ファミリーのタンパク質BAK由来のBH3含有ペプチドであった。ペプチドをAlexa 488で標識し、完全長のタンパク質をCY5で標識した。GMSプリンターから運搬される液体の容量はストローク当たり50−70 pLで5回反復する。スポット当たり350 pgから350 fgの範囲のタンパク質を運搬した。プリントした後、タンパク質を加湿チャンバーにおいて4℃で12時間、インキュベートした。その後PBSでスライドを洗浄し、10%BSAを含有するPBSで5分間ブロッキングした。表面の反応性およびタンパク質の結合効率を測定するために、GST融合タンパク質の存在のモニタリングを、標識した抗GST標識抗体を1 ng/mlで使用して行った。
【0098】
標識したタンパク質リガンドを、疎水性バリアーによる1 cm2のエリアに含有させた40μlの容量でインキュベートした。
その後スライドを洗浄し、Arrayworxスキャナーで測定した。更に、図5(質量分析プロファイル)に示すように、Bax−GSTタンパク質によるリガンドの結合が左図で確認され、GSTタンパク質では結合しないことが右図に示されている。
【0099】
図6は、未標識の小分子(ここではBH3ペプチド)が捕捉分子(Bax−GST融合タンパク質)を巡って標識されたリガンド(ここではBcl−XL)と競合する能力を有することが確認されている。4つの質量分析プロファイルに示すように、BH3ペプチドの量の増加に伴って、標識されたリガンドと捕捉タンパク質との間の結合が減少することが観察された。これによって、捕捉タンパク質とリガンドとの間の相互作用が実際にBH−3ドメインに帰することができることが確認された。BH−3タンパク質−タンパク質相互作用を特異的に促進することが確認されている小分子を使用して同じ型の実験を実施し、予想通り、捕捉分子(Bakペプチド)によるリガンド(Bcl−XL)結合の向上が観察された。
【0100】
その後、Bcl−2ファミリーのメンバーの機能に作用することが知られている3つの薬剤と競合させるリガンドとしてBH3ファミリーのいくつかのペプチドを種々の濃度で使用し、これらの実験を反復した。それぞれの場合にBcl−XLを捕捉タンパク質としてBSA−NHSガラススライド上にプリントした。スライド上に捕捉された標識されたリガンドの検出された蛍光を図7Aおよび7B中の欄に示した。異なる薬剤は同一ファミリーからの2つのリガンドで異なる特異性を示した。Bak(図7A)では阻害効果が実質的に全ての場合で観察されたが、Bid(図7B)では、PNASまたは相対的に低濃度のアンチマイシンはその結合の阻害が見られない。この実験は、標的タンパク質の大ファミリーの各メンバーに関して候補となる薬剤の特異性をマッピングするのに有用でありうる。
【0101】
( iv )細胞表面タンパク質発現
ガン細胞系における細胞表面抗原の発現を検出するためにモノクローナルおよびscFv抗体をガラスマイクロアレイ上にプリントした。c−ErbB2、EGFR、およびトランスフェリン受容体に対する抗体をBSA−NHS活性化ガラススライド上にプリントした。モノクローナル抗体では、蛍光色素で標識した2 ng/mL未満の組換え抗原を検出した。細胞抽出物における抗原の検出のために、ガン細胞系の細胞表面をNHSに基づく色素を使用して蛍光で標識した。これによっていくつかのガン細胞系のc−ErbB2およびEGFRの差次細胞表面発現の検出が可能となった。トランスフェリン受容体は直接標識法を使用して検出しなかった;しかしながら、マイクロ・サンドイッチ法を使用する場合、トランスフェリン受容体も検出した。
【0102】
c−ErbB2、EGFR、およびトランスフェリン受容体(TfR)に対するモノクローナル抗体をGMS 417アレイヤー上で配列させた。抗体を40%グリセロール中でスポッティングし、BSA−NHSスライド上でのスポットの乾燥を防止した。抗体を冷所で一晩スライドと反応させた。得られたスポットのサイズは375マイクロメーターの間隔で(中央から中央)約150マイクロメーターであった。
【0103】
スライドを0.5 Mグリシン中で30分間、次いでBSA中で更に30分間ブロッキングし、その後サンプルを添加した。複数のサンプルを単一のスライド上で処理する場合、抗体スポットの群を疎水性のペンで描いて分離し、スライド当たり24サンプルまで処理できるようにした。あるいはまた、抗体スポットの群を粘着性テフロン(登録商標)マスクを使用して分離し、スライド当たり50以上のサンプルを処理できるようにした。
【0104】
サンプルは通常、Cy3またはCy5−NHS色素を用いて室温で1時間標識し、未反応の色素をゲル濾過で除去する。この研究で使用した細胞系は乳腺ガン細胞系SKBR3および類表皮ガン細胞系A−431であった。色素フルオレセイン−PEG2000−NHS(Shearwater)をPBS中10 mg/mLで使用して氷上で2時間、細胞表面を標識し、細胞を洗浄して未反応の色素を除去した後、TBS中の0.25%SDSに可溶化した。組換えタンパク質抗原を0.1%Tween−PBS中の2%BSA中でインキュベートした。BSAを含有しない溶解バッファー中で細胞溶解物をインキュベートした。サンプルと共に2から3時間インキュベートした後、洗浄バッファーを含有するビーカーに迅速に浸水することによって、4×10回:TPBS中で20回、次いでPBS中で20回、スライドを洗浄した。Array WoRxスライドリーダーを使用して蛍光を検出した。
【0105】
感度:
連続希釈したAlexa488で標識したErbB2およびCy5で標識したEGFRと共にマイクロアレイをインキュベートした。洗浄後、スライドをArrayWoRxでスキャニングした。図8に示すように、TfR抗体#3以外、全ての抗体はそれぞれErbB2、TfR、およびEGFRを捕捉できた。1.6 ng/mLという低希釈でタンパク質の捕捉を検出できた。
【0106】
細胞表面抗原の検出:
乳腺ガン細胞系SKBR3および類表皮ガン細胞系A−431をコンフルエントになるまで増殖させ、細胞表面を色素フルオレセイン−PEG2000−NHSで標識した。標識に続いて細胞を洗浄して未反応の色素を除去し、細胞を0.25%SDS中で溶解した。その後、標識されたタンパク質全体(約50,000細胞に相当)を抗体マイクロアレイ上で2時間インキュベートし、スライドをArray WoRxでスキャニングした。図9に示すように、A−431細胞系はEGFRを過剰発現するがErbB2はしない;SK−BR−3細胞系はErbB2を過剰発現するがEGFRは低レベルにしか発現しない。この2つの細胞系における2つの受容体の差次発現はフローサイトメトリーによって確認する(例えばA−431細胞において細胞当たり>106 EGFR受容体)。
【0107】
異なる方法では、細胞タンパク質を蛍光で直接標識しなかった。それに代わり、アレイに結合する抗原を、抗原に対する蛍光標識した2次抗体で検出した。この“サンドイッチ”検出法の感度は直接標識した組換え抗原で観察されるものと同様であった。
【0108】
ある実験で、抗体を前述のようにマイクロアレイにプリントし、未標識の抗原と共に2時間インキュベートした。Cy5(EGFRの検出)またはCy3(TfRの検出)で標識した抗原に対する2次抗体で結合を検出した。結果を図10に示す:凡例に示すモノクローナル抗体は約25 ng/mLで良好な感度を示す。
【0109】
同じサンドイッチ法を、Cy5で標識したscFv F5のようなファージディスプレイした抗体を使用して実施した。
細胞抽出物中の抗原を検出するために、細胞系(A431またはSKBR−3)を0.25% SDS中で溶解し、抽出物を抗体アレイと共に2時間インキュベートした。洗浄後、結合した抗原を蛍光モノクローナル抗体(EGFRおよびTfR)またはファージ抗体(ErbB2)で検出した。図11に示すように、サンドイッチ法を使用して、両細胞抽出物において3つの抗原、EGFR、ErbB2、またはTfRの全てを検出した。抗EGFR抗体によってA431細胞系およびSKBR−3細胞系におけるErbB2の差次発現が検出された(>10倍の差異)。同様に、抗ErbB2ファージ抗体によって2つの細胞系におけるErbB2の発現の差異が検出された。予想通り、トランスフェリン受容体発現の場合、2つの細胞系間で発現の顕著な差異は検出されなかった。
【0110】
本明細書において上に引用した全ての文書、特許、出版物は参照によってここに組み込まれる。本発明の種々の修飾および変更は、本発明の範囲および意図から逸脱することなく、当業者に明白である。本発明について特定の好ましい態様と関連して記載したが、請求する本発明はそれらの特定の態様に過度に制限されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、本発明を実施するために記載した様式の種々の修飾で当業者に明白なものは、本発明の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1Aは、支持体表面を処理してBSA分子をそれに結合させ、BSA分子を活性化するための代表的な段階を示す。
図1Bは、捕捉タンパク質を活性化したBSA分子に結合させるための代表的な段階を示す。
【図2】近接リン親和性マッピングを示す。
【図3】図3A、3Bは、タンパク質−タンパク質相互作用を調節する小分子を研究する態様を示す。
【図4】図4Aは、SKOV3細胞のトリプシン消化物からの定常表面タンパク質の質量分析の概要である。
図4Bは、ペプチドがNi−NTA SELDI表面上でscFv H7によってアフィニティー捕捉されることを示す質量分析図である。
図4Cは、コントロール実験の結果を示す質量分析図である。
図4Dは、CY−5で標識したトランスフェリン受容体エクトドメインのトリプシンペプチドの捕捉を示す。
【図5】ネガティブコントロールに対する捕捉分子としての融合タンパク質による結合を示す質量分析図である。
【図6】SELDI表面上で小分子が結合要素をめぐってリガンドと競合することを示す質量分析図である。
【図7】図7A、7Bは、小分子の存在下または不在下で固定化した結合要素に結合したリガンドから検出された蛍光単位を示す。
【図8】種々の濃度の標識されたEGFR、TfR、またはErbB2を捕捉したマイクロアレイの蛍光スキャンを示す。
【図9】抗体マイクロアレイに捕捉された細胞溶解物由来の標識された細胞表面タンパク質を示す蛍光スキャンである。
【図10】標識された2次抗体によって未標識の抗原の捕捉を検出するマイクロアレイの蛍光スキャンである。
【図11】細胞溶解物由来の抗原の結合を検出する蛍光スキャンである。検出は標識された2次抗体による。
関連する出願
本出願は米国仮出願第60/222,763号(2000年8月3日出願)に基づいて優先権を主張するものであり、その開示は参照によって本明細書に援用される。
【0002】
技術分野
本発明は診断化学および分析化学の分野、特に複雑な化学的サンプルまたは生物学的サンプルをスクリーニングして、サンプル中の成分を特定の結合要素に結合するその能力に基づいて同定、単離、または定量するための装置に関する。本発明は特に、生物学的に重要な結合要素、または生物学的に重要なリガンドに結合する結合要素のアレイ、好ましくはマイクロアレイ、の生成および使用に関する。
【0003】
発明の背景
複雑な化学的サンプルもしくは生物学的サンプル、または多数の化合物を効率的にスクリーニングするための機能性生体分子の高密度アレイを構築するために、結合要素を固体支持体上に固定化する必要がある。当該分野において固体支持体に生物学的分子を結合させるための種々の方法が知られている。一般に、Affinity Techniques, Enzyme Purification : Part B, Meth. Enz. 34(W.B. JakobyおよびM. Wilchek編, Acad. Press, N.Y. 1974)およびImmobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Adv. Exp. Med. Biol. 42(R. Dunlap編, Plenum Press, N.Y., 1974)を参照されたい。例えばArenkovらは、タンパク質をその機能を保持しつつ固定化する方法について記載しているが、これは微細加工(microfabricated)ポリアクリルアミドゲルパッドを使用してタンパク質を捕捉し、その後、微量電気泳動(microelectrophoresis)によってマトリクスを通ずる拡散を促進することによるものである(Arenkovら(2000), Anal Biochem 278 (2):123−31)。また特許文献は、固体支持体に生物学的分子を結合させる多くの異なる方法を記載している。例えば米国特許第4,282,287号は、ビオチン、アビジン、および増量剤の多層の連続的適用によってポリマー表面を修飾する方法について記載している。米国特許第4,562,157号は、光化学反応性アリールアジドへの結合によって表面に生化学的リガンドを結合させるための方法について記載している。アジドの放射線照射によって反応性ナイトレンが生成されるが、これは溶液中で高分子と不可逆的に反応し、それによって共有結合が形成される。しかしながら、ナイトレン中間体は反応性が高いため、非特異的反応によって結合効率の低下および多くの潜在的に好ましくない生成物の生成の両方が起こる。米国特許第4,681,870号は、シリカマトリクス上に遊離のアミノ基またはカルボキシル基を導入する方法を記載しており、ここではそれらの基をそれに続いてカルボジイミドの存在下でタンパク質に共有結合させてもよい。更に、米国特許第4,762,881号は、固体基質にポリペプチド鎖を結合させるための方法について記載しているが、これは光感受性非天然型(unnatural)アミノ酸基をポリペプチド鎖に導入し、生成物を低エネルギー紫外線に暴露することによるものである。
【0004】
しかしながら、複合サンプル中の成分を同定、単離、および/または定量し、多数の化合物を種々の異なる結合パートナーに結合するその能力に基づいてスクリーニングする、より効率的で製造が容易なアレイ系が今なお必要とされている。
【0005】
発明の概要
本発明は、興味の結合要素を基質に固定化し、サンプル分析物と相互作用させて結合させることができる、マイクロアレイ・アッセイ系を提供する。マイクロアレイは、天然または合成化合物の大型ライブラリーをスクリーニングし、結合要素の天然の結合パートナーを同定し、そして診断的または治療的目的であり得る非天然型結合パートナーを同定するのに有用である。本発明は、これまでその特異的結合活性を保持しながら高密度アレイに導入することができなかったscFvのような抗体または抗体フラグメントのマイクロアレイを提供するのに特に有用である。本発明はまた、それらのマイクロアレイの使用法、それらのアレイに有用な抗体または抗体フラグメントのためのエピトープの選択法、そしてマイクロアレイで実施したアッセイから得られるデータの分析法を提供する。
【0006】
好ましくは、固定化した結合要素はシリコンベースのチップまたはガラススライドのような固体支持体上に配列させてアレイとする。支持体の表面は、更なる結合化学に使用できる少なくとも1つの反応性化学基を有するように選択するか、またはそのように化学的に誘導する。必要により、フレキシブルな分子リンカーを支持体および結合要素間に挿入してもよい。それらのリンカーの例にはウシ血清アルブミン(BSA)分子、マレイミド、およびビニルスルホン基がある。
【0007】
本発明のある態様では、結合要素の、その同族リガンドへの結合に関与する領域と、支持体に結合される領域とを分離するように、結合要素を支持体に固定化する。好ましい態様では、2つの領域は2つの異なる末端であり、結合要素を操作して、末端の1つを介して支持体上のリンカー分子への共有結合を形成させるようにする。それらの共有結合はシッフ塩基結合、マイケル付加によって生成される結合、またはチオエーテル結合によって形成してもよい。特に好ましい態様では、抗体フラグメントを操作して、そのカルボキシル末端に還元されたシステインを含むようにする。
【0008】
好ましい態様では、マイクロアレイはcm2当たり少なくとも1000スポットの密度の固定化され、なおかつ機能性を有する結合要素のアレイを含む。ある態様では、乾燥を防ぐために、固定化した結合要素の層にグリセロールのような保水剤を添加することを本発明は提供する。他の態様では、基質表面にBSAのようなブロッキング剤溶液を添加することを本発明は提供する。
【0009】
別の観点では、本発明は、標識が抗原と抗体または抗体フラグメントとの結合に干渉しないような抗原の標識方法を提供する。好ましい態様では、プロテアーゼ消化後に抗原をその末端アミンで標識する。特に好ましい態様では、抗原をトリプシンで消化した後、スクシンイミジルエステル色素で標識する。
【0010】
更なる観点では、本発明は候補となるタンパク質を多数のペプチドにフラグメント化することによってリン酸化されたタンパク質を検出する方法を提供し、ここでペプチドの1つは既知の、または疑いのあるリン酸化部位を含み、抗体または抗体フラグメントを使用して、リン酸化部位に近いエピトープによってペプチドを選択する。
【0011】
更に別の観点では、本発明はタンパク質−タンパク質相互作用を調節する小分子の同定法を提供する。この観点によれば、捕捉タンパク質を支持体表面に結合させ、そのリガンドおよび少なくとも1つの小分子に暴露する。次いで捕捉タンパク質とリガンドとの間の結合の存在または不在を検出して、小分子の調節作用を確認する。好ましい態様では、同じ細胞経路で作用する捕捉タンパク質のマイクロアレイを支持体表面に結合させ、これら全てのタンパク質に対する小分子の調節作用の概要を同時に得る。
【0012】
更に別の観点では、本発明は支持体表面に捕捉分子を結合させて、全細胞溶解物のような溶液中に含有される細胞オルガネラを捕捉させることによって、細胞事象を研究する方法を提供する。
【0013】
本発明のこれらおよび他の観点は以下の詳細な開示および好ましい態様の説明によって当業者に明らかとなる。
発明の詳細な説明
本発明は一部には、天然に存在する、または人工的に製造した生体高分子のアレイ(特にマイクロアレイ)を製造する新規の方法の発見に依存し、それを使用してサンプル(生物学的サンプルおよび人工サンプルの両方を含む)をスクリーニングし、固定化した結合要素と結合するそれらのサンプル中の分子を同定、単離、または定量してもよい。このため、本発明は生物学的高分子と相互作用する能力のある化合物を同定するための、膨大な数の化合物のハイスループット・スクリーニングを可能にする方法および製品を提供する。
【0014】
本発明は免疫アッセイにおいて特に有意に適用され、これによって抗体および同様の分子を使用する広範かつ効率的なスクリーニングが可能となる。抗体は長い間、タンパク質機能の確認、遺伝子発現の空間時間的パターンの同定、タンパク質−タンパク質相互作用の同定、そしてin vitroおよびin vivoでの表現型ノックアウトによる標的の確認において非常に重要な役割を果たしてきた。しかしながら、個々の抗体は生物学的サンプル由来の個々のタンパク質をモニタリングするのに有用であるのに対し、本発明はハイスループット分析用にフォーマットした抗体、抗体フラグメント、または抗体様結合要素の大型アレイの生成を提供する。この技術によって正常および疾病状態の血清、細胞、および組織由来の多数のタンパク質の広範なプロファイリングが可能となるが、これは有力な診断および薬剤発見の手段となる。
【0015】
本発明のある観点は、(特に捕捉タンパク質または抗体フラグメントの場合)化学リンカーを介して生体分子を固体支持体に結合させ、その分子の生体機能は保持する方法の改善に関する。
【0016】
I .基質/支持体
本発明のマイクロアレイは基質または支持体上に形成する。これらの基質の特性は意図する使用によって種々に変化しうるが、形状、原料、および基質表面の修飾に関する基本的な考慮事項を以下に記載する。
【0017】
A .形状
本発明の基質は本質的にいずれの形状で形成してもよい。基質は実質的に平面(planar)またはフラットな表面を少なくとも1つ有するのが好ましいが、凹凸(indentation)、隆起(protuberances)、階段状、隆線(ridge)、テラス状(terraces)などを含んでもよい。基質はシート、ディスク、チューブ、円錐、球状、凹表面、凸表面、ストランド、ストリング、またはこれらおよび他の幾何学的形状のいずれかを組み合わせた形状であってもよい。いくつかの基質表面を組み合わせて本発明を利用してもよい。一例は、分析物を含有するサンプルを、本発明に従って両表面上に形成したマイクロアレイを有する2つの平面基質表面間に挟むものである。
【0018】
B .原料
種々の原料(有機もしくは無機、または両方の組み合わせ)を本発明の支持体として使用できる。好適な基質原料には、限定される訳ではないが、ガラス、セラミック、プラスチック、金属、合金、炭素、紙、アガロース、シリカ、石英、セルロース、ポリアクリルアミド、ポリアミド、およびゼラチン、並びに他のポリマー支持体、他の固形物質支持体、またはフレキシブル膜支持体がある。基質として使用してもよいポリマーには、限定される訳ではないが、以下がある:ポリスチレン;ポリ(テトラ)フルオロエチレン(PTFE);ポリビニリデンジフルオライド;ポリカーボネート;ポリメチルメタクリレート;ポリビニルエチレン;ポリエチレンイミン;ポリオキシメチレン(POM);ポリビニルフェノール;ポリラクチド、ポリメタクリルイミド(PMI);ポリアルケンスルホン(PAS);ポリプロピレン;ポリエチレン;ポリヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA);ポリジメチルシロキサン;ポリアクリルアミド;ポリイミド;および種々のブロック・コポリマー。基質は原料(水透過性であってもなくても)を組み合わせて多層状で含有することもできる。基質の好ましい態様は表面Si−OH機能性を有する平らな(plain)2.5 cm×7.5 cmのガラススライドである。
【0019】
C .表面の調製/反応基
リンカーによる結合または結合要素による直接の結合を可能にするために、基質表面に初期処理を行って好適な反応基を生成する必要がある。それらの反応基には以下のような単純な(simple)化学部分がある:アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレート、アルデヒド、エステル、エーテル(例えばチオエーテル)、アミド、アミン、ニトリル、ビニル、スルフィド、スルホニル、ホスホリル、または同様の化学反応基。あるいはまた、反応基は更に複雑な部分を含有してもよく、それらには、限定される訳ではないが、以下がある:マレイミド、N−ヒドロキシスクシンイミド、スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド、ニトリロトリ酢酸、活性化ヒドロキシル、ハロアセチル(例えばブロモアセチル、ヨードアセチル)、活性化カルボキシル、ヒドラジド、エポキシ、アジリジン、スルホニルクロリド、トリフルオロメチルジアジリジン、ピリジルジスルフィド、N−アシル−イミダゾール、イミダゾールカルバメート、ビニルスルホン、スクシンイミジルカルボネート、アリールアジド、無水物、ジアゾアセテート、ベンゾフェノン、イソチオシアネート、イソシアネート、イミドエステル、フルオロベンゼン、ビオチン、およびアビジン。それらの反応基を機械的、物理的、電気的、または化学的方法によって基質上に配する技術は当該分野で十分知られており、例えば米国特許第4,681,870号に記載されているが、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0020】
高密度アレイとするために、支持体表面に反応基を高密度で“詰め込む(pack)”必要があり得る。ガラス表面の場合の好ましい方法は、まず強酸のような試薬で表面を“ストリッピング(strip)”し、その後表面に反応基を適用または再適用するものである。
【0021】
ガラス表面の場合、反応基はシラン、Si−OH、酸化ケイ素、窒化ケイ素、第1級アミン、またはアルデヒド基でもよい。アルデヒド含有シラン試薬で処理したスライドは多くの結合要素を固定化するのに好ましく、TeleChem International(Cupertino, CA)から“SuperAldehyde Substrates”の商品名で販売されている。これらのスライド表面上のアルデヒド基はタンパク質上の第1級アミンと容易に反応してシッフ塩基結合を形成する。典型的なタンパク質はその表面上に多くのリジン残基を、そして一般により反応性の高いα−アミンをそのN末端に表示するので、それらをスライドに種々の配位で結合させることができ、それによってタンパク質の種々の側を溶液中で他のタンパク質または小分子と相互作用させることができる。タンパク質のような結合要素をこれらのアルデヒドスライド上に配置した後、ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するバッファーをスライドに適用し、分析物とスライド上の未反応アルデヒド基とのその後の非特異的結合を阻害してもよい。
【0022】
II .リンカー
基質上の反応基の初期処理が終了すれば(必要により)、必要によってリンカー分子を基質の表面に添加して、更なる結合化学に好適となるようにしてもよい。
【0023】
ここで使用するところの“リンカー”という用語は、既に基質上にある反応基と後に固定化する結合要素とを共有結合させる化学部分を意味し、これは基質上の反応基と結合要素間の連続的な連結を形成させる化学結合のバックボーンを有し、そのバックボーンに沿って多数の自由に回転する結合を有する。リンカーは好適な種類の化合物から選択してもよく、有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール、アミンなどのポリマーまたはコポリマーを含んでもよい。例えば、ヒドロキシカルボン酸、アミノカルボン酸、またはジカルボン酸、例えばグリコール酸、乳酸、セバシン酸、またはサルコシンのポリマーまたはコポリマーを使用してもよい。あるいはまた、飽和または不飽和炭化水素、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、糖類などのポリマーまたはコポリマーを使用してもよい。好ましくはリンカーは、結合される結合要素がサンプル溶液中の分子と自由に相互作用して有効な結合を形成できるのに好適な長さである。
【0024】
本発明のリンカーは少なくとも2つの反応基、すなわち基質に結合する第1の反応基および結合要素に結合する第2の反応基を含有する。2つの反応基は同じ化学部分であってもよい。リンカーの少なくとも2つの反応基は基質上の反応基の上に記載した化学部分のいずれかを含んでもよい。また、好ましい第2の基はマレイミド基を含有する。リンカーの第2の基の別の好ましい態様は、ビニルスルホン基である。これらの基の親水性は、バッファー水溶液中で更なるアッセイを行う際に、タンパク質のような分析物による非特異的結合を制限する助けとなると信じられる。
【0025】
リンカーを基質表面に結合させる方法は既に基質上にある反応基および選択されるリンカーによって種々であり、当業者に適宜に考慮されるように、変化する。例えば、リンカーのトリクロロシリル基またはトリサルコキシ基と支持体表面上のヒドロキシル基との間の反応を介してシロキサン結合を形成してもよい。
【0026】
リンカーは分枝または非分枝であってもよいが、リンカーのこの構造的特性、そして他の構造的特性は結合要素の関連機能(例えばリガンド−抗リガンド相互作用)に立体化学的に干渉すべきでない。
【0027】
当業者に既知の保護基を使用してリンカーの末端基の望ましくない反応、または早期の反応を防止してもよい。例えば米国特許第5,412,087号(参照により本明細書に組み込まれる)はリンカーのチオール基上の光によって除去できる保護基の使用について記載している。
【0028】
好ましい態様では、リンカーはBSA分子を含む。それらの態様の一例はマイクロアレイの作製に好適なBSA−NHSスライドである。いくつかの適用には好適であるが、アルデヒド基で機能化し、更にBSAでブロッキングしたスライドは、ペプチドまたは小タンパク質をアレイ化する場合には好適でなく、おそらくこれはBSAが興味の分子を不明瞭にするためである。それらの適用にはBSA−NHSスライドが好ましい。図1Aおよび1Bにそれらのスライドの作製方法を示す。まずBSAの分子単層をガラススライドの表面に結合させる。図1Aに具体的に示すように、ヒドロキシル基を有するガラススライド10をアミノプロピルトリエトキシシランでシラン化し(段階1)、その後N,N’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化する(段階2)。次に、スライド上の活性化したアミノ基をリンカー20(BSA)と共有結合させる(段階3)。次いでBSAの表面をN,N’−ジスクシンイミジルカーボネートで活性化し(段階4)、これによって活性化したカルバメートおよびエステル、例えばN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)基が得られる。図1Bに関連して、BSA上の活性化したリジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸残基は結合要素30(ここでは捕捉タンパク質)上の表面アミンと容易に反応し(段階5)、尿素共有結合またはアミド共有結合を形成する。次いで、残存するBSA上の反応基をグリシンでクエンチングする(段階6)。結果として、結合要素30(ここでは捕捉タンパク質)がリンカー20(ここではBSA分子)を介して支持体10に固定化される。BSAでブロッキングしたアルデヒド機能性を有するスライドに比較して、BSA−NHS基質上に配列させたタンパク質またはペプチドはBSA単層の上部に表示され、溶液中の高分子へアクセスしやすくなる。
【0029】
III .結合要素
本発明の結合要素は種々の異なるタイプの天然に存在する、または合成の分子(生物学的重要性を有するもの(“生体分子”)を含む)のいずれかから選択してもよい。
【0030】
例えば結合要素には天然に存在する分子または分子フラグメント、例えば核酸、核酸類似体(例えばペプチド核酸)、多糖類、リン脂質、捕捉タンパク質(糖タンパク質、ペプチド、酵素、細胞受容体、および免疫グロブリン(例えば抗体、抗体フラグメント)を含む)、抗原、天然に存在するリガンド、他のポリマー、そして上記のいずれかの組み合わせがありうる。また、標準的な化学合成によって、またはスプリット・アンド・プール(split−and−pool)ライブラリーもしくはパラレル合成から生成させる天然産物様化合物を結合要素として利用することも企図される。
【0031】
A .抗体および抗体フラグメント
抗体および抗体フラグメントは結合要素として好ましい候補である。これらには抗原結合フラグメント(Fab)、Fab’フラグメント、ペプシンフラグメント(F(ab’)2フラグメント)、scFv、Fvフラグメント、単一ドメイン抗体、dsFvs、Fdフラグメント、およびダイアボディー(diabodies)、並びに完全長ポリクローナルまたはモノクローナル抗体がある。抗体様フラグメント、例えば修飾したフィブロネクチン、CTL−A4、およびT細胞受容体もここに同様に企図される。マイクロアレイの形成後は、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインを利用して抗体または抗体フラグメントによって認識される特異的な抗原決定基を有する分子をスクリーニングしてもよい。
【0032】
好ましい態様では、細胞の転移事象および細胞表面発現を研究するために、表面受容体の細胞内部移行の引き金となるファージディスプレイされたscFvを大型非免疫ファージライブラリーから直接選択することができ、これはファージ粒子を細胞から回収し、増幅することによって行う。参照:Becerrilら(1999), Biochem Biophys Res Commun. 255(2):386−93(参照により本明細書に組み込まれる)。
【0033】
B .受容体
天然に存在する生物学的受容体、またはそれらの受容体を合成もしくは組換えによって修飾した変異体を本発明の結合要素として使用してもよい。結合要素として使用できる受容体の種類には細胞外マトリクス受容体、細胞表面受容体、および細胞内受容体がある。受容体の具体的な例にはフィブロネクチン受容体、フィブリノーゲン受容体、マンノース6−リン酸受容体、erb−B2受容体、およびEGF(上皮成長因子)受容体がある。
【0034】
C .受容体リガンド
同様に、天然に存在する生物学的受容体リガンド、またはそれらのリガンドを合成もしくは組換えによって修飾した変異体を結合要素として使用し、それらの特異的結合パートナーまたは他の非天然型結合パートナーをスクリーニングしてもよい。それらのリガンドの種類にはホルモン、成長因子、神経伝達物質、抗原があり、またファージディスプレイすることができる。
【0035】
D .基質/リンカーへの結合のための修飾
当業者に明白なように、結合要素を修飾して共有結合または非共有結合を介する基質表面上の反応基または基質に結合したリンカーの第2の反応基への結合を容易にしてもよい。それらの修飾の例として、求核性S−、N−、およびO−含有基を付加してリンカーへのマイケル付加反応を介する固体支持体への結合要素の結合を容易にしてもよい。
【0036】
結合要素の結合親和性を保持するために、結合要素を修飾して、結合要素の同族リガンドとの相互作用に関与する領域から分離した領域で支持体基質に結合するようにするのが好ましい。結合要素が第1の末端でそのリガンドに結合する場合、結合要素を第2の、もしくは反対の末端、または末端間のいずれかの位置で支持体へ結合させることがそのような解決策となりうる。結合要素がscFvである好ましい態様では、本発明はscFvを求電子性リンカー(例えばマレイミド基)との結合を介して、scFvの抗原結合活性に干渉することなく、ガラススライド表面に結合できるような修飾方法を提供する。実施例C(i)に詳述するこの方法によれば、まずscFvを操作してそのカルボキシ末端がシステイン残基を含有するようにし、これはその後マレイミド基のような求電子性リンカーと共有結合を形成することができる。同様に、結合要素のN−末端を操作して支持体表面への結合のための反応基を含有させることができる。
【0037】
E .基質/リンカーへの結合
結合要素を基質表面上またはリンカー上の反応性末端基に結合させる方法にはチオエーテル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、カルバメート結合、尿素結合、エステル結合、カーボネート結合、エーテル結合、ヒドラゾン結合、シッフ塩基結合のような結合、および(例えばイオン性または疎水性相互作用を介する)非共有結合を形成する反応が含まれる。反応の形態は当然、基質/リンカーおよび結合要素の両方にある可能な反応基に依存する。
【0038】
以下の実施例の項に記載するように、マイケル付加を利用してガラススライドに化合物を結合させてもよく、平らなガラススライドを誘導体化して、マレイミド基で高密度に機能化した表面を得てもよい。次いでチオール基を含有する化合物(例えばカルボキシ末端にシステインを含有するように修飾したscFv)をマレイミドと反応させてチオエーテル結合を形成してもよい。
【0039】
IV .マイクロアレイの形成
ある観点では本発明は、基質上に直接、またはリンカーを介して固定化した結合要素のアレイ(高密度マイクロアレイを含む)の作製法を提供する。本発明の方法によれば、非常に高密度の(cm2当たり100スポットを超える、好ましくは1,000スポットを超える、そして更に好ましくは2,000スポットを超える密度の)マイクロアレイを、高密度の反応基を生成するように機能化した、または反応基を有する高密度のリンカーの付加によって機能化した支持体表面上に生体分子を結合させることによって生成することができる。
【0040】
A .スポッティング
本発明のマイクロアレイは多くの方法によって製造してもよく、それらには少量の反応物を基質表面上の特定の位置に施与する“スポッティング”がある。スポッティングの方法には、限定される訳ではないが、以下がある:マイクロフルイディクス・プリンティング、マイクロスタンピング(例えば米国特許第5,515,131号および米国特許第5,731,152号参照)、マイクロコンタクト・プリンティング(例えばWO96/29629 号参照)、およびインクジェット・ヘッド・プリンティング。一般に、分配装置はサンプル沈着量を制御するためのキャリブレーション手段を含み、支持体表面に関してサンプルを移動および配置させるための構造を含んでもよい。
【0041】
( i )容量/スポットサイズ
結合要素毎のアレイに分配される液体の容量は意図されるアレイの使用法および利用できる装置によって変化する。好ましくは1回の分配での容量は100 nL未満、より好ましくは10 nL未満、そしてもっとも好ましくは約1 nLである。得られるスポットのサイズも同様に変化し、好ましい態様では、これらのスポットは直径20,000μm未満、より好ましくは直径2,000μm未満、そして最も好ましくは直径約150−200μmである(平方センチメートル当たり約1600スポットとなる)。
【0042】
( ii )粘性の添加物
1個の結合要素のスポットに相当するアレイのスポットサイズを、溶液の粘性を高めるグリセロールまたはトレハロースのような媒質の添加によって低減し、それによって溶液の拡散を防止してもよい。親水性基質表面上の疎水性境界は、アレイを含むスポットのサイズを制限する役割を果たせる。
【0043】
結合要素の溶液に湿潤剤を添加することによって、基質表面上に生成した後のマイクロアレイの脱水を効果的に予防してもよい。酸化、またはタンパク質の場合は変性と同様に、脱水によって結合要素に化学的または立体化学的変化が起こりうるので、湿潤剤の添加によってマイクロアレイを保存および安定化し、scFvのような結合要素の機能性を保持することができる。例えば好ましい態様では、scFvを40%グリセロールを含有するリン酸バッファー(PBS)溶液中でマレイミド誘導体化したガラスに結合させる。グリセロールによって持続的に水分が補給され、変性が防止される。
【0044】
( iii )ブロッキング剤
ブロッキング剤の溶液をマイクロアレイに適用して、結合要素に結合していない反応基による非特異結合を防止してもよい。例えばウシ血清アルブミン(BSA)、カゼイン、または脱脂乳の溶液をブロッキング剤として使用し、その後のアッセイにおけるバックグラウンド結合を低減してもよい。
【0045】
( iv )ロボット工学
好ましい態様では、高精度コンタクト・プリンティングロボットを使用して少量の溶解した結合要素をマイクロタイタープレートのウェルから採取し、約1 nLの溶液を基質(例えば化学的に誘導体化したガラス顕微鏡スライド)の表面上の規定の位置に反復して運搬する。それらのロボットの例にはGMS 417アレイヤー(Affymetrix(Santa Clara, CA)から販売されている)およびスプリット・ピン・アレイヤー(split pin arrayer)(http://cmgm.stanford.edu/pbrownからダウンロードできる説明書に従って行う)がある。化学的に誘導体化したガラス顕微鏡スライドはカスタムメイドのスライドサイズの反応容器を使用して調製するのが好ましく、これによってスライドの片面に均一に溶液を適用することができ、これについては実施例の項に示し、検討する。これによってスライド上に化合物の超小型のスポットが形成される。しかしながら、当業者に評価されるように本発明は1 nL容量の溶液の運搬、特定のロボット装置の使用、または化学的に誘導体化したガラススライドの使用に限定されるものではなく、また、ピコリットルまたはそれ以下の容量を運搬できるような別の運搬手段を使用することもできる。従って、高精度アレイロボットに加え、化合物を運搬するための他の手段を使用することができ、それには、限定される訳ではないが、インクジェットプリンター、圧電プリンター、および小容量のピペッティング・ロボットがある。
【0046】
B . in situ 光化学
基質表面上の分子のアレイまたはマイクロアレイの形成において、in situ光化学を光活性化反応基と組み合わせて使用してもよく、この基は基質表面上、リンカー上、または結合要素上に存在してもよい。それらの光活性化基は当該分野で周知である。
【0047】
C .標識
結合要素を蛍光、放射性、染色、および他の物理的または化学的な標識またはエピトープでタグ化してもよい。ある好ましい態様では標識の定量が可能であり、これはその後のアッセイに大きな利点となる。
【0048】
好ましい態様では、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマー部分を含有する蛍光色素を使用する。
V .アッセイサンプル
固体支持体上での結合要素のマイクロアレイの形成の際、大量のサンプルを結合アッセイのために支持体表面に適用してもよい。それらのサンプルの例を以下に示す:
A .体液/組織および生検サンプル
本発明のマイクロアレイを使用してアッセイするサンプルは種々の生理学的、環境、または人工の供給源から得てもよい。特に、生理学的サンプル、例えば患者または生体の体液をアッセイサンプルとして使用してもよい。それらの体液には、限定される訳ではないが、以下がある:唾液、粘液、汗、全血、血清、尿、生殖液(genital fluids)、糞便、骨髄、血漿、脊髄液、心膜液、胃液、腹腔液(abdominal fluids)、腹水、胸膜液、および他の身体部分からの抽出液、そして他の腺からの分泌液。あるいはまた、培養液中で増殖させた細胞から得た生物学的サンプルを利用してもよい。それらのサンプルには細胞物質の溶解および分画によって得られた上清、全細胞溶解物、または細胞画分がある。
【0049】
B .細胞抽出物
細胞抽出物およびその画分(生物学的存在から直接得たものおよび人工的環境で増殖させたものを含む)を使用して特定の結合要素に結合する細胞溶解物中の分子をスクリーニングすることもできる。
【0050】
C .正常サンプルと疾病サンプル
上記のサンプルのいずれかを正常な、または疾病を有する生物学的存在からの細胞集団から誘導してもよい。
【0051】
D .処理サンプルと未処理サンプル
上記のサンプルのいずれかを、有害または有益のいずれかであると信じられる、または疑われる化合物または他の処理により処理をした、または処理していない細胞集団から誘導してもよく、処理および非処理集団間の差異を使用して処理の効果を評価してもよい。
【0052】
E .標識
所定のサンプル中の特定の分子を修飾して後の検出を可能にしてもよく、これは当業者に知られる技術、例えば蛍光、放射性、染色、および他の物理的または化学的標識の使用によって行う。好ましい態様では、親水性ポリマー部分(例えばポリエチレングリコール(例えばフルオレシン−PEG2000−NHS))を含有する蛍光色素を使用する。標識はサンプル中の分析物を直接標識するか、または分析物を認識する親和性タグを標識するか(間接標識)によって行うことができる。異なる蛍光色素でサンプル分析物を直接標識することにより、同一スポットから複数のアッセイを行うことが可能となる(例えば標的タンパク質の発現レベルおよびリン酸化レベルの測定)。分析物がファージディスプレイ・リガンドである場合、リガンドと結合要素のマイクロアレイとの間の結合を検出するためにファージをあらかじめ標識してもよい。
【0053】
直接標識法では、長い間、サンプルの過剰標識が深刻な問題であると認識されてきた。タンパク質の過剰標識はタンパク質複合体の凝集を引き起こす可能性があり、これによって非特異的染色が起きる傾向がある;また、抗体のエピトープ認識機能の崩壊によって抗体の抗原に対する特異性が低下し、これによってシグナルの喪失が起こりうる。当該分野で周知のように、過剰標識を低減するために、標識過程の反応時間を短縮するか、または基質:標識比を増加させる必要がある。過剰標識の解決策は、まず全タンパク質を消化してペプチドとし、その後ペプチドの末端を標識し、これによって内部エピトープの標識を回避することである。このように、過剰標識を心配することなく標識過程を完了させ、従って研究者は標識過程にわたってより完全に制御しうる。更に、ペプチド上の可能性のある標識部位が既知である場合は、内部エピトープを認識する親和性試薬を介してペプチドを捕捉した後、標識されたペプチドを定量することが可能である。この方法を適用して、細胞抽出物中の全タンパク質から消化した標識されたペプチドを定量し、タンパク質発現レベルの定量分析を行う。
【0054】
好ましい態様では、全タンパク質をトリプシンで消化し、その後スクシンイミジルエステル色素(例えばCy3、Cy5、またはAlexa色素)によって標識を行う。スクシンイミジルエステル色素は第1級アミン(例えばリジン中のもの)を標識する。トリプシンはリジンの後で開裂し、C−末端にリジンを有するペプチドを生成する。従って、トリプシン消化から得られるペプチドは2つの種類に分けられる:リジンを含有せずN−末端に第1級アミンを有するもの、およびC−末端にリジンを有し、従って両末端に第1級アミンを有するもの。いずれのペプチドも内部リジンを有しない。結果として、スクシンイミジルエステル色素は内部エピトープを標識することなく、トリプシンペプチドをその末端でのみ標識する。
【0055】
別の態様では、トリプシン以外のプロテアーゼを使用して全タンパク質を消化してもよく、この場合も捕捉するペプチドが内部リジンを含有しない限りスクシンイミジルエステル色素を標識に使用する。そのように、ここでも選択されたペプチドの末端のみが標識される。それらのペプチドを優先的パニングペプチド(preferential panning peptide)として使用してもよい。優先的パニングペプチドを利用するために、まずペプチドに対して免疫グロブリンを産生させる。次に(例えば全細胞溶解物からの)サンプルを特定のパニングペプチドを生成するような単一のプロテアーゼまたは複数のプロテアーゼの組み合わせで消化し、ペプチドのライブラリーを得る。次いでこれらのペプチドをスクシンイミジルエステル色素で完全に標識する。大過剰量の反応性標識試薬を使用して非リジン含有ペプチドの完全な標識を確実にしてもよい。次いで、標識されたペプチドを免疫グロブリンに適用して捕捉する。
【0056】
優先的パニングペプチド上の標識の量は既知であるため、アフィニティー捕捉後に検出される標識シグナルの量によって所定のサンプル中のそれらのペプチドの量を定量することができる。ある標的タンパク質のプロテアーゼ消化から得られるそれらのパニングペプチドの数がわかれば、その数を容易にサンプル中の標的タンパク質の量に換算することができる。リジン以外のアミノ酸をこの方法で使用するための標的とすることもできる。例えば、限定された数の天然または付加したシステインを含有するタンパク質を選択または構築して、還元されたチオールを介して、マレイミドが結合した色素(例えばマレイミド結合したAlexa488(Molecular Probes、Eugene, Oregonから市販されている))で標識してもよい。
【0057】
抗原分析物の間接標識を、後の検出のために(例えば放射性原子、蛍光分子で)標識した2次抗体または抗体フラグメントを使用してサンドイッチ方式で行ってもよい。好ましい態様では、抗原に対する蛍光標識した2次抗体によって抗体のマイクロアレイに結合する抗原を検出し、抗原を標識することは不要である。更なる好ましい態様では、2次抗体は抗体フラグメントをディスプレイする標識したファージ粒子である。M13のようなファージを使用する標準的なファージディスプレイ技術を使用してscFvのような抗体フラグメントを含むファージ抗体をしてもよい。これによって、ファージディスプレイ抗体ライブラリーからのサンドイッチ検出のための試薬の、相対的に簡易および迅速な製造が可能となる。ファージ抗体が、固定化した捕捉抗体が抗原上で認識するものとは異なるエピトープを認識することを確実にするために、ファージディスプレイライブラリーからの選択を以下のような方法で実施してもよい:(1)捕捉の目的でマイクロアレイに固定化したのと同一の抗体で試験管をコーティングする、(2)試験管をブロッキングし、抗原を添加し、コーティングした抗体で捕捉する、(3)洗浄後、ファージ抗体ライブラリーを試験管内でパニングする。単離したファージ抗体(またはポリクローナルファージ抗体)は捕捉抗体が認識するエピトープとは別のエピトープとのみ結合し、従ってサンドイッチ検出方式に理想的である。
【0058】
F .接触時間
上記の方法に従って調製した表面にサンプルを暴露して結合アッセイを行うことができる。まずそれらの表面をサンプル溶液に暴露し、次いでそれぞれの具体的なアッセイに好適な時間インキュベートするが、これは予想される結合反応に必要とされる時間に大きく依存する。この過程を反復して、同時にまたは連続的に複数のサンプルを適用することができる。一般に複数サンプルの連続的な適用には間に洗浄を行う必要がある。
【0059】
VI .結合アッセイ
上記の方法に従って調製した表面を使用して、表面に結合した結合要素に高い親和性を有するサンプル中の分子をスクリーニングすることができる。特異的結合は、サンプル中の標的分子を標識する方法によって(もしあるなら)、多くの異なる方法で検出および測定してもよい。一般的な例はオートラジオグラフィーの技術を使用して、放射性同位元素であらかじめ標識した分子の結合を検出するものである。
【0060】
好ましい態様では、蛍光色素(Cy5)を使用して所定のサンプル中のタンパク質を標識した後、サンプルを機能性scFvのマイクロアレイをプリントしたスライド表面に適用した。インキュベーションおよび洗浄後、スライド表面を乾燥し、分子動力学STORMまたはArrayWorxTM光学測定器(Applied Precision, Seattle, WA)でイメージ化した。
【0061】
別の好ましい態様では、CY3のような蛍光色素で標識した2次抗体を、結合にあずかる第1の抗体を後に検出するために使用した。
当該分野で知られる種々の検出方法(いくつかをあげると、例えば質量分析、表面プラスモン共鳴(surface plasmon resonance)、および光学分光法)を本発明に使用して、結合標的が全く標識されなくても結合を検出することができる。
【0062】
VII .アッセイ結果の分析
A .サンプル中の存在/不在の検出
本発明を使用して生物学的サンプルにおける、興味の分子への結合パートナーの存在または不在を確認することができる。
【0063】
B .サンプル間の比の測定
異なる細胞集団における(例えば正常および疾病状態間での)遺伝子およびタンパク質発現の比を比較によって計算できる。
【0064】
VIII .適用/実用
本発明によって研究できる生物学的に重要な分子には、限定される訳ではないが、シグナル伝達、アポトーシス、二量体化、遺伝子調節、細胞周期および細胞周期チェックポイント、そしてDNA損傷チェックポイントに関与するものがあるので、本発明は生物科学および医学の研究に広く適用できる。
【0065】
通常の技術を有する当業者にも評価されるように、タンパク質アレイは、タンパク質と生体高分子以外の別な種類の分子との間の相互作用を検出するのにも有用であり得る。例えば本発明のアレイは、いくつかあげると触媒、物質研究、情報保存、分離科学の分野でも有用であり得る。
【0066】
A .標的の発見
通常の技術を有する当業者に評価されるように、非常に高い空間密度を有するタンパク質のアレイの生成によって、所定のタンパク質集団および生体高分子間に起こる結合および/または活性化事象の検出が容易になる。従って本発明は、ある観点では、分子パートナーを同定し、生物学的に重要な高分子の結合標的を発見する方法を提供する。パートナーは、興味のある特定の高分子に結合して興味のある生体高分子を活性化または阻害する能力のあるタンパク質であってもよい。一般に、この方法は以下を含む:(1)上記のような1つ以上のタンパク質のアレイを提供し、ここでタンパク質のアレイはcm2当たり少なくとも1,000スポットの密度を有し;(2)アレイを1つ以上の型の興味のある生体高分子と接触させ;そして(3)特定のタンパク質および高分子パートナー間の相互作用を測定する。
【0067】
特に好ましい態様では、本発明のアレイを使用して遺伝生化学の研究のための化合物を同定する。伝統的な遺伝学では、DNA配列における不活性化(例えば欠失または“ノックアウト”)または活性化(例えば腫瘍発生性)変異のいずれかを使用して、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の機能を研究する。遺伝生化学はそのかわりに小分子の使用を含むが、この小分子はそれらが結合するタンパク質の機能を変更し、それによってタンパク質の機能を不活性化または活性化するものである。当然、これはもっとも最近認可された小分子薬剤の作用の基礎である。本発明は、“チップ様”技術を開発して小分子および興味のある特定のタンパク質の間の相互作用の迅速な検出を確実にすることを含む。本発明の方法および組成物を使用して、遺伝生化学の研究に使用するための小分子リガンドを同定することができる。通常の技術を有する当業者に認識されるように、本発明の組成物および方法を、高密度のタンパク質フォーマットを必要とする他の目的に利用することができる。
【0068】
B .シグナル変換
本発明で実施される結合アッセイの別の好ましい態様は、小分子によるタンパク質−タンパク質相互作用の変調(modulation)の研究である。これらのアッセイでは種々の分子による同族の結合の促進または競合のいずれかを測定し、種々の条件下での結合動力学の観点の理解を深める。代表的な態様では、捕捉タンパク質を支持体表面上に結合させてマイクロアレイを成し、同族リガンドを添加して捕捉タンパク質に結合させる。捕捉タンパク質およびその同族リガンド間の結合をモニタリングし、薬剤候補となりうる小分子が存在する場合としない場合とで比較する。好ましい態様では、捕捉タンパク質の、種々の小分子の作用を受ける種々のリガンドとの種々の相互作用を、マイクロアレイチップ上で多重様式で調査する。
【0069】
タンパク質相互作用は多くの場合、結合モチーフと呼ばれる場合もあるドメインを通して起こる。タンパク質相互作用の制御に有効な小分子が作用すると最も考えられるのはこれらの領域においてである。しかしながら、ファミリー内のタンパク質は結合モチーフの形成に関与する相同配列を共有する傾向があり、これらのモチーフを含有するタンパク質は多くの場合、同様の機能を有する。それらのタンパク質機能を制御する薬剤のスクリーニングにおける問題はこれらのスクリーニングにおいて特異性を得ることであり、これはタンパク質の結合モチーフファミリーのあいだで標的が同様の構造であり、同様の結合特性を有するためである。ここに開示するタンパク質マイクロアレイ技術によって、多数のモチーフ含有タンパク質ファミリーメンバーを制御するための小分子の特異性の測定の段階が効率的かつ容易に反復できるものになり、薬剤スクリーニングの工程が非常に容易になる。
【0070】
代表的な態様では、細胞アポトーシスに影響を及ぼすことが知られているBcl−2ファミリーの制御を研究する。これらのタンパク質は4つのBcl−2相同領域(BH1−4)の組み合わせと相同性を共有する。Bcl−2ファミリータンパク質は、ミトコンドリアおよび小胞体で膜の挙動およびイオンチャンネル機能を制御することによって細胞をアポトーシスから保護するか、またはアポトーシスを促進するように機能する。抗アポトーシスファミリーのメンバーであるBcl−2、Bcl−XL、およびMcl−1は4つのドメイン全てを含有する。プロアポトーシス(pro−apoptotic)メンバーの最大の群であるBad、Bik、Bid、Bag−1、HRK、およびNoxaはBH−3ドメインのみを含有し、プロアポトーシスタンパク質であるBaxおよびマルチドメインプロアポトーシスタンパク質はBH−1、BH−2、およびBH−3ドメインを含有する。
【0071】
本発明の方法を使用してアポトーシス制御タンパク質のファミリー全体の機能を制御する小分子をスクリーニングすることができる。それらの小分子はBH−3タンパク質の機能を擬態して薬剤候補として役立ちうる。図3Aおよび3Bに関連して、Bcl−2ファミリーのアポトーシス制御タンパク質からの組換え融合タンパク質を標準的な方法で調製し、上記のようなBSA−NHSガラススライドまたはアルデヒド誘導体化ガラススライド10上にリンカー20を介して結合要素30としてプリントしてマイクロアレイとしてもよい。これらのタンパク質(例えば完全長Bcl−XLタンパク質)のリガンド80を、小分子90(例えばBcl−2ファミリータンパク質BAKからのBH−3含有ペプチドまたはBH−3含有ペプチドを擬態する小分子)の不在下または存在下で添加してもよい。リガンド80を蛍光色素(例えばCy5)で標識してもよい。プリントされるタンパク質、リガンド、または小分子の濃度は単独で、または他と組み合わせて変化しうる。その後スライドをArrayworxスキャナーのような光学測定器を使用して測定し、そして/または市販の質量分析チップを使用して質量分析によって確認してもよい。結合したリガンドから得られるシグナルの増加または減少を使用して小分子の制御の役割が亢進的制御か抑制的制御かに関わらず、図表化することができる。本発明の方法を使用して、複数の捕捉分子、複数のリガンド、および複数の小分子を単一のアレイ支持体(例えば96ウェルプレート)上で並行してスクリーニングすることができ、薬剤スクリーニングの効率が非常に向上する。より詳細な例は実施例のE(iii)に見られる。
【0072】
シグナル変換の研究における本発明の適用の別の例は、マルチドメインを含有するBcl−2ファミリーメンバーのBH−4領域を介するアポトーシス経路においてタンパク質−タンパク質結合を阻害する小分子のスクリーニングである。
【0073】
C .タンパク質発現
現在まで、標識した細胞抽出物におけるマイクロアレイに基づくタンパク質の検出に関する報告は発表されていない。細胞表面タンパク質の標識および検出によって複数の細胞表面抗原の並行したプロファイリングが可能となる。細胞表面分子のプロファイリングにおける技術水準はフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡によるものであり、現在は1つのサンプルで2−5個の異なる抗原をプロファイリングできる。理論的には抗体アレイによって無数の抗原の検出が可能である。更に、抗体アレイは細胞内タンパク質およびタンパク質修飾(例えばリン酸化)を発現と並行して検出できる可能性を有する。
【0074】
代表的な態様では、c−ErbB2、EGFR、およびトランスフェリン受容体のような細胞表面タンパク質に対するモノクローナル抗体を、GMS417アレイヤーによってBSA−NHSスライド上に配列させる。類表皮ガン細胞系A−431または乳ガン細胞系SK−BR−3のようなガン細胞系からの生きた細胞をサンプル細胞として使用してもよい。好ましくは細胞表面タンパク質を、ポリエチレングリコールのような親水性ポリマー部分を含有し、良好な特異性を示し、低バックグラウンドであり、細胞内のタンパク質を標識しない色素で標識する。それらの色素の一例はShearwaterから販売されているフルオレセイン−PEG2000−NHS色素である。標識および洗浄した後、細胞を溶解する(例えばSDS中で)。次いで、総標識タンパク質を抗体マイクロアレイ上でインキュベートして結合を起こさせ、その後スライドを光学測定器でスキャニングする。結果として、A−431細胞系はEGFRを過剰発現するがErbB2はしないことが確認された。同様に、SK−BR−3細胞系はErbB2を過剰発現するがEGFRはしないことが確認された。
【0075】
D .翻訳後修飾
タンパク質機能は多くの場合、(いくつかをあげると)ミリストイル化(myristoylation)、ゲラニル−ゲラニル化、もしくはファルネシル化によって得られるような糖複合体、脂質アンカーの添加のような翻訳後修飾によって、またはリン酸化によって制御される。リン酸化または脱リン酸化によるタンパク質機能の制御は細胞のシグナル変換の中核をなす。
【0076】
本発明の方法を使用して翻訳後修飾事象の研究またはリン酸化部位の同定ができる。好ましい態様では、scFvのような抗体フラグメントをマトリックス支援レーザー脱離イオン化(Matrix−Assisted Laser Desorption/Ionization;MALDI)チップにプリントしてタンパク質中の既知のリン酸化部位、および疑いのあるリン酸化部位のリン酸化を検出する。反応性表面であるMALDI質量分析表面へのタンパク質の結合は米国特許第6,020,208号に記載されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。チップはCiphergen Biosystems(Freemont, CA)から市販されている。代表的な態様では、アポトーシスタンパク質Bcl−2、Bad、およびカスパーゼ9に対するリン特異的抗体を反応性表面MALDIチップに結合させ、これらのタンパク質のリン酸化されたフラグメントの選択的捕捉に使用する。チップを飛行時間型質量分析を使用して、質量を分析することができる。
【0077】
本発明の方法は更に、質量分析と合わせて組換え1本鎖抗体(scFv)を使用し、既知または未知のリン酸受容残基上におけるリン酸化事象の発生を検出する新しい方法を提供する。この方法は近接リン親和性マッピング(proximal phospho−affinity mapping)と呼ばれており、作製が困難であることが知られているIMACの使用またはリン特異的抗体の使用によらない別の方法として役立つ。
【0078】
図2に関連し、この方法の態様は組換え1本鎖抗体(scFv)、ポリクローナル抗体、またはモノクロール抗体30を使用するが、これはリン酸化部位70そのものの代わりに、リン酸化部位70がリン酸化について確認されているか、またはその疑いがあるかに関わらず、部位70に近接する同一抗原上のエピトープ50を認識するように設計されている。エピトープ50は、エピトープ50とリン酸化部位70との間の距離がリン酸化事象によって抗体認識が妨害されないようなものである限り、5−10アミノ酸程度まで近接していてもよい。それらの抗体または抗体フラグメント30(リンカー20を介して支持体表面10に結合している)は抗原(例えばトリプシンペプチド)がリン酸化されているかいないかに関わらず、抗原60を認識する。代表的な態様では、トリプシンもしくはV8のようなプロテアーゼを使用して、またはCNBrのような非酵素法によってペプチドを生成する。これによってペプチドフラグメントが生成され、これはその独自のサイズによって同定できる。これらのフラグメントの中に既知の、または予測されるリン酸化部位を含有する標的フラグメント60がある。1本鎖抗体または伝統的な抗体を、標準的なパニング方法を使用して、トリプシンフラグメント60中のリン酸化部位70に近接するエピトープ領域50に相当する合成ペプチドに対してパニングまたは免疫化する。エピトープ50はわずか3−7アミノ酸から成る。生成される抗体または抗体フラグメントをMALDI反応性チップに結合させた捕捉分子として使用してもよい。次いでチップを使用して、リン酸化を示す特徴的な質量変化を検出してもよい。この方法によって並行した精製/同定およびリン酸化の分析が可能となるため、リン酸化のスクリーニングための価値のある検出手段となる。また、この方法に従って生成される抗体または抗体フラグメントはリン酸化状態および非リン酸化状態のいずれでも標的ペプチドを認識するので、この方法はリン酸化に影響を及ぼす事象および条件の研究にも有用である。
【0079】
特に好ましい態様では、ペプチド60を以下のように選択する:まず、タンパク質の配列情報を含有するデータベースでサーチしてキナーゼ基質のコンセンサス配列を標的タンパク質中に配する。次いで、種々のプロテアーゼの消化マップの比較によってそれらのコンセンサス配列を含有するペプチドを選択する。約20アミノ酸のペプチドが好ましい。最後に選択したペプチド上のキナーゼ基質コンセンサス配列以外のエピトープを選択して抗体または抗体フラグメントを産生させる。
【0080】
E .細胞オルガネラ
本発明の方法を使用して全細胞抽出物または全細胞抽出物の画分からの細胞オルガネラを捕捉することもできる。好ましい態様では、ミトコンドリア膜と独自に会合する電圧依存性アニオンチャンネル(“VDAC”)受容体を認識する抗体を前述のようにプリントした後、緑色蛍光を結合させたチトクロームc発現ミトコンドリアを捕捉させる。電位差特性を有する色素を使用して無傷の電圧グラジエントを有するミトコンドリアを特異的に標識することができる。異なる状態の細胞からの捕捉されたミトコンドリアまたは他のオルガネラの検出を使用してアポトーシスまたは他の細胞事象の発生を示すことができる。
【0081】
F .その他
本発明の方法を他の適用、例えば組織タイピング、疾病診断、および治療の評価に使用してもよい。遺伝的障害が明らかになりうる患者からの生物学的サンプル(WO89/11548号。参照によって本明細書に組み込まれる)を本発明に使用してもよい。同様に、本発明を使用して所定のサンプルにおけるタンパク質発現の異常、抗原または毒物の存在を検出することができる。更に、本発明の方法を使用して、薬剤、医薬リード化合物、または環境因子の変化への暴露に対する生体、組織、または個々の細胞からの応答を評価することもできる。
【0082】
実施例
A .基質表面の調製
( i )ガラススライドのストリッピングおよび反応基の再充填の方法
好ましい方法の一例は以下の通りである:まず平らなガラススライド(例えばVWR Scientific Products)をピラニア(piranha)溶液(濃H2SO4および30% H2O2の70:30 v/v 混合液)中、室温で12時間洗浄する。(注:“ピラニア”溶液はいくつかの有機物質と激しく反応するので、十分注意して操作すべきである)。水で完全に洗浄した後、スライドをシラン溶液(例えば95%エタノール中の3−アミノプロピルトリエトキシシランの3%溶液)で処理する。また、スライドの処理の前に、シラン溶液を少なくとも10分間撹拌して加水分解およびシラノール形成をさせてもよい。次いでスライドをエタノールまたは同様の溶液に軽く浸漬し、遠心分離して過剰のシラノールを除去する。その後、吸収されたシラン層を硬化させる(例えば115℃で1時間)。冷却後、スライドをエタノールまたは同様の溶液で洗浄して未結合の試薬を除去する。
【0083】
単純な半定量的方法を使用してスライド表面上のアミノ基の存在を確認することができる。アミノ誘導体化したスライドを5 mLの50 mM 重炭酸ナトリウム(pH8.5)で簡単に洗浄する。その後スライドを、0.1 mMのスルホ−スクシンイミジル−4−O−(4,4’−ジメトキシトリチル)−ブチレート(s−SDTB;Pierce, Rockford, IL)を含有する50 mM 重炭酸ナトリウム(pH8.5)5 mLに浸漬し、30分間激しく撹拌できる。(s−SDTB溶液の調製は3.03 mgのs−SDTBを1 mLのDMFに溶解し、50 mM 重炭酸ナトリウム(pH8.5)で50 mLに希釈して行う)。30分間インキュベートした後、スライドを20 mLの蒸留水で洗浄し、その後5 mLの30%過塩素酸で処理することができる。橙色の溶液となれば、これはスライドがアミンでうまく誘導体化されたことを示す;未処理のガラススライドでは色の変化が見られない。酸処理によって遊離される4,4’−ジメトキシトリチルカチオン(E498nm=70,000 M−1cm−1)の定量はおおよそnm2当たり2アミノ基の密度を示す。
【0084】
B .基質へのリンカーの付加
( i )リンカーとしての BSA
ウシ血清アルブミン(BSA)の固定化層の表面上に活性化されたアミノ基およびカルボキシル基をディスプレイするBSA−NHSスライドを以下のように製作した:10.24 gのN,N’−ジスクシンイミジルカーボネート(100 mM)および6.96 mlのN,N’−ジイソプロピルエチルアミン(100 mM)を400 mlの無水N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。30枚のポリリジンスライド(例えばCMT−GAPスライド(Corning Incorporated, Corning, NY))はその表面にアミノ基をディスプレイするが、これをこの溶液に室温で3時間浸漬した。これらのスライドを95%エタノールで2回洗浄し、その後1% BSA(w/v)を含有するリン酸バッファー溶液(PBS)(pH7.5)400 mlに室温で12時間浸漬する。スライドを更にddH2Oで2回、95%エタノールで2回洗浄し、200 gで1分間遠心分離して過剰の溶媒を除去した。次いで100 mMのN,N’−ジスクシンイミジルカーボネートおよび100 mMのN,N−ジイソプロピルエチルアミンを含有するDMFの400 mlにスライドを室温で3時間浸漬した。スライドを95%エタノールで4回洗浄し、上記のように遠心分離してBSA−NHSスライドを得た。スライドはデシケーター中で真空下、室温で保存し、2ヶ月まで顕著な活性の喪失が見られなかった。
【0085】
( ii )リンカーとしてのマレイミド( malemido )
マレイミド誘導体化したスライドを以下のように製造した:平らなガラススライドの表面を実施例A(i)に記載するように“充填”(例えば再シラン化)した後、得られたスライドをスライドサイズのポリジメチルシロキサン(PDMS)反応容器に移した。それぞれのスライドの片面を50 mM重炭酸ナトリウムバッファー(pH8.5)中の20 mM N−スクシンイミジル3−マレイミドプロピオネートで3時間処理した(この溶液の調製は、N−スクシンイミジル3−マレイミドプロピオネートをDMFに溶解し、バッファーで10倍に希釈して行った)。インキュベーション後、プレートを蒸留水で数回洗浄し、遠心分離で脱水し、室温で真空下、更なる使用まで保存した。得られたスライド表面はマレイミド末端を有する。
【0086】
C .結合要素の調製
( i )システイン標識した scFv の製造および精製
scFv C6.5はヒト腫瘍抗原c−erbB−2の細胞外領域に1.6×10−10 MのKdで結合する。抗体をSchierら(1996), J. Mol. Biol. 255(1):28−43に記載されるようなアフィニティー選択法を使用して単離した。
【0087】
その後scFv C6.5の遺伝子をpUC−119−(Hexa−His)−Cys発現ベクターにサブクローニングし、これによってscFvのCOOH−末端にヘキサ−Hisタグ、次いで1個のシステインが付加された。タンパク質を発現させ、固定化した金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用して精製した。C6.5の結合親和性変異体を相補的結合領域(CDR)の変異誘発によって作製し、誘導変異体の親和定数[C6.5ML 3−4(Kd=3.4×10−9)およびC6.5 G98(Kd=1.6×10−9)]をBiaCoreを使用して測定した(Schierら, 1996bに記載される)。システインタグを付したscFv C6.5、C6.5 ML3−4、およびC6.5 G98を使用してガラス表面に化学的に結合させたscFvによるリガンドの捕捉を証明した。これらのscFvのCOOH末端システインの還元されたスルフヒドリルによってチオールが生成され、これを使用してマレイミド基で機能化したガラス表面にscFvを結合させることができる。
【0088】
( ii )マレイミドリンカーにコンジュゲートさせるための scFv の還元
精製したscFvを5 mMシステアミン(SIGMA)を使用して25℃で1時間還元し、P10スピンカラムを使用してリン酸バッファー溶液(PBS)(pH7.0)に交換した。
【0089】
D .マイクロアレイを使用するアッセイ
( i )蛍光のスキャニングスライド
Array WoRoxTMスライドスキャナー(AppliedPrecison, Issaquah, WA)を使用してスライドをスキャニングした。スライドをピクセル当たり5μmの解像度でスキャニングした。入射光および放射光のいずれにもダブルフィルターを使用した。フルオレセインの蛍光はFITC/FITC 励起/放射フィルターセットを使用して観察し、Cy3の蛍光はCy3/Cy3 励起/放射フィルターセットを使用して観察し、Cy5の蛍光はCy5/Cy5 励起/放射フィルターセットを使用して観察した。
【0090】
E .マイクロアレイの適用
( i ) scFv 修飾したガラス表面上での標識したペプチドの親和捕捉
細胞表面タンパク質の定常状態トリプシン開裂を、SKBR3(ヒト乳ガン)またはSKOV3細胞について、TPCK処理したトリプシンを使用して4℃で行った。トリプシン消化物をMALDI質量分析法を使用して測定したが、SKOV3細胞について図4Aに示す。約0.5μlの消化物をMALDI表面に負荷し、以下から成るマトリクスで包埋した:ケイ皮酸飽和50%アセトニトリル、0.5%トリフルオロ酢酸(Triflour and acetic acid)。消化物をプロテアーゼ阻害剤で処理し、トランスフェリン受容体のエクトドメインに対する精製した6×His−scFv 1μgと共にインキュベートした。Ni−NTAセファロースビーズを使用してscFv−ペプチド複合体を消化物から精製した。ビーズを洗浄した後、上記のケイ皮酸マトリクスに包埋した。マトリクスで溶出したペプチドの質量分析を行った(図4Bに示す)。エピトープを含有するトリプシンペプチドを、EXPASYシリーズ(suite)からのペピデント(pepident)プログラムを使用して同定した。コントロール実験のために、CHO細胞で発現したHAタグ化したトランスフェリン受容体を、セファロースビーズに結合した抗HA IgGを使用して免疫沈降させた。精製したタンパク質を、HAペプチドを使用してビーズから脱離し、固定化したTPCK処理トリプシンで消化した。scFvエピトープを含有するペプチドをH7 scFvを使用して精製し、上記のように質量分析を行ったが、これを図4Cに示す。トランスフェクトしたトランスフェリンタンパク質はそのアミノ末端にHAエピトープ配列を含有する(細胞内ドメイン)。このタグは細胞外特異的標識のためのコントロールとして役立つ。
【0091】
精製したトランスフェリン受容体および細胞表面タンパク質のトリプシン消化物を第1級アミン反応性色素NHS−CY−5で標識し、PBSに対して透析した。次いで標識したペプチドを、10 mg/mlのBSAおよび0.05% Tween 20を含有するPBSで0.2 mg/mlの濃度に希釈し、トランスフェリン受容体に対するscFv(H7)で誘導体化したガラススライドの表面上でインキュベートした。加湿チャンバー内で一晩、4℃でインキュベートした。CY−5標識されたペプチドの結合を、蛍光スキャナーを使用して測定した。図4Dに実験結果を示すが、これはトランスフェリン受容体が種々の濃度のH7 scFvに結合することを示している。HAエピトープは細胞内ドメイン上にあるので、ここでは抗HA IgGがネガティブコントロールとなる。
【0092】
( ii )マレイミド誘導体化したガラススライドに結合した scFv の機能性の試験
マレイミド誘導体化したガラススライド表面上のスポットの輪郭を疎水性のペンで描いてサンプルが分散しないようにした後、実施例C(ii)に記載するように還元したscFv 1.0μgを、加湿チャンバーにおいて4℃で12時間、ガラス表面に結合させた。チオールを含有する末端システインは、おそらくチオエーテル結合によって、マレイミド基に容易に結合する。チトクロームcおよびBcl−2に対するモノクローナル抗体、および末端システインを含有しないscFvを2−イミノチオラン・HCl(トラウト試薬)で処理して表面に暴露したリジンにスルフヒドリル残基を導入した。その後これらの抗体を上記のように還元し、コントロールとして使用した。結合後、スポットの洗浄を、2% BSA、0.05% Tween 20、および1.0 mM β−メルカプトエタノールを含有するPBSを用いて、25℃で15分間、3回行った。同族リガンドまたはネガティブコントロールを、2% BSA、0.05% Tween 20を含有するPBS中、10.0 pMから0.01 pMの範囲の濃度で好適なスポットに添加し、加湿チャンバーにおいて4℃で2時間インキュベートした。
【0093】
ある場合には、40%グリセロールをスポット混合物に添加し、scFvのマイクロアレイ化を容易にしたが、これはサンプルがサブマイクロリットルの容量でスポッティングした場合でも乾燥しないためである。scFv C6.5およびscFvF5では、40%グリセロールはscFv結合の機能に不利な効果を有さなかった。
【0094】
scFv 6.5の同族リガンドは精製したerbB−2受容体である。erbB−2の組換えエクトドメインを標準的な方法を使用してCHO細胞から発現させ、精製した。NHS−CY5単機能色素(AMERSHAM)を使用して、色素/タンパク質の最終モル比5.0でタンパク質を標識した。標識化反応は0.1 M炭酸ナトリウムバッファー中、25℃で30分間実施し、P10スピンカラムを使用してPBSに交換した。コントロールとして使用した他のタンパク質(Bcl−2、チトクロームc、およびBSA)は上記のようにCY−5で同様に標識した。標識したタンパク質を、ファージ生成した抗体またはモノクローナル抗体のいずれかでの免疫沈降によって免疫原性について試験し、その後ガラスに結合したscFvのリガンドとして使用した。erbB−2タンパク質を2% BSAを含有するPBS Tween20中、1μMから1 pMの範囲で、加湿チャンバーにおいて25℃で2時間インキュベートした。CY5標識したerbB2をネガティブコントロールとして使用した。
【0095】
インキュベーション後、サンプルをPBS、0.05%Tween 20で2分間、3回、そしてPBSで1回洗浄した。サンプルを乾燥させた後、分子動力学STORM上で640 nmの励起光を使用してイメージ化した。
【0096】
( iii )シグナル変換における小分子
Bcl−2ファミリーのアポトーシスを制御するタンパク質からの組換え融合タンパク質を標準的な方法で調製し、BSA−NHSガラススライドまたはアルデヒド誘導体化ガラススライドのいずれかにプリントした。タンパク質は、40%グリセロール含有バッファー中、ミリリットル当たり200から20マイクログラムの濃度範囲でプリントした。プリンティングは記載のようにGMS 417リング・アンド・ピン・プリンターを使用して行った。プレートに捕捉タンパク質サンプルを負荷した;GMS417プリンターでのプリンティングのための96ウェルプレート。タンパク質を反応性スライド上、わずかに水分を補給した条件下、4℃で12時間インキュベートした。結合反応が完了した後、PBSおよび蛍光色素で標識した同族リガンドの変異体でスライドを洗浄した。Arrayworx光学測定器を使用して検出した。
【0097】
プリントしたタンパク質はBcl−XLおよびBAXのGST融合体、および6×ヒスチジンタグ化したBcl−XLであった。これらのタンパク質のリガンドは完全長のBcl−XLタンパク質およびBcl−2ファミリーのタンパク質BAK由来のBH3含有ペプチドであった。ペプチドをAlexa 488で標識し、完全長のタンパク質をCY5で標識した。GMSプリンターから運搬される液体の容量はストローク当たり50−70 pLで5回反復する。スポット当たり350 pgから350 fgの範囲のタンパク質を運搬した。プリントした後、タンパク質を加湿チャンバーにおいて4℃で12時間、インキュベートした。その後PBSでスライドを洗浄し、10%BSAを含有するPBSで5分間ブロッキングした。表面の反応性およびタンパク質の結合効率を測定するために、GST融合タンパク質の存在のモニタリングを、標識した抗GST標識抗体を1 ng/mlで使用して行った。
【0098】
標識したタンパク質リガンドを、疎水性バリアーによる1 cm2のエリアに含有させた40μlの容量でインキュベートした。
その後スライドを洗浄し、Arrayworxスキャナーで測定した。更に、図5(質量分析プロファイル)に示すように、Bax−GSTタンパク質によるリガンドの結合が左図で確認され、GSTタンパク質では結合しないことが右図に示されている。
【0099】
図6は、未標識の小分子(ここではBH3ペプチド)が捕捉分子(Bax−GST融合タンパク質)を巡って標識されたリガンド(ここではBcl−XL)と競合する能力を有することが確認されている。4つの質量分析プロファイルに示すように、BH3ペプチドの量の増加に伴って、標識されたリガンドと捕捉タンパク質との間の結合が減少することが観察された。これによって、捕捉タンパク質とリガンドとの間の相互作用が実際にBH−3ドメインに帰することができることが確認された。BH−3タンパク質−タンパク質相互作用を特異的に促進することが確認されている小分子を使用して同じ型の実験を実施し、予想通り、捕捉分子(Bakペプチド)によるリガンド(Bcl−XL)結合の向上が観察された。
【0100】
その後、Bcl−2ファミリーのメンバーの機能に作用することが知られている3つの薬剤と競合させるリガンドとしてBH3ファミリーのいくつかのペプチドを種々の濃度で使用し、これらの実験を反復した。それぞれの場合にBcl−XLを捕捉タンパク質としてBSA−NHSガラススライド上にプリントした。スライド上に捕捉された標識されたリガンドの検出された蛍光を図7Aおよび7B中の欄に示した。異なる薬剤は同一ファミリーからの2つのリガンドで異なる特異性を示した。Bak(図7A)では阻害効果が実質的に全ての場合で観察されたが、Bid(図7B)では、PNASまたは相対的に低濃度のアンチマイシンはその結合の阻害が見られない。この実験は、標的タンパク質の大ファミリーの各メンバーに関して候補となる薬剤の特異性をマッピングするのに有用でありうる。
【0101】
( iv )細胞表面タンパク質発現
ガン細胞系における細胞表面抗原の発現を検出するためにモノクローナルおよびscFv抗体をガラスマイクロアレイ上にプリントした。c−ErbB2、EGFR、およびトランスフェリン受容体に対する抗体をBSA−NHS活性化ガラススライド上にプリントした。モノクローナル抗体では、蛍光色素で標識した2 ng/mL未満の組換え抗原を検出した。細胞抽出物における抗原の検出のために、ガン細胞系の細胞表面をNHSに基づく色素を使用して蛍光で標識した。これによっていくつかのガン細胞系のc−ErbB2およびEGFRの差次細胞表面発現の検出が可能となった。トランスフェリン受容体は直接標識法を使用して検出しなかった;しかしながら、マイクロ・サンドイッチ法を使用する場合、トランスフェリン受容体も検出した。
【0102】
c−ErbB2、EGFR、およびトランスフェリン受容体(TfR)に対するモノクローナル抗体をGMS 417アレイヤー上で配列させた。抗体を40%グリセロール中でスポッティングし、BSA−NHSスライド上でのスポットの乾燥を防止した。抗体を冷所で一晩スライドと反応させた。得られたスポットのサイズは375マイクロメーターの間隔で(中央から中央)約150マイクロメーターであった。
【0103】
スライドを0.5 Mグリシン中で30分間、次いでBSA中で更に30分間ブロッキングし、その後サンプルを添加した。複数のサンプルを単一のスライド上で処理する場合、抗体スポットの群を疎水性のペンで描いて分離し、スライド当たり24サンプルまで処理できるようにした。あるいはまた、抗体スポットの群を粘着性テフロン(登録商標)マスクを使用して分離し、スライド当たり50以上のサンプルを処理できるようにした。
【0104】
サンプルは通常、Cy3またはCy5−NHS色素を用いて室温で1時間標識し、未反応の色素をゲル濾過で除去する。この研究で使用した細胞系は乳腺ガン細胞系SKBR3および類表皮ガン細胞系A−431であった。色素フルオレセイン−PEG2000−NHS(Shearwater)をPBS中10 mg/mLで使用して氷上で2時間、細胞表面を標識し、細胞を洗浄して未反応の色素を除去した後、TBS中の0.25%SDSに可溶化した。組換えタンパク質抗原を0.1%Tween−PBS中の2%BSA中でインキュベートした。BSAを含有しない溶解バッファー中で細胞溶解物をインキュベートした。サンプルと共に2から3時間インキュベートした後、洗浄バッファーを含有するビーカーに迅速に浸水することによって、4×10回:TPBS中で20回、次いでPBS中で20回、スライドを洗浄した。Array WoRxスライドリーダーを使用して蛍光を検出した。
【0105】
感度:
連続希釈したAlexa488で標識したErbB2およびCy5で標識したEGFRと共にマイクロアレイをインキュベートした。洗浄後、スライドをArrayWoRxでスキャニングした。図8に示すように、TfR抗体#3以外、全ての抗体はそれぞれErbB2、TfR、およびEGFRを捕捉できた。1.6 ng/mLという低希釈でタンパク質の捕捉を検出できた。
【0106】
細胞表面抗原の検出:
乳腺ガン細胞系SKBR3および類表皮ガン細胞系A−431をコンフルエントになるまで増殖させ、細胞表面を色素フルオレセイン−PEG2000−NHSで標識した。標識に続いて細胞を洗浄して未反応の色素を除去し、細胞を0.25%SDS中で溶解した。その後、標識されたタンパク質全体(約50,000細胞に相当)を抗体マイクロアレイ上で2時間インキュベートし、スライドをArray WoRxでスキャニングした。図9に示すように、A−431細胞系はEGFRを過剰発現するがErbB2はしない;SK−BR−3細胞系はErbB2を過剰発現するがEGFRは低レベルにしか発現しない。この2つの細胞系における2つの受容体の差次発現はフローサイトメトリーによって確認する(例えばA−431細胞において細胞当たり>106 EGFR受容体)。
【0107】
異なる方法では、細胞タンパク質を蛍光で直接標識しなかった。それに代わり、アレイに結合する抗原を、抗原に対する蛍光標識した2次抗体で検出した。この“サンドイッチ”検出法の感度は直接標識した組換え抗原で観察されるものと同様であった。
【0108】
ある実験で、抗体を前述のようにマイクロアレイにプリントし、未標識の抗原と共に2時間インキュベートした。Cy5(EGFRの検出)またはCy3(TfRの検出)で標識した抗原に対する2次抗体で結合を検出した。結果を図10に示す:凡例に示すモノクローナル抗体は約25 ng/mLで良好な感度を示す。
【0109】
同じサンドイッチ法を、Cy5で標識したscFv F5のようなファージディスプレイした抗体を使用して実施した。
細胞抽出物中の抗原を検出するために、細胞系(A431またはSKBR−3)を0.25% SDS中で溶解し、抽出物を抗体アレイと共に2時間インキュベートした。洗浄後、結合した抗原を蛍光モノクローナル抗体(EGFRおよびTfR)またはファージ抗体(ErbB2)で検出した。図11に示すように、サンドイッチ法を使用して、両細胞抽出物において3つの抗原、EGFR、ErbB2、またはTfRの全てを検出した。抗EGFR抗体によってA431細胞系およびSKBR−3細胞系におけるErbB2の差次発現が検出された(>10倍の差異)。同様に、抗ErbB2ファージ抗体によって2つの細胞系におけるErbB2の発現の差異が検出された。予想通り、トランスフェリン受容体発現の場合、2つの細胞系間で発現の顕著な差異は検出されなかった。
【0110】
本明細書において上に引用した全ての文書、特許、出版物は参照によってここに組み込まれる。本発明の種々の修飾および変更は、本発明の範囲および意図から逸脱することなく、当業者に明白である。本発明について特定の好ましい態様と関連して記載したが、請求する本発明はそれらの特定の態様に過度に制限されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、本発明を実施するために記載した様式の種々の修飾で当業者に明白なものは、本発明の範囲内にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1Aは、支持体表面を処理してBSA分子をそれに結合させ、BSA分子を活性化するための代表的な段階を示す。
図1Bは、捕捉タンパク質を活性化したBSA分子に結合させるための代表的な段階を示す。
【図2】近接リン親和性マッピングを示す。
【図3】図3A、3Bは、タンパク質−タンパク質相互作用を調節する小分子を研究する態様を示す。
【図4】図4Aは、SKOV3細胞のトリプシン消化物からの定常表面タンパク質の質量分析の概要である。
図4Bは、ペプチドがNi−NTA SELDI表面上でscFv H7によってアフィニティー捕捉されることを示す質量分析図である。
図4Cは、コントロール実験の結果を示す質量分析図である。
図4Dは、CY−5で標識したトランスフェリン受容体エクトドメインのトリプシンペプチドの捕捉を示す。
【図5】ネガティブコントロールに対する捕捉分子としての融合タンパク質による結合を示す質量分析図である。
【図6】SELDI表面上で小分子が結合要素をめぐってリガンドと競合することを示す質量分析図である。
【図7】図7A、7Bは、小分子の存在下または不在下で固定化した結合要素に結合したリガンドから検出された蛍光単位を示す。
【図8】種々の濃度の標識されたEGFR、TfR、またはErbB2を捕捉したマイクロアレイの蛍光スキャンを示す。
【図9】抗体マイクロアレイに捕捉された細胞溶解物由来の標識された細胞表面タンパク質を示す蛍光スキャンである。
【図10】標識された2次抗体によって未標識の抗原の捕捉を検出するマイクロアレイの蛍光スキャンである。
【図11】細胞溶解物由来の抗原の結合を検出する蛍光スキャンである。検出は標識された2次抗体による。
Claims (72)
- 以下のもの:
固体支持体;
該固体支持体に共有結合するリンカー;および
該リンカーと共有結合を形成する能力のある末端を有するタンパク質またはタンパク質フラグメント
を含有する、タンパク質マイクロアレイ。 - 該末端がカルボキシ末端である、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 該固体支持体がガラスである、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 該リンカーがマレイミド基を含む、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 該リンカーがビニルスルホン基を含む、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 該リンカーがN−ヒドロキシスクシンイミド基を含む、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 該タンパク質またはタンパク質フラグメントが抗体または抗体フラグメントである、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 該抗体または抗体フラグメントが1本鎖抗体である、請求項7記載のマイクロアレイ。
- 該マイクロアレイがcm2当たり少なくとも1,000スポットを有する、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 該マイクロアレイがcm2当たり少なくとも2,000スポットを有する、請求項1記載のマイクロアレイ。
- 支持体表面にタンパク質を結合させる方法であり、該方法が以下の段階:
(a)ウシ血清アルブミン分子を支持体表面に共有結合させ;
(b)該分子の露出面上に活性化カルバメート基または活性化エステル基を形成し;そして
(c)該活性化カルバメート基または該活性化エステル基をアミンを含む結合要素に暴露し、それによって該分子の該カルバメート基または該エステル基および該結合要素のアミン基の間に共有結合を形成させる;
を含む、上記方法。 - 該形成段階が該ウシ血清アルブミンを試薬に暴露して、N−ヒドロキシスクシンイミド基を形成することを含む、請求項11記載の方法。
- 該結合要素がタンパク質である、請求項11記載の方法。
- 該タンパク質が抗体または抗体フラグメントである、請求項13記載の方法。
- 該抗体または抗体フラグメントが1本鎖抗体である、請求項14記載の方法。
- 該結合要素に結合していない該活性化カルバメート基またはエステル基をブロッキングする段階を更に含む、請求項11記載の方法。
- 支持体表面にタンパク質を結合させる方法であり、該方法が以下の段階:
(a)反応に使用できる第1の化学基を含む支持体表面を提供し;
(b)第1の末端および第2の末端を含む捕捉タンパク質を提供し、該第1末端はリガンドに結合する能力を有し、該第2末端は第2の化学基を含み;そして
(c)該第1の化学基と該第2の化学基との間に共有結合を形成し、それによって該捕捉タンパク質を該捕捉タンパク質の該第2末端で該支持体表面に結合させる;
を含む、上記方法。 - 該捕捉タンパク質が末端システインを含む、請求項17記載の方法。
- 該末端システインがカルボキシ末端にある、請求項18記載の方法。
- 該形成段階が該システインの化学的還元を含む、請求項18記載の方法。
- タンパク質結合の小分子調節物質を同定するための方法であり、該方法が以下の段階:
(a)捕捉タンパク質を支持体表面上に結合させ;
(b)該基質を該捕捉タンパク質のリガンドおよび少なくとも1つの小分子に暴露し;そして
(c)該捕捉タンパク質および該リガンド間の結合の存在または不在を検出する;
を含む、上記方法。 - 段階(a)が該捕捉タンパク質をBSA−NHSスライド上に結合させることを含む、請求項21記載の方法。
- 段階(a)がアルデヒド基で該支持体表面を機能化することを含む、請求項21記載の方法。
- 段階(a)が該捕捉タンパク質をcm2当たり少なくとも1,000スポットのマイクロアレイとなるように結合させることを含む、請求項21記載の方法。
- 該捕捉タンパク質をGSTタンパク質に融合させることを更に含む、請求項21記載の方法。
- 蛍光色素によって該捕捉タンパク質と該リガンドとの間の該結合を検出することを更に含む、請求項21記載の方法。
- 該蛍光色素が親水性ポリマー部分を含む、請求項26記載の方法。
- 該部分がポリエチレングリコールである、請求項27記載の方法。
- 段階(c)が抗体フラグメントをディスプレイする標識したファージ粒子によって該捕捉タンパク質と該リガンドとの間の該結合を検出することを含む、請求項21記載の方法。
- 該リガンドが関連タンパク質のファミリーを含む、請求項21記載の方法。
- 該リガンドがBcl−2ファミリーのタンパク質を含む、請求項30記載の方法。
- 該捕捉タンパク質が関連タンパク質のファミリーを含む、請求項21記載の方法。
- 細胞経路に選択的に作用する小分子を同定するための方法であり、以下の段階:
(a)支持体表面に捕捉タンパク質のマイクロアレイであって、細胞経路で作用するタンパク質を含むものを結合させ;
(b)該基質表面を該捕捉タンパク質のリガンドの少なくとも1つおよび小分子の少なくとも1つに暴露し;そして
(c)該捕捉タンパク質および該リガンド間の結合の変化であって該小分子との相互作用の結果生じる変化を検出する;
を含む、上記方法。 - 段階(c)が質量分析を使用して該変化を定量することを更に含む、請求項33記載の方法。
- 蛍光色素によって該捕捉タンパク質と該リガンドとの間の該結合を検出することを更に含む、請求項33記載の方法。
- 該蛍光色素が親水性ポリマー部分を含む、請求項35記載の方法。
- 該部分がポリエチレングリコールである、請求項36記載の方法。
- 段階(c)が抗体フラグメントをディスプレイする標識したファージ粒子によって該捕捉タンパク質と該リガンドとの間の該結合を検出することを含む、請求項33記載の方法。
- 段階(a)がBSA−NHSスライド上に該捕捉タンパク質を結合させることを含む、請求項33記載の方法。
- 段階(a)が該捕捉タンパク質をcm2当たり少なくとも1,000スポットのマイクロアレイとなるように結合させることを含む、請求項34記載の方法。
- 抗原を標識するための方法であり、該方法が以下:
抗原をプロテアーゼで消化して、多数のペプチドを生成させ、該ペプチドの少なくとも1つは、該ペプチド上のエピトープと抗体または抗体フラグメントとの間の結合と干渉しない該ペプチドの領域で標識されることが可能である
を含む、上記方法。 - スクシンイミジルエステル色素を使用して該ペプチドを標識することを更に含む、請求項41記載の方法。
- 該スクシンイミジルエステル色素がCy3、Cy5、またはAlexa色素である、請求項42記載の方法。
- 該ペプチドの末端第1級アミンのみを標識することを更に含み、ここで該エピトープが内部にある、請求項41記載の方法。
- トリプシンで該抗原を消化することを更に含む、請求項41記載の方法。
- リン酸化したタンパク質を検出するための方法であり、以下の段階:
(a)候補となるタンパク質をフラグメント化して、リン酸化部位を含む標的ペプチドを含む多数のペプチドとし;
(b)該リン酸化部位に隣接する該標的ペプチド上のエピトープに対して親和性を有する抗体または抗体フラグメントに、該多数のペプチドを暴露し;
(c)該抗体または抗体フラグメントに対する該標的ペプチドの親和性に基づいて該標的ペプチドを選択し;そして
(d)該標的ペプチドについて質量分析を行って、リン酸化された該タンパク質のサブセットの存在を検出する;
を含む、上記方法。 - 段階(a)がプロテアーゼにより該候補タンパク質を消化することを含む、請求項46記載の方法。
- プロテアーゼがトリプシンである、請求項47記載の方法。
- 該エピトープに対するscFvのパニングを更に含む、請求項46記載の方法。
- 段階(c)が固体支持体への該抗体または抗体フラグメントの固定化を含む、請求項46記載の方法。
- 段階(d)が該標的ペプチドのサブセットの分子量変化を検出することを含む、請求項46記載の方法。
- 段階(d)がMALDI質量分析を実施することを含む、請求項46記載の方法。
- エピトープに対するモノクローナル抗体を免疫化することを更に含む、請求項46記載の方法。
- エピトープに対するポリクローナル抗体を免疫化することを更に含む、請求項46記載の方法。
- エピトープがリン酸化部位から15アミノ酸未満だけ離れている、請求項46記載の方法。
- エピトープがリン酸化部位から10アミノ酸未満だけ離れている、請求項46記載の方法。
- エピトープが10アミノ酸未満である、請求項46記載の方法。
- エピトープが5アミノ酸未満である、請求項46記載の方法。
- 細胞事象を研究する方法であり、以下の段階:
(a)支持体表面上にリガンドに対する親和性を有する捕捉分子を結合させ;
(b)該基質表面を細胞オルガネラを含有する溶液に暴露し、ここで該リガンドは該細胞オルガネラの表面に結合し;そして
(c)該捕捉分子と該リガンドとの間の結合によって該オルガネラを捕捉する;
を含む、上記方法。 - 該捕捉分子がタンパク質を含む、請求項59記載の方法。
- 該捕捉分子が抗体またはそのフラグメントを含む、請求項59記載の方法。
- 該捕捉されたオルガネラに結合するタンパク質を研究することを更に含む、請求項59記載の方法。
- 該オルガネラがミトコンドリアである、請求項59記載の方法。
- 該リガンドがミトコンドリア膜に特異的に(uniquely)結合する電圧依存性アニオンチャンネル受容体である、請求項63記載の方法。
- 該溶液が全細胞抽出物である、請求項59記載の方法。
- 該溶液が全細胞抽出液の画分である、請求項59記載の方法。
- 蛍光色素によって該捕捉を検出することを更に含む、請求項59記載の方法。
- 該蛍光色素が親水性ポリマー部分を含む、請求項67記載の方法。
- 該部分がポリエチレングリコールである、請求項68記載の方法。
- 色素が該オルガネラの無傷の電圧グラジエントを認識するための電位差特性を有する、請求項67記載の方法。
- 該オルガネラがミトコンドリアである、請求項70記載の方法。
- 抗体フラグメントをディスプレイする標識されたファージ粒子によって該捕捉を検出することを更に含む、請求項59記載の方法。
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