ES2291124B1 - Procedimiento para el tratamiento de superficies de soportes solidos. - Google Patents
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Abstract
Se describe un procedimiento para la modificación química de una superficie de un soporte, en el que dicha superficie contiene grupos hidroxilo disponibles y carece de metales o aleaciones metálicas, que comprende el tratamiento de dicha superficie con ácido orto-fosfórico. La superficie así tratada puede ser utilizada para inmovilizar biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células o secciones de tejidos. De aplicación en Biotecnología, Proteómica, Genómica, Farmacología e Histología, para la realización de estudios sobre los productos inmovilizados.
Description
Procedimiento para el tratamiento de superficies
de soportes sólidos.
La presente invención se encuadra dentro de la
tecnología de inmovilización de productos (biomoléculas, membranas
celulares, liposomas, células o tejidos) sobre soportes sólidos, y,
en concreto, en métodos basados en la modificación química de las
superficies de dichos soportes sólidos para inmovilizar dichos
productos.
La invención es aplicable, entre otras, en las
áreas de Biotecnología, Proteómica, Genómica, Farmacología e
Histología, ya que permite la realización de todo tipo de estudios
sobre los productos inmovilizados.
La inmovilización de biomoléculas es un proceso
por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de
libertad de movimiento de las biomoléculas mediante su unión a un
soporte insoluble en agua. Los aspectos fundamentales a considerar
en la inmovilización de biomoléculas son el soporte y el mecanismo
de inmovilización seleccionados.
La elección del soporte es determinante ya que
se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por
el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibilidades de contaminación microbianas.
Además, el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las
condiciones de operación del reactor y debe ser fácilmente
separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado.
Los soportes empleados hasta el momento son de
tipo orgánico (polímeros naturales y polímeros sintéticos) o de
tipo inorgánico. Los soportes de tipo orgánico presentan la
desventaja de ser poco estables térmicamente. Los soportes de tipo
inorgánico más empleados son los soportes manufacturados con óxidos
de metales (oro, titanio, silicio, etc.) y vidrio [Kikukawa T.
et al., (2005), Journal of Membrane Science, vols 259,
161-166; Shin D. et al., (2003), Biosensors
and Bioelectronics, 19, 485-494].
En cuanto a los métodos de inmovilización, la
adsorción es uno de los más sencillos. Mediante este método, la
biomolécula se une a un soporte sin funcionalizar mediante
interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y/o puentes de
hidrógeno. En este tipo de métodos se emplean diversos compuestos
tales como la polilisina y la gelatina. Estos métodos tienen la
ventaja de su bajo coste, preparación sencilla y estabilidad de los
derivados en medios de trabajo con bajo contenido en agua. Sin
embargo, entre los inconvenientes que presentan se encuentran la
poca estabilidad de los derivados desde el punto de vista mecánico,
una débil unión al soporte y la aplicación de medidas de
conservación de los soportes recubiertos.
Los métodos de inmovilización por unión química
más empleados son los que transcurren mediante la formación de
uniones covalentes y se basan en el empleo de agentes de
acoplamiento que se unen covalentemente al soporte por un lado y,
por otro, a la biomolécula a inmovilizar a través de grupos
funcionales. Se conocen diversos agentes de acoplamiento para
realizar las uniones covalentes al soporte e inmovilizar la
biomolécula dependiendo de los grupos funcionales reactivos
disponibles, grupos amino, tiol, aldehído, epoxi, etc.
El grupo funcional amino constituye la primera
opción ya que es el acoplador químico más general. La mayoría de
las macromoléculas contienen grupos amino, los cuales pueden ser
utilizados como acopladores químicos. Este tipo de acopladores son
menos adecuados en el caso de ligandos ácidos donde el grupo amino
constituye un centro activo y en el caso de moléculas que poseen
muchos grupos amino.
La posibilidad de utilizar tiol como grupo
funcional de acoplamiento depende, sobre todo, de la disponibilidad
de los grupos tiol en el ligando. La unión química del tiol es más
fuerte que la de la amina, así que las condiciones del grupo
funcional son menos criticas. Los agentes de acoplamiento basados
en grupos funcionales tiol no se pueden utilizar bajo condiciones
reductoras fuertes, puesto que el enlace disulfuro es inestable en
dichas condiciones.
El grupo funcional aldehído se utiliza en casos
específicos, por ejemplo con polisacáridos y glicoconjugados que
tienen cis-cis-dioles y con el ácido
salicílico. Estos grupos son oxidados por los aldehídos con
relativa facilidad.
El grupo funcional epoxi permite una adecuada
reacción con diversas matrices orgánicas termoplásticas y una gran
estabilidad de enlace a lo largo del tiempo.
Los silano-derivados constituyen
un grupo de agentes de acoplamiento muy utilizado. En ese tipo de
derivados, un extremo de la molécula (el grupo silano) se une
covalentemente al soporte inerte y el otro extremo que contiene el
grupo funcional químico, e.g., el grupo amino, tiol, aldehído,
epoxi, etc., se une a la biomolécula a inmovilizar.
En otros casos, cuando las opciones anteriores
son inadecuadas se opta por utilizar el par de unión
estreptavidina-biotina.
\newpage
En general, este tipo de métodos presenta
algunas ventajas, tales como la estabilidad de las biomoléculas
inmovilizadas y un elevado nivel de control de la inmovilización de
las biomoléculas, y algunas desventajas ya que los procesos son
laboriosos, costosos, se utilizan compuestos altamente corrosivos y
su utilidad depende de la naturaleza de la biomolécula a
inmovilizar.
A pesar de que se han descrito diferentes
métodos para el tratamiento de superficies de soportes destinados a
la inmovilización de biomoléculas, sigue existiendo todavía una
gran necesidad de diseñar métodos alternativos que permitan
proporcionar soportes con las propiedades ópticas y mecánicas
deseadas de una manera sencilla y económicamente conveniente.
La presente invención proporciona un
procedimiento alternativo para el tratamiento de soportes sólidos,
tales como los soportes destinados a la inmovilización de productos
de diversa naturaleza (e.g., biomoléculas, membranas celulares,
liposomas, células o secciones de tejidos), que comprende el
tratamiento de dichos soportes con ácido
orto-fosfórico. Las superficies de los soportes que
pueden ser sometidos a dicho tratamiento presentan grupos hidroxilo
disponibles y carecen de metales o aleaciones metálicas. Ejemplos
ilustrativos de soportes que pueden ser sometidos a dicho
tratamiento incluyen soportes cuyas superficies son de vidrio o de
un material polimérico, etc., siempre y cuando cumpla dichas
condiciones de presencia de grupos hidroxilo disponibles y ausencia
de metales o aleaciones
metálicas.
metálicas.
El procedimiento para el tratamiento de
superficies proporcionado por esta invención constituye una
alternativa a la silanización, es sencillo, permite obtener
superficies homogéneas, no presenta problemas de conservación y
utiliza compuestos que resultan más aceptables desde el punto de
vista medioambiental. Además, permite su aplicación sobre soportes,
e.g., portaobjetos, de tamaño y composición estándar que se
utilizan para múltiples aplicaciones en los campos de la biomedicina
y la biotecnología.
Por tanto, un objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento para la modificación química de la
superficie de un soporte que comprende el tratamiento de dicha
superficie con ácido orto-fosfórico. Dicho soporte
puede ser un soporte sólido apropiado para inmovilizar productos de
diversa naturaleza (e.g., biomoléculas, membranas celulares,
liposomas, células, secciones de tejidos, etc.).
La superficie de dicho soporte modificada
químicamente según el procedimiento previamente descrito, así como
los soportes que la incorporan, constituyen aspectos adicionales de
la presente invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un soporte sólido, tal como un soporte sólido para inmovilizar
dichos productos de naturaleza diversa, que comprende una
superficie tratada según el procedimiento previamente descrito. En
una realización particular, dicha superficie es una superficie de
vidrio, tal como la superficie de un portaobjetos de vidrio.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un método para inmovilizar un producto (e.g., biomoléculas,
membranas celulares, liposomas, células, secciones de tejidos,
etc.) en un soporte sólido que comprende una superficie tratada
según el procedimiento de modificación química de superficies
previamente descrito, comprendiendo dicho método la etapa de poner
en contacto dicho producto con dicha superficie tratada según el
procedimiento previamente descrito.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un soporte sólido que comprende una superficie tratada según el
procedimiento de modificación química de superficies previamente
descrito y, al menos, un producto (e.g., biomoléculas, membranas
celulares, liposomas, células, secciones de tejidos, etc.)
inmovilizado sobre la superficie tratada de dicho soporte
sólido.
La Figura 1 es una representación esquemática
que ilustra el tipo de unión covalente del ácido
orto-fosfórico a una superficie de un soporte que
contiene grupos hidroxilo disponibles, e.g., vidrio.
La Figura 2 es una representación esquemática
que muestra el tipo de unión mediante puentes de hidrógeno del
ácido orto-fosfórico a una superficie de un soporte
que contiene grupos hidroxilo disponibles, e.g., vidrio.
La Figura 3 ilustra la inmovilización de
membranas celulares aisladas y muestra la estimulación de la
fijación basal de [^{35}S]GTPgammaS
([^{35}S]GTP\gammaS) en arrays de tejido en ausencia de
ligando. Se muestran los resultados obtenidos utilizando
portaobjetos de vidrio sometidos a distintos tratamientos,
concretamente, a tratamiento con ácido fosfórico (AF), gelatina
(G),
gamma-aminopropil-trietoxisilano
(APTS), ácido nítrico y gelatina (AN), ácido nítrico y kuzú
(AN+KUZÚ), ácido nítrico y lignina (AN+LIGNINA) o ácido nítrico y
pectina (AN+PECTINA).
La Figura 4 ilustra la inmovilización de
membranas celulares aisladas y muestra la estimulación de la
fijación de [^{35}S]GTP\gammaS en arrays de tejido en
presencia del agonista cannabinoide
WIN-55,212-2 [Ejemplo 2]. Se
muestran los resultados obtenidos sometiendo portaobjetos de vidrio
a distintos tratamientos, concretamente, a tratamiento con ácido
fosfórico (AF), gelatina (G), APTS, ácido nítrico y gelatina (AN),
ácido nítrico y kuzú (AN+KUZÚ), ácido nítrico y lignina
(AN+LIGNINA) o ácido nítrico y pectina (AN+PECTINA).
La Figura 5 ilustra la inmovilización de
membranas celulares aisladas y muestra la estimulación de la
fijación de [^{35}S]GTP\gammaS en arrays de tejido en
presencia del agonista muscarínico carbacol. Se muestran los
resultados obtenidos sometiendo portaobjetos de vidrio a distintos
tratamientos, concretamente, a tratamiento con ácido fosfórico
(AF), gelatina (G), APTS, ácido nítrico y gelatina (AN), ácido
nítrico y kuzú (AN+KUZÚ), ácido nítrico y lignina (AN+LIGNINA) o
ácido nítrico y pectina (AN+PECTINA).
La Figura 6 ilustra la inmovilización de
membranas celulares aisladas y muestra la fijación de
[^{35}S]GTP\gammaS en ausencia (basal) y en presencia de
diferentes ligandos de receptores de galanina [Galanin, Galnon,
Gal(2-11), M15, M35, M40 y combinaciones de
los mismos, tales como Galanin+M15, Galanin+M40, Galnon+M35,
Galnon+M40 y Gal(2-11)+M40]. La fijación no
específica se determina en presencia de GTP\gammaS 10 \muM
(NS). En la esquina inferior derecha se muestra el estándar de
^{14}C y los valores en nCi/gt.e asignados a cada color.
La Figura 7 es un diagrama de barras
representativo de los porcentajes de estimulación sobre la fijación
basal de [^{35}S]GTP\gammaS en presencia de diferentes
ligandos de los receptores de galanina [Galanin, Galnon,
Gal(2-11), M15, M35, M40 y combinaciones de
los mismos, tales como Galanin+M15, Galanin+M40, Galnon+M35,
Galnon+M40 y Gal(2-11)+M40] en riñón,
estómago y pituitaria cuantificados en arrays de tejido.
En un aspecto, la invención se dirige a un
procedimiento para la modificación química de la superficie de un
soporte, en adelante "procedimiento de la invención", que
comprende someter dicha superficie a tratamiento con ácido
orto-fosfórico.
Los soportes que pueden ser sometidos a dicho
tratamiento son soportes cuyas superficies presentan las siguientes
características:
- (i)
- contienen grupos hidroxilo disponibles (es decir, poseen grupos -OH capaces de reaccionar con el ácido orto-fosfórico); y
- (ii)
- carecen de metales o aleaciones metálicas (debido a que el ácido orto-fosfórico ataca a los metales y a las aleaciones metálicas).
Dichos soportes pueden ser utilizados para
inmovilizar productos de diversa naturaleza, por ejemplo,
biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de
tejido, etc.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de
soportes que pueden ser sometidos al tratamiento con ácido
orto-fosfórico según la presente invención incluyen
soportes cuyas superficies están constituidas total o parcialmente
por vidrio o por un material polimérico que satisface las
condiciones (i) y (ii) previamente mencionadas, e.g., material
plástico, (poli)metacrilato, etc. La amplia oferta de mercado
existente, y su bajo precio, hacen del vidrio un material de
soporte interesante para la inmovilización de biomoléculas.
Dicho soporte puede estar conformado en
cualquier forma y tamaño adecuados para los fines a los que va
destinado; no obstante, en una realización particular, dicho
soporte presenta una superficie dimensional, lisa o sustancialmente
plana, y uniforme. En una realización particular, dicho soporte es
un portaobjetos, de tamaño y composición estándar, del tipo
utilizado en aplicaciones de Biomedicina y Biotecnología.
Por tanto, en una realización particular, dicho
soporte comprende una superficie constituida por vidrio.
Prácticamente cualquier superficie de vidrio de tipo borosilicatado
de uso estándar como material de laboratorio puede ser modificada
mediante el tratamiento con ácido orto-fosfórico
propuesto por esta invención para dotarla de afinidad y capacidad
para inmovilizar productos de diversa naturaleza, por ejemplo,
biomoléculas, membranas celulares, liposomas, células, secciones de
tejido, etc. Dicha superficie de vidrio puede formar parte de un
soporte sólido o de un dispositivo o aparato, constituyendo la
totalidad o una parte del mismo. En una realización particular,
dicha superficie de vidrio está conformada en forma de un
portaobjetos (soporte) de vidrio del tipo utilizado habitualmente en
aplicaciones biomédicas o biotecnológicas.
El ácido orto-fosfórico
(PO_{4}H_{3}) es un producto conocido y comercialmente
disponible que presenta una estructura tetraédrica. Durante el
tratamiento de la superficie del soporte con ácido
orto-fosfórico se producen dos reacciones
competitivas, por una parte, una unión covalente a través de los
grupos hidroxilo presentes en la superficie del soporte con
eliminación de agua, y, por otra parte, una adhesión a dicha
superficie que contiene grupos hidroxilo por formación de puentes
hidrógeno (Figuras 1 y 2). Como resultado de ambas reacciones, que
incluyen la formación de enlaces covalentes, uniones por puentes de
hidrógeno y eliminación de agua, se logran superficies homogéneas
recubiertas de ácido orto-fosfórico con fuertes
puentes de hidrógeno. De este modo, se produce una disminución de
la hidrofilia de la superficie del soporte dotándola de una elevada
afinidad y capacidad de inmovilizar productos de diversa
naturaleza, por ejemplo, biomoléculas, membranas celulares,
liposomas, células, secciones de tejido, etc.
La concentración del ácido
orto-fosfórico utilizado para la puesta en práctica
del procedimiento de la invención puede variar dentro de un amplio
intervalo. En una realización particular, se emplea ácido
orto-fosfórico en solución acuosa con una
concentración comprendida entre aproximadamente 10% en peso y
aproximadamente 85% en peso, preferentemente entre 40% en peso y
85% en peso. En una realización concreta, se emplea ácido
orto-fosfórico concentrado (85% en peso) en solución
acuosa. Para la puesta en práctica del procedimiento de la
invención, la superficie del soporte a tratar se pone en contacto
con ácido orto-fosfórico. El tratamiento de dicha
superficie con ácido orto-fosfórico se lleva a cabo
a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20ºC y
aproximadamente 100ºC, preferentemente entre 20ºC y 60ºC, durante
un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 24 horas, preferentemente
entre 5 y 15 horas.
Si se desea, el procedimiento de la invención
comprende, además, una o más etapas previas al tratamiento con
ácido fosfórico con el fin de lavar y/o desengrasar la superficie a
tratar.
Por tanto, en una realización particular, antes
del tratamiento con ácido orto- fosfórico, la superficie del soporte
a tratar se pone en contacto con un disolvente, tal como un
disolvente orgánico, para lavar y/o desengrasar dicha superficie, y,
a continuación, se seca. Para ello, dicho disolvente se aplica
sobre la superficie del soporte a tratar por cualquier método
convencional, por ejemplo, mediante pulverización, rociado, etc., o
bien la superficie del soporte se sumerge en dicho disolvente
orgánico. Como disolvente puede utilizarse cualquier disolvente
inerte para la superficie a tratar, es decir, que no ataque o
afecte adversamente a dicha superficie; ventajosamente, dicho
disolvente presenta un gran poder desengrasante y un alto índice de
evaporación, tal como un alcohol o una cetona de cadena corta, por
ejemplo, un alcohol o una cetona de 1-6 átomos de
carbono, preferentemente, un alcohol o una cetona de
1-4 átomos de carbono, e.g., etanol, isopropanol,
acetona, etc. En una realización concreta, la superficie a tratar
es una superficie de vidrio y el disolvente se selecciona entre una
cetona (e.g., acetona) y un alcohol (e.g., isopropanol). El
posterior secado de la superficie o del soporte puede realizarse
por métodos convencionales, por ejemplo, mediante una corriente de
aire sintético o en estufa. En una realización particular, el
secado se realiza mediante una corriente de aire sintético a una
presión comprendida entre aproximadamente 0,1 bar (10^{4} Pa) y
aproximadamente 0,01 bar (10^{5} Pa), preferentemente entre 0,3
bar (3x10^{4} Pa) y 0,6 bar (6x10^{4} Pa), durante un periodo
de tiempo comprendido entre aproximadamente 1 minuto y
aproximadamente 10 minutos, preferentemente entre 2 y 6 minutos. El
aire sintético no debe contener más de 3 ppm de agua ni más de 3
ppm de hidrocarburos totales [THC] (como CH_{4}). El secado
mediante estufa se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre
aproximadamente 100ºC y aproximadamente 160ºC, preferentemente
entre 110ºC y 140ºC, durante un periodo de tiempo comprendido entre
aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 3 horas,
preferentemente entre 1 y 2 horas. En una realización concreta, el
disolvente orgánico utilizado en este tratamiento es acetona.
En otra realización particular, después de dicho
primer lavado de la superficie del soporte con un disolvente
orgánico y secado, se efectúa un segundo lavado de dicha
superficie, para lo cual la superficie del soporte a tratar se pone
en contacto con un segundo disolvente orgánico y, a continuación, se
seca. Para ello, el segundo disolvente orgánico se aplica sobre la
superficie del soporte a tratar por cualquier método convencional,
por ejemplo, mediante pulverización, rociado, etc., o bien dicha
superficie se sumerge en dicho disolvente orgánico. Como se ha
mencionado previamente, dicho disolvente no debe atacar la
superficie del soporte a tratar y, ventajosamente, debe presentar
un gran poder desengrasante y un alto índice de evaporación;
ejemplos ilustrativos, no limitativos, de disolventes que cumplen
tales condiciones incluyen los alcoholes y cetonas de cadena corta,
por ejemplo, alcoholes o cetonas de 1-6 átomos de
carbono, preferentemente, de 1-4 átomos de carbono,
e.g., etanol, isopropanol, acetona, etc. El posterior secado de la
superficie o del soporte puede realizarse por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante una corriente de aire
sintético o en estufa. En una realización particular, el secado se
realiza mediante una corriente de aire sintético a una presión
comprendida entre aproximadamente 0,1 bar (10^{4} Pa) y
aproximadamente 0,01 bar (10^{5} Pa), preferentemente entre 0,3
bar (3x10^{4} Pa) y 0,6 bar (6x10^{4} Pa), durante un periodo
de tiempo comprendido entre aproximadamente 1 minuto y
aproximadamente 10 minutos, preferentemente entre 2 y 6 minutos. El
aire sintético no debe contener más de 3 ppm de agua ni más de 3 ppm
de THC (como CH_{4}). El secado mediante estufa se lleva a cabo a
una temperatura comprendida entre aproximadamente 100ºC y
aproximadamente 160ºC, preferentemente entre 110ºC y 140ºC, durante
un periodo de tiempo comprendido entre aproximadamente 30 minutos y
aproximadamente 3 horas, preferentemente entre 1 y 2 horas. En una
realización concreta, el disolvente orgánico utilizado en este
segundo lavado es isopropanol, ventajosamente, isopropanol
anhidro.
El soporte sólido obtenido según el
procedimiento de la invención, que comprende una superficie tratada
según el procedimiento de la invención constituye un aspecto
adicional de la invención. En una realización particular, dicho
soporte sólido que comprende una superficie tratada según el
procedimiento de la invención es un portaobjetos de vidrio.
Mediante el procedimiento de la invención se
logra modificar químicamente la superficie del soporte así tratada,
dotándola de afinidad y capacidad para inmovilizar productos de
diversa naturaleza, por ejemplo, biomoléculas, membranas celulares,
liposomas, células, secciones de tejido, etc.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un método para inmovilizar un producto en una
superficie de un soporte sólido, en el que dicho producto se
selecciona entre una biomolécula, una membrana celular, un liposoma,
una célula, una sección de un tejido, y sus mezclas, y dicha
superficie contiene grupos hidroxilo disponibles y carece de
metales o aleaciones metálicas, comprendiendo dicho método la etapa
de poner en contacto dicho producto con dicha superficie tratada
según el procedimiento de la invención.
La naturaleza del producto a inmovilizar sobre
la superficie del soporte sólido puede ser muy variada, por
ejemplo, una biomolécula, una membrana celular, un liposoma, una
célula o una sección de un tejido. Si se desea y fuera posible, se
pueden combinar distintos productos en un mismo soporte.
El término "biomolécula", tal como aquí se
utiliza, se refiere a una molécula orgánica o inorgánica tanto
constituyente como generada por los seres vivos e incluye
polinucleótidos o ácidos nucleicos (e.g., ADN, ARN, monocatenarios o
bicatenarios, etc.), proteínas (e.g., enzimas, hormonas,
inmunoglobulinas, anticuerpos, ribozimas, etc.), lípidos (e.g.,
ácidos grasos, triglicéridos, fosfolípidos, glucolípidos, etc.),
combinaciones de lípidos con proteínas y/o con polinucleótidos
(e.g., colesterol asociado a lipoproteínas de baja densidad
(LDL-colesterol), colesterol asociado a
lipoproteínas de alta densidad (HDL-colesterol),
etc), sustratos o cofactores de los compuestos anteriormente
mencionados (e.g., azúcares, coenzimas, metabolitos, etc.),
etc.
Alternativamente, el producto a inmovilizar
sobre la superficie tratada según el procedimiento de la invención
incluye membranas celulares (e.g., fragmentos de membranas
plasmáticas o de membranas de orgánulos celulares), liposomas (de
cualquier tipo), células (e.g., wild-type,
transformadas, transfectadas, etc.), secciones (fragmentos) de
tejido, etc.
En una realización particular, dicha biomolécula
es un polinucleótido, una proteína, un lípido, una combinación de
un lípido con una proteína y/o con un polinucleótido, un sustrato o
cofactor de los compuestos anteriormente mencionados, un fragmento
de una membrana celular, un liposoma, una célula o una sección de un
tejido, susceptibles de ser inmovilizados para realizar ensayos que
supongan la existencia y/o detección de reacciones químicas
específicas [e.g., fijación de anticuerpos o radioligandos a
moléculas de membrana, estudios de actividad de receptores y de sus
sistemas efectores: activación de proteínas G, adenilil ciclasa,
fosfolipasas, etc., así como la determinación de segundos
mensajeros tales como
adenosin-3'-5'-monofosfato
cíclico (AMPc), inositol 3 fosfato (IP3), diacilglicerol (DAG),
guanosin-3'-5'-monofosfato
cíclico (GMPc), etc.].
Para la puesta en práctica de dicho método para
inmovilizar productos de diversa naturaleza (e.g., biomoléculas,
membranas celulares, liposomas, células o secciones de tejido)
sobre una superficie tratada de un soporte sólido, el producto a
inmovilizar se pone en contacto con dicha superficie tratada según
el procedimiento de la invención (en adelante, "superficie
tratada") bajo condiciones que permiten la inmovilización de
dicho producto sobre dicha superficie tratada mediante técnicas
convencionales, por ejemplo, mediante pulverización, rociado, etc.
de una solución o suspensión de dicho producto sobre la superficie
tratada y se deja actuar durante un periodo de tiempo, a una
temperatura apropiada (dependiendo del producto a inmovilizar, del
disolvente en el que se encuentre si está en solución o suspensión,
etc); alternativamente, dicha superficie tratada (o el soporte
sólido que la contiene) se sumerge en una solución o suspensión del
producto a inmovilizar durante un periodo de tiempo apropiado para
que dicho producto se inmovilice sobre la superficie tratada. Tras
la aplicación del producto sobre la superficie tratada, la
combinación (producto inmovilizado)-(superficie tratada), se deja
secar con el fin de consolidar la unión del producto a la superficie
tratada contenida en dicho soporte sólido (el tiempo y la
temperatura variarán en función del tipo de producto que se
pretenda inmovilizar y de los estudios en los que se vayan a
utilizar dichas muestras).
En una realización particular, el producto a
inmovilizar es una biomolécula, e.g., un polinucleótido, una
proteína, un lípido, una combinación de un lípido con una proteína
y/o con un polinucleótido, o un sustrato o cofactor de los
compuestos anteriormente mencionados. Dicha biomolécula puede
encontrarse bien en forma de solución o suspensión en un medio
apropiado (e.g., en estado sólido o liofilizada, formando parte de
liposomas o membranas celulares, disuelta o suspendida en tampón de
ensayo, agua destilada, disolventes orgánicos, etc.).
En otra realización particular, el producto a
inmovilizar es una biomolécula, membrana celular (e.g., una
membrana celular (plasmática o de un orgánulo celular) procedente
de un tejido celular, una membrana de una célula transfectada, una
membrana de un microorganismo opcionalmente transformado, una
membrana lipídica, etc.), un liposoma, una célula o una sección de
tejido. En una realización concreta, dicho producto a inmovilizar
se encuentra en estado sólido o en forma de una suspensión en un
medio apropiado (e.g., en estado sólido o liofilizado, formando
parte de liposomas o membranas celulares, disuelto o suspendido en
tampón de ensayo, agua destilada, disolventes orgánicos,
etc.).
etc.).
El método para inmovilizar productos
proporcionado por esta invención permite inmovilizar productos
mediante su unión a una superficie tratada previamente con ácido
orto-fosfórico contenida en un soporte sólido de
forma suficientemente fuerte pero sin afectar los centros activos
de dicho producto. Dicho método para inmovilizar productos de
diversa naturaleza proporcionado por esta invención es un método
sencillo, de bajo coste y no requiere la aplicación de medidas de
conservación especiales de los soportes sólidos tratados.
Asimismo, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un soporte sólido que comprende una superficie
tratada según el procedimiento de la invención y un producto
inmovilizado sobre dicha superficie tratada, en donde dicho producto
se selecciona entre una biomolécula, una membrana celular, un
liposoma, una célula, una sección de un tejido y sus mezclas. Dicho
soporte sólido que comprende dicho producto inmovilizado sobre
dicha superficie tratada puede obtenerse mediante un método para
inmovilizar productos como el descrito previamente. En una
realización particular, dicho soporte sólido que comprende un
producto inmovilizado sobre dicha superficie tratada es un
portaobjetos de vidrio, e.g., un portaobjetos de vidrio del tipo
utilizado habitualmente en microscopia.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención y, por ello, no deben ser considerados limitativos del
alcance de la misma.
Como soporte se utilizaron unos portaobjetos de
vidrio ("portas") (MENZEL®) con las características que se
mencionan a continuación y corno modificador químico se utilizó
ácido orto-fosfórico concentrado.
Composición química:
- \quad
- SiO_{2}: 72,20%
- \quad
- Na_{2}O: 14,30%
- \quad
- K_{2}O: 1,20%
- \quad
- CaO: 6,40%
- \quad
- MgO: 4,30%
- \quad
- Al_{2}O_{3}: 1,20%
- \quad
- Fe_{2}O_{3}: 0,03%
- \quad
- SO_{3}: 0,30%
- \quad
- Coeficiente de expansión medio: 90,3 x 10^{-7}/ºC (20-300ºC)
- \quad
- Índice refracción: 1,513-1,523 (medido en el intervalo 546,7 nm-643,85 nm)
- \quad
- Densidad: 2,47+0,01 kg/dm^{3}
\vskip1.000000\baselineskip
Como modificador químico se utilizó ácido
orto-fosfórico. Las características de dicho
modificador químico eran las siguientes:
- \quad
- Ácido orto-fosfórico 85% PANREAC®
- \quad
- Límite máximo de impurezas:
- \quad
- Riqueza: 85-88%
- \quad
- Sustancias precipitables por NH_{4}OH: sin especificar
- \quad
- Ácido hipofosforoso y fosforoso: sin especificar
- \quad
- Cloruros: 0,005%
- \quad
- Nitratos: sin especificar
- \quad
- Sulfatos: 0,01%
- \quad
- Metales pesados (en Pb): 0,001%
- \quad
- As: 0,0002%
- \quad
- Cu: 0,001%
- \quad
- Mg: 0,01%
- \quad
- Pb: 0,001%
- \quad
- Ca: 0,01%
- \quad
- Fe: 0,005%
- \quad
- Ni: 0,001%
Los portas fueron sometidos al siguiente
tratamiento:
- 1.
- Inmersión de los portas (en posición vertical) en acetona (grado químico) durante 5-10 minutos.
- 2.
- Secado de los portas con aire.
- 3.
- Inmersión de los portas (en posición vertical) en isopropanol anhidro durante 5-10 minutos.
- 4.
- Secado de los portas con aire.
- 5.
- Inmersión de los portas (en posición vertical) en ácido orto-fosfórico concentrado (85%) durante 24 horas.
- 6.
- Lavado con agua destilada (Millipore).
- 7.
- Secado en aire.
Para comprobar la funcionalización de las
superficies de los portas se midió el ángulo (\theta) de contacto
con agua. El ángulo de contacto (\theta) se define como el ángulo
formado entre la superficie y la línea tangente al punto de contacto
entre la gota de líquido y la superficie del sustrato. El valor de
dicho ángulo depende, entre otras cosas, de la energía superficial
del sustrato (la capa adherida de ácido
orto-fosfórico) y de la tensión superficial del
líquido de prueba (en este caso, el líquido de prueba utilizado ha
sido agua desionizada o agua DI).
La medición del ángulo de contacto proporciona
información sobre el grado de hidrofilia/hidrofobia que presenta
una superficie al entrar en contacto con un líquido. En general, se
dice que un líquido moja (es hidrófilo) a un sólido cuando el ángulo
de contacto es inferior a 90º mientras que, en el caso contrario,
un líquido no moja (es hidrófobo) cuando el ángulo de contacto es
mayor a 90º. Sin embargo, es muy común hablar de "grados de
hidrofilia o de mojado", es decir, de si una Superficie A es más
hidrófoba/hidrófila que una Superficie B si el ángulo de contacto
(\theta) de dicha Superficie A es mayor/menor que el que tiene
una Superficie B''.
La variación del ángulo de contacto (\theta) a
través de la modificación química de superficies significa que la
energía superficial de la superficie ha variado, es decir, ha
variado la tendencia que tiene la superficie sólida [portas (en este
caso)] a atraer o repeler moléculas de otra sustancia (e.g.,
biomoléculas). Por ejemplo, cuando el ángulo de contacto (\theta)
aumenta comparado con el de la superficie de referencia [portas
MENZEL® sin tratar], se ha logrado una disminución de la energía
superficial de la superficie sólida; la superficie tiene menos
fuerza o capacidad de atraer a otras moléculas del líquido de
prueba, y, por lo tanto, el líquido moja menos, y, por ello, el
ángulo de contacto (\theta) es mayor.
Para medir el ángulo de contacto (\theta) se
ha utilizado un equipo SURFTENS universal. El equipo consta de un
banco óptico, trasladadores accionados con tomillos micrométricos,
una cámara de video y una fuente de iluminación de luz. Para ello,
brevemente, el ángulo de contacto (\theta) se determinó
depositando con una jeringuilla una pequeña gota de agua DI sobre
la superficie de los portas. La gota se iluminó con una fuente de
luz difusa para producir una imagen de bordes nítidos y la imagen
producida se captó con una cámara de vídeo. A continuación, a
través de un software especializado, se midió automáticamente el
ángulo de contacto (\theta) que forma el líquido sobre la
superficie sólida.
Los resultados obtenidos fueron los
siguientes:
- -
- el ángulo de contacto (\theta) formado por el agua DI sobre la superficie de vidrio tratada con ácido orto-fosfórico de acuerdo con el procedimiento previamente descrito fue de 30,2º, mientras que
- -
- el ángulo de contacto (\theta) formado por el agua DI sobre la superficie de vidrio sin tratar (superficie de referencia) fue de 16,1º.
Estos resultados ponen de manifiesto que la
modificación química de la superficie de los portas mediante
tratamiento con ácido orto-fosfórico ha producido
una variación en la energía superficial del sustrato (la capa
adherida de ácido orto-fosfórico) lo que significa
que la superficie tratada de los portas con ácido
orto-fosfórico es más hidrófoba (30,2º) que la
superficie de los portas sin tratar (16,1º).
La eficacia del método de tratamiento de
soportes sólidos destinados a la inmovilización de biomoléculas
proporcionado por esta invención ha sido comprobada mediante la
inmovilización de membranas celulares aisladas.
5 ratas macho Sprague Dawley
(250-275 g) fueron anestesiadas y sacrificadas de
acuerdo con la guía aprobada por el Comité Ético de la Facultad de
Medicina de la Universidad del País Vasco siguiendo las directrices
internacionalmente aceptadas (86/609/EEC). Posteriormente, se
procedió a la extracción de los órganos y tejidos que iban a ser
utilizados en el experimento (páncreas, estómago, intestino delgado,
bazo, corazón, pulmón, hígado, testículo, conducto deferente,
riñón, glándulas suprarrenales, médula y cerebro: corteza frontal,
estriado, tronco cerebral, pituitaria, núcleos olfativos,
hipocampo, hipotálamo, tálamo, colículo y cerebelo). Estas muestras
fueron almacenadas a -70ºC hasta la realización del
experimento.
Las muestras de tejido (1 g) fueron
homogeneizadas utilizando un homogeneizador de
teflón-vidrio (10 golpes a 1.500 rpm) en 30
volúmenes de tampón de homogeneización [ácido
etilenglicol-bis(\beta-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético
(EGTA) 1 mM, MgCl_{2} 3 mM, ditiotreitol (DTT) 1 mM y
Tris-HCl 50 mM, pH 7,4] suplementado con sacarosa
0,25 mM. El homogeneizado crudo fue centrifugado a 3.000 x g y a
4ºC durante 5 minutos y el sobrenadante resultante fue nuevamente
centrifugado a 40.000 x g durante 10 minutos (4ºC). El pellet fue
lavado en 20 volúmenes de tampón de homogeneización y
re-centrifugado en las mismas condiciones. Se
realizaron alícuotas y se almacenaron a -70ºC. El contenido
proteico fue determinado de acuerdo con el método de Bradford
[Bradford MM., Anal Biochem 1976; 72:248-54] usando
albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.
Se tomaron alícuotas de 1 mg/ml de cada tejido y
con esta suspensión se realizaron micropuntos de 1 \mul sobre
soportes de vidrio (portas) sometidos a los siguientes
tratamientos:
- a)
- Tratados con ácido orto-fosfórico (AF) según el procedimiento del Ejemplo 1;
- b)
- Gelatinizados (G);
- c)
- Recubiertos con gamma-aminopropiltrietoxisilano (APTS);
- d)
- Tratados con ácido nítrico y gelatinizados (AN);
- e)
- Tratados con ácido nítrico y posteriormente con lignina (AN+lignina);
- f)
- Tratados con ácido nítrico y posteriormente con pectina (AN+pectina); o
- g)
- Tratados con ácido nítrico y posteriormente con kuzú (AN+kuzú).
La lignina (Lignin, Organosolv, Ref.
8068-03-9, Aldrich Chemical Company
Inc.), pectina (Apple Pectin Powder, Ref. 0120. Solgar Laboratoires,
EEUU) y kuzú (Mitoku Organic Kuzu) utilizados en el tratamiento de
los portas son productos comerciales.
Los arrays fueron congelados a -70ºC hasta la
realización del experimento.
Se dejaron secar los portaobjetos con las
secciones de tejido durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se preincubaron las secciones de tejido en tampón de
ensayo a pH 7,4 [Tris-HCl 50 mM, MgCl_{2} 3 mM,
EGTA 0,2 mM, NaCl 100 mM, adenosina deaminasa 3 mU/ml] durante 20
minutos a temperatura ambiente para eliminar, en lo posible, la
presencia de neurotransmisores endógenos; tras ello, se procedió a
preincubar las secciones de nuevo en el tampón de ensayo
suplementado con guanosindifosfato (GDP) (2 mM) y DTT (1 mM).
A continuación, se procedió a incubar los
portaobjetos durante 2 horas a 30ºC en el tampón de ensayo
anterior, al cual se le añadieron las siguientes sustancias en
función de las diferentes condiciones del experimento:
Basal: [^{35}S]GTP\gammaS 0,04 nM
Activado: [^{35}S]GTP\gammaS 0,04 nM
+ agonista
Inhibido: [^{35}S]GTP\gammaS 0,04 nM
+ agonista + antagonista
Inespecífico: [^{35}S]GTP\gammaS 0,04
nM + GTP\gammaS 10 \muM
Una vez transcurrido ese tiempo se realizaron 2
lavados de 15 minutos en tampón Tris-HCl 50 mM, pH
7,4 a 4ºC. Tras el segundo lavado se sumergieron las secciones en
agua destilada a 4ºC para eliminar las sales y se procedió al secado
de los portaobjetos mediante la aplicación de una corriente de aire
frío.
Posteriormente, los portaobjetos con las
secciones correspondientes fueron expuestos a una película
radiosensible (Kodak Biomax MR) que se reveló de forma similar a
una película fotográfica. El marcaje se cuantificó transformando las
diferentes densidades de grises a nCi/g de equivalente de tejido.
Para ello cada película se expuso junto con estándares comerciales
previamente calibrados (Amersham). La cuantificación se realizó con
resolución anatómica microscópica en un sistema de análisis de
imagen computerizado, utilizando el software
NIH-image.
Las sustancias añadidas en los diferentes
ensayos fueron las siguientes:
- (A)
- Para estudiar la fijación de [^{35}S]GTP\gammaS en ausencia (basal) y en presencia de agonistas, se utilizaron los siguientes agonistas:
- (i)
- el agonista cannabinoide WIN 55,212-2 [(R)-(+)-[2,3-dihidro-5-metil-3-[(4-morfolinil)metil]pirrolo[1,2,3-d,e]-1,4-benzoxazin-6-il]-(1-naftalenil)metanona mono-metanosulfonato] [D'Ambra TE et al. (1992) J Med Chem. 135(1):124-35; Kuster JE, et al., (1993) J Pharmacol Exp Ther. 264(3):1352-63], producto suministrado por Tocris Cookson (Bristol, Reino Unido); y
- (ii)
- el agonista muscarínico carbacol (H_{2}N-C(O)O-(CH_{2})_{2}-N(CH_{3})_{3})+ (Cl)^{-}(Merck Index 13ª Edición Merck and Co., Inc.- Referencia Nº 1786); y
- (B)
- Para estudiar la fijación de [^{35}S]GTP\gammaS en ausencia (basal) y en presencia de ligandos de receptores de galanina, se utilizaron los siguientes ligandos: galanina, galnon, gal(2-11), M15 [galanin-(1-13)-sustancia P-5-11 amida], M35 [galanin-(1-13)-bradikini,-(2,9)amida] u M40 [galanin-(1-13)-Pro-Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala amida].
En la Figura 3 se muestran los resultados de la
fijación basal de [^{35}S]GTP\gammaS; en dicha figura se
puede observar cómo los soportes tratados con ácido
orto-fosfórico o con ácido nítrico y posterior
tratamiento con lignina o kuzú presentan una fijación inespecífica
menor que con otros soportes (e.g., APTS). Sin embargo, cuando se
realiza el mismo experimento en presencia del agonista cannabinoide
WIN 55,212-2 (Figura 4) se observa que los
portaobjetos con menor fijación inespecífica son los tratados con
ácido orto-fosfórico. Este efecto también se observa
en el experimento realizado en presencia del agonista muscarínico
carbacol (Figura 5). Además, se puede observar que los depósitos de
membranas realizados sobre este soporte presentan menos halos que el
resto de soportes utilizado, y que el porcentaje de efecto es máximo
en los portaobjetos tratados con ácido
orto-fosfórico [tratamiento a)]. Otra ventaja
observada fue que la adhesión de la muestra se mantenía durante
todo el proceso experimental en los portaobjetos tratados con ácido
orto-fosfórico. Este mismo fenómeno se observó en
presencia de otros fármacos diferentes ensayados.
Utilizando como soportes los portaobjetos
tratados según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 se estudió
una batería de ligandos de los receptores de galanina con el fin de
determinar la actividad específica de cada molécula (Figura 6). En
dicha figura se puede observar cómo en algunos tejidos (e.g.,
pituitaria) se produce un aumento de la fijación de
[^{35}S]GTP\gammaS en presencia de galanina, galnon,
gal(2-11), M15, M35 y M40, sin embargo, la
acción del galnon es antagonizada por M35 y M40 (Figura 7).
Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que
los portaobjetos que han sido tratados con ácido
orto-fosfórico según el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1 fijan membranas celulares de manera que las proteínas
insertas mantienen su funcionalidad. Estas membranas se mantienen
durante todo el experimento adheridas al soporte. Por tanto, los
portas tratados de acuerdo con el procedimiento descrito en el
Ejemplo 1 permiten realizar experimentos de autorradiografia de
[^{35}S]GTP\gammaS (Figuras 6 y 7). Además los arrays
fabricados con los soportes tratados de esta forma presentan una
menor fijación inespecífica que el resto de superficies tratadas con
otros compuestos como se puede observar en las Figuras 3, 4 y
5.
Claims (14)
1. Un procedimiento para la modificación química
de una superficie de un soporte, en el que dicha superficie
contiene grupos hidroxilo disponibles y carece de metales o
aleaciones metálicas, que comprende el tratamiento de dicha
superficie con ácido orto-fosfórico, y, en donde
dicha modificación química incluye una unión covalente a través de
los grupos hidroxilo con eliminación de agua y formación de puentes
hidrógeno.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dicha superficie es una superficie de vidrio o de un
material polimérico.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende el tratamiento de dicha superficie con una solución
acuosa de ácido orto-fosfórico con una concentración
comprendida entre aproximadamente 10% en peso y aproximadamente 85%
en peso.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho tratamiento de la
superficie con ácido orto-fosfórico se lleva a cabo
a una temperatura comprendida entre aproximadamente 20ºC y
aproximadamente 100ºC.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende, además, una o más etapas de
lavado y secado de la superficie a tratar previas al tratamiento
con ácido orto-fosfórico.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que dicha etapa de lavado se realiza con un disolvente
orgánico.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en
el que dicho disolvente orgánico es un alcohol o una cetona de
cadena corta.
8. Un soporte sólido que comprende una
superficie tratada según el procedimiento definido en las
reivindicaciones 1 a 7.
9. Soporte sólido según la reivindicación 8,
configurado en forma de un portaobjetos de vidrio.
10. Un método para inmovilizar un producto en
una superficie de un soporte sólido, en el que dicho producto se
selecciona entre una biomolécula, una membrana celular, un
liposoma, una célula y una sección de un tejido, y dicha superficie
contiene grupos hidroxilo disponibles y carece de metales o
aleaciones metálicas, comprendiendo dicho método la etapa de poner
en contacto dicho producto con dicha superficie de vidrio tratada
según el procedimiento definido en las reivindicaciones 1 a 7.
11. Método según la reivindicación 10, que
comprende, además, someter la combinación (producto
inmovilizado)-(superficie tratada) a una etapa de secado.
12. Método según la reivindicación 10, en el que
dicha biomolécula es un polinucleótido, una proteína, un lípido,
una combinación de un lípido con una proteína y/o con un
polinucleótido, o un sustrato o cofactor de dicho compuestos.
13. Un soporte sólido que comprende una
superficie tratada según el 1 procedimiento definido en las
reivindicaciones 1 a 7 y un producto inmovilizado sobre dicha
superficie tratada, en donde dicho producto se selecciona entre una
biomolécula, una membrana celular, un liposoma, una célula, una
sección de un tejido y sus mezclas.
14. Soporte sólido según la reivindicación 13,
configurado en forma de un portaobjetos de vidrio.
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| ES200602057A ES2291124B1 (es) | 2006-07-28 | 2006-07-28 | Procedimiento para el tratamiento de superficies de soportes solidos. |
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