ES2322727B1

ES2322727B1 - Metodo para cuantificar la union receptor acoplado a proteina g (gpcr)-proteina g mediante el empleo de un array de membranas celulares.

Info

Publication number: ES2322727B1
Application number: ES200501859A
Authority: ES
Inventors: Rafael Rodriguez Puertas; Gabriel Barreda Gomez; Maria Teresa Giralt Rue
Original assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea
Current assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea
Priority date: 2005-07-28
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2010-04-22
Anticipated expiration: 2025-07-28
Also published as: EP1930727A2; US8017346B2; WO2007012688A3; WO2007012688A2; US20080318799A1; EP1930727B1; ES2322727A1

Abstract

Método para cuantificar la unión receptor acoplado a proteína G (GPCR)-proteína G mediante el empleo de un array de membranas celulares.

El método comprende (i) poner en contacto un compuesto candidato no marcado con un array de membranas celulares en presencia de GTP marcado o de un análogo del mismo, no hidrolizable, marcado, en condiciones que permitan la interacción entre dicho compuesto y dicho GPCR presente en dichas membranas celulares, y entre dicho GTP marcado o análogo del mismo y dicha proteína G presente en dichas membranas; (ii) lavar; y (iii) cuantificar la señal obtenida por la unión del GTP (o análogo) marcado a dicha proteína G. De aplicación en el análisis de la interacción entre compuestos y proteínas de receptores de membranas celulares y de los mecanismos de señalización intracelular que desencadena este mecanismo de interacción mediado por dichos compuestos.

Description

Campo de la invención

La invención se relaciona, en general, con el empleo de un array de membranas celulares que contienen receptores de membrana acoplados a proteína G (GPCR) para el análisis de la interacción entre compuestos y las proteínas de receptores de membranas celulares, así como para el análisis de los mecanismos de señalización intracelular que desencadena este mecanismo de interacción mediado por tales compuestos (ligandos).

Antecedentes de la invención

Los receptores acoplados a proteínas G (G protein coupled receptors, GPCRs) se encuentran involucrados en numerosos procesos fisiológicos de señalización tanto a nivel intracelular como intercelular. Los GPCRs son receptores de hormonas, neurotransmisores y neuromoduladores y median sus acciones intracelulares a través de vías en las que están implicadas las proteínas G (rev: Kristiansen "Molecular mechanisms of ligand binding, signaling and regulation within the superfamily of G-protein coupled receptors: molecular modeling and mutagenesis approaches to receptor structure and function" Pharmacology and Therapeutics, 2004, 103, 21-80). Las proteínas G transmiten la señal intracelularmente a proteínas efectoras, como enzimas o canales iónicos, produciendo cambios en moléculas de señalización como AMPc, GMPc, inositol fosfatos, diacilglicerol, ácido araquidónico e iones. Su activación y regulación es uno de los procesos iniciales de los mecanismos de adaptación a nivel celular que disparan la activación de segundos mensajeros intracelulares y la activación de diversas cascadas de señalización, fosforilando enzimas y promoviendo la regulación a nivel génico, que en última instancia darán lugar a un determinado efecto fisiológico.

Existen dos clases principales de proteínas G, proteínas G heterotriméricas, que se unen a GPCRs y participan en los mecanismos de transducción de señales intracelulares, y las pequeñas proteínas G citoplasmáticas. Las primeras se componen de tres subunidades, \alpha, \beta y \gamma. Las subunidades \beta\gamma están estrechamente asociadas y pueden considerarse como una única unidad funcional. Con la unión del agonista, el receptor se activa y sufre un cambio conformacional que resulta en un incremento de su afinidad por la proteína G. Esto, permite una disociación rápida de GDP de su sitio de unión en la subunidad \alpha. En condiciones fisiológicas normales, el GDP se reemplaza inmediatamente por GTP, cuya concentración supera a la de GDP varias veces. El cambio de los nucleótidos de guanina produce una reducción en la afinidad de la subunidad \alpha por el complejo \beta\gamma y la consiguiente disociación del heterotrímero, en la subunidad \alpha por un lado y el dímero \beta\gamma por otro. Cada una de las subunidades ya disociadas es capaz de promover la regulación de diferentes segundos mensajeros como el 5'-3'adenosín monofosfato (AMPc) o los inositol trifosfato (IP3), y activar diferentes cascadas de señalización lo que resulta en una gran variedad de funciones celulares. El estado activo dura hasta que el GTP se hidroliza a GDP por la actividad intrínseca GTPasa de las subunidades G\alpha. Una vez que se ha producido esta hidrólisis de GTP a GDP, las subunidades \alpha-GDP y \beta\gamma se vuelven a unir y a ser
inactivas.

Todas las proteínas G heterotriméricas siguen el mismo ciclo de activación/desactivación, permitiendo así una transmisión de la señal intracelular específica y de modo reversible. Cuando una molécula de GDP se une a la subunidad \alpha, el complejo se asocia con las subunidades \beta\gamma, formando así un heterotrímero inactivo. A pesar de que el GDP unido a la subunidad \alpha es capaz de unirse al receptor sin \beta\gamma, la asociación con el receptor resulta altamente incrementada en presencia de \beta\gamma.

Sin embargo, no todos los receptores que activan proteínas G son miembros de la superfamilia de GPCRs. La activación de las proteínas G está además implicada en la señal de transducción mediada por varios receptores de tirosin-kinasas, como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), insulina y factores de crecimiento similar a insulina I y II.

Los GPCRs se encuentran implicados en patologías como dolor, cáncer, asma, inflamación, trastornos metabólicos, inmunitarios, gastrointestinales y neurológicos. Se conocen alrededor de 500 GPCRs diferentes y todos ellos comparten la típica estructura molecular de 7 dominios hidrofóbicos de unos 30 aminoácidos cada uno que atraviesan la membrana celular, con un extremo carboxilo extracelular y un amino intracelular. La superfamilia de GPCRs comprende receptores para varias hormonas, neurotransmisores, paracrinas y neuromoduladores con funciones fisiológicas muy importantes. La alteración en el funcionamiento de estos receptores causa enfermedades humanas, y muchos de estos GPCRs son dianas para muchos fármacos y drogas de abuso. Esta superfamilia incluye receptores para diversos tipos de ligandos endógenos como las aminas, péptidos, aminoácidos, glicoproteínas, fosfolípidos, nucleótidos, iones calcio, etc. Se ha estimado que aproximadamente un 80% de las hormonas conocidas y neurotransmisores activan mecanismos de traducción de señales mediante la activación de GPCRs, que representan aproximadamente un 30-45% de las dianas para fármacos. Los GPCRs constituyen, por lo tanto, unas excelentes dianas terapéuticas para modular las interacciones ligando:receptor, de interés prioritario para el desarrollo de nuevos fármacos.

Actualmente el desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ha permitido conseguir preparaciones celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de GPCR. Las preparaciones enriquecidas con receptores de membrana, están disponibles comercialmente (por ejemplo Amersham Biosciences, PerkinElmer Life and Analytical Sciences), se pueden obtener como donaciones de otros grupos de investigación o se pueden preparar en un laboratorio de cultivos celulares mediante transfección de líneas celulares.

Actualmente los GPCRs constituyen la diana terapéutica de más del 30% de los fármacos que se encuentran en el mercado y sus ventas han reportado una gran parte de los beneficios de las empresas farmacéuticas, por ejemplo en el 2002 los 30 fármacos más vendidos a nivel mundial generaron más de 35 billones de dólares (Glasel "Emerging Concepts in GPCR research and their implications for drug discovery" Decision Resources 2004).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una imagen autorradiográfica que muestra el marcaje obtenido a partir de un homogenizado de membranas depositado sobre un soporte gelatinizado. El diámetro de cada círculo es 1,5 mm.

La Figura 2 muestra una imagen autorradiográfica con el marcaje obtenido a partir de un homogenizado de membranas mezcladas con polilisina depositado sobre un soporte con resina hidrófoba para delimitar cada micropocillo. El diámetro de cada círculo es 1,5 mm.

La Figura 3 muestra las pruebas del prototipo de array de membranas celulares generado a partir de homogenizados de membrana procedentes de muestras de tejido de corteza cerebral de rata. En la Figura 3A se muestra la fijación basal, en ausencia de fármaco, del [^{35}S]GTP\gammaS debida a la actividad constitutiva de los GPCRs. En la Figura 3B se muestra la estimulación de la fijación de [^{35}S]GTP\gammaS por el fármaco agonista del receptor canabinoide CB1, WIN 55,212-2. La mayor intensidad de gris indica una mayor fijación del radioligando en los micropocillos incubados en presencia de fármaco agonista.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se relaciona, en general, con un array de membranas celulares. De forma más concreta, la invención se basa en un array de membranas celulares que contienen receptores de membrana acoplados a proteína G (GPCR) para el análisis de la interacción de compuestos (por ejemplo fármacos, etc.) y las proteínas de receptores de membranas celulares, así como para el análisis de los mecanismos de señalización intracelular que desencadena este mecanismo de interacción mediado por tales compuestos (ligandos).

En un aspecto, la invención se refiere a un método para cuantificar la unión receptor acoplado a proteína G (GPCR)-proteína G mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

(i): poner en contacto un compuesto candidato no marcado con un array de membranas celulares en presencia de GTP marcado o de un análogo del mismo, no hidrolizable, marcado, en condiciones que permitan la interacción entre dicho compuesto y dicho GPCR presente en dichas membranas celulares, y entre dicho GTP marcado o análogo del mismo y dicha proteína G también presente en dichas membranas celulares;

(ii): lavar dicho array de membranas para eliminar dicho GTP marcado o análogo del mismo, no hidrolizable, marcado no unido a dicha proteína G; y

(iii): cuantificar la señal obtenida debida a la unión de dicho GTP marcado o análogo del mismo, no hidrolizable, marcado a dicha proteína G.

El término "membranas celulares" se refiere a un homogeneizado de membranas celulares y que contienen en estado funcional los complejos proteicos receptor-proteína transductora.

Las membranas celulares de la presente invención pueden provenir de vesículas, liposomas, membranas de monocapa lipídica, membranas de bicapa lipídica, partes de membranas o membranas completas celulares, etc. Las membranas de bicapa lipídica incorporarán, preferiblemente, ionóforos, canales fónicos o analitos, tal como anticuerpos, enzimas, lectinas, agentes quelantes, etc.

Los homogeneizados de membranas celulares pueden ser obtenidos por procesos de homogeneización y centrifugación conocidos en el estado de la técnica a partir de cualquier tejido, órgano o tipo celular de cualquier miembro de una especie animal, incluida la especie humana, a modo ilustrativo, puede ser un mamífero, tal como un primate, un animal doméstico, un roedor, modelos animales de patologías, animales transgénicos, un humano normal o que presente cualquier tipo de patología o tratamiento farmacológico, etc.

Métodos de homogeneización de tejidos son bien conocidos en el estado de la técnica. A modo de ejemplo ilustrativo, para la homogeneización de las membranas celulares del array de la invención se siguieron los protocolos descritos en el ejemplo incluido en el presente documento.

Para generar el array de membranas de la presente invención, se utiliza un soporte sobre el que se fijan múltiples microdepósitos de homogeneizados de membranas celulares. El término "microdepósitos" se refiere a depósitos de membranas que contendrán cantidades inferiores a microgramos de membrana. La forma de los microdepósitos del array será del tipo más adecuado a las necesidades de la invención, preferiblemente serán de forma circular, oval u otra forma análoga que resulte del método particular empleado para producir el array. La densidad de todos los microdepósitos del array es de, al menos, 1/cm^{2} y normalmente de al menos 10/cm^{2} sin exceder de 1.000/cm^{2}. El tamaño del soporte será estándar de forma que permita la utilización de microspotters y scanners comerciales desarrollados por ejemplo para arrays de ADN. Además, cada soporte está provisto de un sistema de identificación que permite identificar cada array de proteínas y permite automatizar el sistema, como, por ejemplo, un código de barras.

El tamaño y forma del soporte será estandarizado, de forma que facilite una automatización del sistema. La forma del soporte puede ser rectangular o circular. Preferiblemente, el soporte tendrá una forma rectangular, con un tamaño de aproximadamente de 10 mm a 200 mm, normalmente de 40 mm a 150 mm de largo y de aproximadamente 10 mm a 200 mm de ancho, preferiblemente de 20 mm a 120 mm y con un grosor de aproximadamente 0,01 mm a 5 mm, normalmente de 0,1 mm a 2 mm. Como ejemplo ilustrativo, no limitativo, el tamaño del soporte será similar al de un portaobjetos, esto es, 25 mm de ancho por 75 mm de largo y 1 mm de grosor.

La disposición de los microdepósitos en el array será de acuerdo a un patrón a lo largo y ancho de la superficie del soporte, como, por ejemplo, en filas y columnas formando una cuadricula y patrones similares.

La composición de los soportes será de vidrio o material plástico, como polímeros plásticos, polímeros orgánicos, etc. de forma que permita una superficie lisa, o sustancialmente plana, o con irregularidades, como depresiones o elevaciones. La superficie puede también ser porosa y preferentemente transparente cuando se requiera su escaneado para la cuantificación. La composición del soporte incluye, por ejemplo, metales nobles o seminobles, como oro o plata, vidrio, óxidos metálicos o no metálicos, silicona, fosfato de amonio, polímeros y plásticos como polivinilcloridro, polivinilalcohol, etc.

El array de la presente invención puede opcionalmente estar cubierto por algún tipo de material o sustancia que normalmente aumentará la afinidad de los microdepósitos de membranas celulares al soporte. Las membranas se fijarán al soporte mediante el empleo de sustancias inertes que promuevan la inmovilización de las membranas en dichos soportes y que, a su vez, permitan mantener las preparaciones de membranas en estado funcional, es decir, conservando las proteínas de membrana la adecuada conformación espacial para permitir su función, la fijación de fármacos a proteínas receptoras y el acople de estos receptores a los mecanismos e transducción de señales intracelulares bajo condiciones de puesta en contacto y lavado, es decir, los microdepósitos deben mantener su posición y su funcionalidad cuando se cambia de interfase aire-agua durante el procesamiento del método de la invención.

Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas sustancias inertes son polilisina, gelatina, ácido ortofosfórico, lignina, agar-agar, etc.

El término "receptor acoplado a proteína G (GPCR)" se refiere a receptores de membranas celulares con siete dominios transmembrana y que están asociados a su co-efector, la proteína G. Estos receptores transducen la señal extracelular (unión del compuesto/ligando) en una señal intracelular (activación de la proteína G). La superfamilia de proteínas de GPCR es la mayor familia de proteínas conocida cuyos miembros participan en prácticamente todos los procesos biológicos intercelulares y unen como ligandos a prácticamente todos los tipos de macromoléculas biológicas.

En una situación normal, según ocurre en la naturaleza, tras la unión de un compuesto al GPCR de membrana, se produce un cambio conformacional del GPCR de forma que deja así al descubierto los sitios de unión a proteínas de la proteína G que anteriormente estaban tapados. Esta interacción cataliza un cambio de nucleótido de guanina, resultando en la unión de un GTP a la subunidad \alpha de la proteína G. Esta unión hace que el complejo G\alpha-GTP se disocie de las subunidades G\beta\gamma. Como consecuencia de la actividad GTPasa intrínseca de la subunidad G\alpha, el GTP unido se hidroliza a GDP, de esta forma volviendo el sistema a su estado inicial de heterotrímero.

Con el fin de eliminar cualquier resto de fármaco o compuesto no unido a los microdepósitos así como de radioligando no unido específicamente a las membranas en cada micropocillo, el método de la invención, además, incluye un paso de lavado del array. Para la realización de dicho lavado se usan métodos convencionales conocidos por el experto en la materia y que, a modo ilustrativo, no limitativo, incluye tampones y soluciones como las descritas en el ejemplo del presente documento.

Para desarrollar el método de la invención se ha usado el GTP o un análogo del mismo, no hidrolizable. El método de la invención también incluye la cuantificación de la señal obtenida debida a la unión de dicho GTP marcado o análogo del mismo, no hidrolizable, marcado, a dicha proteína G. La cuantificación de la señal puede realizarse por medio de cualquier técnica descrita en el estado actual de la técnica de arrays y bien conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo las técnicas de cuantificación, mediante software, empleadas en arrays de ácidos nucleicos.

Para determinar el efecto de la unión GPCR-proteína G sobre segundos mensajeros celulares, y así, poder analizar su posible actuación sobre las cascadas de señalización celular, la invención se basa, en otro aspecto, en un método para analizar la unión GPCR-proteína G y cuantificar el efecto que esta unión promueve sobre un segundo mensajero intracelular mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

(i): poner en contacto un compuesto candidato no marcado con un array de membranas celulares en presencia de GTP o de un análogo del mismo y un marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado, en condiciones que permitan la interacción entre dicho compuesto y dicho GPCR presente en dichas membranas celulares, entre dicho GTP o análogo del mismo y dicha proteína G presente en dichas membranas celulares, entre la proteína G activa y una molécula efectora también presente en dichas membranas celulares, y entre dicha molécula efectora y dicho marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado;

(ii): lavar dicho array de membranas para eliminar dicho marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado no unido a dicha molécula efectora; y

(iii): cuantificar la señal obtenida debida a la unión de dicho marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado a dicha molécula efectora, donde la intensidad de la señal obtenida es proporcional al efecto que la unión GPCR-proteína G promueve sobre dicho segundo mensajero intracelular.

El término "marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular" según se utiliza en la presente invención, se refiere a una molécula que tiene capacidad de unirse a una molécula efectora incluida en las membranas celulares de la invención y cuya unión es indicativa de la formación de un segundo mensajero celular. El término "molécula efectora" se refiere a una molécula incluida en las membranas celulares de la invención y a la que es capaz de unirse su ligando, el marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular, el cual se añade al array en el método de la invención y, además, está marcado.

En una realización particular, el método descrito anteriormente incluye que dicho GTP o análogo del mismo hidrolizable o no, esté marcado. En este caso, el marcaje será distinto al utilizado para el del marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular, es decir, el marcaje será tal que permita distinguir ambas señales. Esta metodología permite, por ejemplo, el uso de marcadores fluorescentes que emiten a diferente longitud de onda y que, por tanto, pueden ser diferenciables por su señal para el GTP o análogo del mismo hidrolizable o no y el marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular.

En otra realización particular, en el método descrito anteriormente el marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado es ATP marcado o un análogo del mismo. En una realización aún más particular, el marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado es un análogo no hidrolizable de fosfatidil inositol 4,5 difosfato (PtdIns(4,5)P2) marcado o un análogo del mismo.

En otro aspecto, la presente invención se basa en un método para cuantificar la unión compuesto-GPCR mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

(i): poner en contacto un compuesto candidato marcado con un array de membranas celulares en presencia o no de GTP o de un análogo del mismo en condiciones que permitan la interacción entre dicho compuesto y dicho GPCR presente en dichas membranas celulares;

(ii): lavar dicho array de membranas para eliminar el compuesto marcado no unido a dicho GPCR; y

(iii): cuantificar/analizar la señal obtenida debida a la unión del compuesto marcado a dicho GPCR, donde la intensidad de la señal obtenida es proporcional al grado de interacción compuesto candidato-GPCR.

Como se ha descrito anteriormente, la unión de un GTP a la subunidad \alpha de la proteína G hace que el complejo G\alpha-GTP se disocie de las subunidades G\beta\gamma. El GTP unido se hidroliza a GDP, de esta forma volviendo el sistema a su estado inicial de heterotrímero. En los métodos de la presente invención se utiliza un GTP o análogo del mismo no hidrolizable. En una realización particular, en cualquiera de los métodos descritos en la presente invención el análogo de GTP no hidrolizable utilizado es GTP\gammaS. Este GTP\gammaS estará marcado de forma que sea posible su detección y cuantificación en las muestras del array. Existen diferentes métodos y técnicas de marcaje para GTP\gammaS descritos en el estado de la técnica.

En una realización particular, dicho GTP\gammaS está marcado radiactivamente, o fluorescentemente. En una realización más particular, dicho GTP\gammaS es [^{35}S]GTP\gammaS, 2' (3')-O-(N-metil-3'-antraniloil)-GTP\gammaS o BODIPY-FL-GTP\gammaS.

La cuantificación de la señal puede realizarse por medio de cualquier técnica descrita en el estado actual de la técnica de arrays y bien conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo las técnicas de cuantificación, mediante software, empleadas en arrays de ácidos nucleicos.

Las técnicas de cuantificación de receptores, tanto en membranas celulares aisladas (fijación de radioligandos a membranas) como en secciones de tejido (autorradiografía de receptores), permiten caracterizar parámetros farmacológicos como densidad de receptores (Bmax) y constantes de afinidad (Kd) de los diferentes radioligandos específicos de una determinada proteína receptora.

La técnica de cuantificación de la fijación de guanosin 5'-O-3'-tiotrifosfato (GTP\gammaS) a la subunidad \alpha de la proteína G, con radioligandos detectables por métodos radiométricos como el [^{35}S]GTP\gammaS, permite cuantificar el acople funcional receptor-proteína G promovido por fármacos tanto en secciones de tejido como en homogeneizados de membrana de tejidos y de células que sobreexpresan un GPCR determinado (Payne et al. "Mechanisms of ligand binding and efficacy at the human D2 (short) dopamine receptor". J Neurochem., 2002, 82, 1106-1117; Roberts et al., Mechanisms of agonist action at D2 dopamine receptors. Mol Pharmacol., 2004, 66, 1573-1579). Asimismo, esta metodología permite el uso de marcadores fluorescentes como el 2'(3')-O-(N-metil-3'-antraniloil)-GTP\gammaS (mant-GTP\gammaS). Esta metodología permite analizar valores de concentración eficaz 50 (EC50), cuando el receptor es activado por un agonista específico (Seifert et al., "Functional differences between full and partial agonists: evidence for ligand-specific receptor conformations". J Pharmacol Exp Ther., 2001, 297, 1218-1226). Los fármacos que actúen como antagonistas no activarán la proteína G. Incluso serán identificables un novedoso tipo de fármacos que promueven el desacople del receptor de la proteína G en estado basal, en ausencia de activación, disminuyendo la fijación constitutiva de GTP a la proteína G; son los compuestos conocidos como agonistas inversos (Newman-Tancredi et al., "Differential modulation by GTPgammaS of agonist and inverse agonist binding to h5-HT(1A) receptors revealed by [3H]-WAY100,635". Br J Pharmacol., 2001, 132, 518-524). Este último tipo de fármacos constituye un nuevo y prometedor avance terapéutico de gran interés para la industria farmacéutica para el tratamiento de aquellas dolencias que transcurran como consecuencia de una actividad basal o constitutiva anómala del organismo.

En un aspecto, en los métodos descritos en la presente invención cada uno de los microdepósitos de dicho array está constituido por membranas celulares aisladas de líneas celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de receptor acoplado a proteína G o cualquier variación genética de los mismos.

El término "subtipo de receptor" se refiere a cada una de las diferentes moléculas de naturaleza proteica acopladas a proteína G, que reciben y transmiten señales mediante las que se regula la transmisión intercelular de los seres vivos. Farmacológicamente, cada subtipo de receptor se identifica según su diferente afinidad y selectividad tanto por ligandos endógenos como por fármacos.

Según este aspecto de la invención, las proteínas incluidas en uno de los microdepósitos, serán diferentes de las incluidas en otro microdepósito del mismo array. En este sentido, en un mismo array se incluye una pluralidad de diferentes proteínas incluidas en diferentes microdepósitos. Normalmente, un array contiene al menos dos subtipos de GPCR. Preferiblemente, el array contiene 10 subtipos diferentes, y más preferiblemente el array contiene al menos 50 subtipos diferentes. De forma aún más preferible el array contiene al menos 100 subtipos diferentes. Alternativamente, el array puede contener al menos 1.000 subtipos diferentes de receptores o más de 10^{4}.

En una realización particular, el subtipo de receptor acoplado a proteína G es un receptor muscarinico para acetilcolina tal como M_{1}, M_{2}, M_{3}, M_{4}, M_{5}; un receptor de dopamina tal como D_{1}, D_{2}, D_{3}, D_{4}, D_{5}; un receptor adrenérgico tal como \alpha_{1A}, \alpha_{1B}, \alpha_{1D}, \alpha_{2A}, \alpha_{2B}, \alpha_{2C}, \beta_{1}, \beta_{2}, \beta_{3}, \beta_{4}; o cualquiera de los subtipos de GPCR para serotonina etc.

En otro aspecto, en los métodos descritos en la presente invención cada uno de los microdepósitos de dicho array está constituido por membranas celulares aisladas de líneas celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de proteína G o cualquier variación genética de las mismas.

"Subtipo de proteína G" queda definido por cada una de las diferentes moléculas de naturaleza proteica que fijan nucleótidos de guanina y cuya activación a través de GPCRs produce una respuesta en un sistema efector como los enzimas adenililciclasa o fosfolipasa C. Basándose en su función biológica y en la homología de sus secuencias de aminoácidos, las proteínas G\alpha se pueden clasificar en tres grandes familias (G_{s}, G_{i/o}, G_{q}). Asimismo, existen al menos cinco G\beta y siete G\gamma descritas en la literatura, lo que hace aumentar el número posible de diferentes subtipos de proteínas G.

En una realización particular, y de acuerdo con las subunidades \alpha de la proteína G, los subtipos de proteína G son cada uno de los posibles subtipos de las tres familias G_{s}, G_{i/o}, G_{q}.

En una realización particular el compuesto candidato utilizado en los métodos descritos en la presente invención es un compuesto químico o un producto biológico obtenido por síntesis química y/o aislado a partir de un organismo (vivo o muerto), conocido o no. Ejemplos de compuestos candidatos incluyen fármacos, moléculas con afinidad y selectividad por diferentes subtipos de GPCRs, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, policlonales, recombinantes, quiméricos y fragmentos de los
mismos.

Además, cada uno de los microdepósitos del array puede estar constituido por una misma proteína pero en diferentes cantidades.

La selección de un fármaco o compuesto potencial para un determinado GPCR de un determinado órgano, tejido, o incluso célula constituye un factor extremadamente importante y que debe por tanto considerarse y monitorizarse en el proceso de selección de fármacos. Muchos GPCRs y mutantes de los mismos, están relacionados con el desarrollo de determinados tumores, y algunos GPCRs se distribuyen en un tipo de tejido determinado, por ejemplo, los receptores de opioides y los de aminas biógenas se encuentran mayoritariamente en el sistema nervioso central. Del mismo modo, algunos de estos GPCRs se asocian con determinadas funciones fisiológicas y farmacológicas conocidas. Por ejemplo, algunos GPCRs de quimioquinas actúan como cofactores en la infección por HIV. Los arrays de la presente invención pueden emplearse para fabricar arrays específicos para un tema concreto de interés, específico de tejido, con funciones específicas en fisiología o en farmacología.

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Los homogeneizados de membranas obtenidos a partir de tejidos normales y patológicos se pueden usar para la preparación de un array de membranas de la presente invención de forma que puede ser empleado para comparar las características tanto farmacológicas como fisiológicas de dichos tejidos. Por este motivo, en una realización particular, en los métodos de la presente invención cada uno de los microdepósitos está formado por membranas aisladas de diferentes tejidos de un mismo sujeto, o mismo tejido de individuos diferentes, de una misma especie, de especies diferentes o de especies modificadas genéticamente. En una realización más particular, dichos tejidos de un mismo sujeto provienen de un mismo órgano o de órganos diferentes. En una realización aún más particular, cada uno de los microdepósitos está formado por membranas aisladas de líneas celulares o tejidos obtenidos a partir de individuos con diferentes patologías y/o tratamientos farmacológicos.

Ejemplo 1 Diseño básico de un array de membranas celulares aisladas de cerebro de rata para el análisis del acople de receptores cannabinoides a proteínas G I. Materiales y métodos Materiales

El radioligando [^{35}S]GTP\gammaS (1.250 Ci/mmol) fue obtenido de DuPont NEN (Bruselas, Bélgica). DL-ditiotreitol (DTT), guanosina-5'-difosfato (GDP), GTP\gammaS, tricina y WIN 55212-2 fueron obtenidos de Sigma (St. Louis, USA). Las [^{14}C]-microescalas fueron suministrados por Amersham Biosciences (Barcelona, España). Las películas \beta-sensibles Kodak Biomax MR fueron suministradas por Amersham Biosciences. El resto de reactivos fueron obtenidos de diferentes casas comerciales con un grado de pureza adecuado para estudios neuroquímicos.

Métodos

Para la realización de este estudio se emplearon ratas macho Sprague-Dawley de un peso comprendido entre 250 y 275 g procedentes del estabulario de la Universidad del País Vasco. Los animales, tras ser anestesiados con hidrato de cloral a una dosis de 400 mg/kg, fueron sacrificados y a continuación se procedió a la disección del cerebro. Estas muestras se almacenaron a -70ºC hasta que fueron procesadas.

Para la realización del presente experimento se utilizaron membranas procedentes de la corteza cerebral de ratas. Concretamente, se descongeló aproximadamente 1 g de tejido y se homogeneizó en 30 volúmenes de tampón de homogeneización (Tris-HCl 50 mM, MgCl_{2} 3 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4) suplementado con sacarosa 0,25 M a 4ºC. Posteriormente se centrifugó el homogeneizado de tejido a 1.000 x g durante 5 minutos a 4ºC y el sobrenadante se volvió a centrifugar a 40.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se desechó el sobrenadante y los pellets se resuspendieron en tampón de homogeneización, tras lo cual se centrifugaron nuevamente a 40.000 x g durante 10 minutos a 4ºC.

Los pellets se resuspendieron en 10 volúmenes de tampón de homogeneización, se realizaron alícuotas de 1 ml y se centrifugaron durante 15 minutos a 14.000 rpm. Finalmente, se decantaron los tubos y se congelaron los pellets a -70ºC, excepto una alícuota que se utilizó para determinar la concentración de proteínas. Para ello se utilizó el método Bradford, que consiste en determinar la concentración de proteínas a partir de la absorbancia mediante una recta patrón con concentraciones conocidas y crecientes de seroalbúmina bovina (Bradford MM., 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. May 7;72:248-54).

El dispositivo de membranas celulares se preparó resuspendiendo una de las alícuotas de membranas de corteza de rata en tampón de ensayo con polilisina al 10%. Se colocó 1 \mul de este homogeneizado en cada micropocillo de los portaobjetos. Estos portaobjetos se fabricaron con una máscara de resina hidrofóbica que delineaba cada micropocillo para evitar la dispersión de las microgotas de muestra (fabricado por Tekniker, Eibar, España). Estos dispositivos de membranas celulares con las muestras de membranas inoculadas se dejaron secar durante 20 minutos a temperatura ambiente y se procedió a la realización del ensayo.

El ensayo consistió en la cuantificación del acople de receptores a proteínas G. Para ello, se realizó una incubación de las secciones de tejido con el radioligando [^{35}S]GTP\gammaS 0,04 nM y el agonista cannabinoide específico WIN 55,212-2 (Rodríguez-Puertas et al., 2000. Autoradiography of receptor-activated G-proteins in post mortem human brain. Neuroscience. 96(1):169-80) siguiendo el siguiente protocolo experimental:

Se preincubaron los dispositivos de membranas celulares en tampón de ensayo a pH 7,7 (Tris-HCl 50 mM, MgCl_{2} 3 mM, EGTA 0,2 mM, NaCl 100 mM, Adenosina deaminasa 3 mU/ml, GDP 2 mM y DTT 1 mM) durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar la presencia de neurotransmisores endógenos que pudieran estar presentes en las preparaciones de membranas aisladas. A continuación se procedió a incubar los portaobjetos durante 2 horas a 30ºC en el tampón de ensayo anterior, al cual se le añadieron las siguientes sustancias en función de las diferentes condiciones del experimento:

- Basal: [^{35}S]GTP\gammaS 0,04 nM

- Activado por agonista: [^{35}S]GTP\gammaS 0,04 nM + WIN 55,212-2 1 \muM

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Una vez transcurrido este tiempo, se procedió a realizar 2 lavados de 15 minutos en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 a 4ºC para eliminar tanto el fármaco como el radioligando [^{35}S]GTP\gammaS no unido específicamente a la membranas en cada micropocillo. Tras el segundo lavado se sumergieron las secciones en agua destilada a 4ºC para eliminar las sales
del tampón de lavado y se procedió al secado de los portaobjetos mediante la aplicación de una corriente de aire frío.

Posteriormente, los dispositivos de membranas celulares fueron expuestos a una película radiosensible (Kodak Biomax MR) durante 48 horas. Una vez transcurrido ese tiempo se reveló de forma similar a una película fotográfica. Esta película fue digitalizada por medio de un escáner de transparencias.

El marcaje se cuantificó en densidades ópticas mediante un sistema de análisis de imagen computerizado (programa NIH-image). Los resultados se expresan en porcentajes de estimulación sobre el estado basal mediante la siguiente fórmula: (estimulado x 100/basal)-100.

II. Resultados

Al aplicar un homogenizado de membranas (sin polilisina) sobre portaobjetos gelatinizados se obtuvieron microdepósitos heterogéneos (Figura 1), sin embargo, cuando se preparó el homogenizado de membranas con un 10% de polilisina y se colocó sobre portaobjetos en los cuales cada micropocillo era previamente marcado con una máscara de resina hidrofóbica los círculos con el marcaje que se generaron fueron bastante homogéneos (Figura 2).

Los valores medios de la suma de todos los micropocillos expresados como porcentaje de estimulación sobre los basales de la fijación de [^{35}S]GTP\gammaS inducida por WIN 55,212-2 en el dispositivo de membranas celulares procedentes de corteza cerebral de rata fueron de 10,2 \pm 2,7% (Tabla 1).

La Tabla 1 muestra los resultados de la fijación de [^{35}S]GTP\gammaS en la condición basal (ausencia de fármaco) y en la condición de estimulación con el agonista cannabinoide WIN 55,212-2 obtenidas en el dispositivo de membranas celulares procedentes de corteza cerebral de rata. Los valores están expresados en densidades ópticas y corresponden a cada uno de los diferentes micropocillos. En la parte inferior de la tabla aparecen el valor medio y el error estándar para ambas condiciones experimentales.

TABLA 1 Fijación de [^{35}S]GTP\gammaS en ausencia de fármaco (basal) y tras estimulación con el agonista cannabinoide WIN 55,212-2

1

III. Discusión

La presente invención demuestra que el acople del receptor GPCR a la proteína G se conserva en los dispositivos de membranas celulares procedentes de corteza cerebral de rata y que la técnica de [^{35}S]GTP\gammaS es una herramienta útil para evaluar esta respuesta funcional en este tipo de preparaciones y dispositivos. El hecho de que la funcionalidad de los receptores se conserve a este nivel, nos indica que también podrían estar conservadas otras vías de señalización intracelular como la vía de los fosfoinosítidos o del AMPc y por tanto este dispositivo podría también utilizarse para cuantificar este tipo de respuestas u otras en las que intervengan proteínas de membrana.

Este mismo ensayo se ha realizado también sobre dispositivos de membranas celulares provenientes de muestras de tejido de diferentes áreas cerebrales y de células (datos no mostrados), sobre los que se han ensayado diferentes fármacos. En estos experimentos se ha comprobado que se reproducen las propiedades ya mencionadas de estos dispositivos, por lo que podemos concluir que los dispositivos de membranas celulares son una herramienta útil para evaluar la respuesta de los receptores de membrana a un compuesto determinado, al menos a nivel del acople a la proteína G.

Claims

1. Método para cuantificar la unión receptor acoplado a proteína G (GPCR)-proteína G mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

2. Método para analizar la unión GPCR-proteína G y cuantificar el efecto que esta unión promueve sobre un segundo mensajero intracelular mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

3. Método según la reivindicación 2, donde dicho GTP o análogo del mismo no hidrolizable está marcado.

4. Método según la reivindicación 2, donde dicho marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado es ATP marcado o un análogo del mismo.

5. Método según la reivindicación 2, donde dicho marcador de actividad de formación de un segundo mensajero celular marcado es un análogo no hidrolizable de fosfatidil inositol 4,5 difosfato (PtdIns(4,5)P2) marcado o un análogo del mismo.

6. Método para cuantificar la unión compuesto-GPCR mediante el empleo de un array de membranas celulares que comprende:

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho análogo de GTP no hidrolizable es GTP\gammaS.

8. Método según la reivindicación 6, donde dicho GTP\gammaS está marcado radiactivamente o con un fluoróforo.

9. Método según la reivindicación 8, donde dicho GTP\gammaS es [^{35}S]GTP\gammaS, 2'(3')-O-(N-metil-3'-antraniloil)-GTP\gammaS o BODIPY-FL-GTP\gammaS.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos de dicho array está constituido por membranas celulares aisladas de líneas celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de receptor acoplado a proteína G o cualquier variación genética de los mismos.

11. Método según la reivindicación 10, donde dicho subtipo de receptor acoplado a proteína G es un receptor muscarínico para acetilcolina tal como M_{1}, M_{2}, M_{3}, M_{4}, M_{5}; un receptor de dopamina tal como D_{1}, D_{2}, D_{3}, D_{4}, D_{5}; un receptor adrenérgico tal como \alpha_{1A}, \alpha_{1B}, \alpha_{1D}, \alpha_{2A}, \alpha_{2B}, \alpha_{2C}, \beta_{1}, \beta_{2}, \beta_{3}, \beta_{4}; o un subtipo de GPCR para serotonina.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos de dicho array se caracteriza por estar constituido por membranas aisladas de líneas celulares que sobreexpresan un determinado subtipo de proteína G o cualquier variación genética de las mismas.

13. Método según la reivindicación 12, donde dicho subtipo de proteína G es cualquiera de los posibles subtipos de las tres familias, G_{s}, G_{i/o} o G_{q}.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho compuesto candidato es un compuesto químico o un producto biológico.

15. Método según la reivindicación 14, donde dicho compuesto candidato es un compuesto químico o un producto biológico con afinidad y selectividad por un subtipo de GPCR.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos está formado por membranas aisladas de (i) diferentes tejidos de un mismo sujeto, o (ii) mismo tejido de individuos diferentes, de una misma especie, de especies diferentes o de especies modificadas genéticamente.

17. Método según la reivindicación 16, donde dichos tejidos de un mismo sujeto provienen de un mismo órgano o de órganos diferentes.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde cada uno de los microdepósitos está formado por membranas aisladas de líneas celulares o tejidos obtenidos a partir de individuos con diferentes patologías y/o tratamientos farmacológicos.