AT414047B - Anordnung zur bindung von molekülen - Google Patents

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Description

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AT 414 047 B
Die vorliegende Erfindung betrifft Anordnungen zur Bindung von Molekülen, insbesondere zur Anwendung als Biochips bzw. zur Analyse mittels der "Single Dye Tracing" Methode.
Die jungen Forschungsgebiete wie Genomik und Proteomik stellen die Biotechnologie vor gro-5 ße Herausforderungen, wobei die Einzelmolekül-Mikroskopie eine wichtige Stellung einnehmen kann. Gängige Methoden der Genomik und Proteomik basieren auf Untersuchungen mittels DNS- oder Protein-Arrays, bei deren Auswertung die Ensemble-Eigenschaften vieler Biomoleküle ermittelt werden (Arbeitman et al., 2002; MacBeath and Schreiber, 2000; Pollack et al., 1999; Zhu et al., 2001). Die Einzel-Molekül Mikroskopie bietet hingegen einen qualitativen io Vorteil von grundsätzlicher Bedeutung, da einzelne Biomoleküle untersucht werden können, ohne dass deren relevante Eigenschaften durch Mittelung der Ensemble-Beobachtung verzerrt oder ausgedünnt werden würden (Clausen-Schaumann et al., 2000; Mehta et al., 1999; Nie and Zare, 1997; Schmidt et al., 1996; Segers-Nolten et al., 2002; Xie and Lu, 1999). Beispiele für die Eigenschaften von einzelnen Molekülen sind etwa der jeweilige Satz von Mutationen eines 15 DNS-Moleküls, oder die individuelle post-translationale Modifikation jedes einzelnen exprimier-ten Proteins, sowie sein Assoziationszustand mit anderen Proteinen.
Gefordert ist eine Technologie, die viele verschiedene Biomoleküle bzw. deren Strukturvarianten einzeln und schnell zu untersuchen gestattet, zum Beispiel Eigenschaften von DNS-20 Molekülen oder Art und Zahl von Boten-RNS Molekülen, die in einer Zelle bestimmten Zustands oder nach bestimmter Behandlung exprimiert vorliegen (Expressionsprofil); weiters die detaillierten Profile der jeweils exprimierten Proteine, d.h. Profile differenziert nach Typ, Zahl, post-translationaler Modifizierung (Phosphorylierung, Glykosilerung, etc.), Verteilung der einzelnen Proteine in der Zelle, spezifische Protein-Protein Assoziationen, und der Effekt auf die Aktivität 25 des Proteins.
Um eine statistisch relevante Aussage zu treffen, sollte die Zahl der gleichzeitig untersuchbaren Einzelmoleküle zumindest einige Zehnerpotenzen erreichen, etwa 106 bis 10®, bei einer vertretbaren Datenaufnahmezeit. 30 Für diese Anwendung bietet sich der Einsatz der fluoreszenz-mikroskopischen SDT-Methode an. SDT ist seit einigen Jahre eine Routinetechnik, sowohl zur Detektion einzelner fixer oder diffundierender Moleküle an Oberflächen (Schmidt et al., 1996) als auch von einzelnen Biomolekülen in Zellen (Schutz et al., 2000; Sonnleitner et al., 1999). Zur ultraschnellen Mikroskopie 35 von Molekülen an Oberflächen mit gleichzeitiger Einzelmolekül-Empfindlichkeit wurde ein Verfahren entwickelt und patentiert, "SDT-scan" (Hesse et al., 2002; Schindler, 2000). Dieses Verfahren gestattet die Analyse aller einzelnen fluoreszenzmarkierten Moleküle auf 1 cm2 in etwa 5 min mit sehr gutem Signal-Rausch-Verhältnis, und erfüllt somit eine der gestellten Forderung: Die Bereitstellung einer genügend empfindlichen und zugleich genügend schnellen 40 Detektionsmethode.
Die verbleibenden Forderungen beziehen sich auf die Entwicklung einer Methodik zur definierten Anordnung der Moleküle mit hoher Dichte mit dem Maximalwert von 1,1 x 10® isolierter Moleküle oder einer gleichen Anzahl von Gruppen gleicher Moleküle auf einem cm2. 45
Zur Zeit gebräuchliche Methoden zur Anordnung von Molekülen auf Oberflächen werden zur Herstellung von Oligonukleotid-, DNA-, Protein-, Oligosaccharid- und chemischen Microarrays eingesetzt. Gängige Methoden zur Herstellung von DNA-Microarrays beruhen auf dem Contact-Spotting (Schena et al., 1995) und Non-Contact-Spotting (Okamoto et al., 2000) geringer Flüs-50 sigkeitsvolumina; für Oligonukleotid-Microarrays wird zudem die photolithographische Synthese am festen Substrat eingesetzt (Fodor et al., 1993). Für Protein-Microarrays stehen Spotting-Verfahren (MacBeath and Schreiber, 2000) und Stempel-Methoden mit flexiblen Kunststoffen (Bernard et al., 1998; Bernard et al., 2001), sowie für Oligopeptid-Microarrays zusätzlich auch photolithographische Syntheseverfahren zur Verfügung (Pellois et al., 2002). Für Oligosaccha-55 rid-Microarrays (Fukui et al., 2002) und Microarrays kleiner Moleküle (Lam and Renil, 2002) 3
AT 414 047 B kommen meist Spotting-Verfahren zum Einsatz.
Die Spot-Dichten der genannten Microarrays hängen vom Herstellungsverfahren ab und reichen für die Spotting-Verfahren von wenigen 1000 bis 5 x 104 Spots pro cm2, und bei photoli-5 thographischen Verfahren bis maximal 5 x 105 Spots pro cm2.
In der WO 00/06770 A werden Biomolekül-Arrays geoffenbart, die zwar bestimmte Abstände zwischen den Biomolekül-Spots einhalten, jedoch nur eine für viele Anwendungen unzureichend niedrige Dichte an Spots zulässt. Weiters ist auch eine spezifische Addressierbarkeit der io dortigen Moleküle oder das Vorsehen mehrerer, voneinander verschiedenen Funktionalitäten nicht möglich. Im Übrigen bereiten die dort geoffenbarten Arrays Probleme im Hinblick auf unspezifische Bindungen und die Wiederverwendbarkeit dieser Arrays ist nicht gegeben.
Die beispielsweise in den W089/09406 und W098/39688 vorgeschlagenen Arrays auf Basis 15 von S-Layern mit Proteinen als Abstandshaltern weisen zwar eine sehr große Dichte auf, jedoch sind diese Arrays aus mehreren Gründen ungeeignet für die optische Analyse: Die Abstände zwischen den Funktionalitäten, die im Bereich von 10 nm liegen sind zu klein, um eine optische Auflösung zu erlauben; die Schichten sind labil und nicht reproduzierbar aufbaubar. Weiters können keine verschiedenen Funktionalitäten, insbesondere addressierbare Funktionalitäten, 20 vorgesehen werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, die eben geschilderten Nachteile des Standes der Technik ganz oder teilweise zu vermeiden und Arrays von Biomolekülen zur Verfügung zu stellen, die eine große Dichte aufweisen, deren einzelne Bindungsbereiche genü-25 gend Abstand von benachbarten Bindungsbereichen aufweisen, die in optischen Analysesystemen genutzt werden können, adressierbare Bindungsplätze aufweisen können oder die verschiedene Funktionalitäten nutzen können. Insbesondere sollten diese Arrays für die Einzelmolekülanalyse, insbesondere unter Verwendung der SDT-Methode, nutzbar sein und den dafür erforderlichen Kriterien genügen. 30
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Anordnung zur Bindung von Molekülen, umfassend bindungsfähige Funktionalitäten, welche als molekular-einzelne Funktionalitäten oder in Gruppen gleicher Funktionalitäten auf einem festen Träger vorliegen, wobei die Dichte der einzelnen Funktionalitäten bzw. Gruppen von Funktionalitäten auf dem festen Träger von 35 104 bis 1010 einzelnen bzw. gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten pro cm2 beträgt, sich bei zumindest 95 %, insbesondere bei zumindest 99 %, der einzelnen bzw. gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten innerhalb eines gewählten Abstandes d von einer (beliebigen) einzelnen bindungsfähigen Funktionalität oder Gruppe von bindungsfähigen Funktionalitäten keine weiteren bindungsfähigen Funktionalitäten befinden. 40
Erfindungsgemäß werden unter Funktionalitäten stets bindungsfähige Funktionalitäten verstanden.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen stellen eine entscheiden verbesserte Alternative zu den 45 konventionellen Microarrays dar, insbesondere können erfindungsgemäß Dichten von 1 x 108 Molekülen oder Gruppen gleicher Moleküle oder mehr erzielt werden. Der minimale Abstand zwischen Molekülen oder Molekül-Gruppen, die mit fluoreszenzoptischer Detektion noch gerade einzeln auflösbar sein sollen, ist etwa gleich der Wellenlänge des Fluoreszenzlichts, -0,5 pm (Beugungslimit abbildender optischer Mikroskopie). Diese prinzipielle Grenze bestimmt erfin-50 dungsgemäß in der Praxis den Minimalabstand zwischen den Molekülen oder Molekül-Gruppen zu - 1 pm, d.h. in einer Fläche mit dem Durchmesser von - 1 pm um jedes Molekül oder jede Molekül-Gruppe sollten sich keine weiteren Moleküle befinden. Dennoch sollte die Anzahl der Moleküle oder Gruppen möglichst hoch sein, d.h. in den meisten Fällen zumindest im Prozent-Bereich der bevorzugten maximalen Flächendichte von 1 x 108/cm2 liegen, um die schnelle 55 Datenaufnahme der SDT-scan Methode zur Geltung kommen zu lassen. 4
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Mit der vorliegenden Erfindung lassen sich somit Dichten erzielen, die zumindest um den Faktor 100 größer sind, als z.B. in der WO 00/06770 A; weiters kann die erfindungsgemäße Anordnung als geordneter Array zur Verfügung gestellt werden (im Unterschied zu den "random arrays" gemäß den WO 00/06770 A und W098/39688 A). Schließlich können auch verschiedene Spezifitäten der Bindungsstellen vorgesehen werden und somit Multi-Komponenten-Arrays bereitgestellt werden, die auch noch wiederverwendbar sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt in der Anordnung der Abstand d von 0,1 bis 100 pm, insbesondere 0,5 bis 10 pm.
Diese Abstände erlauben eine besonders effiziente Nutzung in Zusammenhang mit optischen Methoden, insbesondere mit SDT, insbesondere im Scan-Modus gemäß der WOOO/25113 A.
Die erfindungsgemäße Anordnung weist vorzugsweise zusätzlich Einheiten auf, die über die bindungsfähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden sind, wobei die Einheiten vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, insbesondere RNA und DNA, sowie Oligopeptiden und Polypeptiden, insbesondere Antikörpern, oder organischen Molekülen, insbesondere Mitgliedern einer kombinatorischen Bibliothek.
Bevorzugter Weise beträgt in der erfindungsgemäßen Anordnung die Dichte der einzelnen oder gruppierten bindunasfähigen Funktionalitäten auf dem festen Träger von 105 bis 109, insbesondere von 106 bis 10, einzelnen oder gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten pro cm2.
Vorzugsweise ist die feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Anordnung zusätzlich Einheiten auf, die über die bindungsfähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden sind, und an welche Moleküle, vorzugsweise nicht kovalent, gebunden sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Einzelmolekülen, welche durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Bereitstelien einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten, - Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypeptide, tragen, die an die bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche bindenden können, so dass die Hilfsstrukturen über die Einheiten und Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden werden, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche entweder (i) die bindungsfähigen Funktionalitäten, die nicht mit den Hilfsstrukturen verbunden sind, inaktivieren, so dass diese bindungsfähigen Funktionalitäten ihre Bindungsfähigkeit verlieren, oder (ii) die Einheiten, die nicht an die bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche gebunden sind, blockieren, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche die Bindung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebundenen Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten oder Fragmenten dieser im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche.
Vorzugsweise werden als Mittel zur (i) Inaktivierung der bindungsfähigen Funktionalitäten und zur (ii) Blockierung der Einheiten chemische Substanzen eingesetzt, die an die bindungsfähigen Funktionalitäten oder Einheiten kovalent binden und diese dadurch inaktivieren oder blocken. Beispiele sind chemische Substanzen mit freien Thiolgruppen, die an bindungsfähige Funktionalitäten, wie Maleimide, binden können. 5
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Alternativ dazu kann dieses erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, auch durch die folgenden Schritte realisiert werden: - Bereitstellen einer festen Oberfläche mit Funktionalitäten, - Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit aktivierbaren Funktionalitäten tragen, die an die Funktionalitäten der festen Oberfläche binden können, sofern sie durch äußere Stimuli aktiviert werden, - oder Bereitstellen einer festen Oberfläche mit aktivierbaren Funktionalitäten und Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit Funktionalitäten tragen, - Einwirken eines äußeren Stimulus auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, sodass die aktivierten Funktionalitäten der Hilfsstrukturen bzw. der festen Oberfläche an die anderen Funktionalitäten der festen Oberfläche bzw. der Hilfsstrukturen binden und damit die Hilfsstrukturen über die Einheiten an die feste Oberfläche binden, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche die Bindung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebunden Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten oder Fragmenten dieser im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche.
Beide Varianten nutzen ein und denselben Lösungsgedanken, indem mittels Hilfsstrukturen eine Oberfläche spezifisch und örtlich definiert aktiviert bzw. deaktiviert wird und so die erfindungsgemäß erforderlichen Parameter der Anordnungen realisiert werden.
Vorzugsweise werden zur Aktivierung der aktivierbaren Funktionalitäten äußere Stimuli, wie elektromagnetische Wellen in Form von UV-Licht sowie Veränderungen der Temperatur, eingesetzt.
Vorzugsweise werden als Hilfsstrukturen im wesentlichen kugelförmige Gebilde eingesetzt, welche aus organischen oder anorganischen Polymeren, Metallen oder Metallverbindungen bestehen.
Um mehrere verschiedene Spezifitäten vorzusehen und eine Adressierbarkeit des Arrays zu gewährleisten, weisen die Hilfsstrukturen vorzugsweise eine Markierung auf, wobei vorzugsweise mehr als eine Art von markierten Hilfsstrukturen verwendet wird.
Besonders günstig ist dabei, wenn Hilfsstrukturen mit einer Fluoreszenz-Markierung eingesetzt werden, und vorzugsweise Hilfsstrukturen mit unterschiedlicher Fluoreszenz-Markierung verwendet werden.
Vorzugsweise trägt eine beliebige Hilfsstruktur nur eine spezifische Art von Einheiten, wie organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypeptide, wobei eine Population von Hilfsstrukturen mit je unterschiedlich belegten Einheiten verwendet wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist im erfindungsgemäßen Verfahren sowohl die spezifische Fluoreszenz-Markierung der unterschiedlichen Hilfsstrukturen als auch die spezifische Belegung der Hilfsstrukturen mit Einheiten vor Aufbringen der Hilfsstrukturen auf die feste Oberfläche bekannt.
Vorzugsweise ist aufgrund der Kenntnis der Positionen der fluoreszenz-markierten Hilfsstrukturen auf der festen Oberfläche die chemische Identität der von der Hilfsstrukturen hinterlassenen Einheiten nach der Ablösung der Hilfsstrukturen bekannt.
Das Kontaktieren der festen Oberfläche mit den Hilfsstrukturen erfolgt vorzugsweise unter Zuhilfenahme von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Magnetkraft, elektrischer Anziehung, Anreicherung an Zweiphasen-Grenzschichten oder Kombinationen davon. 6
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Vorzugsweise wird als feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche eingesetzt.
Als besonders bevorzugte bindungsfähige Funktionalitäten haben sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung NH2-, SH-, OH-, COOH-, CI-, Br-, I-, Isothiocyanat-, Isocyanat-, NHS-Ester-, Sulfonyl-Chlorid-, Aldheyd-, Epoxid-, Carbonat-, Imidoester-, Anhydrid-, Maleimid-, Acryloyl-, Aziridin-, Pyridyl-Disulfid-, Diazoalkan-, Carbonyl-Diimidazol-, Cärbodiimid-, Disuccinimidyl Carbonat-, Hydrazine-, Diazonium-, Aryl-Azid-, Benzophenon-, Diazirin-Gruppen oder Kombinationen davon bewährt.
Vorzugsweise können zwischen den bindungsfähigen Funktionalitäten und den zu bindenden Einheiten oder zwischen der festen Oberfläche und den bindungsfähigen Funktionalitäten ein Spacer-Molekül vorgesehen wird.
Bei einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen folgende Schritte eingesetzt: - Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten, vorzugsweise Maleimid-Funktionalitäten, - Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere Nukleinsäuren oder Polypeptide, über molekulare Erkennung gebunden haben und welche terminale Thiol-Funktionalitäten tragen, die an die feste Oberfläche bindenden können, so dass die Hilfsstrukturen an die feste Oberfläche gebunden werden, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit thiolhältigem Reagenzien, vorzugsweise beta-Mercaptoethanol, welche die Funktionalitäten, insbesondere die Maleimid-Funktionalitäten, die nicht mit den Hilfsstrukturen verbunden sind, inaktivieren, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit einem physikalischen oder chemischen Stimulus, insbesondere mit erhöhter Temperatur, welche die molekulare Erkennung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebundenen Einheiten rückgängig macht, und - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche.
Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen folgende Schritte eingesetzt: - Bereitstellen einer festen Oberfläche mit Funktionalitäten, insbesondere Aminen, - Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Moleküle einer kombinatorischen Bibliothek, mit aktivierbaren Funktionalitäten, insbesondere photoaktivierbare Phenylazide, tragen, die an die Funktionalitäten, insbesondere Amin-Funktionalitäten, der festen Oberfläche binden können, sofern sie insbesondere durch einen UV-Licht-Beleuchtungsschritt aktiviert werden, wobei die Einheiten über chemisch spaltbare Funktionalitäten, insbesondere Disulfid-Brücken, an die Hilfsstrukturen gebunden sind, - lokalisiertes Einwirken eines äußeren Stimulus, insbesondere UV-Licht, auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, sodass die Einheiten insbesondere mit den photoaktivierten Phenylaziden an die Funktionalitäten, insbesondere die Amin-Funktionalitäten, binden und damit die Hilfsstrukturen an die feste Oberfläche gebunden werden, wobei der äußere Stimulus, insbesondere in Form eines evaneszierenden Feldes von UV-Licht, eingesetzt wird und lokalisiert auf Funktionalitäten an der festen Oberfläche wirkt sowie an jenen Teilen der Hilfsstrukturen, die im Bereich des evanszierenden Feldes sind, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, insbesondere Dithiothreitol, welche die Disulfid-Brücken zwischen den Hilfsstrukturen und den gebunden Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spalten, und - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen 7
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Einheiten oder Fragmenten dieser im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche.
Die Erfindung betrifft natürlich auch Anordnungen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich sind. 5
Die erfindungsgemäßen Anordnungen werden gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung im Rahmen einer Fluoreszenz-Mikroskopie-Untersuchung (vor allem für Einzelmolekül-Untersuchungen), insbesondere der "Single Dye Tracing" (SDT) Methode, genutzt. io Insbesondere können die erfindungsgemäßen Anordnungen zur Bindung von Biomolekülen, insbesondere zur Bindung von Antigenen, Liganden, Proteinen, DNS, mRNS, Toxinen, Viren, Bakterien, Zellen oder Kombinationen davon, verwendet werden und dann alle mit diesen Anordnungen mögliche Verfahren (z.B. Detetions- und Analyseverfahren) durchgeführt werden. 15 Weiters werden die erfindungsgemäßen Anordnungen zur Untersuchung von cDNS von Zellen, wobei fluoreszenzmarkierte cDNSs an die Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden binden, und die Bindung für jede gebundene cDNS-Art ausgelesen werden kann, verwendet.
Die erfindungsgemäßen Anordnungen werden bevorzugt auch zur Untersuchung der Proteine 20 von Zellen verwendet, wobei fluoreszenzmarkierte Proteine an die Anordnung von verschiedenen Antikörpern binden und die Bindung für jede gebundene Protein-Art ausgelesen werden kann.
Die Realisierung einer freien Fläche mit ~ 1 pm Durchmesser um jeden "Bindungsplatz" (ein-25 zelnes "Fängermolekül" oder eine Gruppe gleicher "Fängermoleküle") bei Flächendichten der "Bindungsplätze" im Bereich von vorzugsweise 106 bis 108/cm2 stellt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Eine weitere Besonderheit bevorzugter erfindungsgemäßer Anordnungen ist die Realisierung 30 der Adressierbarkeit der Bindungsplätze. Für die avisierten Anwendungen sollten die Position und Anzahl der Bindungsplätze möglichst genau und a priori bekannt sein, sowie die Art der Moleküle auf jedem Bindungsplatz. Eine solche Adressierbarkeit der Bindungsplätze bezüglich sowohl Position als auch Funktion (spezifische molekulare Erkennung eines Analyt-Moleküls) stellt den Schlüssel für zugleich einfache und breite Anwendung dar. Für die erfindungsgemäße 35 Anordnung mit z.B. Antikörpern und Oligonukleotiden ist bekannt, gegen welches Protein welcher Antikörper an welchem Ort gerichtet ist und welches Oligonukleotid mit welcher DNS oder Boten-RNS Sequenz an welcher Stelle der Matrix hybridisiert. Ohne Adressierbarkeit lässt sich kein Zusammenhang hersteilen zwischen den Beobachtungen an einer Bindungsstelle und der Art des gebundenen Moleküls. Es wäre keine Molekül-spezifische Aussage möglich, und damit 40 würde der zentrale Vorteil der Anwendung von Einzelmolekül-Mikroskopie auf die beschriebenen Aufgabenstellungen entfallen. Über Adressierbarkeit können Proben vieler verschiedener Biomoleküle durch Markierung mit nur einem Fluoreszenzmarker aufgeschlüsselt werden, denn der Fluoreszenz-Nachweis an 45 einem bestimmten Ort bedeutet Bindung an ein bekanntes Fängermolekül. Ohne funktionelle Adressierbarkeit müssten die Analyt-Moleküle entweder einzeln markiert und sequentiell vermessen werden, oder viele verschiedene Farbstoffe zur farb-spezifischen Markierung gleichzeitig eingesetzt werden, was entweder undurchführbar ist oder sehr schnell an praktische Grenzen stößt. 50
Durch die Adressierbarkeit werden nicht nur Zugänge zu Informationen erleichtert, sondern auch die Rechenzeit für Datenaufnahme und Auswertungen wird in einen vertretbaren Bereich verschoben. Tatsächlich würde ohne Vorkenntnis alleine der Positionen der Bindungsstellen die Rechenzeit mit schnellen Rechnern und schnellen Algorithmen lange Zeit in Anspruch nehmen, 55 da die notwendige Suche der Molekülpositionen (Maxima der Einzelmolekül-Fluoreszenz Inten- 8
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Die der Erfindung zugrunde liegenden Anforderungen zur Realisierung einer Molekül-Matrix (forthin abgekürzt durch "MARS, Matrix of Addressable Recognition Sites") lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Die Bindungsstellen zur molekularen Erkennung (Fängermoleküle, einzeln oder in Gruppen gleicher) sollen auf dem "MARS" vorzugsweise in folgender Weise in Kombinationen vorliegen: 1. Isoliert detektierbar (keine Moleküle im Radius von mind. ~0,5 um Bindungsstelle) 2. Position jeder Bindungsstelle soll a priori bekannt sein 3. Funktion jeder Bindungsstelle soll a priori bekannt sein 4. Die Dichte an unterschiedlichen adressierbaren Bindungsstellen soll hoch sein (10® bis 108/cm2).
Die Erfindung bezieht sich demgemäß insbesondere auf die Fabrikation von Matrizen von organischen Molekülen oder Biomolekülen (z.B. Antikörper, Rezeptoren, Peptide, Oligonukleotide oder Nukleinsäuren), die über geeignete Hilfsstrukturen an eine Substratoberfläche übertragen und gebunden werden, dergestalt, dass die übertragenen Biomoleküle einzeln oder in Gruppen gleicher Moleküle isoliert vorliegen, d.h. isoliert beobachtbar mit optischer Einzel-Molekül Mikroskopie. Sowohl die Position als auch die Art jedes einzelnen Biomoleküls oder jeder isolierten Gruppe gleicher Moleküle ist vorab bekannt, wobei die mittlere Flächendichte der gebundenen Moleküle sehr hohe Werte erreichen soll. Die Anwendung dieser adressierbaren Molekül-Matrizen dient der Quantifizierung der spezifischen Bindung (molekulare Erkennung) von Bindungspartnern (z.B. Antigene, Liganden, Proteine, DNS, Boten-RNS, Toxine, Viren, Bakterien, Zellen, etc.), unter Einsatz der Fluoreszenz-Markierung der Bindungspartner und einer neuen, patentierten Mikroskopie Methode ("Single Dye Tracing, SDT"), die das Lesen dieser Molekül-Matrizen mit zugleich hoher Empfindlichkeit (Abbildung bis zu einzelnen Fluoreszenz-Moleküle) und sehr hoher Geschwindigkeit gestattet.
Im Folgenden werden nunmehr bevorzugte Realisierungen der erfindungsgemäßen Anordnungen anhand der in den Zeichnungsfiguren schematisch skizzierten Ausführungen beschrieben.
Zur Erfüllung der erfindungsgemäß gestellten Aufgaben können bevorzugter Weise Hilfsstrukturen verwendet werden (FIG. 1A), insbesondere Kugeln (3, 11) aus organischen oder anorganischen Stoffen mit Durchmessern (18), die vom Verwendungszweck abhängen und im Bereich von ~ 0.5 pm bis ~100 pm liegen. Jede Kugel (3,11) trägt "Fängermoleküle" (4, 6) und zwar nur je einer Art. Durch Zugabe der Kugeln an ein Substrat (1) kommen die "Fängermoleküle" (5, 7, 12, 13) in Kontakt zur Substratoberfläche und es wird eine kontrollierte Übertragung (8, 14) von "Fängermolekülen" (5, 7, 12, 13) von den Kugeln (3, 11) auf die Substratoberfläche ermöglicht, dergestalt dass Bindungsstellen (einzelne oder Gruppen gleicher "Fängermoleküle") entstehen, die räumlich von einander getrennt sind (9, 10, 15, 16). FIG. 1B skizziert die einzelnen Schritte des Vorganges zur Übertragung exemplarisch an einem übertragenen "Fängermolekül". Die "Fängermoleküle" (z.B. Antikörper, Oligonukleotide, etc.; Symbol Y in FIG. 1B) sind an die Kugeln gebunden, vorzugsweise über molekulare Erkennung durch komplementäre Biomoleküle (z.B. Epitope für Antikörper, komplementäre Oligonukleotide, etc.; Symbol X in FIG. 1B), welche unmittelbar oder über flexible Abstandsmoleküle an die Kugeloberfläche gebunden sind. Die Kugeln werden bevorzugt in flüssiger Phase dem Substrat zugegeben und lagern sich an dessen Oberfläche an. Bei geeigneten Bedingungen kann eine hexagonal dichte Packung erreicht werden. Ihre unspezifische Wechselwirkung mit dem Substrat ist schwach im Vergleich zu der spezifischen Bindung der "Fängermoleküle". Die "Fängermoleküle" (4, 6) binden (FIG. 1B: 5, 7, 12, 13) kovalent oder über spezifische nichtkovalente molekulare Wechselwirkung an die Oberfläche des Substrats (1). Die Bindungsstärke eines "Fängermoleküls" reicht aus, um die Kugel an der Bindungsstelle festzuhalten. Nach der Fixie- θ ΑΤ 414 047 Β rung von "Fängermolekülen" an das Substrat werden die Kugeln von der Oberfläche entfernt (36) und die "Fängermoleküle" bleiben an der Kontaktstelle zur Kugel am Substrat zurück (9, 10, 15, 16). Bei der Ablösung der Kugeln werden die molekularen Erkennungskomplexe zwischen den übertragenen "Fängermolekülen" und den an die Kugeln gebundenen komple-5 mentären Molekülen dissoziiert. Die Bindungen der molekularen Erkennung können durch Wahl spezifischer Bedingungen der flüssigen Phase leicht und ohne Schaden der "Fängermoleküle" gelöst werden ohne dass die Fixierung der "Fängermoleküle" vom Substrat rückgängig gemacht wird. Andere Methoden zur Ablösung sind die Anwendung von Zugkräften (bei Verwendung von magnetischen Kugeln (Edelstein et al., 2000)) oder hydrodynamischen Scherkräften. 10
Die von den Kugeln hinterlassenen "Abdrücke" sind entweder einzelne "Fängermoleküle" (FIG. 1A: 9,10), bei Verwendung von Kugeln entsprechend geringer Besetzungsdichte (3), oder Gruppen von M Fängermolekülen (FIG. 1A: 15, 16), bei Verwendung von Kugeln mit entsprechend hoher Dichte gebundener "Fängermoleküle" (11). In beiden Fällen ist der Mindestabstand 15 der Bindungsstellen (2) durch den Durchmesser der Kugeln (18) gegeben, reduziert um den Durchmesser des Bindungsbereiches (17). Die erreichbare Dichte von Bindungsstellen entspricht der Dichte der Übertragungs-Kugeln, die eine hexagonal dichte Packung erreichen kann. Allerdings wird durch die Zugabe von Kugeln und deren zufällige Bindung über "Fängermoleküle" nicht die maximale Dichte erreicht, jedoch ist etwa 25% der maximalen Dichte leicht 20 erreichbar, eine für alle Anwendungen genügend hohe Dichte. Zum Beispiel, mit d = 1 pm Kugeln werden bei dieser Dichte pro cm2 (vorgesehene normale Fläche der Molekül-Matrix) etwa 30 Millionen Bindungsstellen übertragen.
Die Anzahl der pro "Abdruck" übertragenen "Fängermoleküle" hängt von mehreren Faktoren ab 25 und kann dadurch gesteuert werden. Zwei wichtige Faktoren sind die Flächendichte der "Fängermoleküle" auf der Kugel sowie die Bindungskapazität des Substrates gegenüber den "Fängermolekülen". Zudem wird die Anzahl der übertragenen "Fängermoleküle" auch von der Größe der Kontaktfläche (FIG 1A: 17) zwischen Kugel (11) und Substrat (1) beeinflusst. 30 Eine größere Kontaktfläche ergibt sich bei Einsatz von Substraten, die mit einer komprimierbaren Polymerschicht belegt sind. Bei Verwendung einer Beschichtung mittels linearer flexibler Polymerketten lässt sich der Radius des Kontaktbereichs (17), r, berechnen aus dem Kugeldurchmesser (18), d, und der effektiven Polymerlänge, h, mit der Beziehung r2~h*d. Für das flexible Abstandsmolekül PEG (Polyethylen Glykol), Mw = 2000 mit maximal gestreckter Länge 35 von 15 nm ergibt sich aus gemessenen Werten für dessen Flexibilität (Jeppesen et al., 2001) ein dynamischer Längenbereich von h = 5 -10 nm. Dies ergibt für eine Kugel mit einem Durchmesser (18) von d = 1 pm einen Bindungsbereich (17) mit dem Radius r = 70 - 100 nm. Kugeln mit hoher Besetzungsdichte (11), M "Fängermoleküle" pro r2, erlauben dann die Übertragung von etwa M "Fängermolekülen". M ist in einem weiten Bereich einstellbar mit etablierten Verfah-40 ren zur Besetzung von Kugeln mit Biomolekülen über molekulare Erkennung, mit Dichten bis zu 1/50 nm2. Zum Beispiel, mit einer Kugel mit d = 1 pm lässt sich so eine Gruppe von M "Fängermolekülen" übertragen, einstellbar zwischen M = 1 und M - 200, mit einer statistischen Abweichung von M1/2. 45 Zur Übertragung (FIG. 1A: 8) von einzelnen "Fängermolekülen" (9, 10) werden Kugeln mit geringer Besetzung von "Fängermolekülen" (3) eingesetzt. Die Zuverlässigkeit von Einzel-Molekül Übertragung lässt sich gut abschätzen für experimentell kontrollierbare Bedingungen. Die mittlere Zahl der "Fängermoleküle" an der Kugel sei <N>. Bei geringen Werten von <N> kann zufällige Verteilung angenommen werden, sowohl der Zahl N der "Fängermoleküle" auf so einzelnen Kugeln (Poissonverteilung mit Mittelwert <N>) als auch der Verteilung der N "Fängermoleküle" auf der Oberfläche jeder Kugel, wobei die Wahrscheinlichkeit des Auffindens von M der N "Fängermoleküle" in der Kontaktfläche durch die Binomialverteilung beschrieben ist. Das liefert ohne weitere Annahmen eine Formel zur Abschätzung der Fehler-Wahrscheinlichkeit, dass im Kontaktbereich mehr als ein "Fängermolekül" gebunden ist: P(>1) = 55 (<N>* (r/d)2)2. Für <N> = 3, einem Kugeldurchmesser (18) d = 1 pm, und einem Durchmesser 10
AT 414 047 B (17) der effektiven Kontaktfläche für Bindung von 2r = 200 nm (konservativer Wert, siehe oben) ist P(>1) ^ 0.0009, d.h. höchstens jede 1000te Kugel überträgt zwei "Fängermoleküle". Die Tatsache, dass sich statistisch an jeder ~20ten Kugel kein "Fängermolekül" befindet, hat keinen wesentlichen Einfluss auf das Ergebnis (geringfügige Reduktion der mittleren Dichte der Bin-5 dungsstellen). Für noch geringere Besetzung der Kugeln, zum Beispiel für <N> = 1, steigt die Zuverlässigkeit der Übertragung einzelner "Fängermoleküle" an (höchstens jede 10000te Bindungsstelle trägt zwei "Fängermoleküle"), aber auch der Anteil der Kugeln ohne "Fängermoleküle" steigt auf -37%. io Um die Position der Abdrücke der übertragenen "Fängermoleküle" am Substrat zu bestimmen, werden die Positionen der Kugeln vor ihrer Ablösung gemessen (FIG. 2: 22). Auch hierfür ist der Einsatz der SDT-scan Methode vorteilhaft. Bei Verwendung von fluoreszierenden Kugeln kann die Position jeder Kugel aus seinem Abbild (24) auf dem Pixel-Array (23) der bei der SDT-Methode eingesetzten CCD (Charged Coupled Device) Kamera sehr genau bestimmt werden, 15 zu etwa 40 nm (Hesse et al., 2002). Für praktische Anwendungen genügt die ungenauere Zuordnung einzelner Pixel zu jeder Kugel (FIG. 2: 26 sowie FIG. 3: 26) wodurch die limitierende Zeit der Datenauswertung wesentlich verkürzt wird, auf etwa die Zeit der Datenaufnahme. Neben den Kugeln, die zur Herstellung von Bindungsstellen benutzt werden, enthält die Matrix noch Kugeln, die als Positionsreferenzen dienen (FIG. 2: 19 und FIG. 3: 19). Diese Kugeln 20 tragen reaktive Funktionalitäten (FIG. 2: 20) in hoher Dichte und werden an das Substrat über mehrere kovalente oder nicht-kovalente Bindungen (FIG. 2: 21) fixiert und können nicht mehr abgelöst werden. Sie sind fluoreszierend und geben ein signifikant größeres Signal (FIG. 2: 25) auf dem Pixel-Array (FIG. 2: 23). Nach dem Ablösen der Übertragungs-Kugeln verbleiben die Referenz-Kugeln auf dem Substrat und deren Positionen (FIG. 2: REF 1) geben ein langlebiges 25 Raster zum Wiederfinden (FIG. 3:27) der Positionen der Bindungsstellen (FIG. 3: 26). Die SDT-scan Methode erlaubt das Wiederfinden jeder Position einer Oberfläche, die zu nur 0.1 % mit zufällig verteilten Referenzkugeln bedeckt ist, mit einer Präzision weit unter einem Pixel, auch nach zwischenzeitigem Entfernen der Matrix vom SDT-scan Mikroskop. 30 Zur Realisation der funktionalen Adressierbarkeit (a priori Zuordnung von Typ und Zahl von "Fängermolekülen" zu den Bindungsstellen) wird Farbkodierung der Kugeln eingesetzt (FIG. 4). Farbkodierung von Kugeln aus anorganischen oder organischen Polymeren der fraglichen Größe ist Stand der Technik und wird in einigen Varianten von Firmen angeboten (Bangs, Luminex, Microparticles, micromod, dynal). Hierbei befinden sich fluoreszierende Moleküle 35 verschiedener Farben in den Kugeln, wobei die Zahlen der Moleküle jeder Farbe auf definiert abgestufte Werte eingestellt werden können. Bei n verschiedenen Farben und m verschiedenen Konzentrationen jedes Fluorophors lassen sich im Prinzip mn -1 in ihrer Fluoreszenz unterscheidbare Kugeln herstellen. Durch Bindung von bestimmten "Fängermolekülen" an Kugeln mit bestimmtem Farbkode wird über Fluoreszenzmessung der gebundenen Kugeln für jede Bin-40 dungsstelle (Fig. 4: 26) ein Farbkode (33, 34) gemessen, der angibt, welches "Fängermolekül" an der Bindungsstelle vorliegt. Auf Grund der extremen Empfindlichkeit der SDT-Methode können Kugeln hinsichtlich der Abstufungen ihrer Fluoreszenz-Intensität und hinsichtlich ihrer Position genau vermessen werden. In FIG. 4 ist das für 5 Abstufungen 0, 1, 2, 3, und 4 (kommerziell erhältlich sind bis zu 10 Abstufungen für den gleichen Farbstoff) der Fluoreszenz von 4 ver-45 schiedenen Farbstoffen skizziert. Für jede Farbe wird das Fluoreszenzbild der Kugelmatrix (FIG.4) getrennt aufgenommen. Dies ergibt für jede Kugelposition (FIG. 4: 26) einen Farbkode (33), zum Beispiel 1314 für die Kugel an der Stelle 2, 7, bestimmt aus den 4 verschiedenen Fluoreszenz-Intensitäten (29, 30, 31, 32) für diese Kugel. Mit den 4 Farben und den 5 Abstufungen lassen sich 54 -1 = 624 verschiedene Kugeln unterscheiden. Die optische Auflösung der so SDT-scan Methode lässt vermutlich die Unterscheidung von Bibliotheken mit Tausenden verschiedener Farbkode-Kugeln zu, wobei allerdings die Erstellung solch großer Bibliotheken einen erheblichen technischen Aufwand erfordert. Für jede Kugel der Matrix wird die Pixelposition und der Farbkode einschließlich jener der Referenzkugeln (34) mit hoher Fluoreszenzintensität (28) gespeichert. Dieser Datensatz dient nach der Ablösung (FIG. 5: 36) der Übertragungs-55 Kugeln der Identifizierung der Bindungsstellen innerhalb der Matrix. Die ~1 cm2 große Matrix 1 1
AT 414 047 B (FIG. 5: 37) von Bindungsstellen und Referenzkugeln mit einem Durchmesser von 1 μιτι zusammen mit den gespeicherten Positionen Pi aller Bindungsstellen, i = 1 bis *-30 Millionen, und deren Funktion (Typ des "Fängermoleküls", Fi, und Zahl der "Fängermoleküle", mi, an der Stelle i), sei mit "MARS (Pi; Fi, mi)" bezeichnet, wobei "MARS" die Abkürzung von "Matrix of Adres-5 sable Recognition Sites" ist.
Die Verwendung von Kugeln zur Übertragung von Molekülen gestattet neben der Herstellung einer biochemischen "Matrix of Adressable Recognition Sites", MARS, auch die Produktion des chemischen Analogons, einer "Matrix of Adressible Chemical reaction Sites", kurz MACS. Im io Gegensatz zu MARS wird bei der Herstellung von MACS die Ablösung der Kugeln nicht durch Dissoziation von komplementären biochemischen Bindungspartnern wie Oligonukleotiden bewerkstelligt, sondern durch die chemische Spaltung einer kovalenten Bindung. FIG. 6A zeigt die bei der Herstellung einer MACS ablaufenden Schritte exemplarisch anhand eines Moleküls. Die zu übertragenden Moleküle sind an die Kugeln gebunden und sind aufgebaut aus einer spaltba-15 ren Funktionalität (40) (z.B. eine Disulfid-Brücke), einem optionalen Molekülteil (57, 58) sowie einer terminalen Funktionalität. Die Kugeln lagern sich nach Zugabe am Substrat an und binden über die terminalen Funktionalitäten an dessen Oberfläche. Zur Ablösung der Kugeln werden die spaltbaren Funktionalitäten (40) getreent (z.B. Reduktion des Disulfids durch Dithiothreitol); ein Anteil der gespaltenen Funktionalität (41, 42) (z.B. Thiol) sowie der optionale Molekülteil 20 (60, 61) verbleiben am Substrat (1). MACS Molekül-Matrizen können über den hier beschriebenen Weg für zwei unterschiedliche Aufgaben hergestellt werden: Im ersten Fall (FIG. 6B-1) bezweckt man, eine Population unterschiedlicher Moleküle (57, 58) von Kugeln (3, 11) auf das plane Substrat zu übertragen (59). 25 Die je unterschiedlichen Moleküle liegen entweder einzeln (60) oder in Gruppen (61) in der Matrix MACS (Pi; Fi, mi) vor, wobei Pi die Position, Fi der Molekültyp und mi die Anzahl von Molekülen für die Bindungsstellen, i = 1 bis 30 Millionen, ist. Ein Beispiel für eine spezifische Anwendung ist eine kombinatorische Bibliothek von organischen Substanzen auf Kugeln (Jung, 2000; Nicolaou et al., 2002). Eine Kugel trägt nur je einen Typ einer organischen Substanz, und 30 die Gesamtheit der unterschiedlichen Substanzen soll auf ein planes Substrat übertragen werden, um deren biologische Aktivität testen zu können.
Um die Auswertung nicht zu stören, können die gespaltenen Funktionalitäten (41, 42 in FIG. 6A und FIG 6B-1; z.B. Thiol) inaktiviert werden (Methyliodid). 35
Im anderen Fall (FIG. 6B-2) wird eine chemische Matrix mit identischen, gespaltenen reaktiven Funktionalitäten (41, 42) (z.B. Thiol) auf einer Oberfläche hergestellt. Die chemischen Funktionalitäten können chemisch weiter modifiziert werden, etwa mit Antikörpern oder Oligonukleotiden. Allgemein kann diese chemische Matrix beschrieben werden durch MACS (Pi; mi) wobei 40 an der Position Pi die Anzahl mi reaktiver Funktionalitäten vorliegt. FIG. 7 summiert einige Wege, wie "Matrices of Adressible Chemical reaction Sites" des zuletzt genannten Typs MACS (Pi, mi) (FIG. 6B-2) hergestellt und dann in MARS "Matrices of Adressable Recognition Sites" überführt werden können. Ausgehend von dem Substrat (1) werden 45 über den Übertragungsschritt (44, 46) die Funktionalitäten (40) von Kugeln (11, 3) mit hoher oder geringer Belegungsdichte auf die Substratoberfläche übertragen. Die resultierenden Matrizen enthalten isolierte Stellen mit Gruppen von reaktiven Funktionalitäten (41), MACS (Pi, mi) (45) oder Stellen mit einzelnen reaktiven Funktionalitäten (42), MACS (Pi, 1) (48). Chemische Matrix MACS (Pi, mi) (45) kann auch in MACS (Pi, 1) (48) überführt werden (47) durch Anwen-50 düng kleinerer Kugeln (38) mit sehr wenigen reaktiven Funktionalitäten (40). Das bietet den Vorteil, hochreine Matrizen mit einzelnen reaktiver Funktionalitäten (42) hersteilen zu können. Dies wird erreicht durch die zyklische Wiederholung der Bindung der kleineren Kugeln (38) mit Funktionalitäten (40) (z.B. Ortho-pyridylsulfid) an einige der reaktiven Funktionalitäten (41) (z.B. Thiol), welche dadurch geschützt werden vor der nachfolgenden Inaktivierung der freien Funkti-55 onalitäten am Substrat (1) z.B. durch N-Ethyl-Maleimid. Bei diesem Weg (47) kommt es nicht zu 1 2
AT 414 047 B einer wesentlichen Verminderung der Flächendichte der reaktiven Stellen (42). Natürlich kann das gleiche Verfahren auch direkt auf die Matrix "MACS (Pi, 1)" (48) angewendet werden (nicht in Fig. 7 inkludiert), um die Matrix von Fehlstellen mit mehr als einer reaktiven Funktionalität zu reinigen. 5
Die resultierenden chemischen Matrizen (45, 48) sind universell ersetzbar und können zur Herstellung von "MARS"-Matrizen verschiedener Art eingesetzt werden. Einige Beispiele sind dargestellt. Weg (51): die Herstellung von multi-funktionalen Einzel-Molekül Matrizen, "MARS (Pi; Fi, 1)" (55), ist dadurch erleichtert, dass die Beladung der Kugeln, vorteilhaft kleine Kugeln io (39) mit "Fängermolekülen" (4, 6) in hoher Belegung, unkritisch ist bezüglich der Flächendichte der "Fängermoleküle" auf den Kugeln, denn für deren Bindung an die Substratoberfläche steht pro Bindungsstelle nur eine reaktive Gruppe am Substrat zur Verfügung. Weg (50): Alternativer Weg zur Herstellung von "MARS (Pi; Fi, 1)" (55), unter Benutzung kleiner, mit wenigen "Fängermolekülen" (4, 6) beladener Kugeln (38). Weg (52): Matrizen mit nur einer Art von "Fänger-15 molekül", "MARS (Pi; 1, 1)" (56), können direkt durch Zugabe von "Fängermolekülen" in die flüssige Phase (53) erzeugt werden. Weg (49) ist eine Möglichkeit zur Herstellung von Matrizen "MARS (Pi; Fi, mi)" (54) mit einzelnen oder Gruppen von Fängermolekülen. Weg (49) geht von der Matrix MACS (Pi, mi) (45) aus und ist eine Alternative zum direkten Weg (43) zur Herstellung von "MARS (Pi; Fi, mi)" Matrizen ohne chemische Matrizen. 20
Die Erfindung wird anhand der nun folgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht beschränkt ist, näher erläutert.
Es zeigen: 25
Fig. 1: (A) Schematische Darstellung des Vorgangs, bei welchem einzelne oder Gruppen von Molekülen mittels sphärischer Hilfsstrukturen an ein planes Substrat übertragen werden. (B) Schematische Darstellung der einzelnen Schritte des Vorgangs zur Übertragung von Biomolekülen exemplarisch anhand eines "Fängermoleküls". 30
Fig. 2: Schematische Darstellung von an einem planen Substrat angelagerten Kugeln, deren Fluoreszenz-Intensität durch Scannen bestimmt wird.
Fig. 3. Schematische Darstellung des Verfahrens, um die Position von fluoreszierenden Kugeln 35 anhand eines Array von Pixeln eindeutig festzulegen.
Fig. 4. Schematische Darstellung der Fluoreszenzaufnahmen von oberflächenlokalisierten und farbkodierten Beads, welche verschiedene Fluorophore in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten. 40
Fig. 5. Schematische Darstellung zur Herstellung einer "Matrix of Adressable Recognition Sites", MARS.
Fig. 6. Schematische Darstellung des Vorgangs zur Herstellung einer "Matrix of Adressible 45 Chemical Reaction Sites", MACS mittels sphärischer Hilfsstrukturen. (A) Darstellung der einzelnen Schritte des Vorgangs zur Herstellung einer MACS exemplarisch anhand eines Moleküls. (B) Schematische Darstellung der Herstellung zweier unterschiedlicher Arten von MACS.
Fig. 7. Schematische Darstellung verschiedener Wege, um "Matrices of Adressible Chemical so Reaction Sites in "Matrices of Adressable Recognition Sites" überzuführen.
Fig. 8: Anwendungen für MARS-Matrizen: Nutzbarmachung der hohen Empfindlichkeit.
Der grosse Umfang der Matrize "MARS (Pi; Fi, 1)" von ~108 Bindungsstellen erlaubt viele ver-55 schiedene "Fängermoleküle" (hier exemplarisch 100 verschiedene Antikörper; es können auch 1 3
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Mischungen von Oligonukleotiden und Antikörpern angewendet werden) anzubieten und gleichzeitig jedes "Fängermolekül" in vielen Kopien (hier 1 Million), woraus sich mit der Detektionsempfindlichkeit von einzelnen Fluoreszenz-Molekülen ein dynamischer Bereich für Detektion von 6 Größenordnungen ergibt, und zwar gleichzeitig für die Detektion von 100 verschiedenen 5 Biomolekülen, messbar mit SDT-scan in ~5 min.
Fig. 9: Anwendungen für MARS-Matrizen: Proteomik.
Fig. 9A: Anwendungen für MARS-Matrizen: Protein-Funktion. Gleichzeitige Messung der Funk-io tion von vielen (hier 104) einzelnen Proteinen (Dreiecke) durch wiederholte Bildaufnahme, zur Erfassung der zum jeweiligen Zeitpunkt gebundenen Liganden (L), welche eine Fluoreszenzmarkierung (Stern) tragen. Die Liganden in Lösung geben bei der bevorzugten Anwendung einen zu vernachlässigenden Fluoreszenz-Hintergrund. Die Anwendung auf Enzyme ist besonders vielversprechend. Die Funktionsantworten (Serien von +, Bindung, und -, keine Bindung) 15 ergeben direkt die Bindungskonstanten und die Assoziations- und Dissoziationskonstanten für die Liganden-Bindung jedes einzelnen der 104 Rezeptor-Moleküle oder Enzyme, und erlaubt damit die direkte Messung der Funktionsvariabilität von Biomolekülen. Die SDT-scan Methode erlaubt 104 Moleküle im Abstand von ~1 pm in 50 ms aufzunehmen, sodass die Funktion der Proteine mit einer Zeitauflösung von -50 ms erfolgt. 20
Fig. 9B: Anwendungen für MARS-Matrizen: Messung der post-translationalen Modifikation von Proteinen. Durch Einsatz von fluoreszenzmarkierten Anikörpern gegen Phosphorylierungsstellen (P) und von markierten Lektinen gegen Zuckerreste an den Proteinen kann das Profil dieser Modifikationen für ein Protein oder mehrere Proteine gemessen werden, und gegebenenfalls 25 mit der vorher gemessenen Variation der Funktion (Fig. 9A) in einen Struktur-Funktions-Zusammenhang gestellt werden.
Fig. 9C&D: Anwendungen für MARS-Matrizen: Messung von Protein-Assoziationen. Hierbei wird ausgenutzt, dass die SDT -Methode stöchiometrische Messungen von ko-lokalisierten 30 Fluoreszenz-Molekülen erlaubt. Die Intensität an den Bindungsstellen gibt Auskunft über Homo-Assoziation (Fig. 9C) oder Hetero-Assoziation (Fig. 9D). Für den letzteren Fall ist im unteren Teil des Bildes dargestellt, dass die gleiche Information unabhängig auch durch Einsatz zweier verschiedener Farbstoffe erzielt bzw. überprüft und abgesichert werden kann. 35 Fig. 10: Anwendungen für MARS-Matrizen: DNS und mRNS Analysen.
Fig. 10A: Anwendungen für MARS-Matrizen: Messung von mRNA-Profilen. Eine Matrix mit zahlreichen verschiedenen Oligonukleotiden, jedes jedoch in genügend hoher Zahl zur Gewährleistung hoher Empfindlichkeit, kann eingesetzt werden, um mRNA-Profile von zum Beispiel 40 Extrakten von Zellen oder Organellen zu erstellen für verschiedene Zustände der Zellen.
Fig. 10B: Anwendungen für MARS-Matrizen: Korrelation benachbarter SNP's. Ein großes Interesse besteht derzeit an der Bestimmung der Reihenfolge von SNP's (Single Nucleotide Poly-morphism) in bestimmten Bereichen des Genoms. Die fraglichen DNS Einzelstränge werden 45 zunächst an Magnetkugeln mit einem Ende fixiert, und das andere Ende an entsprechende Oligonukleotide auf der Matrizze. Durch Anwendung von Magnetkraft werden die DNA Stränge gestreckt, damit die Bindung von fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden an die zu untersuchenden SNP-Stellen möglichst sicher erfolgt. Die Fuoreszenz-Antwort durch SDT-Scan gibt dann Aufschluss über gleichzeitig auftretende Mutationen an den SNP-Stellen. 50
Fig. 10C: Anwendungen für MARS-Matrizen: Mutationen in "repeats". Das gleiche Verfahren wie in Fig. 10B kann angewendet werden auf die Identifizierung von Mutationen in Bereichen von DNS mit vielfach sich wiederholenden Sequenzen ("repeats"), durch Einsatz von zwei verschiedenen Oligonukleotiden: Eines gegen die natürliche Sequenz und eines gegen die mutierte Sequenz. Die obere Bildhälfte zeigt das Ergebnis für DNS ohne Mutation, die untere 55 5 5 1 4
AT 414 047 B mit einer Mutation.
Fig. 11: Figur zu Beispiel 1: Visualisierung einzelner Fluorophore mittels der SDT-scan Methode.
Fig. 12: Figur zu Beispiel 2: Hexagonal dichte Packung von Kugeln auf einer Oberfläche.
Fig. 13: Figur zu Beispiel 3: Ablösung von Markerbeads. A: Mit Pfeilen gekennzeichnete Mar-kerbeads vor (A) und nach der Ablösung (B) von nicht gekoppelten Beads. 10
Fig. 14: Figur zur Beispiel 4: Abdruck von Gruppen fluoreszenzmarkierter Moleküle, die mittels Kugeln auf eine plane Oberfläche übertragen und kovalent gebunden wurden.
Fig. 15: Figur zur Beispiel 5: An einer Oberfläche angeordnete Beads mit unterschiedlicher 15 Fluoreszenz-Markierung.
Index der Bezeichnungen in den Figuren 1-7: I. Substrat 20 2. Mindestabstand der übertragenen Moleküle am Substrat 3. Kugel zur Übertragung, mit wenigen Fängermolekülen belegt 4. Fängermolekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel durch molekulare Erkennung gebunden 5. An das Substrat fixiertes Fängermolekül (4) vor Ablösung der Kugel 25 6. Fängermolekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel durch molekulare Erken nung gebunden, Fängermolekül unterschiedlich zu 4 7. An das Substrat fixiertes Fängermolekül (6) vor Ablösung der Kugel 8. VORGANG: Übertragung einzelner Fängermoleküle 9. Übertragene einzelne Fängermoleküle (4) nach der Ablösung der Kugel 30 10. Übertragene einzelne Fängermoleküle (6) nach der Ablösung der Kugel II. Kugel zur Übertragung, mit vielen Fängermolekülen belegt 12. An das Substrat fixierte Fängermoleküle (Gruppen von 4) vor Ablösung der Kugel 13. An das Substrat fixierte Fängermoleküle (Gruppen von 6) vor Ablösung der Kugel 14. VORGANG: Übertragung mehrerer Fängermoleküle (Gruppen) 35 15. Übertragene Gruppen von Fängermolekülen (4) nach der Ablösung der Kugel 16. Übertragene Gruppen von Fängermolekülen (6) nach der Ablösung der Kugel 17. Bindungsbereich an der Kontaktfläche Kugel-Substrat 18. Durchmesser einer Kugel zur Übertragung 19. Referenz-Kugel 40 20. Reaktive Gruppen mit hoher Dichte auf Referenz-Kugel 21. An das Substrat "kovalent gebundene" reaktive Gruppen (20) von der Referenz-Kugel 22. VORGANG: Scanning der Kugeln vor der Ablösung 23. Pixel-Array 24. Abbild der Kugeln zur Übertragung auf Pixel-Array 45 25. Abbild der Referenz-Kugeln auf Pixel-Array 26. Position der Bindungsstellen definiert durch Position der Kugeln abgebildet am Pixel-Array 27. VORGANG: Wiederfindung der Positionen 28. Fluoreszenzintensität der Referenz-Kugel 29. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Übertragung, innerhalb eines ausgewähl- 50 ten Wellenlängenbereichs. 30. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Übertragung, innerhalb eines von 29 abweichenden Wellenlängenbereichs. 31. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Übertragung, innerhalb eines von 29 und 30 abweichenden Wellenlängenbereichs. 55 32. Fluoreszenzintensität einer definierten Kugel zur Übertragung, innerhalb eines von 29, 30 1 5
AT 414 047 B und 31 abweichenden Wellenlängenbereichs. 33. Farbcode (mit willkürlichen Werten) 34. Farbcode der Referenz-Kugel 35. An Kugeln verbleibende Anteil nach Spaltung der Funktionalität 40 5 36. VORGANG: Ablösung der Kugeln zur Übertragung 37. Matrix von Bindungsstellen und Referenz-Kugeln, MARS (Matrix of Addressable Recogni-tion Sites) oder MARS (Pi, Fi, mi) 38. Kleine Kugeln zur Übertragung, mit wenigen Molekülen belegt 39. Kleine Kugeln zur Übertragung, mit vielen Fängermolekülen belegt io 40. Reaktive spaltbare Funktionalitäten zur Erzeugung von MACS (Matrix of Addressable Chemical reaction Sites)
41. Übertragene Gruppen von reaktiven Funktionalitäten auf MACS
42. Übertragene einzelne reaktive Funktionalitäten auf MACS 43. VORGANG zur Erzeugung von MARS (Pi, Fi, mi) (37) 15 44. VORGANG zur Erzeugung von MACS (Pi, mi) (45) 45. MACS mit Gruppen gleicher Funktionalitäten, MACS (Pi, mi) 46. VORGANG zur Erzeugung von MACS (Pi, 1) (48) 47. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi, mi) (45) in MACS (Pi, 1) (48) 48. MACS mit einzelnen Stellen gleicher Funktionalitäten, MACS (Pi, 1) 20 49. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi, mi) (45) in MARS (Pi, Fi, mi) (54) 50. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi, mi) (45) in MARS (Pi, Fi, 1)(55) 51. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi, 1) (48) in MACS (Pi, Fi, 1) (55) 52. VORGANG zur Überführung von MACS (Pi, 1) (48) in MACS (Pi, 1,1) (56) 53. Fängermoleküle in flüssiger Phase 25 54. MARS (Pi, Fi, mi) mit einzelnen und Gruppen an verschiedenen Fängermolekülen ver schiedener Art, aus MACS (Pi, mi) (45) hergestellt 55. MARS (Pi, Fi, 1) mit ausschließlich einzelnen Fängermolekülen verschiedener Art, aus MACS (Pi, mi) (45) und MACS (Pi, 1)(48) hergestellt
56. MARS (Pi, 1,1) mit ausschließlich einzelnen Fängermolekülen gleicher Art, aus MACS 30 (Pi, 1) (48) hergestellt 57. Molekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel gebunden 58. Molekül definierter Art zur Übertragung, auf einer Kugel gebunden; Molekül unterschiedlich zu 57 59. VORGANG: Übertragung von Molekülen einzeln und/oder in Gruppen 35 60. Übertragenes einzelnes Molekül 61. Übertragene Gruppe von Molekülen
Beispiele: 40 Beispiel 1:
Einzelne Cy3 Fluorophore wurden auf einem Glasplättchen immobilisiert und mit SDT-Scan visualisiert. Zur Immobilisierung wurde Cy3 zunächst an Polyethylenglykol-Diamin gekoppelt, und dieses Konjugat wurde über die verbleibende terminale Amingruppe des PEG an eine 45 Epoxid-Oberfläche kovalent gebunden. Zur Herstellung des Cy3-PEG-Konjugates wurden 0,2 Gramm (100 pmol) PEG-Diamin (Mw 2000, Rapp Polymerere) in 4 ml salzsaurem Dimethylformamid (DMF) pH = 6,5 gelöst und mit 1 mg (1,3 pmol) Cy3-N-Hydroxysuccinimid (Cy3-NHS, Amersham Pharmacia), gelöst in 1 ml DMF, für 3 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 pl einer 5%-igen Disopropylethylamin (DIEA)/DMF-Lösung gestartet; Reakti-50 onsverlauf und Reaktionsende wurden mittels Dünnschichtchromatographie (DC) überwacht. Die Aufreinigung erfolgte über Gel-Filtration und lonenaustauch-Chromatographie, und die Reinheit der Fraktionen wurde mit DC überprüft. Zur Herstellung von Glasplättchen mit Epoxid-Beschichtung wurden Deckgläschen (Esco, microscope cover glass, 24 x 50 mm; Erie Scientific, Portsmouth, N.H.) mit Trifluoressigsäure geätzt und mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan 55 (GPS) gemäß der Publikation (Hehler et al., 2000) silanisiert. Die Qualität der Beschichtung 16
AT 414 047 B wurde mit Kontaktwinkelmessungen (Dataphysics OCA 20) bestätigt. Die Kopplung von Cy3-PEG-Amin an die silanisierten Glasplättchen erfolgte mit einer Konzentration von 20 nM (Messung mit UV-Vis-Spektrophotometer Shimadzu UV1601) in 50 mM Borat-Puffer pH = 8,8 für 10 Minuten. Überschüssiges, nicht gebundenes Cy3-PEG-Amin wurde durch mehrmaliges 5 Waschen in Wasser entfernt. Zur Visualisierung der immobilisierten Fluorophore wurde das Fluoreszenz-Lesegerät "Nanoreader" verwendet. Zur Anregung wurde ein Dioden-gepumpter Festkörper-Laser mit einer Wellenlänge von 532 nm eingesetzt, als Objektiv wurde ein Axiovert PNF 40x/1,3 Öl verwendet. Die Belichtungsdauer betrug 100 ms und das Signal wurde mit einem Cy3-Filtersatz (Chroma, HQ610_75m) gefiltert. Zur Bildwiedergabe wurde das Programm io V++ (Digital Optics) eingesetzt. Fig. 11 zeigt eine Fläche von 30 pm mal 50 pm mit einzelnen und Clustern von Fluorophoren mit einer durchschnittlichen Einzel-Signalintensität von 15 Counts. Das Signal zu Rauschverhältnis betrug im Mittel 50.
Beispiel 2: 15
Zur Herstellung einer hexagonal dichten Packung von Kugeln an einer Oberfläche wurden Beads mit einer Beschichtung aus Polyethylen Glykol (PEG) eingesetzt. Zur Beschichtung mit PEG wurden die Beads (Latex-Beads, Polysciences, Durchmesser 2 pm, Carboxyl-Oberfläche) in 20 pl 1M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer mit einer Endkonzentration von 20 1 Massenprozent suspendiert und mit 1 ml einer Lösung von 0,1 M MES-Puffer pH = 4,5 mit 26 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid und 10 mM Methoxy-Polyethylenglykol-Amin (Mw 5000, Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA) gemischt und für 2 Stunden in einem Schüttler bei 150 rpm inkubiert. Nach der PEG-Beschichtung wurden die Beads mehrmals gewaschen und in einer 1% Suspension auf eine pegylierten Glasplättchenoberfläche 25 aufgebracht. Zur Herstellung einer pegylierten Glasoberfläche wurden mit Glycidoxypropyltri-methoxysilan modifizierten Glasplättchen (Herstellung siehe Beispiel 1) mit 100 mg Methoxy-Polyethylenglykol-Amin (Mw 5000) (Shearwater Polymers) in 25 ml 50 mM Borat Puffer pH = 8,8 bei Raumtemperatur für 24 Stunden inkubiert. Fig. 12 zeigt einen 110 pm mal 60 pm großen Ausschnitt eines Durchlicht-Bildes von in hexagonal dichter Packung angeordneter 30 pegylierter Latexkuglen auf pegyliertem Glasplättchen, aufgenommen mit dem Nanoreader.
Beispiel 3:
Zur Demonstration des Einsatzes von Markerbeads wurde eine Mischung von nicht fluoreszie-35 renden Beads und kovalent koppelnden, fluoreszierenden Markerbeads auf ein Glassubstrat aufgebracht. Die Markerbeads banden kovalent und verblieben nach dem Waschen auf der Oberfläche während nicht gekoppelte Beads von der Oberfläche abgelöst werden. Zur Herstellung von koppelnden Markerbeads wurden fluoreszenzmarkierte Silikatbeads (sicastar ® -redF von Micromod, mit Carboxyl-Oberfläche, Durchmesser von 2 pm) mit PEG-Diamin (Mw 3400, 40 Shearwater Polymers) via EDC-Aktivierung modifiziert. Für die Modifizierung wurden die Beads in 20 pl 1M MES-Puffer pH = 4,5 mit einer Endkonzentration von 1 Massenprozent resuspen-diert. Diese Suspension wurde transferiert in 1 ml 0,1M MES-Puffer pH = 4,5 mit 26 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC; Sigma) und 10 mM Polyethylenglykol-Diamin (Mw 3400, Shearwater Polymers) und für 2 Stunden in einem Schüttler bei 750 rpm 45 inkubiert. Die mehrfache Waschung erfolgte mit Wasser. Zur Herstellung von nichtkoppelnden Beads wurden unmarkierte Silikatbeads (sicastar ® von Micromod, mit Carboxylat-Oberfläche, Durchmesser von 2 pm) in 1 ml 0,1 M MES-Puffer pH = 4,5 mit 26 mM EDC und 10 mM Metho-xy-Polyethylenglykol-Amin (Mw 5000, Shearwater Polymers) für 2 Stunden in einem Schüttler (Thermomixer comfort, Eppendorf) bei 750 rpm inkubiert. Die mehrfache Waschung erfolgte mit so Wasser. Für die Belegungsexperimente mit Beads wurden pegylierte Glasplättchen mit Aminreaktiver Oberfläche eingesetzt. Zur Herstellung einer pegylierten Glasoberfläche wurden mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan-modifizierte Glasplättchen (Herstellung siehe Beispiel 1) mit 100 mg Methoxy-Polyethylenglykol-Amin (Mw 5000, Shearwater Polymers) in 25 ml Borat Puffer pH = 8,8 bei Raumtemperatur für 24 Stunde inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen wurde die terminale Amin-Funktion mit Succinanhydrid (Sigma) in einer gesättigten, mit 6N NaOH auf 55 1 7 AT 414 047 ß pH = 6,2 - 6,5 gehaltenen Lösung für 2 Stunden modifiziert. Die entstandene Carboxylat-Funktion wurden in 25 ml DMF mit 13 mM N.N.N’.N’-Tetramethyl-O-iN-succinimidylJ-uronium-tetrafluoroborat (TSTU) und 6,9 mM NHS unter Zugabe von 20 μΙ Triethylamin aktiviert. Die Waschung erfolgte mit einem DMF/Isopropanol-Gradienten, abschließend wurde im Stickstoff-5 ström getrocknet. Zur Belegung der beschichteten Glasplättchen mit Beads wurde eine Mischung von 0,01% Markerbeads mit PEG-Amin-Terminus und von 1% Beads mit PEG-Terminus in Borat Puffer pH = 8,8 aufgenommen, die Mischung auf das Plättchen aufgetragen und 60 Minuten inkubiert. Fig. 13 A zeigt eine Durchlicht-Aufnahme der angelagerten Beads. Während der Inkubation koppelten die Markerbeads mit dem Aminterminus an die NHS-io aktivierte Glasoberfläche, sodass die Markerbeads nach einem Waschschritt an dem Glasplättchen verblieben während nichtkoppelnden Beads abgelöst wurden. Fig. 13 B zeigt eine Cy3 Fluoreszenz-Aufnahme der anhaftenden Makerbeads nach der Ablösung der nichtkoppelnden Beads. Der abgebildete Plättchenbereich ist gleich jenes in Fig. 13 A. 15 Beispiel 4:
Fluoreszenzmarkierte Moleküle wurden von Kugeln in kontrollierter Weise auf eine plane Oberfläche übertragen. Dazu wurden Beads mit Amin-PEG-Cy3 belegt und auf ein Glasplättchen mit PEG-NHS Beschichtung aufgebracht. An den Kontaktstellen zwischen Kugeln und Glas wurde 20 Amin-PEG-Cy3 auf das Glassubstrat übertragen und kovalent gekoppelt, sodass nach Abwaschen der Kugeln fluoreszenzmarkierte Abdrücke verblieben. Für diese Übertragung wurden 20 μΙ Silicat Beads (Bangs Laboratories Inc, mit Carboxylatoberfläche, Durchmesser 5 μιη) in PBS Puffer pH = 7,3 mit einer Endkonzentration von 10 Massenprozent resuspendiert. Diese Beads-Suspension wurde zu 1 ml PBS Puffer pH = 7,3 mit 1,2 μΜ (1 mg) Amin-PEG-Cy3 (Syn-25 these siehe Beispiel 1) zugegeben und für 2 Stunden unter Schütteln (Thermomixer Eppendorf comfort) bei 750 rpm inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen in PBS Puffer pH = 7,3 wurde im Überstand kein Fluoureszenzsignal (Fluoreszenzenzspektrometer Hitachi f-4500) nachgewiesen. Zu den beladenden Übertragungsbeads wurden Markerbeads (Silicat Beads, Bangs Laboratories Inc., Carboxylatoberfläche, Durchmesser 5 pm mit einer gemischten PEG-Amin/Cy3-30 PEG-Amin-Oberfläche, Herstellung analog zu Beispiel 3) im 1000-fachen Unterschuss gemengt. Die Mischung wurde auf das Glasplättchen mit PEG-NHS-Beschichtung aufgebracht und für 15 Minuten inkubiert (Herstellung der beschichteten Plättchen siehe Beispiel 3). Die Übertragungsbeads wurden durch Waschen abgelöst und die fluoreszenzmarkierten Abdrücke mit dem Nanoreader visualisiert (siehe Beispiel 1). Fig. 14 A zeigt einen etwa 100 pm mal 35 50 pm großen Ausschnitt mit einem Markerbead hoher Fluoreszenzintensität und ca. 100 Abrü cken geringerer Intensität. Fig. 14B zeigt einen Teilausschnitt von Fig. 14A mit Abdrücken unterschiedlicher Fluoreszenzintensitäten.
Beispiel 5: 40
Zur Demonstration des Einsatzes von farbmarkierten Beads wurden drei Sorten unterschiedlich fluoreszenzmarkierter Silikat-Beads (sicastar ® blueF und sicastar ® greenF, sicastar ® redF von Micromod, mit Carboxylatoberfläche, Durchmesser je 2 pm) eingesetzt. Die Beads wurden mit Methoxy-PEG-Amin mittels EDC Aktivierung modifiziert (Herstellung siehe Beispiel 2). 45 Ebenso wurde das Glassubstrat mit Methoxy-PEG-Amin beschichtet (Herstellung siehe Beispiel 2). Zur Belegung des Glasplättchens mit Kugeln wurde eine Mischung der drei Beadsorten mit gleichen Anteilen von 0,5 Massenprozent in Wasser mit einer gesamten Endkonzentration von 1,5 Massenprozent suspendiert und auf das Plättchen aufgetragen. Zur Fluoreszenzaufnahme der adsorbierten Beads wurde ein Fluoreszenzmikroskop mit einer Quecksilberdampflampe so (Zeiss, fluo arc HBO 100) und einem Objektiv (Zeiss, Axiovert PNF 40x/1,3 Öl) eingesetzt. Ein Bildausschnitt wurde mit drei Filtersätzen aufgenommen: DAPI Anregungsfilter: D365/10x, Dichroitischer Strahlteiler: 380DCLP, Emissionsfilter: D460/50m. FITC Anregungsfilter: HQ480/40x, Dichroitischer Strahlteiler: Q505LP- Emissionsfilter: HQ535/50m. Cy3 Anregungsfilter: HQ535/50x, Dichroitischer Strahlteiler: Q565LP Emissionsfilter: HQ610/75m. Cy5 Anre-55 gungsfilter: HQ620/60x, Dichroitischer Strahlteiler: Q660LP- Emissionsfilter: HQ700/75m. Die

Claims (22)

1 8 AT 414 047 B einzelnen Bilden wurden zur Verdeutlichung abhängig von den ausgesandten Wellenlängen farblich kontrastiert und mit Hilfe der Software V++ übereinandergelegt (Fig. 15). Die blauen Kugeln entsprechen den Signalen der Sicastar blue, die grünen Kugeln jener von 5 Sicastar red, die schwarzen Kugeln jenen der Sicastar green. Referenzen: Arbeitman et al. (2002). Science 297, 2270-2275. io Bernard et al. (1998). Langmuir 14, 2225-2229. Bernard et al. (2001). Nat Biotechnol 19, 866-869. Clausen-Schaumann et al. (2000). Curr Opin Chem Biol 4, 524-530. Edelstein et al. (2000). Biosens Bioelectron 14, 805-813. Fodor et al. (1993). Nature 364, 555-556. 15 Fukui et al. (2002). Nat Biotechnol 20, 1011-1017. Hesse et al. (2002). J Chromatogr B 782, 127-135. Jeppesen et al. (2001). Science 293, 465-468. Jung (2000). Combinatorial Chemistry : Synthesis, Analysis, Screening, Vch Verlagsgesellschaft). 20 Lamet al. (2002). Curr Opin Chem Biol 6, 353-358. MacBeath et al. (2000). Science 289, 1760-1763. Mehta et al. (1999). Science 283, 1689-1695. Nicolaou et al. (2002). Handbook of Combinatorial Chemistry : Drugs, Catalysts, Materials, John Wiley & Sons). 25 Nie et al. (1997). Annu Rev Biophys Biomol Struct 26, 567-596. Okamoto et al. (2000). Nat Biotechnol 18, 438-441. Pellois et al. (2002). Nat Biotechnol 20, 922-926. Piehler et al. (2000). Biosens Bioelectro 15, 473-481. Pollack et al. (1999). Nat Genet 23, 41-46. 30 Schena et al. (1995). Science 270, 467-470. Schindler (2000) WOOO/25113 Schmidt et al. (1996). Proc Natl Acad Sei U S A 93, 2926-2929. Schutz et al. (2000). Embo J 19, 892-901. Segers-Nolten et al. (2002). Nucleic Acids Res 30, 4720-4727. Sonnleitner et al. (1999). Bi-35 ophys J 77, 2638-2642. Xie et al. (1999). J Biol Chem 274,15967-15970. Zhu et al. (2001). Science 293, 2101-2105. 40 Patentansprüche: 1. Anordnung zur Bindung von Molekülen, umfassend bindungsfähige Funktionalitäten, welche als molekular-einzelne Funktionalitäten oder in Gruppen gleicher Funktionalitäten auf einem festen Träger vorliegen, wobei die Dichte der einzelnen Funktionalitäten bzw. Grup- 45 pen von Funktionalitäten auf dem festen Träger von 101 2 bis 1010 einzelnen bzw. gruppier ten Funktionalitäten pro cm2 beträgt, sich bei zumindest 95 %, insbesondere bei zumindest 99 %, der einzelnen bzw. gruppierten Funktionalitäten innerhalb eines gewählten Radius d von einer (beliebigen) einzelnen bindungsfähigen Funktionalität oder Gruppe von Funktionalitäten keine weiteren bindungsfähigen Funktionalitäten befinden. 50
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand d von 0,1 bis 100 pm, insbesondere 0,5 bis 10 pm, beträgt. 55 1 Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich Einhei 2 ten, die über die bindungsfähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden sind, 19 AT 414 047 B aufweist, wobei die Einheiten vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, insbesondere RNA und DNA, sowie Oligopeptiden und Polypeptiden, insbesondere Antikörpern, oder organischen Molekülen, insbesondere Mitgliedern einer kombinatorischen Bibliothek. 5
4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte der einzelnen oder gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten auf dem festen Träger von 105 bis 101 2, insbesondere von 106 bis 10®, einzelnen oder gruppierten bindungsfähigen Funktionalitäten pro cm2 beträgt. 10
5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche ist.
6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätz- 15 lieh Einheiten, die über die bindungsfähigen Funktionalitäten an die feste Oberfläche ge bunden sind, und an welche Moleküle, vorzugsweise nicht kovalent, gebunden sind.
7. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Einzelmolekülen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
20 - Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten, - Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypeptide, tragen, die an die bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche bindenden können, so dass die Hilfsstrukturen über die Einheiten und Funktionalitäten an die feste Oberfläche gebunden werden,
25 - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche entweder (i) die bindungsfähigen Funktionalitäten, die nicht mit den Hilfsstrukturen verbunden sind, inaktivieren, so dass diese bindungsfähigen Funktionalitäten ihre Bindungsfähigkeit verlieren, oder (ii) die Einheiten, die nicht an die bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche gebunden sind, blockieren,
30 - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche die Bindung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebundenen Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten oder Fragmenten dieser im Bereich der Kontaktstelle auf der festen 35 Oberfläche. 1 Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten und Kontaktie- 40 ren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit aktivierbaren bindungsfä higen Funktionalitäten tragen, die an die Funktionalitäten der festen Oberfläche binden können, sofern sie durch äußere Stimuli aktiviert werden, - oder Bereitstellen einer festen Oberfläche mit aktivierbaren bindungsfähigen Funktionalitäten und Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten mit bin- 45 dungsfähigen Funktionalitäten tragen, - Einwirken eines äußeren Stimulus auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, so dass die aktivierten bindungsfähigen Funktionalitäten der Hilfsstrukturen bzw. der festen Oberfläche an die anderen bindungsfähigen Funktionalitäten der festen Oberfläche bzw. der Hilfsstrukturen binden und damit die Hilfsstrukturen über die so Einheiten an die feste Oberfläche binden, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, welche die Bindung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebunden Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und 2 - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getra- 55 genen Einheiten oder Fragmenten dieser im Bereich der Kontaktstelle auf der festen 20 AT 414 047 B Oberfläche.
9. Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass als Hilfsstrukturen im wesentlichen kugelförmige Gebilde eingesetzt werden, welche aus organischen oder anor- 5 ganischen Polymeren, Metallen oder Metallverbindungen bestehen.
10. Verfahren nach Anspruch 7 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfsstrukturen eine Markierung aufweisen und vorzugsweise mehr als eine Art von markierten Hilfsstrukturen verwendet werden. 10
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Hilfsstrukturen mit einer Fluoreszenz-Markierung eingesetzt werden, und vorzugsweise Hilfsstrukturen mit unterschiedlicher Fluoreszenz-Markierung verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine beliebi ge Hilfsstruktur nur eine spezifische Art von Einheiten, wie organische Gruppen, Nukleinsäuren oder Polypeptide trägt, und eine Population von Hilfsstrukturen mit je unterschiedlich belegten Einheiten verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die spezifische Fluoreszenz-Markierung der unterschiedlichen Hilfsstrukturen als auch die spezifische Belegung der Hilfsstrukturen mit Einheiten vor Aufbringen der Hilfsstrukturen auf die feste Oberfläche bekannt ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass aufgrund der Kenntnis der Positionen der fluoreszenz-markierten Hilfsstrukturen auf der festen Oberfläche die chemische Identität der von den Hilfsstrukturen hinterlassenen Einheiten nach der Ablösung der Hilfsstrukturen bekannt ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Kontak tieren der festen Oberfläche mit den Hilfsstrukturen unter Zuhilfenahme von Schwerkraft, Zentrifugalkraft, Magnetkraft, elektrischer Anziehung, Anreicherung an Zweiphasen-Grenzschichten oder Kombinationen davon erfolgt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Oberfläche eine Glas-, Kunststoff-, Membran-, Metall-, oder Metalloxid-Oberfläche eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als bin- 40 dungsfähige Funktionalitäten NH2-, SH-, OH-, COOH-, CI-, Br-, I-, Isothiocyanat-, Isocya- nat-, NHS-Ester-, Sulfonyl-Chlorid-, Aldheyd-, Epoxid-, Carbonat-, Imidoester-, Anhydrid-, Maleimid-, Acryloyl-, Aziridin-, Pyridyl-Disulfid-, Diazoalkan-, Carbonyl-Diimidazol-, Carbo-diimid-, Disuccinimidyl Carbonat-, Hydrazine-, Diazonium-, Aryl-Azid-, Benzophenon-, Diaz-irin-Gruppen oder Kombinationen davon eingesetzt werden. 45
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den bindungsfähigen Funktionalitäten und den zu bindenden Einheiten oder zwischen der festen Oberfläche und den bindungsfähigen Funktionalitäten ein Spacer-Molekül vorgesehen wird. 50
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, folgende Schritte eingesetzt werden: - Bereitstellen einer festen Oberfläche mit bindungsfähigen Funktionalitäten, insbesondere 55 Maleimid-Funktionalitäten, 5 10 15 20 25 30 35 40 21 AT 414 047 B - Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere Nukleinsäuren oder Polypeptide, über molekulare Erkennung gebunden haben und welche terminale Thiol-Funktionalitäten tragen, die an die feste Oberfläche bindenden können, so dass die Hilfsstrukturen an die feste Oberfläche gebunden werden, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit thiolhäl-tigen Reagenzien, insbesondere beta-Mercaptoethanol, welche die Funktionalitäten, insbesondere die Maleimid-Funktionalitäten, die nicht mit den Hilfsstrukturen verbunden sind, inaktivieren, - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit einem physikalischen oder chemischen Stimulus, wie erhöhte Temperatur, welche die molekulare Erkennung zwischen den Hilfsstrukturen und den gebundenen Einheiten rückgängig macht, und - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung einer Anordnung zur Bindung von Molekülen, folgende Schritte eingesetzt werden: - Bereitstellen einer festen Oberfläche mit Funktionalitäten, insbesondere Aminen, - Kontaktieren der festen Oberfläche mit Hilfsstrukturen, die Einheiten, insbesondere organische Moleküle, einer kombinatorischen Bibliothek, mit aktivierbaren Funktionalitäten, insbesondere photoaktivierbare Phenylazide, tragen, die an die Funktionalitäten, insbesondere an die Amin-Funktionalitäten, der festen Oberfläche binden können, sofern sie, insbesondere durch einen UV-Licht-Beleuchtungsschritt, aktiviert werden, wobei die Einheiten über chemisch spaltbare Funktionalitäten, insbesondere Disulfid-Brücken, an die Hilfsstrukturen gebunden sind, - lokalisiertes Einwirken eines äußeren Stimulus, insbesondere UV-Licht, auf die feste Oberfläche mit den daran angeordneten Hilfsstrukturen, sodass die Einheiten insbesondere mit den photoaktivierten Phenylaziden an die Funktionalitäten, insbesondere die Amin-Funktionalitäten, binden und damit die Hilfsstrukturen an die feste Oberfläche gebunden werden, wobei der äußere Stimulus, insbesondere in Form eines evaneszieren-den Feldes von UV-Licht, eingesetzt wird und lokalisiert auf Funktionalitäten an der festen Oberfläche wirkt sowie an jenen Teilen der Hilfsstrukturen, die im Bereich des eva-neszierenden Feldes sind - Behandeln der festen Oberfläche mit den daran gebundenen Hilfsstrukturen mit Mitteln, insbesonder Dithiothreitol, welche die Disulfid-Brücken zwischen den Hilfsstrukturen und den gebunden Einheiten oder Fragmenten der gebundenen Einheiten spaltet, und - Ablösen der Hilfsstrukturen unter Zurücklassen der zuvor von den Hilfsstrukturen getragenen Einheiten oder Fragmenten dieser im Bereich der Kontaktstelle auf der festen Oberfläche. 21. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 20.
22. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Fluoreszenzmik- 45 roskopieuntersuchung. 23. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Bindung von Biomolekülen, insbesondere zur Bindung von Antigenen, Liganden, Proteinen, DNS, mRNS, Toxinen, Viren, Bakterien, Zellen oder Kombinationen davon. 50 24. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Untersuchung von cDNS von Zellen, wobei fluoreszenzmarkierte cDNSs an die Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden binden, und die Bindung für jede gebundene cDNS-Art ausgelesen werden kann. 55 22 AT 414 047 B
25. Verwendung einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Untersuchung der Proteine von Zellen, wobei fluoreszenzmarkierte Proteine an die Anordnung von verschiedenen Antikörpern binden und die Bindung für jede gebundene Protein-Art ausgelesen werden kann. Hiezu 20 Blatt Zeichnungen 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
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