WO2009127751A1 - Solución de espoteo de un sustrato en un soporte sólido - Google Patents

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WO2009127751A1
WO2009127751A1 PCT/ES2008/070072 ES2008070072W WO2009127751A1 WO 2009127751 A1 WO2009127751 A1 WO 2009127751A1 ES 2008070072 W ES2008070072 W ES 2008070072W WO 2009127751 A1 WO2009127751 A1 WO 2009127751A1
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spotting
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PCT/ES2008/070072
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Inventor
Pedro Manuel Franco De Sarabia Rosado
Gemma Rocio LIMONES LÓPEZ
Nuria CORTÉS BAREA
Javier MARTÍNEZ-BOTAS MATEO
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Biotools Biotechnological & Medical Laboratories, S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a solution for splashing (spotting buffer) chemical substances, including synthetic or non-biological substances, in different solid fixing supports such as glass, plastic, cellulose, ceramics or the like that have been or not previously chemically derivatized in their surface .
  • the commonly used rts are glass and polystyrene, although glass has more favorable optical characteristics.
  • the surfaces of these supports may or may not be chemically derivatized so that they have different reactive groups that allow the covalent and permanent fixation of the molecules.
  • the most common used are aminosilane, epoxysilane, aldehyde and poly-L-lysine.
  • nucleic acid microarrays there are two types of platforms widely used: oligonucleotide microarrays of length 25-70 meters and microarrays of cDNA or PCR products of length between 70-600 bp.
  • oligonucleotide microarrays can be prepared following the standard methods of phosphoramidite chemistry for their synthesis in a glass support (Maskos and Southern, Nucleic Acids Res. 20: 1679-1684 (1992); Gao et al., Biopolymers 73 (5): 579-596 (2004)).
  • This procedure together with the introduction of photolabel protective groups in phosphoramidites, has allowed the development of new technology-based synthetic strategies. photolithographic that allow to direct and control the synthesis in spatially specific places of the surface of the glass in function of the transmission of light applied US7144700, Nat. Genet 21: 20-24 (1999); Fodor et al., Science 251: 767-773 (1991)).
  • the synthesis of oligonucleotides ⁇ n s ⁇ tu has the disadvantage that they cannot be purified so that, depending on the final purity achieved, the accuracy and quality of the results during the subsequent hybridization stage could be altered.
  • nucleic acid microarrays Another methodology used in nucleic acid microarrays involves the deposition or splashing of oligonucleotides of biological or synthetic origin and cDNA on the surface of the glass, using contact or non-contact printing technologies with robotic pins or piezoelectric ink-jet instruments. This methodology is also used for the deposition of other chemical and biological molecules such as proteins, and tissues. Depending on the type of surface, several strategies are followed to fix the molecules covalently, either through the phosphate groups of the nucleic acid chains or through chemical modifications introduced at the 5 'end of the oligonucleotides. Unlike the previous methodology, thousands of points can be printed with each molecule.
  • a suitable spout solution is required to keep the samples of molecules to be dissolved and stable, but at the same time give the resulting solutions viscosity properties and surface tension appropriate for proper deposition on the glass surface, tion on the surface of the glass, giving rise to points with good intensity, uniformity and reproducibility.
  • composition of the ideal sputtering solution would be that which would allow the formation of dripping drops at the printing stage that, when dried, produce points that met a series of important requirements:
  • the point must have a circular or round shape.
  • an adequate point diameter in high density arrays is about 100-150 ⁇ m.
  • the intensity signal after the hybridization stage should be homogeneous over the entire surface of the point, avoiding variations in the concentration of the substance deposited along the point. It is convenient to avoid the known "donut" ring effect, by accumulating higher concentrations of the substance deposited in the margins of the point than in the interior, or the effect of aggregation of the substance deposited in certain places of the point. An adequate viscosity and slow evaporation of the dripping solution minimizes these effects.
  • This uniformity can be evaluated according to the coefficient of variation (CV), which is the ratio of the standard deviation between the average of all the pixels that define the point. A correct distribution of the molecules along the point implies a low CV ( ⁇ 10%).
  • CV coefficient of variation
  • cDNA microarrays entail a stage of denaturation of the double chains prior to the hybridization stage to obtain single-stranded DNA, by contact with boiling water or by treatment with NaOH, generally. In this sense, the possibility that the spout solution itself has a denaturing effect that involves the direct deposition of single stranded DNA seems advantageous.
  • the present invention is a new solution of splashing (spotting buffer) of a substrate in different solid supports (sudes).
  • the spout solution described herein comprises at least the mixture of at least one non-reducing carbohydrate, at least one amino acid and at least one organic polymer in aqueous solution together with at least one organic solvent.
  • the splash solution described herein contains non-reducing carbohydrates that allow the slow evaporation of the water contained in the mixture so that the point obtained is homogeneous in size and intensity.
  • the dripping solution contains polymers that maintain the surface tension of the drop while retaining a certain amount of water that allows the spilled substrate (dnas, proteins, tissues) to maintain its three-dimensional structure and its analysis is viable.
  • the splash mixture contains an organic solvent which is in a percentage between 25-75% of the total of the mixture, so that the mixture has the proper density so that it can be properly sputtered by the arrayer.
  • non-reducing carbohydrates are taken from the group consisting of: trehalose, melezitose, palatinitol and raffinose.
  • amino acids are taken from the group consisting of betaine, usine, arginine, tryptophan, and aminoguanidine derivatives.
  • the organic polymers are taken from the group consisting of PVP (polyvinylpyrrolidone), PEG (polyethylene glycol) 8000, PEG 2000, ficoll, glycogen, starch and gum arabic.
  • the organic solvent is taken from the group consisting of formamide, nitrocellulose, DMSO (dimethylsulfoxide), formaldehyde, and glycerol.
  • the substrates to be splashed are synthetic or biological nucleic acids, proteins, labeled or unlabeled tissues.
  • the solid support used is preferably glass, plastic, ceramic and derivatives. Said solid support may be chemically treated or not.
  • Figure 1 shows on its right side an image scanned at 532 nm, stained with SyBr GoId, on the left an image scanned at 633 nm; detection with xylene cyanol dye.
  • Figure 2 shows a scanned image of the hybridized subarrays corresponding to example 2 (oligonucleotide printing)
  • Figure 3 shows a graph of the hybridization intensity of the spiked samples with the different spout solutions of example 2.
  • Figure 4 shows the image at 633 nm of one of the hybridized subarrays corresponding to example 3 (PCR product printing).
  • Figure 5 shows a graph of the hybridization intensity of the spiked samples with the different spout solutions of example 3.
  • Figure 6a and 6b shows the intensity of each antibody against the spout solution after being stored at different temperatures for 3 months.
  • Figure 7a and 7b shows the intensity of each antibody against the dripping solution after being stored at different temperatures for 6 months.
  • Salmon testis DNA (102 ng / ⁇ l) was printed with 0.02 mM of xylene cyanol dye dissolved in two commercial buffer types as reference and comparison object (third (3) and fourth (4) rows in Figure 1), in the spout solution A (first row (1) in Figure 1), (trehalose, betaine and PVP in 50% DMSO) and in the spout solution B (second row (2) in Figure 1), (Trehalose, betaine and gum arabic in 50% DMSO).
  • the robot used for printing was the Perkin Elmer SpotArray TM 72 Microarray Printing System.
  • Sudes with amino functionalization were printed with 8 points for each DNA sample and 4 replicates or subarrays. After printing, the drops were allowed to dry overnight at room temperature and the suds were scanned at 633 nm to detect the dye, with the LuxScan-lOK / A scanner from CapitalBio. The DNA was then immobilized in the crystal by cross-linking, by UV irradiation with a total energy of 400 mJ, and heated 2 h at 80 ° C.
  • Amino groups were blocked unreacted by immersing the sweat in a solution of 1% BSA, prewarmed to 50 0 C for 5 min.
  • the suds were washed and submerged boiling water for 5 min to open the DNA chains and fixed with 95% ethanol. Then they were air dried. Finally, the DNA was stained by immersing the beads in a 1000Bx SyBr GoId solution.
  • Figure 1 shows the scanned image of a sub-ray of a slide amino where the DNA stained with the xylene cyanol dye (figure 1, left) and the image of the corresponding subarray after the staining process are detected SyBr GoId (figure 1, right).
  • Figure 1 shows how morphology, first and second rows (1,2), the uniformity in signal strength and the size of the points (130-150 ⁇ m of the spout solutions A and B) diameter) is comparable to that of the commercial reference spotting buffers (third and fourth rows (3,4).
  • Amino acids were used as they are suitable for working with unmodified nucleic acids. 6 points were printed for each sample of oligonucleotides and 2 replicates or subarrays for each sample.
  • a mixture of the reverse oligonucleotides was printed to the universal primers Ml3 / pUC reverse and M13 (-21) forward (18 bp in length) at a concentration of 12.5 ⁇ M each dissolved in the corresponding buffer. In samples without DNA, only the corresponding buffer was printed.
  • Unreacted amino groups were blocked by immersing the beads in a solution of 1% BSA, preheated to 50 0 C, for 5 min. The suds were washed and air dried.
  • the hybridization solution was prepared by lyophilization of a mixture formed by the complementary oligonucleotides Ml3 / pUC Reverse (1.4 ⁇ mol) and
  • Hybridization Buffer III of Micromax ASAP Labeling Kit 5 min incubated at 50 0 C and the sample was loaded into one of the amino unsub.
  • the slide was kept covered by light and at room temperature overnight.
  • the slide was scanned with the LuxScan-lOK / A Scanner from CapitalBio
  • Buffer A Telose, Betaine, PVP in 50% DMSO
  • Buffer A without oligonucleotides
  • Buffer B Telose, Betaine, 50% DMSO Arabica Gum
  • FIG. 2 shows how in the case of the A and B spill solutions (fourth and sixth rows (4, 6)) a good morphology and an optimum spot size (130-150 ⁇ m in diameter) are obtained, as well as a correct uniformity in the intensity of the hybridization signal, without the undesirable effect of the "donut" ring that is observed with commercial buffer 1 (first row (1) and in DMSO buffer 50% (third row (3) )
  • the second row (2) shows a second commercial buffer.
  • PCR product (around 1200 bp in length) was printed containing the sequences inverse to the universal primers Ml3 / pUC reverse and M13 (-21) forward at a concentration of 35 ng / ⁇ l dissolved in the commercial reference buffers 1 and 2, in 50% of DMSO and in the solutions of dripping A (trehalose, betaine and PVP, in 50% of DMSO) and B (trehalose, betaine and gum arabic, in 50% of DMSO). In samples without DNA, only the corresponding buffer was printed.
  • the robot used for printing was the SpokinArray TM 72 Microarray Printing System by Perkin Elmer.
  • the hybridization solution was prepared by lyophilization of a mixture formed by the complementary oligonucleotides Ml3 / pUC Reverse (1.4 ⁇ mol) and M13 (-21) Forward (1.4 ⁇ mol) fluorescently labeled with Cy5, together with salmon testicle DNA (1.2 ⁇ g). Once the mixture was lyophilized, it was resuspended in 20 ⁇ l of the Perkin Elmer Hybridization hybridization buffer
  • Micromax Buffer III ASAP Labeling Kit 5 min incubated at 50 0 C and the sample was loaded into one of the amino slide. The slide was kept covered by the light and at room temperature overnight.
  • the slide was washed with the wash buffers of Arraylt Wash Buffer 1, 2 and 3, 5 min in each buffer. Finally, it was rinsed with water and dried with air.
  • Figure 633 shows the image at 633 nm of one of the hybridized subarrays.
  • Figure 4 shows how in the case of the A and B spill solutions (fourth and sixth rows (4,6)) a good morphology and an optimum spot size (130-150 ⁇ m in diameter) are obtained, thus as a correct uniformity in signal strength, without the undesirable effect of the "donut" ring that is observed with commercial buffer 1, 2 and with DMSO (first to third rows (1, 2, 3)).
  • Buffer ME trehalose, melezitosa, lysine, glycogen
  • the arrayer used for printing was MicroGridlI arrayer (BioRobotics-Genomic solutions).
  • the images were quantified using the GenePix software and the fluorescence intensities were analyzed using Excel.
  • the points that contain the ME dripping solution are the ones that provide the most reproducible results for the whole of the analyzed antibodies, keeping practically 100% of their activity at room temperature and at 37 ° C when compared with those stored at -80 0 C or 4 ° C
  • I a .- Solution of splashing a substrate on a solid support comprising the mixture of at least one non-reducing carbohydrate, at least one amino acid, at least one organic polymer in aqueous solution, together with at least one organic solvent
  • substrates are to espotear acids nuclei- synthetic or biological origin of eos, proteins, teji- two marked or unmarked

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Abstract

Una solución para espotear e inmovilizar sustancias químicas, incluyendo sustancias biológicas sintéticas o no, sobre un soporte sólido de vidrio, plástico o cerámica, el soporte sólido puede o no estar tratado químicamente en su superficie para derivatizarla con diferentes grupos químicos reactivos, dicha solución de espoteo implica la mezcla de varias sustancias orgánicas en disolventes orgánicos, que ayudan por una parte a la conservación y estabilización de las sustancias espoteadas y, por otra, a la formación de puntos de gran calidad en lo referente a intensidad, uniformidad y reproducibilidad.

Description

SOLUCIÓN DE ESPOTEO DE UN SUSTRATO EN UN SOPORTE SÓLIDO
DESCRIPCIÓN
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una solución para espotear (spotting buffer) sustancias químicas, incluyendo sustancias biológicas sintéticas o no, en distintos soportes sólidos de fijación como vidrio, plástico, celulosa, cerámica o similar que hayan estado o no previamente derivatizados químicamente en su superficie .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La posibilidad de realizar miles de experimentos paralelos de forma simultanea mediante formatos miniatu- rizados que contengan de cientos a millones de sondas inmovilizadas en su superficie, de una forma ordenada, es una herramienta revolucionaria desarrollada durante la pasada década muy ventajosa para la investigación sobre la expresión de genes o la actividad de proteínas. Pero esta nueva tecnología no sólo aporta ventajas en cuanto a la capacidad y rapidez de los experimentos de hibridación, si no también en cuanto a la cantidad de muestra necesaria para realizarlos, siendo significativamente reducida respecto a otras técnicas.
Las ventajas que presenta la técnica de microa- rrays para la investigación se hace constar en la extensa bibliografía existente durante los últimos años en lo que se refiere a ácidos nucleicos (Heller, M. Annual Review of Biomedical Engineering 4:129-153 (2002); Schulze y col. Nature CeIl Biology 3:E19O-E195 (2001) ), proteínas (Angenendt y col. Anal. Chem. 76:1844-1849 (2004); Copeland y col. J. Immunol . Methods 284 : 99-106 (2004)), péptidos (Gao y col. Molecular Diversity 8:177-
187 (2004); Frank, R. Comb. Chem. High Throughput Screen. 5(6) :429-440 (2002)), tejidos (Sauter y col.
Nature Reviews Drud Discovery 2:962-972 (2003) ; Nielsen y col. Am. J. Pathol. 163 ( 4 ) : 1449-1456 (2003)) y otros tipos de moléculas orgánicas.
De entre los diversos soportes sólidos sobre los que inmovilizar moléculas y que permiten esta miniaturi- zación, los rtá s comúnmente utilizados son el vidrio y el poliestireno, aunque el vidrio posee características ópticas más favorables. Las superficies de estos sopor- tes pueden o no estar derivatizadas químicamente para que dispongan de diferentes grupos reactivos que permitan la fijación covalente y permanente de las moléculas. Las más comunes utilizadas son aminosilano, epoxisilano, aldehido y poli-L-lisina.
En el caso de microarrays de ácidos nucleicos, existen dos tipos de plataformas extensamente utilizadas: microarrays de oligonucleótidos de longitud de 25- 70 mers y microarrays de cDNA o de productos de PCR de longitud de entre 70-600 pb .
Más concretamente, los microarrays de oligonucleótidos se pueden preparar siguiendo los métodos estándar de la química de fosforoamiditos para su sínte- sis ín sítu en un soporte de vidrio (Maskos y Southern, Nucleic Acids Res. 20:1679-1684 (1992); Gao y col., Biopolymers 73 (5 ) : 579-596 (2004)) . Este procedimiento junto a la introducción de grupos protectores fotolábi- les en los fosforoamiditos, ha permitido el desarrollo de nuevas estrategias sintéticas basadas en tecnología fotolitográ fica que permiten dirigir y controlar la síntesis en lugares espacialmente específicos de la superficie del cristal en función de la transmisión de luz aplicada US7144700, Nat . Genet . 21:20-24 (1999); Fodor y col., Science 251:767-773 (1991) ) . La síntesis de oligonucleótidos ín sítu presenta el inconveniente de que no se pueden purificar con lo que, dependiendo de la pureza final conseguida, la precisión y calidad de los resultados durante la etapa posterior de hibridación se podrían ver alteradas.
Otra metodología utilizada en microarrays de ácidos nucleicos implica la deposición o espoteo de oligonucleótidos de origen biológico o sintético y de cDNA sobre la superficie del cristal, utilizando tecnologías de impresión de contacto o no contacto con pins robóticos o piezoelectric ink-jet instruments. Esta metodología también se usa para la deposición de otras moléculas químicas y biológicas tales como proteínas, y tejidos. Dependiendo del tipo de superficie, se siguen varias estrategias para fijar las moléculas de forma covalente, ya sea a través de los grupos fosfato de las cadenas de á cidos nucleicos o a través de modificaciones químicas introducidas en el extremo 5' de los oligonu- cleótidos . A diferencia de la metodología anterior, con cada molécula se pueden llegar a imprimir miles de puntos .
Para obtener microarrays de alta densidad con gran calidad y fiabilidad siguiendo esta segunda metodología, se requiere de una solución de espoteo adecuada que mantenga disuelta y estable las muestras de moléculas a espotear, pero que al mismo tiempo confiera a las soluciones resultantes unas propiedades de viscosidad y tensión superficial apropiadas para su correcta deposición sobre la superficie del cristal, ción sobre la superficie del cristal, dando lugar a puntos con una buena intensidad, uniformidad y reprodu- cibilidad .
Asi pues, la composición de la solución de espo- teo ideal seria aquella que permitiera la formación de gotas de espoteo en la etapa de impresión que al secarse produzcan puntos que cumplieran con una serie de requisitos importantes:
- Buena morfología: el punto debe tener una forma circular o redonda.
- Precisión en el tamaño: un diámetro adecuado de punto en arrays de alta densidad es de unas 100-150 μm.
- Buena uniformidad: la señal de intensidad después de la etapa de hibridación deberla ser homogénea en toda la superficie del punto, evitándose variaciones de concentración de la sustancia depositada a lo largo del punto. Es conveniente evitar el conocido efecto de anillo "donut", al acumularse concentraciones mayores de la sustancia depositada en los márgenes del punto que en el interior, o el efecto de agregación de la sustancia depositada en determinados lugares del punto. Una adecuada viscosidad y lenta evaporación de la solución de espoteo minimiza estos efectos. Esta uniformidad se puede evaluar según el coeficiente de variación (CV), que es la relación de la desviación estándar entre la media de todos los pixels que definen el punto. Una correcta distribución de las moléculas a lo largo del punto implica un bajo CV (< 10%) . - Reproducibilidad : poca variación en el tamaño y morfología del punto a lo largo de sucesivas impresiones, asi como poca dispersión en las señales de intensidad de hibridación.
- Baja señal residual: los puntos en los que se deposite únicamente la solución de espoteo, en ausencia de la sustancia a depositar, deberían mostrar una baja o nula señal de intensidad.
Otro punto importante a tener en cuenta es el posible efecto desnaturalizante que pueda tener la solución de espoteo. De hecho, los microarrays de cDNA conllevan una etapa de desnaturalización de las dobles cadenas previa a la etapa de hibridación para obtener DNA de simple cadena, por contacto con agua hirviendo o por tratamiento con NaOH, generalmente. En este sentido, parece ventajoso la posibilidad de que la propia solución de espoteo tenga un efecto desnaturalizante que implique la directa deposición de DNA de cadena simple.
Existe una amplia diversidad de soluciones de espoteo comerciales, como la Micro Spotting Solution de Arraylt, la Pronto!™ Universal Spotting Solution de Corning, el DNA Spotting Buffer de CapitalBio, el Epoxi- de Spotting Buffer de IDT y el Nexterion® Spot LE de Schott Nexterion, entre otros. Como mezclas no comerciales, hay diversos componentes y disolventes comúnmente utilizados en plataformas de microarrays que contribuyen a cumplir algunos de los requisitos anteriores. Podemos destacar el uso de soluciones salinas de citrato sódico (DeRisi y col., Science 278:680-686 (1997); Schena y col., Science 270:467-470 (1995)), betaina (Dielh y col., Nucleic Acids Research 29(7) :e38 (2001); Taylor y col., Nucleic Acids Research 31(16) :e87 (2003) ), nitro- celulosa (Pinkel y col. Nature Genet. 20:207-211 (1998)), formamida (Wrobel y col. Nucleic Acids Research 31(12) :e67 (2003)) y DMSO (Hedge y col., Biotechniques 29:548-550 (2000); Wang y col., Genome Biology 4 ( 1 ) : R5 (2003)), con un pequeño porcentaje en algunos casos de tensoactivos como SDS, Tween o Tritón.
También es muy importante evaluar la capacidad de una solución de espoteo para depositar de forma óptima las sustancias a inmovilizar en varios tipos de superficies de cristal, como la aminosilano, epoxisila- no, aldehido y poli-L-lisina . En algún caso, puede ser necesario variar ligeramente la composición del buffer en función de la superficie a tratar para que sea compa- tibie con la reacción química que tiene que tener lugar para fijar de forma covalente las moléculas.
A pesar de todas las soluciones de soluciones de espoteo existentes, comerciales o no, para conseguir una óptima deposición de las muestras de sustancias químicas y/o biológicas sobre las superficies de microarrays, sigue existiendo la necesidad de desarrollar nuevas fórmulas para su composición que incrementen su estabilidad en el tiempo y que mejoren las características de los puntos formados en cuanto a intensidad, homogeneidad y reproducibilidad . La presente invención proporciona una solución a dicha necesidad.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se trata de una nueva solución de espoteo (spotting buffer) de un sustrato en distintos soportes (sudes) sólidos. La solución de espoteo aquí descrita comprende al menos la mezcla de al menos un carbohidrato no reductor, al menos un aminoácido y al menos un polímero or^nico en solución acuosa junto con al menos un disol- vente orgánico.
La solución de espoteo aquí descrita contiene carbohidratos no reductores que permiten la lenta evaporación del agua contenida en la mezcla para que el punto obtenido sea homogéneo en tamaño e intensidad.
La solución de espoteo contiene polímeros que mantienen la tensión superficial de la gota a la vez que retienen cierta cantidad de agua que permite que el sustrato espoteado (dnas, proteínas, tejidos) mantenga su estructura tridimensional y su análisis sea viable.
Preferentemente, la mezcla de espoteo contiene un disolvente orgánico que se encuentra en un porcentaje entre el 25-75% del total de la mezcla, para que la mezcla tenga la densidad adecuada para poder ser espo- teada por el arrayer correctamente.
Preferentemente los carbohidratos no reductores se toman del grupo formado por: trehalosa, melezitosa, palatinitol y rafinosa.
Preferentemente los aminoácidos se toman del grupo formado por betaína, usina, arginina, triptófano, y derivados de la aminoguanidina .
Preferentemente los polímeros orgánicos se toman del grupo formado por PVP (polivinilpirrolidona) , PEG (polietilenglicol) 8000, PEG 2000, ficoll, glucógeno, almidón y goma arábica. Preferentemente el disolvente orgánico se toma del grupo formado por formamida, nitrocelulosa, DMSO (dimetilsulfóxido) , formaldehido, y glicerol.
Preferentemente los sustratos a espotear son ácidos nucleicos sintéticos o de origen biológico, proteínas, tejidos marcados o no marcados.
El soporte sólido utilizado es preferentemente cristal, plástico, cerámica y derivados. Dicho soporte sólido puede estar tratado químicamente o no.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Se complementa la presente memoria descriptiva, con un juego de planos, ilustrativos del ejemplo preferente y nunca limitativos de la invención.
La figura 1 muestra en su lado derecho una ima- gen escaneada a 532 nm, teñida con SyBr GoId, a la izquierda una imagen escaneada a 633nm; detección con colorante xileno cianol.
La figura 2 muestra una imagen escaneada de los subarrays hibridados correspondientes al ejemplo 2 (impresión de oligonucleótidos )
La Figura 3 muestra una gráfica de la intensidad de hibridación de las muestras espoteadas con las dife- rentes soluciones de espoteo del ejemplo 2.
La Figura 4 muestra la imagen a 633 nm de uno de los subarrays hibridados correspondiente al ejemplo 3 (impresión de productos de PCR) . La Figura 5 muestra una gráfica de la intensidad de hibridación de las muestras espoteadas con las diferentes soluciones de espoteo del ejemplo 3.
La Figura 6a y 6b muestra la intensidad de cada anticuerpo frente a la solución de espoteo tras ser almacenados a diferentes temperaturas durante 3 meses.
La Figura 7a y 7b muestra la intensidad de cada anticuerpo frente a la solución de espoteo tras ser almacenados a diferentes temperaturas durante 6 meses.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
EJEMPLO 1
Comparativa de varias soluciones de espoteo por simple tinción/coloración de DNA impreso en amino sudes .
Se imprimió DNA de testículo de salmón (102 ng/μl) con 0.02 mM de colorante xileno cianol disuelto en dos tipos de buffer comerciales como referencia y objeto de comparación (filas tercera (3) y cuarta (4) en la Figura 1), en la solución de espoteo A (fila primera (1) en la Figura 1), (trealosa, betaina y PVP en un 50% de DMSO) y en la solución de espoteo B (fila segunda (2) en la Figura 1), (trealosa, betaina y goma arábica en un 50% de DMSO) . El robot utilizado para la impresión fue el SpotArray™ 72 Microarray Printing System de Perkin Elmer.
Se imprimieron sudes con funcionalización amino con 8 puntos por cada muestra de DNA y 4 réplicas o subarrays . Después de la impresión, se dejaron secar las gotas toda la noche a temperatura ambiente y las sudes se escanearon a 633 nm para detectar el colorante, con el escáner LuxScan-lOK/A de CapitalBio. Después se inmovilizó el DNA en el cristal por cross-linking, mediante irradiación UV con una energía total de 400 mJ, y se calentaron 2 h a 80 0C.
Se bloquearon los grupos amino sin reaccionar mediante la inmersión de las sudes en una solución de BSA al 1%, precalentada a 50 0C, durante 5 min .
Seguidamente, las sudes se lavaron y sumergieron agua hirviendo durante 5 min para abrir las cadenas de DNA y se fijaron con etanol al 95%. Después se secaron al aire. Finalmente, se tiñó el DNA por inmersión de las sudes en una solución de SyBr GoId al 1000Ox.
A modo de ejemplo, se muestra en la figura 1 la imagen escaneada de un subarray de una slide amino donde se detecta el DNA teñido con el colorante xileno cianol (figura 1, izquierda) y la imagen del correspondiente subarray después del proceso de tinción con SyBr GoId (figura 1, derecha) . En la figura 1 se observa como en el caso de las soluciones de espoteo A y B la morfología, filas primera y segunda (1,2) la uniformidad en la intensidad de la señal y el tamaño de los puntos (130- 150 μm de diámetro) es equiparable a la de los spotting buffer comerciales de referencia (filas tercera y cuarta (3,4) . Por otra parte, si nos fijamos en la imagen de la izquierda de la figura 1 se puede observar como la intensidad de la señal en los buffer A y B de la fila primera y segunda (1 y 2) (color blanco, saturación de señal) es mayor que en el buffer comercial de la fila tercera y cuarta (3 y 4) (sin saturación de señal), lo cual indica una mayor cantidad de muestra teñida con el colorante y, por lo tanto, indica mayor cantidad de DNA depositado y fijado en el cristal.
EJEMPLO 2
Comparativa de varias soluciones de espoteo después de una etapa de hibridación en amino sudes con oligonucleótidos impresos. Análisis de la dispersión en la intensidad de los puntos.
Se utilizaron sudes amino por ser los rtá s adecuados para trabajar con ácidos nucleicos no modificados. Se imprimieron 6 puntos por cada muestra de oligonu- cleótidos y 2 réplicas o subarrays por cada muestra.
Se imprimieron una mezcla de los oligonucleótidos inversos a los primers universales Ml3/pUC reverse y M13(-21) forward (de una longitud de 18 pb) a una con- centración de 12.5 μM cada uno de ellos disueltos en el buffer correspondiente. En las muestras sin DNA, sólo se imprimió el correspondiente buffer.
Se utilizaron dos buffers comerciales como refe- rencia y objeto de comparación.
Después de la impresión se dejaron secar las gotas en las sudes a temperatura ambiente toda la noche.
Posteriormente se hizo un cross-linking a 400 mJ y se calentaron las sudes en una estufa a 80 0C durante 2 h.
Se bloquearon los grupos amino sin reaccionar mediante la inmersión de las sudes en una solución de BSA al 1%, precalentada a 50 0C, durante 5 min. Se lavaron las sudes y se secaron con aire.
Se preparó la solución de hibridación mediante la liofilización de una mezcla formada por los oligonu- cleótidos complementarios Ml3/pUC Reverse (1.4 μmol) y
M13(-21) Forward (1.4 μmol) marcados fluorescentemente con Cy5, junto con DNA de testículo de salmón (1.2 μg) .
Una vez liofilizada la mezcla, se resuspendió en 20 μl del buffer de hibridación de Perkin Elmer
TM
Hybridization Buffer III de Micromax ASAP Labeling Kit . Se incubó 5 min a 50 0C y se cargó la muestra en una de las sudes amino.
Se mantuvo la slide tapada de la luz y a temperatura ambiente durante toda la noche.
Después de un mínimo de 12 h de incubación, se lavó la slide con los buffer de lavado de Arraylt Wash
Buffer 1, 2 y 3, 5 min en cada buffer. Se lavaron con agua y se secaron con aire.
La slide se escaneó con el Escáner LuxScan-lOK/A de CapitalBio
1) Buffer comercial 1
2) Buffer comercial 2
3) DMSO(50%)
4) Buffer A (Trealosa, Betaina, PVP en 50% DMSO) 5) Buffer A (sin oligonucleótidos )
6) Buffer B (Trealosa, Betaina, Goma Arábica en 50% DMSO)
7) Buffer B (sin oligonucleótidos) En la Figura 2 se muestra como en el caso de las soluciones de espoteo A y B (filas cuarta y sexta (4, 6)) se obtiene una buena morfología y un óptimo tamaño de punto (130-150 μm de diámetro), asi como una correcta uniformidad en la intensidad de la señal de hibridación, sin el indeseable efecto del anillo "donut" que si se observa con el buffer comercial 1 (fila primera (1) y en el buffer DMSO 50% (fila tercera (3)) . La fila segunda (2) muestra un segundo buffer comercial.
Por otra parte, estas dos soluciones de espoteo muestran una gran reproducibilidad y poca dispersión en la intensidad de señal de hibridación a lo largo de sucesivas impresiones. Esta reproducibilidad se puede comprobar en la Figura 3, donde se han representado la intensidad de hibridación de los puntos correspondientes a las muestras espoteadas con las diferentes soluciones de espoteo de la Figura 2 obtenidos en los dos subarrays impresos .
Cabe resaltar una mayor intensidad de señal cuando se han utilizado las soluciones de espoteo A y B (Filas 4 y 6) con respecto a los bufferes comerciales y al DMSO (Filas 1, 2 y 3) . Lo cual indica una mayor cantidad de muestra depositada y fijada en la slide. Por otra parte es importante resaltar la nula señal residual de los spotting buffer A y B (Filas 5 y 7) en ausencia de oligonucleótidos .
EJEMPLO 3
Comparativa de varias soluciones de espoteo después de una etapa de hibridación en amino sudes con productos de PCR impresos. Análisis de la dispersión en la intensidad de los puntos. Se imprimió producto de PCR (de una longitud alrededor de 1200 pb) que contenia las secuencias inversas a los primers universales Ml3/pUC reverse y M13(-21) forward a una concentración de 35 ng/μl disuelto en los buffer comerciales de referencia 1 y 2, en 50% de DMSO y en las soluciones de espoteo A (trealosa, betaina y PVP, en 50% de DMSO) y B (trealosa, betaina y goma arábica, en 50% de DMSO) . En las muestras sin DNA sólo se imprimió el correspondiente buffer.
El robot utilizado para la impresión fue el Spo- tArray™ 72 Microarray Printing System de Perkin Elmer.
Se imprimieron únicamente sudes con funcionali- zación amino, las más adecuadas para trabajar con ácidos nucleicos no modificados . Se imprimieron 6 puntos por cada muestra de producto de PCR y 2 réplicas o subarrays por cada muestra.
Después de la impresión, se dejaron secar las gotas toda la noche a temperatura ambiente. Se inmovilizaron los ácidos nucleicos al cristal por cross-linking, mediante irradiación UV con una energia total de 400 mJ, y se calentaron las sudes a 80 0C durante 2 h.
Se bloquearon los grupos amino del cristal sin reaccionar mediante la inmersión de las sudes en una solución de BSA al 1%, precalentada a 50 0C, durante 5 min. Se lavaron las sudes y se sumergieron en agua hirviendo durante 5 min para abrir las cadenas de DNA, que se fijaron posteriormente al sumergir las sudes en etanol al 95% durante 2 min. Después de secaron con aire . La solución de hibridación se preparó mediante la liofilización de una mezcla formada por los oligonu- cleótidos complementarios Ml3/pUC Reverse (1.4 μmol) y M13(-21) Forward (1.4 μmol) marcados fluorescentemente con Cy5, junto con DNA de testículo de salmón (1.2 μg) . Una vez liofilizada la mezcla, se resuspendió en 20 μl del buffer de hibridación de Perkin Elmer Hybridization
TM
Buffer III de Micromax ASAP Labeling Kit . Se incubó 5 min a 50 0C y se cargó la muestra en una de las slide amino. Se mantuvo la slide tapada de la luz y a temperatura ambiente durante toda la noche.
Después de un mínimo de 12 h de incubación, se lavó la slide con los buffer de lavado de Arraylt Wash Buffer 1, 2 y 3, 5 min en cada buffer. Finalmente, se aclaró con agua y se secó con aire.
La slide se escaneó con el escáner LuxScan-lOK/A de CapitalBio. A modo de ejemplo, en la Figura 3 se muestra la imagen a 633 nm de uno de los subarrays hibridados .
En la figura 4 se observa como en el caso de las soluciones de espoteo A y B (filas cuarta y sexta (4,6)) se obtiene una buena morfología y un óptimo tamaño de punto (130-150 μm de diámetro), asi como una correcta uniformidad en la intensidad de señal, sin el indeseable efecto del anillo "donut" que si se observa con el buffer comercial 1, 2 y con DMSO (filas primera a tercera (1, 2, 3) ) .
Por otra parte, estos dos soluciones de espoteo A y B muestran una gran reproducibilidad y poca dispersión en la intensidad de señal de hibridación a lo largo de sucesivas impresiones. Esta reproducibilidad se puede comprobar en la Figura 5, donde se han representado la intensidad de hibridación de los puntos correspondientes a las muestras espoteadas con las diferentes soluciones de espoteo de la Figura 4 obtenidos en los dos subarrays impresos .
Cabe resaltar que si bien en la solución de espoteo B se observa una ligera señal residual en ausencia de producto de PCR (en la figura 4 fila séptima (7)), en la solución de espoteo A esta señal residual es nula (en la figura 4 fila quinta (5) ) .
EJEMPLO 4
Comparación del efecto de varias soluciones de espoteo en la estabilidad de arrays de proteínas impresas sobre sudes epoxi
Se espotearon varios anticuerpos policlonales, concretamente proteina A purificada de la fracción IgG de anticuerpos policlonales de conejo. Estos anticuerpos se diluyeron en diferentes soluciones de espoteo y a continuación se espotearon en sudes epoxi (TeleChem Int.) a una concentración final de proteina de lmg/ml . Las diferentes soluciones de espoteo se detallan a continuación:
A) 40% Glicerol
B) Buffer ME (trealosa, melezitosa, lisina, glucógeno) , en DMSO
C) 0.04% Polietilenglicol (PEG200) D) 0.08% PEG 200
E) 0.04% PEG 6000
F) 0.08% PEG 6000
G) 0.04% PEG 600 H) 0.08% PEG 600 I) Buffer ME + buffer comercial de espoteo de proteínas (CBl) (proporción 1:1)
J) Buffer comercial de espoteo de proteínas (CBl) K) Buffer comercial de espoteo de proteínas (CB2) L) 0.04% Trealosa M) 0.08% Trealosa
En las gráficas de las figuras 6a y b y 7a y b, se representan en el eje de las abscisas las letras A a M indicando el buffer que se utiliza en cada caso.
El arrayer usado para la impresión (espoteo) fue MicroGridlI arrayer (BioRobotics-Genomic solu- tions ) .
Una vez impresas las sudes se guardaron a:
1. -Temperatura ambiente, previa liofiliza ción con nitrógeno líquido.
2. —800C
3.+4°C 4.-Temperatura ambiente (25°C)
5.-37°C
Las distintas condiciones 1 a 5 se representan en las figura 6a y 6b y 7a y 7b con diferentes rayados numerados del 1 a 5 que se corresponden a la lista superior .
Después de 3 y 6 meses de almacenamiento en las distintas condiciones (ver arriba) , las sudes fueron procesadas mediante un inmunoensayo tipo "sandwich", para el que se usaron los correspondientes antígenos (en la figura 6a y 7a la gráfica superior Anti 139 en la del centro anti 185 y en la inferior AntiGroEl, en la figura 7a y 7b en la gráfica superior antistv y en la gráfica inferior antithioredoxin) y una mezcla de anticuerpos marcados fluorescentemente con Alexa647.
Para llevar a cabo este inmunoensayo, todas las sudes fueron bloqueadas con 2% BSA, a continuación incubadas con la mezcla de antigenos (5 ng/ml Tioredoxi- na; 10 ng/ml GroEL; 5 ng/ml estreptoavidina; lisado bacteriano 139, y lisado bacteriano 185) durante 1 hora a temperatura ambiente, después lavadas y reveladas con una dilución 1/500 de una mezcla de anticuerpos marcados fluorescentemente durante 2 horas a 4°C.
Finalmente se lavaron de nuevo, se secaron y se escanearon en un escáner GMS 417.
Las imágenes fueron cuantificadas mediante el software GenePix y las intensidades de la fluorescencia fueron analizadas mediante Excel.
El efecto de las diferentes soluciones de espo- teo en la estabilidad de los anticuerpos impresos se muestra en las figuras 6 y 7.
De este experimento se concluye que, los puntos que contienen la solución de espoteo ME son los que proporcionan los resultados mas reproducibles para el conjunto de los anticuerpos analizados, manteniendo prácticamente el 100% de su actividad a temperatura ambiente y a 37°C cuando se comparan con los almacenados a -800C o 4°C
No alteran la esencialidad de esta invención variaciones en materiales, forma, tamaño y disposición de los elementos componentes, descritos de manera no limi- tativa, bastando ésta para proceder a su reproducción por un experto.
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35 REIVINDICACIONES
Ia.- Solución de espoteo de un sustrato en un soporte sólido que comprende la mezcla de al menos un carbohidrato no reductor, al menos un aminoácido, al menos un polímero orgánico en solución acuosa, junto con al menos un disolvente orgánico
2a.- Solución según reivindicación Ia caracterizado porque el disolvente orgánico se encuentra en un porcentaje entre el 25-75% del total de la mezcla.
3a.- Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque los carbohidratos no reductores se toman del grupo formado por trehalosa, melezitosa, palatinitol y rafinosa
4a.- Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque los aminoácidos se toman del grupo betaina, lisina, arginina, triptófano y derivados de aminoguani- dena
5a.- Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque el polímero orgánico se toman del grupo formado por PVP, PEG 8000, PEG 20000, Ficoll, Glucógeno, Almidón y goma arábica
6a. -Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque el disolvente orgánico se toman del grupo formamida, nitrocelulosa, DMSO, formaldehido y glicerol
7a.- Solución según reivindicación Ia caracterizada porque los sustratos a espotear son á cidos nuclei- eos sintéticos o de origen biológicos, proteínas, teji- dos marcados o no marcados
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Claims

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REIVINDICACIONES
Ia.- Solución de espoteo de un sustrato en un soporte sólido que comprende la mezcla de al menos un carbohidrato no reductor, al menos un aminoácido, al menos un polímero orgánico en solución acuosa, junto con al menos un disolvente orgánico
2a.- Solución según reivindicación Ia caracterizado porque el disolvente orgánico se encuentra en un porcentaje entre el 25-75% del total de la mezcla.
3a.- Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque los carbohidratos no reductores se toman del grupo formado por trehalosa, melezitosa, palatinitol y rafinosa
4a.- Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque los aminoácidos se toman del grupo betaina, lisina, arginina, triptófano y derivados de aminoguani- dena
5a.- Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque el polímero orgánico se toman del grupo formado por PVP, PEG 8000, PEG 20000, Ficoll, Glucógeno, Almidón y goma arábica
6a. -Solución según reivindicación Ia caracteri- zada porque el disolvente orgánico se toman del grupo formamida, nitrocelulosa, DMSO, formaldehido y glicerol
7a.- Solución según reivindicación Ia caracterizada porque los sustratos a espotear son á cidos nuclei- eos sintéticos o de origen biológicos, proteínas, teji- - 21 dos marcados o no marcados
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