ES2206848T3

ES2206848T3 - Metodo de chorros de burbujas para depositar sondas sobre soportes solidos y metodo para la fabricacion de dispositivos de sondas.

Info

Publication number: ES2206848T3
Application number: ES98306107T
Authority: ES
Inventors: Tadashi Okamoto; Nobuko Yamamoto; Tomohiro Suzuki
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2004-05-16
Anticipated expiration: 2018-07-31
Also published as: JPH11187900A; DK0895082T3; JP4313861B2; EP0895082A3; EP1352976B1; US20030059817A1; US20020146715A1; ATE250764T1; EP0895082B1; US20060177868A1; EP1352976A3; DE69818371T2; DE69818371D1; EP0895082A2; US7994297B2; US6476215B1; CA2244403A1; EP1352976A2; CA2244403C

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA LA COLOCACION DE SONDAS DE MANERA COMPACTA Y EFICAZ SOBRE LA SUPERFICIE DE UN SOPORTE SOLIDO. SE UNE UN LIQUIDO QUE CONTIENE UNA SONDA A UN SOPORTE SOLIDO A MODO DE GOTITAS PARA FORMAR MANCHAS QUE CONTIENEN LA SONDA SOBRE EL SOPORTE SOLIDO MEDIANTE UN METODO DE CHORRO DE TINTA.

Description

Método de chorro de burbujas para depositar sondas sobre soportes sólidos y método para la fabricación de dispositivos de sondas.

Antecedentes de la invención Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a un método de punteado de una sonda en un soporte sólido, a una matriz posicional de sondas y a un método de fabricación de la mismas, y a un método de detección de un ácido nucleico monocatenario (ss) objetivo y a un método de identificación de una secuencia de bases de un ácido nucleico ss objetivo utilizando la matriz posicional de sondas.

Técnica anterior relacionada

Como método para determinar una secuencia de bases de un ácido nucleico, detectar un ácido nucleico objetivo en una muestra, e identificar varias bacterias de forma rápida y precisa, se ha propuesto el uso de una matriz posicional de sondas en la que una o más sustancias que se pueden unir específicamente a un ácido nucleico objetivo, las denominadas sondas, se disponen en un soporte sólido en un gran número de posiciones. Como método general de fabricación de dichas matrices posicionales de sondas, tal como se describe en la patente EP nº. 0373203B1, (1) la sonda de ácido nucleico se sintetiza en un soporte sólido o (2) una sonda sintetizada previamente se suministra sobre un soporte sólido. La patente USP nº. 5405783 da a conocer el método (1) detalladamente. En relación con el método (2), la patente USP nº. 5601980 y la publicación Science Vol. 270, p. 467 (1995) muestran un método de disposición de ADNc en una matriz posicional utilizando una micropipeta.

En el método mencionado (1), no es necesario sintetizar una sonda de ácido nucleico de antemano, ya que la sonda de ácido nucleico se sintetiza directamente sobre un soporte sólido. No obstante, es difícil purificar un ácido nucleico sonda sintetizado en un soporte sólido. La precisión en la determinación de la secuencia de base de un ácido nucleico y en la detección de un ácido nucleico objetivo en una muestra utilizando una matriz posicional de sondas depende en gran medida de la exactitud de la secuencia base de la sonda de ácido nucleico. Por esta razón, para el método (1) se requiere una mejora adicional en la precisión de una sonda de ácido nucleico para fabricar una matriz posicional de sondas de mayor calidad. En el método (2), se requiere una etapa de síntesis de una sonda de ácido nucleico antes de la fijación de la sonda de ácido nucleico en un soporte sólido, aunque la sonda de ácido nucleico se puede purificar antes de unir la sonda a un soporte sólido. Por esta razón, actualmente, se considera que el método (2) es más preferible que el método (1) como método de fabricación de una matriz posicional de sondas de alta calidad. No obstante, el método (2) presenta un problema en el método de punteado de una sonda de ácido nucleico densamente en un soporte sólido. Por ejemplo, cuando se utiliza una matriz posicional de sondas para determinar la secuencia de bases de un ácido nucleico, es preferible disponer tantos tipos de sondas de ácido nucleico como sea posible sobre un soporte sólido. Cuando se deben detectar eficazmente mutaciones en un gen, es preferible disponer sondas de ácido nucleico de secuencias correspondientes a las respectivas mutaciones en un soporte sólido. Además, cuando se detectan un ácido nucleico objetivo en una muestra o mutaciones y deleciones de genes, es deseable que la cantidad de muestra tomada de un sujeto, específicamente una muestra de sangre, sea lo más pequeña posible. De este modo, es preferible que se obtenga tanta información como sea posible en la secuencia de bases utilizando una cantidad de muestra pequeña. Considerando estas indicaciones, es preferible que, por ejemplo, en una matriz posicional de sondas de dispongan 10.000 o más puntos de sonda de ácido nucleico por pulgada cuadrada (1550 por cm cuadrado).

La publicación Patent Abstracts of Japan, volumen 097, número 006, 30 de junio de 1997, da a conocer un método para situar un antígeno o anticuerpo en fase sólida sin desactivarlo utilizando una impresora del tipo de chorros de tinta que tiene un elemento piezoeléctrico en su mecanismo de impresión

La publicación de O'Donnell-Maloney y Little titulada "Microfabrication and array technologies for DNA sequencing and diagnostics", Genetic Analysis: Biomolecular Engineering, 13 (1996), pág. 151 a 157 es otra patente que da a conocer el uso de tecnología piezoeléctrica de chorros de tinta para puntear gotas pequeñas de sonda sobre un sustrato.

La base de datos WPI, sección Ch, semana 9304, Derwent Publications Ltd, Londres, GB; Class E17, AN 93-031735 XP002105850 da a conocer una composición de tinta basada en agua que es útil para la impresión por chorros de tinta.

La publicación Patent Abstracts of Japan, volumen 018, número 306 (P-1752), 10 de junio de 1994, da a conocer un método de medición de antígenos de alta sensibilidad que refina de forma precisa la seroalbúmina bovina (BSA) utilizada como agente de bloqueo.

La publicación de Chrisey y otros, titulada "Fabrication of patterned DNA surfaces", Nucleic Acids Research (1996), volumen 24, número 15, pág. 3040 a 3047, da a conocer el uso de métodos fotolitográficos para formar patrones de una única especie o de múltiples especies de ADN en un soporte sólido.

Características de la invención

Como consecuencia de la investigación llevada a cabo por los inventores para resolver los problemas mencionados anteriormente, se ha descubierto que un método de inyección de chorros de tinta que utiliza la técnica de chorros de burbujas posibilita el punteado de una sonda con una densidad notablemente alta, consiguiendo la presente invención.

Es un objetivo de la presente invención dar a conocer un método para fabricar eficazmente una matriz posicional de sondas, en el que un número elevado de sondas se unen a un soporte sólido, sin dañar las sondas.

Según la presente invención, se da a conocer un método de fabricación de una matriz posicional de sondas que tiene una pluralidad de puntos dispuestos independientemente en una pluralidad de posiciones sobre una superficie de un soporte sólido, conteniendo los puntos una sonda que se puede unir específicamente a una sustancia objetivo que comprende una etapa de suministro de un líquido que contiene la sonda y la fijación del líquido a una posición predeterminada sobre la superficie del soporte sólido por medio de un método de chorros de tinta para formar los puntos;

caracterizado porque el método de chorros de tinta es un método de chorros de burbujas.

La patente USP nº. 5601980 menciona que es inadecuado utilizar un método convencional de chorros de tinta en el punteado de una sonda de ácido nucleico. En las líneas 31 a 52 en la segunda columna de la patente USP nº. 5601980, se dice que el uso de la técnica de la impresora de chorros de tinta en la que se inyecta una cantidad pequeña de tinta mediante ondas de presión es inadecuado, ya que la onda de presión para inyectar tinta puede conducir a un aumento drástico de la temperatura de la tinta y dañar la sonda de ácido nucleico, y la dispersión de la tinta al producirse la inyección puede conducir a la contaminación de puntos de sonda adyacentes. Teniendo en cuenta esto, la patente USP nº. 5601980 da a conocer un método de fabricación de una matriz posicional de sondas en la que una gota de un líquido que contiene una sonda de ácido nucleico se forma en una punta de una micropipeta utilizando una presión de gas, mientras se monitoriza el tamaño de la gota, la aplicación de la presión finaliza cuando la gota alcanza el tamaño predeterminado, y la gota se aplica en un soporte sólido.

La patente USP nº. 5474796 da a conocer la fabricación de una matriz posicional de oligonucleótidos mediante la formación de una matriz de partes hidrófobas e hidrófilas sobre una superficie de un soporte sólido y la inyección de cuatro nucleótidos secuencialmente hacia la parte hidrófila por medio de un aparato de bomba de chorros por impulso piezoeléctrico y un método de determinación de la secuencia de bases de un ácido nucleico objetivo utilizando la matriz posicional de oligonucleótidos. No obstante, estas técnicas anteriores no dan a conocer un método en el que se inyecta de antemano cada una de las sondas de ácido nucleico que tienen una secuencia de bases de una longitud predeterminada utilizando una técnica de chorros de tinta para disponer las sondas de ácido nucleico de forma precisa y densa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista esquemática que ilustra un método de fabricación de una matriz posicional de sondas que utiliza un cabezal de chorros de burbujas;

la figura 2 es una vista en sección transversal tomada según la línea 2-2 del cabezal de chorros de burbujas de la figura 1;

la figura 3 muestra un gráfico que compara una cantidad teórica y una recuperación real de una sonda de ácido nucleico punteada en una placa de aluminio mediante el método de chorros de burbujas en el Ejemplo 3;

la figura 4 muestra un gráfico que compara una cantidad teórica y una recuperación real de una sonda de ácido nucleico punteada en una placa de aluminio mediante el método de chorros de burbujas en el Ejemplo 4;

la figura 5A es una vista esquemática en planta de una realización de una matriz posicional de sondas de la presente invención, y la figura 5B es una vista en sección transversal tomada según la línea 5B-5B de la figura 5A; y

la figura 6 está destinada a explicar un método de punteado en el Ejemplo 8.

Descripción detallada de las realizaciones preferentes Características generales del método de fabricación de la matriz posicional de sondas

Las Figs. 1 y 2 son diagramas esquemáticos que muestran un método de fabricación de una matriz posicional de sondas, por ejemplo, una matriz posicional de sondas de ácido nucleico, según una realización de la presente invención. En la figura 1, se muestran un sistema (boquilla) (101) de suministro de líquido que retiene de forma inyectable un líquido que contiene una sonda, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico, como líquido de inyección, un soporte sólido (103) (por ejemplo, una placa de vidrio transparente, etcétera) con el que se va a unir la sonda de ácido nucleico, y un cabezal (105) de chorros de burbujas, una clase de cabezales de chorros de tinta, dotados de un mecanismo para aplicar energía térmica al líquido y de este modo inyectar el líquido. La referencia (104) indica un líquido que contiene una sonda de ácido nucleico expulsada desde el cabezal (105) de chorros de burbujas. La figura 2 es una vista en sección transversal tomada sustancialmente según la línea 2-2 del cabezal (105) de chorros de burbujas de la figura 1. En la figura 2, se muestran el cabezal (105) de chorros de burbujas, un líquido (107) que contiene una sonda de ácido nucleico a inyectar, y una parte (117) de sustrato con un elemento de calentamiento que aplica energía de inyección al líquido. La parte (117) de sustrato comprende una película protectora (109) realizada con óxido de silicio, etcétera, electrodos (111-1) y (111-2) realizados con aluminio, etcétera, una capa (113) de resistencia exotérmica realizada con nicrom, etcétera, una capa acumuladora (115) de calor, y un material (116) de base realizado con alúmina, etcétera, con buenas propiedades de radiación térmica. Un líquido (107) que contiene una sonda de ácido nucleico sube a un orificio (119) de inyección (salida de inyección) y forma un menisco (121) según la presión predeterminada. Cuando se suministran señales eléctricas desde los electrodos (111-1) y (111-2), una zona mostrada con la referencia (123) (zona de burbujeo) genera rápidamente calor y en el líquido (107) en contacto con la zona (123) aparece una burbuja. El menisco experimenta la inyección bajo la acción de la presión y el líquido (107) es inyectado desde el orificio (119) para proyectarse en dirección a la superficie de un soporte sólido (103). Aunque la cantidad inyectable del líquido utilizando un cabezal de chorros de burbujas de una estructura de este tipo depende del tamaño de la boquilla, etcétera, puede ser controlada de manera que sea aproximadamente entre 4 y 50 picolitros y es muy útil como medios para disponer sondas de ácido nucleico con una densidad elevada.

Relación entre líquido inyectado y soporte sólido Diámetro de los puntos sobre el soporte sólido

Para obtener la densidad de sondas según se ha descrito anteriormente (por ejemplo, 10.000 puntos de sonda por pulgada cuadrada, siendo el límite superior aproximadamente 1 x 10^{6}) sobre un soporte sólido, es preferible que el diámetro de cada punto sea aproximadamente entre 20 y 100 \mum, por ejemplo, y que los puntos sean independientes entre sí. Estos puntos están determinados por propiedades de un líquido inyectado desde un cabezal de chorros de burbujas y propiedades de superficie del soporte sólido al que se fija el líquido.

Propiedades del líquido de inyección

Como líquido de inyección se puede utilizar cualquier líquido, siempre que el líquido se pueda inyectar desde un cabezal de chorros de burbujas, el líquido inyectado desde el cabezal llega a las posiciones deseadas en un soporte sólido, y el líquido no dañe la sonda de ácido nucleico cuando se mezcla con dicha sonda de ácido nucleico y es inyectado.

Desde el punto de vista de las propiedades del líquido a inyectar desde un cabezal de chorros de burbujas, preferiblemente el líquido tiene propiedades tales como viscosidad de entre 1 y 15 cps y tensión superficial de 30 dinas/cm o mayor. Cuando la viscosidad está entre 1 y 5 cps y la tensión superficial está entre 30 y 50 dinas/cm, la posición de llegada sobre un soporte sólido resulta significativamente precisa y es especialmente adecuada.

A continuación, considerando las propiedades de inyección por chorros de tinta del líquido y la estabilidad de una sonda de ácido nucleico en el líquido y, con la inyección por un chorro de burbujas, es preferible contener una sonda de ácido nucleico de 2-5.000 meros, especialmente 2-60 meros en una concentración de 0,05-500 \muM, especialmente 2-50 \muM.

Composición del líquido

La composición de un líquido a inyectar desde un cabezal de chorros de burbujas no está limitada de forma específica, siempre que no influya sustancialmente en una sonda de ácido nucleico cuando se mezcla con una sonda de ácido nucleico o cuando se inyecta desde el cabezal de chorros de burbujas tal como se ha descrito anteriormente, y una composición líquida inyectable de forma normal hacia un soporte sólido utilizando el cabezal de chorros de burbujas cumple las condiciones preferibles. No obstante, un líquido preferible contiene glicerina, urea, tiodiglicol o etilenglicol, alcohol isopropílico, y un alcohol de acetileno según se muestra con la siguiente fórmula (I):

1

en la que R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4} representan grupos alquilo, específicamente grupos alquilo rectos o ramificados que contienen entre 1 y 4 carbonos, m y n representan números enteros, y m=0 y n=0 ó 1\leqm+n\leq30, y cuando m+n=1, m o n es cero.

Más específicamente, se utiliza preferentemente un líquido que comprende entre un 5 y un 10% en peso de urea, entre un 5 y un 10% en peso de glicerina, entre un 5 y un 10% en peso de tiodiglicol, y entre un 0,02 y un 5% en peso, más preferentemente entre un 0,5 y un 1% en peso de un alcohol de acetileno según se muestra con la fórmula anterior (I).

Cuando se utiliza este líquido, los puntos obtenidos al inyectar el líquido que contiene una sonda de ácido nucleico desde un cabezal de chorros de burbujas y fijados en un soporte sólido son redondos, y el área en la que se fija el líquido inyectado es limitada. De este modo, incluso cuando se puntea densamente una sonda de ácido nucleico, se puede evitar eficazmente la conexión de los puntos adyacentes. No se observa ninguna degradación de la sonda de ácido nucleico punteada en un soporte sólido. No obstante, las propiedades del líquido utilizado en la fabricación de una matriz posicional de sondas de ácido nucleico según la presente invención no se limitan a las mencionadas anteriormente. Por ejemplo, cuando en la superficie de un soporte sólido se disponen estructuras a modo de cavidades para evitar la extensión del líquido aplicado en el soporte sólido por parte de un cabezal de chorros de burbujas y la mezcla con puntos adyacentes, se pueden utilizar un líquido de una viscosidad y una tensión superficial fuera de los márgenes anteriores, y una sonda de ácido nucleico de una longitud de bases y una concentración fuera de los márgenes anteriores.

Tipos de grupos funcionales del soporte sólido y los ácidos nucleicos

Como método para unir de forma segura la sonda de ácido nucleico al soporte sólido, así como para retener eficazmente el punto aplicado de una sonda de ácido nucleico en una posición más definida sobre el soporte sólido para evitar la contaminación cruzada entre puntos adyacentes, a la sonda y al soporte sólido se les puede dotar de grupos funcionales que puedan reaccionar entre sí.

Grupo SH y grupo maleimido

Como ejemplo preferible se puede mencionar el uso combinado del grupo maleimido y el grupo tiol (-SH). Es decir, uniendo un grupo tiol (-SH) al terminal de una sonda de ácido nucleico y tratando la superficie del soporte sólido de manera que presente un grupo maleimido, el grupo tiol en una sonda de ácido nucleico, cuando se suministra a la superficie del soporte sólido, reacciona con el grupo maleimido del soporte sólido para inmovilizar la sonda de ácido nucleico sobre el soporte, formando puntos de sonda en las posiciones predeterminadas sobre el soporte sólido. Especialmente, cuando una sonda de ácido nucleico que contiene un grupo tiol en el terminal se disuelve en un líquido de la composición mencionada anteriormente, y se aplica sobre una superficie de un soporte sólido que tiene grupos maleimido por medio de un cabezal de chorros de burbujas, la solución de la sonda de ácido nucleico puede formar un punto muy pequeño sobre el soporte sólido. Como consecuencia, en las posiciones predeterminadas de la superficie del soporte sólido se pueden formar puntos pequeños de una sonda de ácido nucleico. En este caso, no es necesario proporcionar una construcción tal como cavidades compuestas por una matriz posicional parcialmente hidrófila e hidrófoba sobre la superficie del soporte sólido para evitar la conexión entre puntos.

Por ejemplo, cuando desde una boquilla se expulsó (una cantidad de inyección de aproximadamente 24 picolitros) un líquido que contenía una sonda de ácido nucleico de nucleótidos de 18 meros con una concentración de 8 \muM y controlado para presentar la viscosidad y la tensión superficial dentro de los márgenes anteriores, utilizando una impresora de chorros de burbujas (Nombre del producto: BJC62O; Canon Inc., modificada para imprimir sobre una plano liso) con un espacio entre el soporte sólido y la punta de la boquilla del cabezal de chorros de burbujas fijada aproximadamente entre 1,2 y 1,5 mm, se pudieron formar puntos de un diámetro de aproximadamente entre 70 y

\hbox{100  \mu m}

y no se observaron puntos debido a la dispersión cuando el líquido inyectado incidió sobre la superficie del soporte sólido (a los que en los sucesivo se hará referencia como puntos satélite). La reacción entre grupos maleimido sobre el soporte sólido y grupos SH en el terminal de las sondas de ácido nucleico finaliza en aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente (25ºC), aunque depende de las condiciones de un líquido inyectado. El tiempo requerido es menor que el correspondiente requerido cuando para inyectar un líquido se utiliza un cabezal de chorros piezoeléctrico. Aunque no se conoce el motivo, se considera que la temperatura de la solución de la sonda de ácido nucleico en el cabezal de chorros de burbujas se eleva según su principio básico, de manera que la eficacia de la reacción entre un grupo maleimido y un grupo tiol aumenta para acortar el tiempo de reacción.

En relación con esto, un grupo tiol tiende a resultar inestable bajo unas condiciones alcalinas o neutras y se puede formar un enlace de disulfuro (-S-S-), que da como resultado un dímero. Para evitar la formación del enlace de disulfuro y para conseguir una reacción eficaz entre un grupo tiol y un grupo maleimido, es preferible añadir tiodiglicol al líquido de inyección.

Para introducir un grupo maleimido sobre la superficie de un soporte sólido, se pueden utilizar varios métodos. Por ejemplo, cuando se utiliza un sustrato de vidrio como soporte sólido, en la superficie del soporte sólido se puede incorporar un grupo maleimido mediante la introducción de un grupo amino en el sustrato y la reacción sucesiva entre el grupo amino y un reactivo que contiene N-(6-maleimidocaproiloxi)succinimida (reactivo EMCS: Dojin Co., Ltd.). La introducción del grupo amino en la superficie se puede realizar haciendo reaccionar un agente de acoplamiento de aminosilano con el sustrato de vidrio.

Fórmula estructural del EMCS

2

Se puede obtener una sonda de ácido nucleico que tiene un grupo tiol en el terminal del mismo mediante la síntesis de un ácido nucleico utilizando un modificador de tiol 5' C6 (Glen Research Co., Ltd.) como reactivo para el terminal 5' en un sintetizador de ADN automático seguido por una reacción de desprotección habitual y una purificación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

Grupo amino y grupo epoxi

Como grupos funcionales utilizados para la inmovilización y que sean diferentes a la combinación mencionada anteriormente del grupo tiol y el grupo maleimido, se puede utilizar también una combinación del grupo epoxi (en el soporte sólido) y el grupo amino (terminal de la sonda de ácido nucleico). Se pueden introducir grupos epoxi en la superficie de un soporte sólido aplicando, por ejemplo, metacrilato de poliglicidilo con un grupo epoxi en la superficie de un soporte sólido de una resina, o aplicando un agente de acoplamiento de silano con un grupo epoxi en la superficie del soporte sólido de vidrio para la reacción.

Tal como se ha explicado anteriormente, cuando se introducen grupos funcionales en la superficie de un soporte sólido y un terminal de una sonda de ácido nucleico ss para formar enlaces covalentes, la sonda de ácido nucleico se fija más firmemente en el soporte sólido. Además, como la sonda de ácido nucleico se une siempre al soporte sólido por su terminal, los estados de la sonda de ácido de nucleico en cada punto resultan homogéneos. Como consecuencia, la hibridación entre las sondas de ácido nucleico y los ácidos nucleicos objetivo se produce en condiciones uniformes, y de este modo se puede realizar la detección de un ácido nucleico objetivo y la identificación de una secuencia de bases con una precisión más mejorada. Cuando a un soporte sólido se le unen mediante enlaces covalentes sondas de ácido nucleico que tienen un grupo funcional en cada terminal, se puede producir cuantitativamente una matriz posicional de sondas sin diferencias en la cantidad de ADN de la sonda unido debido a la diferencia en la secuencia o la longitud, en comparación con sondas de ácido nucleico fijadas en un soporte sólido mediante un enlace no covalente (por ejemplo, electrostáticamente, etcétera). Además, todas las partes del ácido nucleico participan en la reacción de hibridación, y se puede mejorar notablemente la eficacia de la hibridación. Además, entre la fracción de ácido nucleico ss que hibrida con un ácido nucleico objetivo y el grupo funcional destinado a la unión con un soporte sólido puede estar presente un elemento de enlace tal como grupos alquilenos de entre 1 y 7 carbonos o derivados del etilenglicol. Cuando dicha sonda de ácido nucleico se une a un soporte sólido, entre la superficie del soporte sólido y la sonda de ácido nucleico se puede disponer un espacio predeterminado, de manera que se puede esperar una mejora adicional de la eficacia de la reacción entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico objetivo.

Método de fabricación de la sonda

A continuación se explicará una de las realizaciones preferentes del método de fabricación de la matriz posicional de sondas. En primer lugar, se prepara un líquido que contiene un 7,5% en peso de glicerina, un 7,5% en peso de urea, un 7,5% en peso de tiodiglicol, y un 1% en peso de un alcohol de acetileno según se muestra por medio de la anterior fórmula general (I) (por ejemplo, Nombre del producto: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.). Se sintetiza una sonda de ácido nucleico ss de una longitud de, por ejemplo, aproximadamente 2-5.000 meros, específicamente, de forma aproximada 2-60 meros, con un grupo tiol en el terminal, utilizando un sintetizador de ADN automático. A continuación, la sonda de ácido nucleico se mezcla en el líquido anterior con una concentración en un intervalo de entre 0,05 y 500 \muM, especialmente entre 2 y 50 \muM, para producir un líquido a inyectar que presenta una viscosidad de entre 1 y 15 cps, específicamente entre 1 y 5 cps, y una tensión superficial de 30 dinas/cm o mayor, específicamente entre 30 y 50 dinas/cm. A continuación, por ejemplo, una boquilla de un cabezal de chorros de burbujas se llena con este líquido de inyección. Se introducen grupos maleimido en la superficie de un soporte sólido según el método anterior. El soporte sólido se coloca de manera que la distancia entre la superficie del soporte sólido que presenta grupos maleimidos y la punta de la boquilla del cabezal de chorros de burbujas llega a ser tan pequeña como entre aproximadamente 1,2 y 1,5 mm, y el cabezal de chorros de burbujas se acciona para inyectar el líquido. En este caso, como condiciones de inyección, es deseable fijar un patrón de impresión que no permita la conexión mutua entre los puntos sobre un soporte sólido. Cuando para el punteado se utiliza un cabezal de chorros de burbujas cuya resolución es 360 x 720 dpi, las condiciones preferibles son que una inyección del líquido preceda a dos expulsiones en vacío en la dirección de los 360 dpi y una inyección líquida preceda a 5 expulsiones en vacío en la dirección de los 720 dpi. Estas condiciones pueden proporcionar un espacio de aproximadamente 100 \mum entre puntos y evitan suficientemente la contaminación entre puntos adyacentes. A continuación, el soporte sólido se coloca, por ejemplo, en una cámara húmeda, hasta que se produce una reacción entre los grupos maleimido en un soporte sólido y los grupos tiol de las sondas de ácido nucleico en un líquido y las sondas de ácido nucleico quedan fijadas de forma segura en el soporte sólido. Es suficiente con dejarlo a temperatura ambiente (aproximadamente 25ºC) durante aproximadamente 30 minutos tal como se ha descrito anteriormente. A continuación, las sondas de ácido nucleico que no han reaccionado en el soporte sólido se eliminan mediante lavado para obtener una matriz posicional de sondas de ácido nucleico.

A continuación, para mejorar la precisión de la detección (relación S/N) en, por ejemplo, la detección de un ácido nucleico objetivo utilizando esta matriz posicional de sondas de ácido nucleico, es preferible bloquear la superficie del soporte sólido después de que las sondas de ácido nucleico se fijen en el soporte para evitar que las áreas de la superficie que no se unen a las sondas de ácido nucleico reaccionen con un ácido nucleico objetivo, etcétera, contenido en una muestra. El bloqueo se puede realizar, por ejemplo, sumergiendo el soporte sólido en una solución acuosa de seroalbúmina bovina del 2% durante dos horas o descomponiendo grupos maleimidos no unidos a las sondas de ácido nucleico en la superficie del soporte sólido. Por ejemplo, se puede utilizar DTT (ditiotreitol), \beta-mercaptoetanol, etcétera. No obstante, en términos de un efecto que evita la adsorción de ADN objetivo, la más adecuada es una solución acuosa de seroalbúmina bovina. Esta etapa de bloqueo se puede realizar según se requiera. Por ejemplo, esta etapa de bloqueo se puede omitir cuando se pueda suministrar de forma restrictiva una muestra en los puntos respectivos de la matriz posicional de sondas y ninguna muestra se fije sustancialmente a las partes que no sean los puntos de sonda. La etapa de bloqueo se puede omitir también cuando en el soporte sólido se hayan formado de antemano cavidades, y las partes que no son cavidades se procesen para inhibir la fijación de sondas de ácido nucleico.

Las matrices posicionales de sondas fabricadas mediante dicho método pueden tener una pluralidad de puntos que contienen la misma sonda de ácido nucleico o una pluralidad de puntos que contienen cada uno una sonda de ácido nucleico diferente, dependiendo de las aplicaciones. A continuación, la matriz posicional de sondas en la que se disponen las sondas de ácido nucleico con una alta densidad preparada, tal como se ha mencionado anteriormente, se puede utilizar para la detección de un ácido nucleico ss objetivo y la identificación de una secuencia de bases. Por ejemplo, cuando se detecta un ácido nucleico ss objetivo de una secuencia de bases conocida que puede estar presente en una muestra de prueba, como sonda se utiliza un ácido nucleico ss que tiene una secuencia de bases complementaria con respecto a la correspondiente al ácido nucleico objetivo, y se prepara una matriz posicional de sondas en la que una pluralidad de puntos que contienen la sonda se dispone en un soporte sólido. Cada muestra se suministra a cada punto de la matriz posicional de sondas, y la matriz posicional de sondas se deja reposar en condiciones que permiten la hibridación entre el ácido nucleico objetivo y la sonda, a continuación se detecta la presencia/ausencia de híbrido en cada punto según un método conocido tal como la detección fluorescente. Esto permite la detección de la presencia/ausencia de la sustancia objetivo en una muestra. Cuando para identificar una secuencia de bases de un ácido nucleico ss objetivo contenido en una muestra se utiliza una matriz posicional de sondas, una pluralidad de ácidos nucleicos ss que tienen secuencias de bases complementarias con respecto a las secuencias supuestas del ácido nucleico objetivo se puntean como sondas en el soporte sólido. A continuación, porciones alícuotas de la muestra se suministran a los puntos respectivos y se incuban en condiciones que permiten la hibridación del ácido nucleico objetivo y la sonda, y a continuación se detecta la presencia/ausencia de hibridación en cada punto según un método conocido tal como el método de fluorescencia. Esto posibilita la identificación de una secuencia de bases de un ácido nucleico ss objetivo. Como aplicaciones alternativas de la matriz posicional de sondas según la presente invención, se puede considerar, por ejemplo, la aplicación en el cribado de secuencias de bases específicas reconocidas por proteínas de unión a ADN y sustancias químicas que tienen una propiedad de unión con el ADN.

Tipos de cabezal de chorros de tinta

Aunque anteriormente se ha ilustrado simplemente una constitución en la que una sonda de ácido nucleico se aplica a un soporte sólido por medio de un cabezal de chorros de burbujas, en la presente invención se puede utilizar también un cabezal de chorros piezoeléctrico que inyecta un líquido en una boquilla por presión de vibración de elementos piezoeléctricos. No obstante, en la presente invención se utiliza adecuadamente un cabezal de chorros de burbujas, ya que una reacción de unión a un soporte sólido se completa en un periodo de tiempo breve y la estructura secundaria del ADN se despliega por calor, de manera que, tal como se ha descrito anteriormente, se puede aumentar la eficacia de la reacción de hibridación subsiguiente.

Además, se puede utilizar un sistema de chorros de tinta que tiene una serie de cabezales para formar una pluralidad de puntos simultáneamente en un soporte sólido, de manera que dos o más puntos pueden contener sondas de ácido nucleico diferentes.

ANP/ADN

La presente invención se ha ilustrado utilizando una sonda de ácido nucleico como ejemplo de sondas. Las sondas de ácido nucleico incluyen sondas de ácido desoxirribonucleico (ADN), sondas de ácido ribonucleico (ARN), y sondas de ácido nucleico peptídico (ANP). Los ANP son oligonucleótidos sintéticos en los que cuatro bases (adenina, guanina, timina y citosina) contenidas en ADN se unen a un esqueleto peptídico, no a un esqueleto de fosfato de azúcar tal como se muestra en la siguiente fórmula (II):

Fórmula estructural del ANP (II)

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en donde "Base" representa cualquiera de entre las cuatro bases (adenina, guanina, timina y citosina) contenidas en el ADN, y p representa una longitud de bases del ANP. Los ANP se pueden sintetizar, por ejemplo, por medio de métodos conocidos como síntesis en fase sólida de tipo tBOC y síntesis en fase sólida de tipo Fmoc. Los ANP son más resistentes a enzimas tales como nucleasas y proteasas en comparación con oligonucleótidos naturales de ADN y ARN, apenas desprendidos o no desprendidos enzimáticamente, y estables en el suero. Debido a la ausencia de la fracción de azúcar o los grupos fosfato, los ANP se ven afectados muy raramente por la fuerza iónica de un tampón. Por esta razón, no se requiere controlar una concentración de sal, etcétera, cuando se hacen reaccionar ácidos ANP con un ácido nucleico ss objetivo. Además, debido a la ausencia de repulsión electrostática, se considera que un híbrido entre ANP y un ácido nucleico ss objetivo es más termoestable que los correspondientes entre una sonda de ADN y un ácido nucleico ss objetivo y entre una sonda de ARN y un ácido nucleico ss objetivo. A partir de estas características, se prevé el uso de los ANP como sondas para la detección de un ácido nucleico objetivo y la determinación de una secuencia de bases. El método de fabricación de una matriz posicional de sondas de ácido nucleico según la presente invención es eficaz también cuando se utiliza una sonda de ANP como sonda de ácido nucleico y se puede fabricar fácilmente una matriz posicional de sondas de ANP en la que se disponen densamente y con mucha precisión sondas de ANP. Específicamente, por ejemplo, para aumentar la densidad de una matriz posicional de sondas asegurando una sonda de ANP en posiciones limitadas en un soporte sólido, como en el caso de sondas de ADN y sondas de ARN, se introducen respectivamente dos tipos de grupos funcionales que pueden reaccionar entre sí en el terminal de una sonda de ANP y la superficie de un soporte sólido. Tal como se ha mencionado anteriormente, una combinación preferente de grupos reactivos es una combinación de un grupo tiol (en el terminal del ANP) y un grupo maleimido (la superficie de un soporte sólido). Un grupo tiol se puede introducir en el terminal del ANP, por ejemplo, introduciendo un grupo cisteína (CH(NH_{2})(COOH)CH_{2}SH), etcétera, que contenga un grupo tiol en el terminal N (correspondiente al terminal 5' del ADN) de una sonda de ANP. Un grupo cisteína se puede introducir en el terminal N de una sonda de ANP, por ejemplo, haciendo reaccionar el grupo amino del terminal N de una sonda de ANP y el grupo carboxilo de cisteína. Además, utilizando un elemento de enlace adecuado tal como los correspondientes que contienen un grupo amino y un grupo carboxilo tal como el N_{2}H(CH_{2})_{2}O(CH_{2})_{2}OCH_{2}COOH, el grupo amino en el terminal N de una sonda de ANP se hace reaccionar con el grupo carboxilo del elemento de enlace y a continuación el grupo amino del elemento de enlace se hace reaccionar con el grupo carboxilo de la cisteína para unir la cisteína a la sonda de ANP a través del elemento de enlace. Cuando, tal como se ha mencionado anteriormente, a través de un elemento de enlace se introduce un grupo de unión con un soporte sólido, una parte de la sonda ANP interactiva con una sustancia objetivo se puede separar del soporte sólido una distancia predeterminada de manera que se espera una mejora adicional en la eficacia de la hibridación.

El ANP puede tener una solubilidad en agua menor que el ADN de la misma longitud de bases que la longitud polimérica del ANP. De este modo, cuando se prepara un líquido para la inyección de chorros de tinta, es preferible disolver de antemano ANP en ácido trifluoroacético (por ejemplo, una solución acuosa del 0,1% en peso de ácido trifluoroacético) etcétera, y a continuación preparar un líquido de inyección de propiedades compatibles con la inyección de chorros de tinta utilizando los diversos disolventes mencionados anteriormente. En particular, la anterior disolución en ácido trifluoroacético puede evitar la conversión de los residuos de cisteína terminales en cistina debido a la oxidación de grupos tiol de ANP. De este modo es preferible para una mejora adicional en la eficacia de una reacción entre el grupo tiol del ANP y el grupo maleimido en la superficie de un soporte sólido. Aunque el tiempo de reacción de 30 min es suficiente para una reacción entre un grupo tiol introducido en el terminal de una sonda de ADN o una sonda de ARN y un grupo maleimido en la superficie de un soporte sólido (cuando se utiliza un cabezal de chorros de burbujas), es preferible proceder con una reacción durante aproximadamente 2 horas en el caso del ANP incluso utilizando un cabezal de chorros de burbujas.

En la presente invención, las sondas no se limitan a sondas de ácido nucleico, e incluyen sustancias que se pueden unir específicamente a una sustancia objetivo en una muestra a detectar o analizar, por ejemplo, ligandos que se pueden unir específicamente a receptores, receptores que se pueden unir específicamente a ligandos, oligopéptidos y polipéptidos que se pueden unir a oligopéptidos y polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos específicas, y proteínas (por ejemplo, anticuerpos, antígenos, enzimas, etcétera).

Tal como se ha mencionado anteriormente, según el método de fabricación de una matriz posicional de sondas que comprende una etapa de suministro de una solución de sonda a un soporte sólido utilizando un proceso de inyección de chorros de tinta, una matriz posicional de sondas se puede fabricar muy fácilmente. En particular, cuando se introducen grupos funcionales tanto en una sonda de ácido nucleico como en una superficie de un soporte sólido para formar un enlace covalente entre ellos, los puntos adyacentes no se conectan entre sí ni siquiera cuando se utiliza un soporte sólido en el que no se han dispuesto de antemano cavidades, etcétera, es decir, un soporte sólido que es sustancialmente plano y tiene propiedades superficiales homogéneas (humectabilidad al agua, etcétera). Como consecuencia, se puede fabricar de forma extremadamente eficaz y con unos costes bajos una matriz posicional de sondas de ácido nucleico en la que se disponen de forma precisa y densa puntos de una sonda de ácido nucleico.

Esta descripción no pretende excluir un soporte sólido dotado de cavidades sobre la superficie en la presente descripción. Por ejemplo, cuando entre las cavidades a las que se suministra una solución de sonda se forma previamente un patrón de matriz opaca (a la que en lo sucesivo se hace referencia como matriz negra (BM)), la precisión en la detección (relación SN) se puede mejorar adicionalmente en la detección óptica (por ejemplo, detección de fluorescencia) de la hibridación entre una sonda y una sustancia objetivo. Además, cuando entre cavidades adyacentes se proporciona una matriz cuya superficie tiene una afinidad baja con respecto a una solución de sonda, la solución de sonda se puede suministrar uniformemente a las cavidades deseadas, incluso cuando la solución se suministra a posiciones algo desviadas durante el suministro de la solución de sonda a las cavidades. Para disfrutar de dicho efecto, se puede utilizar un soporte sólido en cuya superficie se proporcionan cavidades. A continuación se describen un soporte sólido con una matriz formada en su superficie, un método de fabricación del mismo, y un método de utilización del soporte sólido según esta realización.

Las figuras 5A y 5B muestran ejemplos de una matriz posicional de sondas según esta realización de la presente invención. La figura 5A es una vista en planta y la figura 5B es una vista en sección transversal tomada según la línea 5B-5B de la figura 5A. Esta matriz posicional de sondas tiene una configuración en la que un patrón (125) de matriz en una estructura de armazón que contiene partes huecas (cavidades) (127) está dispuesto en forma de una matriz que se forma en un soporte sólido (103). Las cavidades (127) separadas por el patrón (125) de matriz (parte saliente) se proporcionan como agujeros pasantes (partes perforadas) en el patrón de matriz, estando formadas las paredes laterales de los agujeros por partes salientes, y una superficie del soporte sólido (103) se deja al descubierto en la parte inferior (129). La superficie al descubierto del soporte sólido (103) forma una superficie que se puede unir a una sonda, y a las cavidades predeterminadas se les fijan sondas (no mostradas).

Preferentemente los materiales para formar el patrón de matriz son aquellos que hacen que el patrón de matriz sea opaco, considerando la mejora en la sensibilidad de detección, la relación S/N, y la fiabilidad, cuando se detecta ópticamente un producto de reacción de una sonda y una sustancia objetivo, por ejemplo, midiendo la fluorescencia emitida desde el producto de reacción. Como ejemplos de dichos materiales se pueden mencionar metales (cromo, aluminio, oro, etcétera) y resinas negras, etcétera. Como resinas negras se incluyen resinas tales como acrílicos, policarbonato, poliestireno, polietileno, poliimida, monómero acrílico, y acrilato de uretano y resinas fotosensibles tales como capas fotorresistentes que contienen colorantes o pigmentos negros. Como ejemplos específicos de resinas fotosensibles se pueden utilizar, por ejemplo, capas protectoras contra UV, capas de protección profunda UV (DEEP-UV), resinas de curado por rayos ultravioleta. Como capas protectoras UV, se pueden mencionar capas protectoras negativas tales como capas protectoras de poliisopreno ciclizado-bisazida aromática, y capas protectoras compuestas de resina fenólica-azida aromática, y capas protectoras positivas tales como capas protectoras de resina novolac-diazonaftoquinona. Como capas protectoras DEEP-UV se pueden mencionar capas protectoras positivas, por ejemplo, capas protectoras de polímeros radiolíticos tales como metacrilato de polimetilo, sulfona de polimetileno, metacrilato de polihexafluorobutilo, cetona de polimetilisopropenilo, y bromuro de poli-1-trimetilsilil propileno y capas protectoras supresoras de disolución tales como colato de éster o-nitrobencílico, y capas protectoras negativas tales como sulfona de polivinilfenol-3,3'-diazidadifenilo y polimetacrilato de glicidilo.

Como resinas de curado ultravioleta se pueden mencionar el acrilato de poliéster, el acrilato de epoxi y el acrilato de uretano, etcétera, que contengan aproximadamente entre un 2 y un 10% en peso de uno o más iniciadores de fotopolimerización seleccionados de un grupo consistente en benzofenona y sus derivados sustituidos, benzoína y sus derivados sustituidos, acetofenona y sus derivados sustituidos, y compuestos de oxima tales como bencilo, etcétera.

Como pigmentos negros, se pueden utilizar el negro de carbón y pigmentos orgánicos negros.

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Cuando el producto de reacción de una sonda y una sustancia objetivo no se detecta ópticamente y cuando la luz de una matriz no influye en la detección óptica de un producto de reacción, no se excluye la utilización de sustancias no protectoras contra la luz como material para un patrón de matriz.

Como uno de los métodos de formación de un patrón de matriz que utiliza los materiales anteriores, se puede mencionar un método en el que una capa fotorresistente se forma sobre una resina o una capa metálica formada sobre la superficie de un sustrato, y después de la formación del patrón de la capa protectora, se forma un patrón en la resina por medio de un proceso tal como ataque químico. Cuando se utiliza una resina fotosensible, la propia resina se puede dejar al descubierto, se puede revelar, y someter a un proceso de curado si así se requiere, mediante un proceso de fotolitografía utilizando una fotomáscara para la formación del patrón. Cuando una matriz (125) se ha realizado con una resina, la superficie de la matriz (125) es hidrófoba. Esta configuración es preferible cuando como solución que contiene una sonda y que se suministra a las cavidades se utiliza una solución acuosa. Es decir, cuando a las cavidades se les suministra una solución de sonda por medio de un método de chorros de tinta, la solución de sonda se puede suministrar muy uniformemente a las cavidades deseadas, incluso cuando la solución de sonda se suministra a posiciones ligeramente desviadas. Además, cuando a cavidades adyacentes se les suministran diferentes sondas simultáneamente, se puede evitar la contaminación cruzada de estas soluciones de sondas diferentes suministradas a las cavidades.

Como una solución de una sonda, un biomaterial, tal como péptidos y ácido nucleico, es frecuentemente una solución acuosa, en dichas ocasiones se puede utilizar adecuadamente esta constitución en la que un patrón de matriz es hidrorrepelente.

A continuación, se describe un método de realización de una parte inferior de una cavidad (una parte dejada al descubierto de la superficie de un soporte sólido) que se puede unir a una sonda. Un grupo funcional que quedará retenido en la parte inferior de una cavidad queda determinado por el grupo funcional que portará una sonda. Por ejemplo, cuando se utiliza una sonda de ácido nucleico en la que se introduce un grupo tiol en el terminal, la introducción previa de un grupo maleimido en la superficie de un soporte sólido, tal como se ha mencionado anteriormente, hace que el grupo tiol de la sonda de ácido nucleico suministrada a las cavidades forme un enlace covalente con el grupo maleimido sobre la superficie del soporte sólido y a continuación la sonda de ácido nucleico se fija sobre la superficie del soporte sólido. De forma similar, con una sonda de ácido nucleico que tiene un grupo amino en el terminal, es preferible introducir grupos epoxi en la superficie de un soporte sólido. Como combinaciones alternativas de estos grupos funcionales, es preferible, por ejemplo, una combinación de un grupo carboxilo para una sonda de ácido nucleico (introduciendo un derivado de la succinimida en el terminal de una sonda de ácido nucleico) y un grupo amino para la superficie de un soporte sólido. Esta combinación de grupos amino y epoxi es inferior en cuanto a la inmovilización de la sonda de ácido nucleico inyectada por chorros de tinta sobre un soporte sólido con respecto a una combinación de grupos tiol y maleimido aunque a un nivel insignificante cuando en el soporte sólido se disponen cavidades.

El grupo amino o epoxi se puede introducir en una placa de vidrio como soporte sólido tratando, en primer lugar, la superficie de la placa de vidrio con una solución de álcali tal como hidróxido de potasio e hidróxido de sodio para dejar al descubierto grupos hidroxilo (grupos silanol) con respecto a la superficie, y a continuación haciendo reaccionar un agente de acoplamiento de silano que contiene un compuesto de silano en el que se ha introducido un grupo amino (por ejemplo, N-\beta-(aminoetil)-\gamma-aminopropiltrimetoxisilano, etcétera) o un compuesto de silano en el que se ha introducido un grupo epoxi (por ejemplo, \gamma-glicidoxipropiltrimetoxisilano, etcétera) con un grupo hidroxilo de la superficie de la placa de vidrio. Para introducir grupos maleimido en la superficie de la placa de vidrio, los grupos amino introducidos por medio del método anterior se hacen reaccionar con N-maleimidocaproiloxi succinimida o succinimidil-4-(maleimido fenil)butirato, etcétera.

A continuación se muestran las estructuras del N-\beta-(aminoetil)-\gamma-aminopropiltrimetoxisilano, \gamma-glicidoxipropiltrimetoxisilano, y succinimidil-4-(maleimido fenil)butirato:

\cdot N-\beta-(aminoetil)-\gamma-aminopropiltrimetoxisilano

(CH_{3}O)_{2}SiC_{3}H_{6}NHC_{2}H_{4}NH_{2}

\cdot\gamma-glicidoxipropiltrimetoxisilano

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\cdot -Succinimidil-4-(maleimido fenil)butirato

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Cuando en una superficie de soporte sólido en el tratamiento anterior de la superficie de un soporte sólido se introduce un grupo epoxi, se puede hacer que la base de las cavidades sea hidrófila después de unir los grupos epoxi a una sonda, mediante la apertura de anillos epoxi que no han reaccionado utilizando una solución acuosa de etanolamina, etcétera, para transformarlos en grupos hidroxilo. Esta operación es preferible cuando un disolvente acuoso que contiene una sustancia objetivo que reaccionará específicamente con una sonda se suministra a cavidades con las que se ha unido la sonda.

Cuando como soporte sólido se utiliza una placa de resina, en la superficie del sustrato de resina se pueden introducir grupos hidroxilo, grupos carboxilo, o grupos amino según el método descrito en el Capítulo 5 de "Organic Thin Films and Surface", Vol. 20, Academic Press. Como alternativa, después de introducir grupos hidroxilo con este método, tal como se muestra para la placa de vidrio mencionada anteriormente, se pueden introducir grupos amino o grupos epoxi utilizando un compuesto de silano que tiene un grupo amino o un grupo epoxi. Además se puede introducir un grupo maleimido. Se pueden introducir grupos funcionales antes o después de que se haya formado el patrón de matriz sobre un soporte sólido. Antes de la formación del patrón de la matriz, a la superficie de un soporte sólido se le puede suministrar una solución de reacción requerida para la introducción de un grupo funcional mediante recubrimiento por giro o recubrimiento por inmersión, etcétera. Después de la formación de la matriz, a cada cavidad se le puede suministrar una solución de reacción por medio del método de chorros de tinta, etcétera.

Para unir una sonda a un sustrato de resina se introducen, por ejemplo, grupos hidroxilo por oxidación de la superficie de un sustrato de resina, a continuación los grupos hidroxilo se hacen reaccionar con un agente de acoplamiento de silano formado por un compuesto de silano que contiene un grupo amino para introducir grupos amino, y cada grupo amino se hace reaccionar con un grupo funcional de una sonda, tal como se describe en la publicación de solicitud de patente japonesa nº. 60-015560.

Cuando el sustrato después del tratamiento es hidrófilo, se pueden utilizar las resinas mencionadas anteriormente para conseguir la formación del patrón de la matriz sin ningún tratamiento tal como un material relativamente hidrorrepelente. Cuando se requiere una repelencia adicional, a un material de la matriz se le puede añadir un agente hidrorrepelente. Cuando se forma un patrón de la matriz a partir de una resina fotosensible tal como una capa fotorresistente, una post-cocción bajo unas condiciones adecuadas después de la exposición y el revelado puede proporcionar una mayor repelencia para el patrón de la matriz.

Cuando una solución de sonda es lipófila, aunque se ha explicado principalmente sobre una solución de sonda hidrófila, se puede realizar el tratamiento opuesto.

El tamaño y la forma de las cavidades en un patrón de matriz se pueden seleccionar según el tamaño de un sustrato, el tamaño de una matriz posicional como un conjunto finalmente preparada, el número y un tipo de sonda que constituye la matriz posicional, o un método de formación de un patrón de matriz, un método de suministro de una solución de sonda a cavidades en el patrón de matriz, y un método de detección, etcétera.

La sección transversal de las cavidades según un plano paralelo al sustrato puede tener varias formas, además de cuadradas según se muestra en la figura 5, por ejemplo, rectángulos, varios polígonos, círculos, y óvalos.

Preferentemente, las cavidades tienen una anchura máxima de 300 \mum o menor, teniendo en cuenta el número de reactantes y el tamaño de una matriz completa. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 5, cuando la sección transversal considerada en paralelo a un sustrato es cuadrada, un lado puede tener una longitud de 200 \mum o menor. Preferentemente, cuando las cavidades son rectangulares, el lado máximo es 200 \mum o menor, y cuando las cavidades son redondas, el diámetro es 200 \mum o menor. El límite mínimo de la longitud es aproximadamente 1 \mum.

Las cavidades se pueden disponer en varios patrones según se requiera. Las cavidades se pueden disponer a intervalos iguales constituyendo filas y columnas tal como se muestra en la figura 5, o las cavidades se pueden disponer de manera que estén desplazadas con respecto a las posiciones de las cavidades de líneas adyacentes.

Una distancia entre cavidades adyacentes se fija preferentemente de manera que no provoque contaminación cruzada ni siquiera cuando las posiciones de inyección están algo desviadas con respecto a la posición de la cavidad objetivo a la que se suministra la solución de sonda, por ejemplo, a través de un método de chorros de tinta. Además, considerando el tamaño de una matriz posicional completa, la contaminación cruzada, y las propiedades de manipulación en el suministro de varias soluciones, la distancia entre las cavidades adyacentes está comprendida en el intervalo que va de 1/2 a 2 veces la anchura máxima.

Por ejemplo, es deseable que en una matriz posicional de sondas estén presentes 100 x 100 ó 1.000 x 1.000 o más tipos de sondas para presentar exhaustivamente funciones de química combinatoria, y el tamaño de un sustrato es deseablemente 1 pulgada x 1 pulgada o 1 cm x 1 cm, de manera que resulte adecuada para la automatización de operaciones tales como fijación de las sondas, el suministro y la detección de muestras, por lo que para cavidades cuadradas es preferible fijar un lado de un cuadrado de una cavidad a 1-200 \mum o menos y una distancia entre cavidades adyacentes es de 200 \mum o menor, considerando el tamaño de la matriz.

El grosor de una matriz (altura con respecto a la superficie del soporte sólido) se determina considerando un método de formación del patrón de la matriz, el volumen de las cavidades, y el volumen de una solución de sondas suministrada. Es preferentemente 1-20 \mum. Dicho grosor posibilita, cuando a cada cavidad se le suministra una solución de sonda a través del método de inyección de chorros de tinta, la retención de la solución de sondas en posiciones predeterminadas sobre un soporte sólido y la evitación de la contaminación cruzada muy eficazmente, incluso cuando las propiedades de la solución de sondas no deberían ser adecuadas para formar puntos pequeños en la superficie del soporte sólido, en relación con las condiciones correspondientes al método de inyección de chorros de tinta.

Cuando una cavidad tiene el tamaño de los límites superiores de los intervalos deseables descritos anteriormente, es decir, 200 \mum x 200 \mum x 20 \mum, el volumen de las cavidades es 800 pl. Cuando se utiliza este tamaño y además la distancia entre cavidades adyacentes (x en la figura 1) se fija a 200 \mum, se obtiene una densidad de cavidades de 625 cavidades/cm^{2}. Es decir, se puede obtener una matriz posicional con una densidad de cavidades del orden de 10^{2} cavidades/cm^{2} o más. Cuando una cavidad es un cuadrado con un lado de 5 \mum, la distancia entre cavidades adyacentes se fija a 5 \mum, y el grosor del patrón de la matriz se fija a 4 \mum, el volumen de una cavidad es 0,1 pl y la densidad de cavidades es 1000000 cavidades/cm^{2}. Como la formación de patrones de 5 \mum x 5 \mum x 4 \mum es posible en la presente tecnología de procesado, en el ámbito de la presente invención se puede incluir una matriz posicional con una densidad de cavidades del orden de 10^{6} cavidades/cm^{2}.

En esta realización, el volumen de alimentación de una solución de sonda o una sustancia a reaccionar con una sonda suministrada a una cavidad es de 0,1 picolitros (pl) a 1 nanolitro (nl) a partir del cálculo anterior, cuando se considera que el volumen a suministrar es el mismo o casi el mismo que el volumen de la cavidad. Cuando una matriz tiene poca afinidad con una solución a suministrar, es posible suministrar la solución en un volumen que supere el volumen de la cavidad el cual se mantiene por encima de la abertura de la cavidad debido a la tensión superficial, dependiendo del tipo de la solución. En tal caso, por ejemplo, se puede suministrar y mantener una solución en un volumen de 10 a varias decenas de veces mayor que el de la cavidad. Es decir, se suministran entre varios picolitros y varias decenas de nanolitros de una solución. En todos los casos, a las cavidades se les suministra preferentemente una solución de sondas utilizando el método de chorros de tinta que puede suministrar dicha cantidad pequeña de solución con precisión en la posición y precisión en el suministro, aunque también se pueden utilizar microdispensadores o micropipetas. En la impresión por chorros de tinta, se inyecta tinta con un posicionamiento con una precisión elevada del orden de \mum. Por esta razón este método es bastante adecuado para suministrar una solución a cavidades. Como el volumen de tinta a inyectar es de varias decenas de picolitros a varios nanolitros, se puede decir que el método de chorros de tinta es adecuado para suministrar una solución, también en relación con esto.

Según esta realización, la dispersión de pequeñas gotas se puede controlar cuantitativamente a través de la reacción entre una sonda de ácido nucleico y una superficie de soporte sólido así como a través de las cavidades. Además, incluso cuando se inyecta un líquido en una dirección algo desviada, cuando una gota pequeña cae en un área que contiene una cavidad, la parte de la gota pequeña sobre la matriz es repelida y absorbida hacia la cavidad suavemente, ya que la matriz no tiene afinidad con la solución inyectada.

El método de chorros de tinta utilizado en la presente invención no está limitado particularmente, y se puede utilizar un método piezoeléctrico de chorros, un método de chorros de burbujas que utilice burbujeo térmico, etcétera.

Como soporte sólido (103) se puede utilizar cualquier material según una realización de la presente invención, siempre que en la superficie se puedan introducir varios grupos funcionales tal como se ha descrito anteriormente. De acuerdo con la segunda realización de la presente invención, los materiales preferentes son aquellos sobre cuya superficie se puede formar un patrón de matriz. Cuando el producto de la reacción de una sonda y una sustancia objetivo se detecta ópticamente por medio de un sistema de detección a través de un soporte sólido, el soporte sólido es preferentemente transparente. Como dichos materiales, se puede mencionar vidrio que incluye cuarzo sintético y cuarzo fundido, silicona, resinas acrílicas, resinas de policarbonato, resinas de poliestireno, y resinas de cloruro de vinilo, etcétera. Cuando el producto de la reacción se detecta ópticamente no a través de un soporte sólido, es preferible utilizar un soporte sólido ópticamente negro, y se utilizan sustratos de resina que contienen colorantes o pigmentos negros tales como negro de carbón.

En la presente invención, una solución que puede contener una sustancia que reacciona con la sonda (una solución de prueba) se suministra a una matriz posicional de sondas y se deja en condiciones de reacción adecuadas para proseguir la reacción. Cuando a la matriz posicional se le deben suministrar múltiples soluciones de prueba, a múltiples cavidades en la matriz posicional de sondas se les suministra por lo menos una solución de prueba, respectivamente. En este caso, tal como se ha mostrado anteriormente, cuando la solución suministrada tiene una afinidad con cavidades que contienen una sonda fijada en la matriz posicional de sondas ya formada y no tiene afinidad con un patrón de matriz, se puede conseguir un suministro cuantitativo de la solución a un área de suministro limitada sin contaminación cruzada. Como la mayoría de biomateriales son solubles en agua, las cavidades son hidrófilas y el patrón de la matriz es hidrorrepelente. Además, la utilización del método de chorros de tinta en el suministro de estas sustancias para la reacción, tal como se ha mostrado anteriormente, puede suministrar cuantitativamente una cantidad muy pequeña de solución.

Según la presente solución se utilizan cantidades muy pequeñas de una solución de sonda y una solución de prueba. De este modo, es deseable incluir condiciones para evitar la evaporación o vaporización de las soluciones suministradas para ambos casos.

La presente invención se describe más detalladamente haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Fabricación de la matriz posicional de sondas de ácido nucleico utilizando una impresora por chorros de burbujas y evaluación de la matriz posicional de sondas (1) Lavado del sustrato

Una placa de vidrio de 1 pulgada x 1 pulgada se colocó en un bastidor y se sumergió en un detergente de lavado ultrasónico por la noche. Después del lavado ultrasónico en el detergente durante 20 minutos, el detergente se eliminó mediante un enjuague con agua. Después del enjuague con agua destilada, se realizó un tratamiento ultrasónico en un recipiente que contenía agua destilada durante 20 minutos. La placa de vidrio se sumergió durante 10 minutos en una solución de hidróxido de sodio 1 N precalentada a 80ºC. A continuación, la placa se lavó con agua y agua destilada para preparar una placa de vidrio para una matriz posicional de sondas.

(2) Tratamiento superficial

Una solución acuosa del 1% en peso de un agente de acoplamiento de silano (Nombre del producto: KBM603; Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) que contenía un compuesto de silano que tenía un grupo amino (N-\beta-(aminoetil)-\gamma-aminopropiltrimetoxisilano) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas para hidrolizar grupos metoxi del compuesto de silano anterior. A continuación, el sustrato se sumergió en esta solución a temperatura ambiente (25ºC) durante 20 minutos, se extrajo de la solución, y se secó soplando gas nitrógeno a ambos lados de la placa de vidrio. A continuación, la placa de vidrio se coció durante 1 hora en un horno calentado a 120ºC para completar el tratamiento de acoplamiento de silano de cara a introducir un grupo amino en la superficie del sustrato. A continuación, se pesaron 2,7 mg de N-(6-maleimidocaproiloxi) succinimida (Dojin Co., Ltd.) (abreviada como EMCS en lo sucesivo) y se disolvieron en una mezcla de DMSO/etanol (1:1) hasta una concentración final de 0,3 mg/ml para preparar una solución de EMCS. La placa de vidrio sometida al tratamiento de acoplamiento de silano se sumergió en la solución de EMCS a temperatura ambiente durante 2 horas para la reacción de los grupos amino portados en la superficie de la placa de vidrio por el tratamiento de acoplamiento de silano y los grupos carboxilo de la solución de EMCS. En esta condición, la placa de vidrio produjo grupos maleimido derivados de la EMCS en su superficie. La placa de vidrio extraída de la solución de EMCS se lavó sucesivamente con un disolvente mezclado de dimetilsulfóxido y etanol y con etanol y a continuación se secó bajo una atmósfera de gas nitrógeno.

(3) Síntesis de la sonda de ADN

Se sintetizó un ácido nucleico monocatenario (ss) de nº. ID de SEC 1 utilizando un sintetizador de ADN automático. En el terminal del ADN ss de nº. ID de SEC 1 se introdujo un grupo tiol (-SH) utilizando Modificador de Tiol (Glen Research Co., Ltd.) durante la síntesis del sintetizador de ADN automático. Después de la desprotección habitual, el ADN se recuperó, se purificó con cromatografía líquida de alto rendimiento, y se utilizó en los siguientes experimentos.

Nº. ID de SEC 1

^{5'}HS-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA ^{3'}

(4) Inyección y unión del ADN al sustrato utilizando una impresora BJ

El ADNss de nº.1 ID de SEC 1 se disolvió en una solución de TE (solución acuosa de 10 mM de Tris-HCl (pH 8)/1 mM de EDTA) hasta una concentración final de aproximadamente 400 mg/ml para preparar una solución de ADNss (la concentración exacta se calcula a partir de la absorbancia).

Una solución acuosa que contenía glicerina al 7,5% en peso, urea al 7,5% en peso, tiodiglicol al 7,5% en peso, y un alcohol de acetileno (Nombre del producto: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) que presentaba la anterior fórmula general (I) al 1% en peso se preparó y se añadió a la solución de ADN para ajustar una concentración final del ADNss a 8 \muM. Este líquido tenía tensión superficial en un intervalo de 30-50 dinas/cm y una viscosidad de 1,8 cps (Viscosímetro de tipo E: Tokyo Keiki Co., Ltd.). Un depósito de tinta de una impresora de chorros de burbujas (Nombre del producto: BJC62O; Canon Inc.) se llenó con este líquido y el depósito de tinta se montó en un cabezal de chorros de burbujas. La impresora de chorros de burbujas utilizada en este caso (Nombre del producto: BJC62O; Canon Inc.) se había modificado para posibilitar la impresión sobre una placa. Esta impresora de chorros de burbujas puede imprimir con una resolución de 360 x 720 dpi. A continuación la placa de vidrio tratada en el anterior punto (2) se montó en esta impresora y el líquido que contenía el ácido nucleico sonda se punteó sobre la placa de vidrio. La distancia entre la punta de la boquilla del cabezal de chorros de burbujas y la superficie de la placa de vidrio era de 1,2-1,5 mm. Las condiciones para el punteado se fijaron de tal manera que el líquido se punteó una vez seguido por 2 expulsiones en vacío en una dirección de 360 dpi y a continuación se punteó una vez seguido por 5 expulsiones en vacío en una dirección de 720 dpi. Después de finalizar el punteado, la placa de vidrio se dejó permanecer en una cámara húmeda durante 30 minutos para completar la reacción entre los grupos maleimido sobre la superficie de la placa de vidrio y los grupos tiol en el terminal de las sondas de ácido nucleico. La cantidad de la solución de ADN inyectada por una operación de inyección de la impresora era de aproximadamente 24 pl.

(5) Reacción de bloqueo

Después de finalizar la reacción entre el grupo maleimido y el grupo tiol, la placa de vidrio se lavó con una solución tampón de 1 M de NaCl/50 mM de fosfato (pH 7,0) para eliminar completamente por enjuague el líquido que contenía el ADN sobre la superficie de la placa de vidrio. A continuación, la placa de vidrio se sumergió en una solución acuosa de seroalbúmina bovina del 2% y se dejó durante 2 horas para proseguir con una reacción de bloqueo.

(6) Reacción de hibridación

Se sintetizó un ADNss con una secuencia de bases complementaria con respecto al ADN de nº. ID de SEC 1 utilizando un sintetizador de ADN automático, y a su terminal 5' se unió rodamina para obtener un ADNss etiquetado. Este ADNss etiquetado se disolvió en una solución tampón de 1 M de NaCl/50 mM de fosfato (pH 7,0) hasta una concentración final de 1 \muM. La matriz posicional de sondas sometida al tratamiento de bloqueo obtenida en el anterior punto (5) se sumergió en esta solución a temperatura ambiente (25ºC) durante 3 horas para proseguir con una reacción de hibridación. A continuación, la matriz posicional de sondas se lavó con la solución tampón de 1 M de NaCl/50 mM de fosfato (pH 7,0) para eliminar por lavado el ADNss que no se había hibridado con el ácido nucleico sonda. A continuación, la intensidad de fluorescencia de cada punto de la matriz posicional de sondas se cuantificó utilizando el analizador de imágenes (Nombre del producto: ARGUS; Hamamatsu Photonics Co., Ltd.).

(7) Resultados

La intensidad de la fluorescencia de los puntos del ácido nucleico de nº. ID de SEC 1 adaptado completamente al ADNss etiquetado era 4.600. Además, se observó la matriz posicional de sondas en la que los puntos respectivos emitían fluorescencia después de la hibridación utilizando un microscopio fluorescente (Nikon Corp.). Los resultados indicaban que, en la matriz posicional de sondas de este ejemplo,

(a) Cada punto era casi redondo y tenía un diámetro comprendido en un intervalo de aproximadamente 70-100 \mum;

(b) Había espacios de aproximadamente 100 \mum, que era casi el mismo diámetro de cada punto, entre puntos adyacentes de manera que cada punto era claramente independiente;

(c) Las columnas y filas de los puntos se dispusieron en líneas.

Estos hechos son muy eficaces en la detección automática, etcétera, de puntos hibridados en una matriz posicional de sondas.

Ejemplo 2 Fabricación de la matriz posicional de sondas de ácido nucleico utilizando una impresora por chorros de burbujas y detección del ácido nucleico objetivo utilizando la matriz posicional de sondas

(1) Se preparó una placa de vidrio para una matriz posicional de sondas de la misma manera que en los puntos (1) y (2) del Ejemplo 1.

(2) Síntesis del ADN sonda

Se sintetizaron ácidos nucleicos monocatenarios de nº. ID de SEC 1-4 utilizando un sintetizador de ADN automático. Los ácidos nucleicos ss de nº. ID de SEC 2-4 eran los siguientes: con respecto al ácido nucleico ss de nº. ID de SEC 1 utilizado en el Ejemplo 1, una base es diferente en el nº. ID de SEC 2, 3 bases en el nº. ID de SEC 3, y 6 bases en el nº. ID de SEC 4. En cada terminal de los ADNss de nº. ID de SEC 1-4 se introdujo un grupo tiol (-SH) utilizando el Modificador de tiol (Glen Research Co., Ltd.) durante la síntesis en el sintetizador de ADN automático. A continuación, después de la desprotección habitual, el ADN se recuperó, se purificó con cromatografía líquida de alto rendimiento, y se utilizó en los siguientes experimentos. A continuación se muestran las secuencias de nº. ID de SEC 2-4:

Nº. ID de SEC 2:

^{5'}HS-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-ACTGGCCGT\underline{T}GTTTTACA^{3'}

Nº. ID de SEC 3:

^{5'}HS-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-ACTGGCCG\underline{CTT}TTTTACA^{3'}

Nº. ID de SEC 4:

^{5'}HS-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-ACTGGC\underline{ATCTTG}TTTACA^{3'}

(3) Inyección y unión de las sondas de ADN al sustrato utilizando una impresora BJ

Los anteriores ADNss de nº. ID de SEC 1-4 se utilizaron para preparar 4 líquidos de inyección a través del método similar al descrito en el punto (4) del Ejemplo 1. Con los líquidos respectivos se llenaron 4 depósitos de tinta de una impresora de chorros de burbujas utilizada en el Ejemplo 1 y los depósitos de tinta respectivos se montaron en los cabezales de chorros de burbujas. La placa de vidrio preparada en el punto (1) se montó en la impresora, y las 4 sondas de ácido nucleico se puntearon en 4 áreas respectivas de 3 x 3 mm sobre la placa de vidrio. El patrón de punteado en cada área era el mismo que el del Ejemplo 1. Después de finalizar el punteado, la placa de vidrio se dejó en una cámara humidificada durante 30 minutos para hacer reaccionar el grupo maleimido y el grupo tiol.

(4) Reacción de bloqueo

Después de finalizar la reacción entre el grupo maleimido y el grupo tiol, la placa de vidrio se lavó con una solución tampón de 1 M de NaCl/ 50 mM de fosfato (pH 7,0) para eliminar completamente por enjuague la solución que contenía el ADN sobre la superficie de la placa de vidrio. A continuación, la placa de vidrio se sumergió en una solución acuosa de seroalbúmina bovina del 2% y se dejó durante 2 horas para proseguir con una reacción de bloqueo.

(5) Reacción de hibridación

Se sintetizó un ADNss con una secuencia de bases complementaria con respecto al ADN de nº. ID de SEC 1 utilizando un sintetizador de ADN automático, y a su terminal 5' se unió rodamina para obtener un ADNss etiquetado. Este ADNss etiquetado se disolvió en una solución tampón de 1 M de NaCl/50 mM de fosfato (pH 7,0) hasta una concentración final de 1 \muM. La matriz posicional de sondas obtenida en el punto (4) se sometió a una reacción de hibridación durante 3 horas. A continuación, la matriz posicional de sondas se lavó con la solución tampón de 1 M de NaCl/50 mM de fosfato (pH 7,0) para eliminar por lavado el ADNss que no se había hibridado con el ácido nucleico sonda. A continuación, los puntos respectivos de la matriz posicional de sondas se observaron utilizando un microscopio fluorescente (Nikon Corp.) y las cantidades de fluorescencia se cuantificaron utilizando el analizador de imágenes (Nombre del producto: ARGUS; Hamamatsu Photonics Co., Ltd.).

(6) Resultados

La intensidad de la fluorescencia de los puntos de la sonda de ADN de nº. ID de SEC 1 adaptado completamente al ADNss etiquetado era 4.600, mientras que la intensidad de la fluorescencia era 2.800 para los puntos de la sonda de ADN de nº. ID de SEC 2 que contenía una base desadaptada. Para los puntos de la sonda de ADN de nº. ID de SEC 3 que tenía 3 bases desadaptadas, la intensidad de la fluorescencia era 2.100, lo cual era menor que la mitad de la correspondiente a la sonda completamente adaptada. Para el ADN de nº. ID de SEC 4 que contenía 6 bases desadaptadas no se observó fluorescencia. El resultado anterior indica que en el sustrato de matriz posicional de ADN se detectó específicamente un ADNss totalmente complementario.

Ejemplo 3 Concentración de la solución de sonda de ADN y propiedades de inyección de los chorros de burbujas (1) Síntesis de la sonda de ADN

Un ADNss de nº. ID de SEC 5 que se muestra posteriormente se sintetizó utilizando un sintetizador de ADN automático y se disolvió en una solución de TE (solución acuosa de 10 mM de Tris-HCl (pH 8)/1 mM de EDTA) hasta concentraciones de aproximadamente 0,2 mg/ml, 2 mg/ml, y 1,5 mg/ml para preparar soluciones de sonda de ADN de 3 concentraciones diferentes (las concentraciones exactas se calcularon a partir de la absorbancia).

Nº. ID de SEC 5:

^{5'}GCCTGATCAGGC^{3'}

(2) Inyección por medio de la impresora BJ

Se preparó una solución acuosa que contenía glicerina al 7,5% en peso, urea al 7,5% en peso, tiodiglicol al 7,5% en peso, y alcohol de acetileno (Nombre del producto: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) que presentaba la anterior fórmula general (I) al 1% en peso, y la misma se añadió a la solución de sonda de 0,2 mg/ml preparada en el punto (1), y se ajustó una concentración final hasta aproximadamente 0,02 mg/ml (3 \muM). Un depósito de tinta de una impresora por chorros de burbujas utilizada en el Ejemplo 1 se llenó con esta solución y el depósito de tinta se montó en un cabezal de chorros de burbujas utilizado en el Ejemplo 1.

Una placa de aluminio de dimensiones A4 se montó en la impresora y el líquido se punteó en un área de 3 x 5 pulgadas cuadradas de la placa de aluminio. La condición del punteado se fijó de manera que se ejecutó el punteado con una densidad de 360 x 720 dpi en el área anterior. En primer lugar, sobre la placa de aluminio se imprimió una tinta comercial correspondiente a la BJ62O como control. Esta operación se ejecutó en un total de 4 placas de aluminio.

La sonda de ácido nucleico punteada en las placas de aluminio respectivas se recuperó utilizando la solución de TE y se purificó a través de un método de filtración de gel. Las cantidades de la sonda de ácido nucleico recuperada y purificada se midieron por absorbancia. La recuperación de la sonda de ácido nucleico obtenida teóricamente se produce de la siguiente manera. Es decir, el volumen de una pequeña gota inyectada desde el cabezal de la impresora utilizada en este ejemplo fue 24 picolitros. A continuación, como se disponía de 4 placas de aluminio en las que se punteó la solución en un área de 3 x 5 pulgadas cuadradas con una densidad de 360 x 720 dpi, se obtuvo la siguiente ecuación:

24 \ (picolitros) \ x \ (720 \ x \ 360) \ x \ (3 \ x \ 5) \ x \ 4 \ placas = 373 \mu l

En la figura 3 se muestran la absorbancia a 260 nm del ácido nucleico sonda para este volumen y la absorbancia a 260 nm de la sonda de ácido nucleico recuperada.

(3) Sobre las soluciones de la sonda se ejecutó la operación idéntica a la descrita en el punto (2) con unas concentraciones de 2 mg/ml y 15 mg/ml. Las concentraciones finales de la sonda de ácido nucleico de los líquidos de inyección respectivos fueron 30 \muM (0,2 mg/ml) y 225 \muM (1,5 mg/ml). En la figura 3 se muestran la absorbencia del ácido nucleico sonda recuperado a partir de las soluciones respectivas y la absorbencia del ácido nucleico sonda en las cantidades obtenidas teóricamente.

(4) Resultados

Tal como se muestra en la figura 3, las cantidades de una sonda de ácido nucleico inyectadas realmente eran parecidas a los valores anticipados teóricamente. A partir de esto, en la inyección de una sonda de ácido nucleico utilizando el método de chorros de burbujas, no se observó ninguna pérdida cuantitativa de la sonda de ácido nucleico debido al quemado y la adherencia de la sonda de ácido nucleico al calentador del cabezal de chorros de burbujas. Durante la etapa de punteado sobre la placa de aluminio utilizando líquidos de varias concentraciones no se produjeron problemas, tales como ausencia de inyección, en el cabezal. Una comparación macroscópica con los puntos de la tinta para una impresora por chorros de burbujas punteados en la placa de aluminio como control y los puntos de la sonda de ácido nucleico mostró que el estado del punteado para los puntos formados utilizando los líquidos a concentraciones de 3 \muM y 30 \muM era similar a la correspondiente al punto de tinta. Los puntos formados utilizando el líquido con una concentración de 225 \muM presentaban ciertos defectos en comparación con el punto de tinta.

Ejemplo 4 Influencia del proceso de chorros de burbujas sobre la sonda de ácido nucleico (1) Síntesis de la sonda de ácido nucleico

Una sonda de ácido nucleico compuesta por ácidos adenílicos de 10 meros (abreviados en lo sucesivo como "A") (Sustancia sintética), oligoA (40-60 meros; Pharmacia Co., Ltd.), y poli(dA) (300-400 meros; Pharmacia Co., Ltd.) se diluyeron respectivamente con una solución de TE para preparar soluciones de las sondas de ácido nucleico de longitudes de base diferentes con una concentración final de 1 mg/ml. A continuación se muestra la secuencia de bases de la sonda de 10 meros (nº. ID de SEC 6):

Nº. ID de SEC 6:

^{5'}AAAAAAAAAA^{3'}

(2) Inyección de la solución de ADN con la impresora por chorros de burbujas

Se preparó una solución acuosa que contenía glicerina al 7,5% en peso, urea al 7,5% en peso, y alcohol de acetileno (Nombre del producto: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) que presentaba la fórmula general (I) al 1% en peso, y las soluciones respectivas de sonda de ácido nucleico preparadas en el punto (1) se diluyeron con esta solución acuosa hasta una concentración final de 0,1 mg/ml.

Tal como en el Ejemplo 3, las soluciones respectivas de sonda de ácido nucleico con las que se llenó un cartucho se inyectaron sobre una placa de aluminio y el estado del punteado se observó macroscópicamente. Como consecuencia, para las sondas de ácido nucleico con longitudes de base de 10 meros y 40-60 meros, las matrices posicionales de sondas tenían puntos independientes dispuestos de forma ordenada en la placa de aluminio. En relación con la sonda de ácido nucleico de 300-400 mer, aunque se obtuvo fundamentalmente una matriz posicional similar, los puntos adyacentes se conectaron en algunas partes. Se considera que esto se produce debido a la dirección de inyección ligeramente imprecisa del cabezal de chorros de burbujas provocada por los cambios de las propiedades físicas atribuibles a una cadena de bases larga de la sonda de ácido nucleico.

Los puntos sobre la matriz posicional de sondas que se prepararon utilizando las soluciones respectivas de sonda de ácido de nucleico se recuperaron tal como se describe en el Ejemplo 3. Una fracción alícuota de 100 \mul de cada solución de sonda de ácido nucleico recuperada se analizó por HPLC de fase inversa, y se observó si las sondas de ácido nucleico se escindieron o no por la inyección en comparación con las soluciones antes de la inyección. Como eluyente para la HPLC de soporte inverso se utilizó un gradiente de 7-70% de acetonitrilo que contenía acetato de trietilamina 1 M. Como consecuencia, no se observó ningún fragmento de ADN debido a la escisión, confirmando que las sondas de ácido nucleico no se desnaturalizaron por la inyección a través del método de chorros de burbujas. Las sondas de ácido nucleico recuperadas se cuantificaron como en el Ejemplo 3 y las sondas de ácido nucleico con 3 longitudes de base diferentes se recuperaron casi con los valores teóricos tal como se muestra en la figura 4.

Ejemplo 5 Investigación del tiempo de reacción

Se prepararon matrices posicionales de sondas tal como en el Ejemplo 1, excepto que la placa de vidrio sometida al tratamiento superficial en la que se puntearon las sondas de ácido nucleico se dejó en una cámara humidificada a temperatura ambiente (25ºC) durante 10 minutos o 90 minutos, o durante la noche en el punto (4) del Ejemplo 1. Las matrices posicionales respectivas se utilizaron para la hibridación. Como consecuencia, las matrices posicionales de sondas que reaccionaron durante 90 minutos o durante la noche presentaban una intensidad de la fluorescencia similar a la mostrada por la matriz posicional de sondas obtenida en el Ejemplo 1. Esto indica que una reacción de unión entre el grupo maleimido sobre la superficie de la placa de vidrio y el grupo tiol del terminal de la sonda de ácido nucleico se completó casi en 30 minutos. No obstante, la matriz posicional de sondas que reaccionó durante 10 minutos presentaba una fluorescencia de aproximadamente el 70% de la correspondiente al Ejemplo 1.

Ejemplo 6 Fabricación de la matriz posicional de sondas de ANP utilizando una impresora por chorros de burbujas y detección del ácido nucleico objetivo utilizando la matriz posicional de sondas (1) Se preparó una placa de vidrio para una matriz posicional de sondas de la misma manera que en los puntos (1) y (2) del Ejemplo 1 (2) Síntesis del ANP sonda

Se prepararon ácidos nucleicos de proteínas (ANP) (Nippon Perceptive Co., Ltd.) con las secuencias de bases de nº. ID de SEC 7 y 8 mostradas a continuación. En los ANP, un residuo de cisteína (expresado como Cis) se unió al terminal N del ANP (correspondiente al terminal 5' del ADN) y, como consecuencia, en el terminal N se introdujo un grupo tiol. La sonda de ANP de nº. ID de SEC 8 se obtuvo cambiando una base de la sonda de ANP de nº. ID de SEC 7.

Nº. ID de SEC 7

^{N}Cis-NH(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-CH_{2}CONH-ACTGGCCGTCGTTTTACA^{C}

Nº. ID de SEC 8

^{N}Cis-NH(CH_{2})_{2}-O-(CH_{2})_{2}-O-CH_{2}CONH-ACTGGCCGTTGTTTTACA^{C}

(3) Inyección y unión de las sondas de ANP al sustrato utilizando una impresora BJ

Las sondas de ANP respectivas se disolvieron en 100 \mul de ácido trifluoroacético al 0,1% en peso hasta una concentración final de 80 \muM. A continuación, a las soluciones de ácido trifluoroacético de los ANP se añadió una solución acuosa que contenía glicerina al 7,5% en peso, urea al 7,5% en peso, tiodiglicol al 7,5% en peso, y alcohol de acetileno (Nombre del producto: Acetylenol EH; Kawaken Fine Chemical Co., Ltd.) que presentaba la anterior fórmula general (I) al 1% en peso para ajustar una concentración final de sonda de ANP a 8 \muM. Estos líquidos tenían una tensión superficial en un intervalo de 30-50 dinas/cm y una viscosidad en un intervalo de 1-5 cps.

Estas soluciones de sonda de ANP se puntearon de una manera similar a la descrita en el punto (3) del Ejemplo 2, sobre las áreas respectivas de la placa de vidrio preparada en el punto (1). Después de finalizar el punteado, la placa de vidrio se dejó permanecer en una cámara húmeda durante 3 horas para hacer reaccionar el grupo maleimido y el grupo tiol. La cantidad de la solución de sonda ANP inyectada por una operación de inyección de la impresora era de aproximadamente 24 pl.

(4) Reacción de bloqueo

Después de finalizar el grupo maleimido y el grupo tiol, la placa de vidrio se lavó con una solución tampón de 1 M de NaCl/ 50 mM de fosfato (pH 7,0) para eliminar completamente por enjuague el líquido que contenía el ANP sobre la superficie de la placa de vidrio. A continuación, la placa de vidrio se sumergió en una solución acuosa de seroalbúmina bovina del 2% y se dejó durante 3 horas para proseguir con una reacción de bloqueo.

(5) Reacción de hibridación

Se sintetizó un ADNss que tenía una secuencia de bases complementaria con respecto al ANP de nº. ID de SEC 7 utilizando un sintetizador de ADN automático, y a su terminal 5' se unió rodamina para obtener un ADNss etiquetado. Este ADNss etiquetado se disolvió en una solución tampón de 10 mM de fosfato (pH 7,0) hasta una concentración final de 5 nM (volumen de solución de 1 ml). La matriz posicional de sondas de ANP sometida al tratamiento de bloqueo en el anterior punto (4) se sumergió en esta solución a temperatura ambiente (25ºC) durante 12 horas para proseguir con una reacción de hibridación. A continuación, la matriz posicional de sondas se lavó con una solución tampón de 10 mM de fosfato (pH 7,0) para eliminar por lavado el ADNss que no se había hibridado con la sonda de ANP. A continuación, la magnitud de la fluorescencia de los puntos de la matriz posicional de sondas se cuantificó utilizando el analizador de imágenes (Nombre del producto: ARGUS; Hamamatsu Photonics Co., Ltd.).

(6) Resultados

La intensidad de la fluorescencia de cada punto de la sonda de ANP de nº. ID de SEC 7 adaptado completamente al ADNss etiquetado era 2.400, mientras que era 1.100, aproximadamente la mitad, para la sonda de ANP de nº. ID de SEC 8 que contenía una base desadaptada. A partir de esto, el ADNss totalmente complementario se detectó específicamente sobre la matriz posicional de ANP.

Después de la hibridación, se observó la matriz posicional de sondas, en la que cada punto emite fluorescencia, con un microscopio fluorescente (Nikon Corp.). Como consecuencia, en la matriz posicional de sondas de este ejemplo, se indicaba que

(a) Cada punto era casi redondo y tenía un diámetro comprendido en un intervalo de aproximadamente 200 \mum;

(b) Había espacios distintos de aproximadamente 50 \mum, entre puntos adyacentes, de manera que cada punto era claramente independiente;

(c) Las columnas y filas de los puntos se dispusieron en líneas.

Además, como no es necesario que una solución utilizada en la reacción de hibridación y la subsiguiente eliminación del ADNss que no ha reaccionado contenga cloruro de sodio, no se requiere prestar atención a la deposición de cloruro de sodio durante la observación de la fluorescencia. Como consecuencia, la detección de híbridos en una matriz posicional de sondas se podría detectar más fácilmente. Además, no es necesario realizar un cierre hermético ajustado durante el almacenamiento y la manipulación es más sencilla.

No se ha clarificado una razón por la que un diámetro de los puntos de la sonda de ANP es mayor que el del punto de la matriz posicional de sondas obtenida en el Ejemplo 1. No obstante, los presentes inventores descubrieron que las sondas de ANP presentaban una solubilidad en agua ligeramente inferior en comparación con las sondas de ADN. De este modo se acepta que los diámetros de los puntos eran diferentes debido a que la diferencia en la solubilidad en agua provoca una diferencia en la tensión superficial de los respectivos líquidos de inyección de chorros de tinta.

Ejemplo 7 Preparación y evaluación del sustrato de vidrio con una matriz negra utilizada para la matriz posicional de sondas que tiene grupos epoxi introducidos en su superficie

(1) Un sustrato de vidrio (50 mm x 50 mm) que constaba de cuarzo sintético se sometió a una limpieza ultrasónica con una solución acuosa de hidróxido de sodio al 2% en peso y a una ozonización de UV para la limpieza superficial. Una solución acuosa de metanol al 50% en peso que contenía un 1% en peso de agente de acoplamiento de silano (Nombre del producto: KBM403, de Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), el cual contiene un compuesto de silano que tiene un grupo epoxi (\gamma-glicidoxipropiltrimetoxisilano), se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas de manera que se hidrolizaron los grupos metoxi del anterior compuesto de silano. A continuación la solución se aplicó a la superficie del anterior sustrato con un dispositivo de recubrimiento por centrifugación, se calentó a 100º durante 5 minutos, y se secó para introducir grupos epoxi en la superficie del sustrato.

(2) A continuación la capa protectora DEEP-UV (capa protectora de tipo negativo para la matriz negra) (Nombre del producto: BK-739P, de Nippon Steel Chemical Co., Ltd.) que contenía negro de carbón se aplicó al anterior sustrato con un dispositivo de recubrimiento por centrifugación para producir un grosor pelicular de 5 \mum después de la fijación, y el sustrato se calentó a 80º durante 5 minutos utilizando una placa caliente para la fijación de la película. Un área de 1 cm x 1 cm del sustrato se sometió a una exposición de proximidad utilizando una máscara en la que se formó un patrón tal que la distancia (X) entre las cavidades adyacentes en la figura 5 sería 100 \mum y la geometría de las cavidades sería un cuadrado de 100 \mum x 100 \mum, y el sustrato se reveló en una solución de revelado alcalina inorgánica utilizando un instrumento de revelado giratorio, a continuación se lavó con agua destilada para eliminar completamente la solución de revelado. A continuación el sustrato se secó someramente utilizando una secadora-centrifugadora y se calentó a 180ºC durante 30 minutos en un horno limpio para que su capa protectora quedara totalmente fijada; de este modo, se obtuvo un sustrato que tenía 2500 cavidades dispuestas en una disposición preestablecida en la que las cavidades adyacentes están aisladas entre sí por la matriz negra. En este caso el volumen calculado de cada cavidad era 50 picolitros (pl).

Llegado este punto, resultaba difícil humedecer la superficie de la matriz negra ya que su ángulo de contacto con el agua era 93º, y resultaba fácil humedecer la superficie inferior de las cavidades ya que su ángulo de contacto con el agua era 35º.

(3) Un depósito de tinta correspondiente a una impresora de chorros de burbujas (Nombre del producto: BJC62O, de Canon Inc.) se llenó con una solución acuosa de Rodamina B 10 \muM y el depósito de tinta se encajó en el cabezal de chorros de burbujas de la impresora de chorros de burbujas utilizada en el Ejemplo 1 descrito anteriormente. Y los soportes sólidos preparados en la anterior descripción (1) y (2) se fijaron en la impresora y a las cavidades de cada soporte sólido se les suministró Rodamina B para confeccionar un patrón a cuadros. En este caso el suministro de Rodamina B por cavidad era aproximadamente 50 pl, y la precisión de posicionamiento de la distribución de esta impresora era \pm2,5 \mum. A continuación otro depósito de tinta se llenó con una solución acuosa de amino-FITC 10 \muM, el depósito de tinta se encajó en el cabezal de chorros de burbujas de la anterior impresora, y la solución se suministró a aquellas cavidades adyacentes a las cavidades a las que ya se les había suministrado Rodamina B. La razón de utilizar Rodamina B y amino-FITC es que son solubles en agua, son fáciles de distribuir desde un cabezal de chorros de tinta, y que la observación de su fluorescencia permite comprobar las condiciones y la contaminación cruzada de la solución suministrada a las cavidades.

(4) Un filtro de excitación G (para la rodamina B) y un filtro de excitación B (para el amino-FITC) se fijaron en un microscopio de fluorescencia (de Nikon Corporation), y se observaron las condiciones de cada solución suministrada a las cavidades a partir de su fluorescencia con un aumento de x 100. Los resultados mostraron que cada solución se suministró a las cavidades uniformemente sin formar ninguna gota. Además, no se observó en ninguna cavidad una fluorescencia de pigmento de otras cavidades, es decir, no se observó contaminación cruzada.

Ejemplo 8 Preparación de la matriz posicional de sondas utilizando el sustrato del ejemplo 7 y detección del ácido nucleico objetivo en la misma

(1) Se preparó un sustrato con una BM de la misma manera que en el ejemplo 7.

(2) Como sondas de ADN, se prepararon tres oligonucleótidos, es decir, un oligonucleótido de 18 meros cuyo grupo hidroxilo del terminal 5' estaba unido a un grupo amino a través de un grupo fosfato y un hexametileno (nº. ID de SEC 9), una sonda diferente al oligómero de nº. ID de SEC 9 en un único nucleótido (nº. ID de SEC 10), y una sonda diferente al oligómero de nº. ID de SEC 9 en dos nucleótidos (nº. ID de SEC 11) (todos ellos son de calidad HPLC, de Nippon Flour Mills Co., Ltd.). La secuencia de bases del oligómero de nº. ID de SEC 9 era complementaria con respecto a la de una parte del sitio de clonación múltiple del ADN M13mp18-ss, el cual es un ADNss. A continuación se muestran la secuencia de bases y la estructura de unión de las sondas de ADN de Nº. ID de SEC 9-11.

Nº. ID de SEC 9

^{5'}NH_{2}-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-TGTAAAACGACGGCCAGT^{3'}

Nº. ID de SEC 10

^{5'}NH_{2}-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-TGTAAAACCACGGCCAGT^{3'}

Nº. ID de SEC 11

^{5'}NH_{2}-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-TGTATAACCACGCCCAGT^{3'}

(3) Se sintetizaron ADN monocatenarios cada uno de los cuales era totalmente complementario con respecto a cada una de las sondas de ADN de nº. ID de SEC 9-11. A continuación cada sonda de ADN y cada ADNss se disolvieron independientemente en una solución de TE (pH 8) cuya concentración de NaCl era 50 mM para producir una concentración final de 100 \muM; de este modo, se prepararon soluciones de sonda de ADN y soluciones de ADNss complementarias. 100 \mul de cada solución de sonda de ADN se añadieron y se mezclaron con 100 \mul de la solución correspondiente de ADNss complementaria, y cada mezcla se calentó a 90ºC, y a continuación se enfrió a 25º durante 2 horas para provocar la hibridación de la sonda de ADN y el ADNss. Cada una de las soluciones que contenía un híbrido de cada una de las sondas de ADN de nº. ID de SEC 9-11 se añadió a la solución acuosa que contenía un 7,5% en peso de glicerol, un 7,5% en peso de urea, un 7,5% en peso de tiodiglicol y un 1% en peso de alcohol de acetileno representado por la anterior fórmula general (1) (nombre del producto: Acetylenol EH, de Kawaken Fine Chemical, Co., Ltd.) hasta una concentración híbrida final de 8 \muM. La tensión superficial de cada solución que contenía un híbrido de cada sonda de ADN está comprendida en el intervalo de 30 a 50 dinas/cm, y la viscosidad en el intervalo de 1 a 5 cps (viscosímetro de tipo E, de Tokyo Keiki, Co., Ltd.).

A continuación se prepararon tres depósitos de tinta para una impresora de chorros de burbujas (nombre del producto: BJC62O, de Canon Inc.), y cada depósito de tinta se llenó con cada una de las tres soluciones híbridas diferentes mencionadas y se encajó en el cabezal de la impresora de chorros de burbujas utilizada en el ejemplo 1. El sustrato de vidrio con una matriz negra (BM) preparado en la anterior descripción (1) y (2) se fijó también en la impresora, y la solución que contenía el híbrido de la sonda de ADN de nº. ID de SEC 9 se suministró en primer lugar a la primera columna de las cavidades ((131) en la figura 6). A continuación la solución que contenía el híbrido de la sonda de ADN de nº. ID de SEC 10 se suministró a la segunda columna de las cavidades ((133) en la figura 6) que eran adyacentes a las de la primera columna, y además la solución que contenía el híbrido de la sonda de ADN de nº. ID de SEC 11 se suministró a la tercera columna de las cavidades ((135) en la figura 6) que eran adyacentes a la de la segunda columna. A cada cavidad se le suministraron cuatro expulsiones de cada solución híbrida para hacer que la cantidad final de la solución por cavidad fuera de aproximadamente 100 pl. Esta cantidad era aproximadamente 2 veces el volumen de cada cavidad; no obstante, la observación microscópica de las cavidades reveló que, aunque la solución híbrida suministrada se elevaba por encima de la superficie más que la abertura de las cavidades, permanecía en las cavidades debido a la matriz hidrófoba, y no se observó contaminación cruzada entre las cavidades.

A continuación el sustrato se situó en un termohigrostato cuyas temperatura y humedad eran, respectivamente, 25º y 100%, para hacer reaccionar grupos amino de las sondas con grupos epoxi de las cavidades. Dado que los grupos amino en las bases de las sondas hibridaron con ADNss totalmente complementarios con respecto a los mismos, no reaccionarían con grupos epoxi de las cavidades.

(4) A continuación el sustrato se lavó con agua pura a 80ºC durante 10 minutos para disociar las cadenas complementarias de las sondas unidas al sustrato y eliminarlas por lavado. Después de esto, el sustrato se trató con una solución acuosa de etanolamina al 1% a temperatura ambiente durante 1 hora para abrir los anillos de los grupos epoxi de cada cavidad que no habían reaccionado. A continuación el sustrato se lavó con agua pura y se secó.

La operación de la anterior descripción (4) permite abrir los anillos de los grupos epoxi que no han reaccionado con las sondas de ADN en las cavidades para proporcionar grupos hidroxilo, y la etanolamina que ha reaccionado también tiene un grupo hidroxilo; por esta razón, la hidrofilidad de la superficie inferior de las cavidades aumenta, lo cual es ventajoso cuando a las cavidades se les suministra una solución que contiene ADNss objetivo.

(5) Unos ADN monocatenarios totalmente complementarios con respecto a la sonda de ADN de nº. ID de SEC 9 se disolvieron en la solución de TE (pH 8) cuya concentración de NaCl era 50 mM para producir una concentración final de 10 \muM, y después de que la matriz posicional de sondas de las cavidades obtenidas en la descripción anterior (4) en las que se introdujeron grupos epoxi se sumergieran en la solución, la temperatura de la mezcla disminuyó de 80ºC a 25ºC durante dos horas para provocar una reacción de hibridación. Después de esto, el sustrato se lavó a 20ºC durante 20 minutos con una solución tampón de TE (pH 8) cuya concentración de NaCl era 10 mM, y la solución de lavado que quedaba en la superficie del sustrato se eliminó con una secadora-centrifugadora.

(6) Se disolvió yoduro de 2-metil-4,6-bis(4-N,N-dimetilaminofenil)pirilio (al que en lo sucesivo se hará referencia como P2), que no emite luz fluorescente hasta que se intercala en un ácido nucleico bicatenario, en una solución de TE (pH 8,0) cuya concentración de NaCl era 50 mM para producir una concentración final de 10 \muM. El depósito de tinta de la anterior impresora de chorros de tinta se llenó con esta solución y dicho depósito se encajó en el cabezal de dicha impresora de chorros de tinta. El sustrato sometido a hibridación en la anterior descripción (5) se fijó también en la impresora mencionada y a cada cavidad del sustrato se le suministraron 100 pl de solución de P2. Después de esto, se dejó el sustrato reposando en una cámara especial cuya humedad era del 100% durante 5 minutos para evitar que se secara, mientras se observó y se determinó cuantitativamente su fluorescencia utilizando un microscopio invertido (nombre del producto: IMT2, de Olympus Optical Co., Ltd.) aumento: x 100, utilizando un cubo de filtros para un microscopio de fluorescencia, un filtro de excitación de 455 nm a 595 nm (pasante), un espejo dicroico de 620 nm, un filtro barrera para fluorescencia de 610 nm a 725 nm (pasante) con una cámara ICCD (nombre del producto: C2400-87, de Hamamatsu Photonics Co., Ltd) y un procesador de imágenes (nombre del producto: ARGUS 50, de Hamamatsu Photonics Co., Ltd) conectado a la misma. El área de observación se fijó a 25 \mum x 25 \mum y la integración x 64, y el nivel de amplificación del ARGUS 50 se fijó adecuadamente.

Como consecuencia, a partir de las cavidades a las que se unió la sonda de ADN de nº. ID de SEC 11 se observó una intensidad de fluorescencia de entre 1200 y 1500 que era casi igual a la del fondo, mientras que a partir de las cavidades que tenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 9 se observó una intensidad de fluorescencia de entre 9800 y 10300 y a partir de las cavidades que tenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 10 se observó una intensidad de fluorescencia de entre 3500 y 3900. Se realizó nuevamente una medición de la intensidad de la fluorescencia después de que cada soporte sólido se lavara a 35ºC durante 10 minutos con una solución tampón de TE, y la intensidad de fluorescencia de las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 10 disminuyó hasta el nivel de fondo.

Estos resultados muestran que la utilización de la matriz posicional de sondas según la presente invención permite conseguir una reacción de hibridación en cada cavidad, además de detectar específicamente el ácido nucleico objetivo que es totalmente complementario con respecto a la sonda de ADN de nº. ID de SEC 9.

Ejemplo 9 Suministro selectivo de reactantes a cada cavidad de la matriz posicional de sondas del ejemplo 8 y reacción de los mismos con la sonda

(1) Se preparó un sustrato que contenía sondas de ADN inmovilizadas de nº. ID de SEC 9-11 de la misma manera que en el ejemplo 8.

(2) Se sintetizaron tres tipos de ADNss, cada uno de los cuales era totalmente complementario con respecto a una de las sondas de ADN de nº. ID de SEC 9-11. Cada ADNss se disolvió en una solución tampón de TE (pH 8) que contenía 50 mM de NaCl, hasta una concentración final de 100 \muM. Se prepararon tres depósitos de tinta para una impresora de chorros de burbujas (nombre del producto: BJC62O, de Canon Inc.), y los tres depósitos se llenaron respectivamente con las anteriores soluciones de ADNss y se encajaron en el cabezal de la impresora de chorros de burbujas utilizada en el ejemplo 1. El sustrato preparado en la anterior descripción (1) se fijó también en la impresora, y en cada cavidad en la que se inmovilizó una de las sondas de ADN de nº. ID de SEC 9-11 se suministraron 100 pl/cavidad de la solución que contenía el ADNss complementario correspondiente. En este momento, a partir de la observación microscópica de las condiciones de las cavidades, no se observó ninguna filtración o contaminación cruzada de la solución, mostrando que a las cavidades de la matriz posicional de sondas se les pueden suministrar independientemente múltiples soluciones de reacción.

(3) Después de que se llevara a cabo la reacción de hibridación en cada cavidad de la misma manera que en el ejemplo 8, a cada cavidad se le suministró una solución de P2 de la misma manera que en el ejemplo 8 para detectar el híbrido formado por la observación de fluorescencia. Como consecuencia, en cada cavidad se observó una intensidad de fluorescencia de 9800-10300. A partir del resultado se confirmó que el reactante se puede suministrar independientemente a cada cavidad de la matriz posicional de sondas, el reactante puede reaccionar con la sonda en cada cavidad, y que se puede detectar el producto resultante de la reacción.

Ejemplo 10 Tratamiento para proporcionar hidrofilidad a la superficie inferior de las cavidades del sustrato del ejemplo 7

(1) Se preparó un sustrato de vidrio con un patrón de matriz negra de la misma manera que en el ejemplo 7.

(2) La superficie del sustrato en la que se formó una matriz negra se sometió a ozonización UV. En este momento, el ángulo de contacto de la superficie de la matriz negra con respecto al agua era 93º, lo cual significa que la superficie de la matriz negra era hidrorrepelente, y el ángulo de contacto de la superficie inferior de las cavidades con respecto al agua era 22º, lo cual significa que la superficie inferior de las cavidades era hidrófila en comparación con la superficie inferior no tratada de las cavidades del sustrato preparado en el ejemplo 7. Esto se puede atribuir al efecto de la ozonización UV descrita anteriormente.

(3) A continuación hacia las cavidades se alimentaron soluciones acuosas de Rodamina B y amino-FITC, exactamente como en el ejemplo 7, desde una impresora de chorros de tinta, y se observaron las condiciones en las cavidades. La observación demostró que cada solución acuosa se dispersaba uniformemente sin formar una gota dentro de las cavidades. Cuando como soporte sólido de una matriz posicional de sondas se utiliza un soporte sólido que tiene cavidades en su superficie, no es necesario mantener la solución inyectada desde una impresora de chorros de tinta en una posición muy definida sobre la superficie del soporte, y es preferible una dispersión total de la solución inyectada sobre la superficie inferior de la cavidad para la detección subsiguiente de la reacción entre una sonda y una sustancia objetivo. El tratamiento para hacer que la superficie inferior de la cavidad sea hidrófila, lo cual se describió en este ejemplo, es una realización preferente de la presente invención. Además, en cada cavidad se encontró solamente el pigmento esperado, demostrando que, con este proceso de chorros de tinta, cada solución de pigmento acuosa se puede suministrar a cada cavidad sin provocar ninguna contaminación cruzada.

Ejemplo 11 Proceso para preparar una matriz posicional de sondas utilizando un soporte sólido que contiene grupos funcionales para la inmovilización de las sondas introducidas al suministrar solución a través de un método de chorros de tinta en cada cavidad en una matriz negra y su utilización

(1) Se preparó un sustrato con una matriz negra de la misma manera que en el ejemplo 7.

(2) Un agente de acoplamiento de silano (nombre del producto: KBM603, de Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) que contenía un compuesto de silano al que estaba unido un grupo amino (N-\beta-(aminoetil)-\gamma-aminopropiltrimetoxisilano) se disolvió en una solución acuosa de metanol al 10% en peso hasta la concentración del 1% en peso, y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas para hidrolizar grupos metoxi del compuesto de silano mencionado. A continuación, un depósito de tinta de una impresora de chorros de burbujas (nombre del producto: BJC62O, de Canon Inc.) se llenó con esta solución, y el depósito se encajó en el cabezal de la impresora de chorros de burbujas utilizada en el ejemplo 1. El sustrato preparado en la anterior descripción (1) se fijó también en la impresora, y la solución del agente de acoplamiento de silano, que contenía un compuesto de silano cuyos grupos metoxi ya habían sido hidrolizados, se suministró a cada cavidad del sustrato de la misma manera que en el ejemplo 8. Después de dejarlo reposar en un termohigrostato cuya temperatura y humedad eran, respectivamente, 25ºC y 100%, durante 30 minutos, el sustrato se lavó con agua destilada, se secó por centrifugado, y se coció a 100ºC durante 30 minutos para introducir grupos amino en la superficie inferior de las cavidades.

(3) A continuación se disolvió succiimidil-4-(maleimidofenil)butilato (de Aldrich Co., Ltd.) en una solución de DMSO al 5% en peso para producir una concentración final del 5% en peso, y 100 pl de esta solución se suministraron a cada cavidad utilizando una impresora de chorros de tinta de la misma manera que la anterior descripción (2), después de lo cual, se dejó al sustrato reposar en un termohigrostato cuya temperatura y humedad eran, respectivamente, 30ºC y 100%, durante 2 horas. A continuación el sustrato se lavó con agua destilada, y se secó por centrifugado. De este modo se introdujeron grupos maleimido en la superficie inferior de las cavidades.

(4) Como sondas de ADN, se prepararon tres oligonucleótidos, es decir, un oligonucleótido de 18 meros cuyo grupo hidroxilo del terminal 5' estaba unido a un grupo tiol a través de un grupo fosfato y hexametileno (nº. ID de SEC 12), una sonda diferente al oligómero de nº. ID de SEC 12 en un único nucleótido (nº. ID de SEC 13), y una sonda diferente al oligómero de nº. ID de SEC 12 en dos nucleótidos (nº. ID de SEC 14) (todos ellos son de calidad HPLC, de Nippon Flour Mills Co., Ltd.). A continuación se muestran la secuencia de bases y la estructura de unión de las sondas de ADN de nº. ID de SEC 12-14.

Nº. ID de SEC 12

^{5'}HS-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-TGTAAAACGACGGCCAGT^{3'}

Nº. ID de SEC 13

^{5'}HS-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-TGTAAAAC\underline{C}ACGGCCAGT^{3'}

Nº. ID de SEC 14

^{5'}HS-(CH_{2})_{6}-O-PO_{2}-O-TGTA\underline{T}AACCACG\underline{C}CCAGT^{3'}

(5) Cada una de las sondas de ADN mencionadas de nº. ID de SEC 12-14 se disolvieron en una solución tampón de fosfato 10 mM para producir una concentración final de 100 \muM, y cada solución de sonda de ADN se suministró a las cavidades del sustrato preparado en la anterior descripción (3) de la misma manera que en el ejemplo 8 descrito anteriormente. Una observación microscópica de cada cavidad demostró que la solución de sonda de ADN suministrada estaba elevada por encima de la superficie de la abertura de la cavidad, aunque permanecía en las cavidades debido a la matriz hidrófila, y no se observó contaminación cruzada entre cavidades. Después de que el sustrato se dejó reposar durante 2 horas en un termohigrostato cuya temperatura y humedad eran, respectivamente, 30ºC y 100%, se lavó con agua destilada, se secó por centrifugado para permitir que grupos tiol de cada sonda de ADN reaccionaran con grupos maleimido de cada cavidad para unir las sondas de ADN al sustrato.

(6) Se sintetizaron ADN monocatenarios que eran totalmente complementarios con respecto a la sonda de ADN de nº. ID de SEC 12. A continuación los ADNss se disolvieron independientemente en una solución de TE cuya concentración de NaCl era de 50 mM para producir una concentración final de 10 \muM. El sustrato unido con la sonda de ADN obtenida en la anterior descripción (5) se sumergió en esta solución, y su temperatura se redujo de 80ºC a 25ºC durante 2 horas para provocar una hibridación. A continuación, el sustrato se lavó a 20ºC durante 20 minutos utilizando una solución de TE (pH 8) cuya concentración de NaCl era 10 mM, y la solución de lavado que quedaba en la superficie del sustrato se eliminó con una secadora-centrifugadora.

(7) Un reactivo YOYO-1, que emite luz fluorescente cuando se intercala en un híbrido, se disolvió en una solución de TE cuya concentración de NaCl era de 50 mM para producir una concentración final de 10 \muM (pH 8). A cada cavidad que había sido sometida al tratamiento en la anterior descripción (6) se le suministraron 100 pl de esta solución, de la misma manera que la anterior descripción (2) utilizando una impresora de chorros de tinta, y se observó y se determinó cuantitativamente la fluorescencia de la misma manera que en el ejemplo 8 (utilizando un filtro de excitación B). En este caso el nivel de amplificación de la señal del ARGUS 50 era el mismo que en el ejemplo 8.

Como consecuencia, en las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 14 se observó una intensidad de fluorescencia de entre 1800 y 2000 que era casi igual a la del fondo, mientras que en las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 12 se observó una intensidad fluorescente de entre 7500 y 8000, y en las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 13 se observó una intensidad fluorescente de entre 3100 y 3300. Después de que el soporte sólido se lavara a 35ºC durante 10 minutos con una solución tampón de TE, se realizó nuevamente una medición de la intensidad fluorescente de cada cavidad, y la intensidad fluorescente de las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 13 disminuyó hasta el nivel de fondo.

Estos resultados muestran que la utilización de una matriz posicional de sondas según la presente invención permite conseguir una reacción de hibridación en cada cavidad, además de detectar específicamente el ácido nucleico objetivo que es totalmente complementario con respecto a la sonda de ADN de nº. ID de SEC 9.

Ejemplo 12

(1) Se preparó un sustrato al que estaban unidas las sondas de ADN de nº. ID de SEC 12-14 de la misma manera que en el ejemplo 11.

(2) Se sintetizaron tres ADNss complementarios con respecto a las sondas de ADN de nº. ID de SEC 12-14. A continuación cada sonda de ADN se disolvió en una solución tampón de TE cuya concentración de NaCl era 50 mM para producir una concentración final de 10 \muM. En este caso el valor pH de cada solución de ADNss era 8. Se prepararon tres depósitos de tinta para una impresora de chorros de burbujas (nombre del producto: BJC62O, de Canon Inc.), y los tres depósitos de tinta se llenaron respectivamente con las anteriores tres soluciones de ADNss mencionadas y se encajaron en el cabezal de la impresora de chorros de burbujas utilizada en el ejemplo 1. El sustrato preparado en la anterior descripción (1) se fijó también en la impresora, y a cada cavidad en la que se fijó una de las sondas de ADNss de nº. ID de SEC 12-14, se le suministraron 100 pl/cavidad de una solución que contenía el ADNss complementario correspondiente. Llegado este momento a partir de una observación microscópica de las condiciones de las cavidades, no se observó ninguna filtración o contaminación cruzada de la solución, mostrando que es posible suministrar la solución de las sustancias para que reaccionen independientemente en cada cavidad de la matriz posicional de sondas.

(3) Después de que se llevara a cabo la reacción de hibridación en cada cavidad de la misma manera que en el ejemplo 11, a cada cavidad se le suministró una solución de YOYO-1 de la misma manera que en el ejemplo 11 para detectar la formación de híbridos observando su fluorescencia. Como consecuencia, en cada cavidad se observó una intensidad fluorescente de 7500-8000. A partir de este resultado se confirmó que el reactante se podría suministrar independientemente a cada cavidad de la matriz posicional de sondas del soporte sólido y podría reaccionar con la sonda en cada cavidad, y que se podría detectar el producto resultante de la reacción.

Ejemplo 13 Proceso para preparar una matriz posicional de sondas utilizando un sustrato dotado de cavidades que tienen grupos epoxi introducidos al sumergir el sustrato después de la formación de una BM en una solución para la introducción de los grupos epoxi

(1) Se preparó un sustrato dotado de una matriz negra según la descripción (2) del ejemplo 7.

(2) De la misma manera que en el punto (1) del ejemplo 7, una solución acuosa al 1% en peso de un agente de acoplamiento de silano (nombre del producto: KBM403, de Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), el cual contenía un compuesto de silano que tiene un grupo epoxi (\gamma-glicidoxipropiltrimetoxisilano), se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para hidrolizar grupos metoxi de la molécula del compuesto de silano. A continuación el soporte sólido preparado en la anterior descripción (1) se sumergió en esta solución a temperatura ambiente durante 30 minutos y se lavó con agua destilada, y después de eliminar el agua que quedaba mediante un flujo de gas nitrógeno, se coció a 120ºC durante 5 minutos para introducir grupos epoxi en la superficie inferior de las cavidades. Llegado este momento, la superficie de la matriz negra era hidrorrepelente, ya que su ángulo de contacto con el agua era 95º, y la parte inferior de las cavidades era hidrófila, ya que su ángulo de contacto con el agua era 33º. De este modo, se posibilita también la introducción de grupos epoxi en la superficie inferior de las cavidades tratando con un agente de acoplamiento de silano el soporte sólido con la BM formada.

(3) Según los procedimientos descritos en los puntos (3) y (4) del ejemplo 8, las sondas de ADN de nº. ID de SEC 9-10 se unieron a la superficie inferior de las cavidades.

(4) Se sintetizó ADN monocatenario complementario con respecto a la sonda de ADN de nº. ID de SEC 9 en un sintetizador de ADN automático, se unió tetrametilrodamina a través de un elemento de enlace de hexanolamina en el terminal 5' de la misma para obtener un ADNss etiquetado. A continuación el ADNss etiquetado se disolvió en una solución tampón de TE (pH 8) cuya concentración de NaCl era de 50 mM para producir una concentración final de 2 \muM. Subsiguientemente, el sustrato unido con las sondas de ADN y preparado en el anterior procedimiento (3) se sumergió en esta solución, y la temperatura de la solución se redujo de 80ºC a 25ºC durante 2 horas para provocar una reacción de hibridación. Después de esto, la matriz posicional de sondas se lavó a 29ºC durante 20 minutos utilizando una solución tampón de NaCl/Te 10 mM (pH 8) para eliminar por lavado el ADNss etiquetado libre.

A continuación se determinó cuantitativamente la intensidad fluorescente en cada cavidad de la misma manera que en el ejemplo 8.

(5) Resultados

En las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 9 se observó una intensidad fluorescente de 8500-9400, lo cual era una coincidencia perfecta de los ADNss etiquetados. En las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 10 se observó una intensidad fluorescente de 2800-3400, mientras que en las cavidades unidas con las sondas de ADN de nº. ID de SEC 11 se observó una intensidad fluorescente de un valor tan bajo como 1200-1500. Después de que la anterior matriz posicional de sondas se lavara a 35ºC durante 10 minutos utilizando una solución tampón de NaCl/Te 10 mM (pH 8), la intensidad fluorescente observada en las cavidades que contenían la sonda de ADN de nº. ID de SEC 10 disminuyó hasta el nivel del fondo. De este modo, es evidente que la utilización de una matriz posicional de sondas según la presente invención posibilita la detección específica de sustancias híbridas objetivo.

Según la presente invención, tal como se ha descrito anteriormente, una solución que contiene una sonda se puede puntear en un soporte sólido sin dañar la sonda o sin provocar puntos satélite por medio del método de chorros de tinta. La utilización de este método permite fabricar eficazmente una matriz posicional de sondas de alta calidad que comprende puntos sonda dispuestos independientemente con una densidad elevada.

Según la presente invención, se obtiene también una matriz posicional de sondas para obtener más información sobre una sustancia objetivo de forma más precisa incluso a partir de una cantidad pequeña de una muestra. Además, utilizando la matriz posicional de sondas se puede determinar de forma más precisa y más rápida la presencia/ausencia de una sustancia objetivo en una muestra. De forma similar, utilizando la matriz posicional de sondas se puede identificar de forma más precisa y más rápida la estructura de una sustancia objetivo en una muestra.

Según la presente invención, utilizando un soporte sólido que tiene cavidades sobre la superficie del soporte sólido se pueden establecer también ciertos grados de posicionamiento desviado durante el suministro de por lo menos una de entre una solución de sonda y una solución de muestra en un soporte sólido. Proporcionando una matriz con varias funciones se puede conseguir un aumento adicional de la precisión en la detección de una sustancia objetivo y la identificación de su estructura.

Nº. ID de SEC: 1

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo tiol unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

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ACTGGCCGTCGTTTTACA

\hfill

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Nº. ID de SEC: 2

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo tiol unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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ACTGGCCGTTGTTTTACA

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Nº. ID de SEC: 3

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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ACTGGCCGCTTTTTTACA

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Nº. ID de SEC: 4

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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ACTGGCATCTTGTTTACA

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Nº. ID de SEC: 5

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 12

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCCTGATCAGGC

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\newpage

Nº. ID de SEC: 6

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 10

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAAAAAAAAA

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Nº. ID de SEC: 7

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ANP sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Residuo de cisteína unido al terminal N'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

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ACTGGCCGTCGTTTTACA

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Nº. ID de SEC: 8

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ANP sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Residuo de cisteína unido al terminal N'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

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ACTGGCCGTTGTTTTACA

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Nº. ID de SEC: 9

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ANP sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo amino unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

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TGTAAAACGACGGCCAGT

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Nº. ID de SEC: 10

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo amino unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

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TGTAAAACCACGGCCAGT

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\newpage

Nº. ID de SEC: 11

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo amino unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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TGTATAACCACGCCCAGT

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Nº. ID de SEC: 12

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo tiol unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

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TGTAAAACGACGCCCAGT

\hfill

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Nº. ID de SEC: 13

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LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo tiol unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGTAAAACCACGGCCAGT

\hfill

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Nº. ID de SEC: 14

\vskip1.000000\baselineskip

LONGITUD DE LA SECUENCIA: 18

TIPO DE SECUENCIA: Ácido nucleico

TIPO DE CADENA: Simple

TOPOLOGÍA: Lineal

TIPO MOLECULAR: Otro ácido nucleico: ADN sintético

INFORMACIÓN ADICIONAL: Grupo tiol unido al terminal 5'

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGTATAACCACGCCCAGT

\hfill

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Claims

1. Método para la fabricación de una matriz posicional de sondas que tiene una pluralidad de puntos dispuestos independientemente en una pluralidad de posiciones sobre una superficie de un soporte sólido, conteniendo los puntos una sonda que se puede unir específicamente a una sustancia objetivo que comprende una etapa de suministro de un líquido que contiene la sonda y la fijación del líquido a una posición predeterminada sobre la superficie del soporte sólido por medio de un método de chorros de tinta para formar los puntos;

caracterizado porque el método de chorros de tinta es un método de chorros de burbujas.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que la sonda es una sonda de ácido nucleico monocatenario.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que la sonda de ácido nucleico monocatenario es una sonda de ADN monocatenario.

4. Método, según la reivindicación 2, en el que la sonda de ácido nucleico monocatenario es una sonda de ARN.

5. Método, según la reivindicación 2, en el que la sonda de ácido nucleico monocatenario es una sonda de ANP monocatenario.

6. Método, según la reivindicación 2, en el que la superficie de la superficie sólida tiene un primer grupo funcional y la sonda de ácido nucleico monocatenario tiene un segundo grupo funcional, y el primer y el segundo grupos funcionales reaccionan entre sí por contacto.

7. Método, según la reivindicación 6, en el que el primer grupo funcional en la superficie del soporte sólido es un grupo maleimido y el segundo grupo funcional de la sonda de ácido nucleico monocatenario es un grupo tiol (SH).

8. Método, según la reivindicación 7, en el que el soporte sólido es una placa de vidrio y se introduce un grupo maleimido introduciendo un grupo amino en la superficie de la placa de vidrio y a continuación haciendo reaccionar el grupo amino con N-(6-maleimidocaproiloxi) succinimida.

9. Método, según la reivindicación 7, en el que el soporte sólido es una placa de vidrio y el grupo maleimido se introduce introduciendo un grupo amino en la superficie de la placa de vidrio y a continuación haciendo reaccionar el grupo amino con succinimidil-4-(maleimido fenil) butirato.

10. Método, según la reivindicación 7, en el que el grupo maleimido se hace reaccionar con el grupo tiol durante por lo menos 30 minutos.

11. Método, según la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico monocatenario es una sonda de ANP monocatenario, en cuyo terminal existe el grupo tiol, el grupo maleimido se hace reaccionar con el grupo tiol durante por lo menos 2 horas.

12. Método, según la reivindicación 11, en el que el grupo tiol en el terminal de la sonda de APN monocatenario se introduce uniendo un grupo cisteína a un terminal N de la sonda de ANP monocatenario.

13. Método, según la reivindicación 6, en el que el primer grupo funcional en la superficie del soporte sólido es un grupo epoxi y el segundo grupo funcional de la sonda de ácido nucleico monocatenario es un grupo amino.

14. Método, según la reivindicación 13, en el que el soporte sólido es una placa de vidrio y el grupo epoxi se introduce aplicando un compuesto de silano que tiene un grupo epoxi en la molécula del mismo sobre la superficie de la placa de vidrio y haciendo reaccionar el compuesto con la placa de vidrio.

15. Método, según la reivindicación 13, en el que el grupo epoxi se introduce aplicando metacrilato de poliglicidilo que tiene un grupo epoxi en el soporte sólido.

16. Método, según cualquier reivindicación, anterior en el que el líquido contiene urea a entre un 5 y un 10% en peso, glicerina a entre un 5 y un 10% en peso, tiodiglicol a entre un 5 y un 10% en peso, y un alcohol de acetileno a un 1% en peso del líquido

17. Método, según la reivindicación 16, en el que el alcohol de acetileno tiene una estructura representada por la siguiente fórmula general (I):

6

(en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, y R_{4} representan un grupo alquilo, cada m y n representan un entero, y m=0 y n=0, o 1\leqm+n\leq30, y cuando m+n=1, m o n es 0.)

18. Método, según la reivindicación 2, en el que una concentración de la sonda de ácido nucleico monocatenario en el líquido es 0,05-500 \muM.

19. Método, según la reivindicación 18, en el que la concentración de la sonda de ácido nucleico monocatenario en el líquido es 2-50 \muM.

20. Método, según la reivindicación 2, en el que la longitud de la sonda de ácido nucleico monocatenario es de 2-5.000 bases.

21. Método, según la reivindicación 20, en el que la longitud de la sonda de ácido nucleico monocatenario es de 2-60 bases.

22. Método, según la reivindicación 1, en el que el líquido se suministra para formar puntos independientes con una densidad de 1550 puntos por cm cuadrado (10.000 puntos por pulgada cuadrada) o mayor sobre el soporte sólido.

23. Método, según la reivindicación 1, en el que la sonda es un oligopéptido o un polipéptido con una secuencia de aminoácidos específica.

24. Método, según la reivindicación 1, en el que la sonda es una proteína.

25. Método, según la reivindicación 24, en el que la proteína es un anticuerpo.

26. Método, según la reivindicación 24, en el que la proteína es un enzima.

27. Método, según la reivindicación 1, en el que la sonda es un antígeno.

28. Método, según la reivindicación 1, en el que el soporte sólido tiene una superficie plana y propiedades superficiales homogéneas.

29. Método, según la reivindicación 28, en el que se realiza un bloqueo, después del punteado de la sonda en el soporte sólido, para evitar que una muestra se fije a la superficie en lugares diferentes a los puntos.

30. Método, según la reivindicación 29, en el que el bloqueo comprende una etapa de sumergimiento del soporte sólido en el que se han formado puntos en una solución acuosa de seroalbúmina bovina.

31. Método, según la reivindicación 30, en el que la concentración de la solución acuosa de seroalbúmina bovina está comprendida entre el 0,1 y el 5%.

32. Método, según la reivindicación 30, en el que el soporte sólido se sumerge en una solución acuosa de seroalbúmina bovina durante por lo menos 2 horas.

33. Método, según la reivindicación 28, en el que el líquido se suministra sobre la superficie del soporte sólido para obtener una distancia entre los puntos adyacentes no menor que una anchura máxima del punto.

34. Método, según la reivindicación 1, en el que el soporte sólido se segmenta por medio de una matriz dispuesta en un patrón sobre la superficie, se proporciona una pluralidad de cavidades cuya parte inferior es la superficie del soporte sólido expuesto en un patrón, y el líquido se suministra a las cavidades respectivas.

35. Método, según la reivindicación 34, en el que el soporte sólido es ópticamente transparente y la matriz es opaca.

36. Método, según la reivindicación 34, en el que la matriz comprende una resina.

37. Método, según la reivindicación 34, en el que la superficie de la matriz es hidrófoba.

38. Método, según la reivindicación 34, en el que la parte inferior de las cavidades es hidrófila.

39. Método, según la reivindicación 34, en el que las cavidades tienen una anchura máxima de 200 \mum.

40. Método, según la reivindicación 34, en el que la matriz tiene una anchura entre 1/2 y 2 veces la anchura máxima de las cavidades.

41. Método, según la reivindicación 34, en el que el grosor de la matriz está comprendido entre 1 y 20 \mum.

42. Método, según la reivindicación 34, en el que el patrón de la matriz se forma por fotolitografía.

43. Método, según la reivindicación 42, en el que la fotolitografía comprende una etapa de formación de una capa de resina en la superficie del soporte sólido, la formación de una capa fotorresistente en la capa de resina, la exposición de la capa fotorresistente a la luz en un patrón correspondiente al patrón de la matriz, y un revelado para formar el patrón de la capa fotorresistente sobre la capa de resina; y una etapa de formación de un patrón de la capa de resina utilizando el patrón de la capa fotorresistente como máscara y a continuación eliminando el patrón de las capas fotorresistentes.

44. Método, según la reivindicación 42, en el que la fotolitografía comprende las etapas de formación de una capa de resina fotosensible sobre la superficie del soporte sólido, la exposición de la capa de resina fotosensible a la luz en un patrón correspondiente al patrón de la matriz, y el revelado.

45. Método, según la reivindicación 44, en el que la capa de resina fotosensible se selecciona de entre el grupo consistente en una capa protectora UV, una capa protectora DEEP-UV, o una resina de curado ultravioleta.

46. Método, según la reivindicación 45, en el que la capa protectora UV se selecciona del grupo consistente en una capa protectora de poliisopreno ciclizado-bisazida aromática, una capa protectora compuesta de resina fenólica-azida aromática, o una capa protectora de resina novolac-diazonaftoquinona.

47. Método, según la reivindicación 45, en el que la resina DEEP-UV es una capa protectora de polímeros radiolizables o una capa protectora supresora de disolución.

48. Método, según la reivindicación 47, en el que la capa protectora de polímero de descomposición por radiación es por lo menos uno seleccionado de un grupo consistente en metacrilato de polimetilo, sulfona de polimetileno, metacrilato de polihexafluorobutilo, cetona de polimetilisopropenilo, y bromuro de poli-1-trimetilsilil propino.

49. Método, según la reivindicación 47, en el que la capa protectora supresora de disolución es éster de o-nitrobencil colato.

50. Método, según la reivindicación 45, en el que la capa protectora DEEP-UV es sulfona de polivinilfenol-3,3'-diazidadifenilo o polimetacrilato de poliglicidilo.

51. Método, según la reivindicación 44, en el que la repelencia al agua del patrón de matriz formado al crear el patrón de la capa de resina fotosensible se mejora adicionalmente mediante una postcocción del patrón de la matriz.

52. Método, según la reivindicación 34, en el que un primer grupo funcional que puede formar un enlace covalente con un segundo grupo funcional de la sonda se introduce en la superficie de la superficie del soporte sólido antes de la formación de las cavidades.

53. Método, según la reivindicación 34, en el que un primer grupo funcional que puede formar un enlace covalente con un segundo grupo funcional de la sonda se introduce en la superficie del soporte sólido después de la formación de las cavidades.

54. Método, según la reivindicación 53, en el que una solución que contiene un compuesto para introducir el primer grupo funcional en la superficie del soporte sólido se suministra a las cavidades.

55. Método, según la reivindicación 54, en el que la solución se suministra a las cavidades por medio del método de chorros de tinta.

56. Método, según la reivindicación 55, en el que la solución es un agente de acoplamiento de silano que contiene un compuesto de silano que tiene un grupo epoxi o un grupo amino en su molécula.

57. Método, según la reivindicación 55, en el que la solución contiene un compuesto que puede reaccionar con un grupo amino en un sustrato de vidrio para introducir un grupo maleimido en el sustrato de vidrio.

58. Método, según la reivindicación 57, en el que el compuesto es N-maleimidocaproiloxi succinimida o succinimidil-4-(maleimidofenil) butirato.