JP4644914B2

JP4644914B2 - プローブアレイ用固相基材、およびプローブアレイ

Info

Publication number: JP4644914B2
Application number: JP2000204355A
Authority: JP
Inventors: 輝久柴原
Original assignee: Murata Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Murata Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2011-03-09
Anticipated expiration: 2020-06-02
Also published as: JP2001343385A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はプローブアレイ用固相基材、および固相基材に複数種類のプローブ（標的とする生体高分子に対して特異的に結合し得る物質）を各々独立に並べて保持したプローブアレイに関する。
【０００２】
【従来の技術】
サンプル中の生体高分子を検出する方法の一つとして、固相基材に複数種類のプローブ（標的とする生体高分子に対して特異的に結合し得る物質）を各々独立に並べて保持したプローブアレイを使用する方法がある。図５にプローブアレイの例を示す。図５の例においては、固相基材８０に、プローブ８１が並べて保持されている。
【０００３】
プローブアレイを用いる利点は、一度の検出試験で、複数種類の生体高分子の検出を行なえるという点である。たとえば、複数種類の抗原をプローブとして並べたプローブアレイを使用すれば、一度の検出試験で、その複数種類の抗原それぞれに対する抗体の有無を調べることができる。また例えば、複数種類の遺伝子変異について、それぞれの遺伝子変異をコードする核酸に対するプローブを並べたプローブアレイを使用すれば、一度の検出試験で、その複数種類の遺伝子変異それぞれの有無を調べることができる。
【０００４】
そしてプローブアレイを用いた検出試験を行なう場合、一度の検出試験で検出することのできる生体高分子の種類の数は、プローブアレイに並べたプローブの種類の数によって決定されるため、プローブアレイに並べるプローブの種類は多い方が好ましい。また検出試験を行なうときには、プローブアレイ全面にサンプルを行き渡らせることが必要であるため、プローブアレイは小面積であることが好ましい。したがって、プローブアレイに関する前述したような利点を追求する場合、プローブアレイには、多種類のプローブが、小面積の領域に、高密度に集積されて並べられていることが好ましい。１平方センチメートルあたり１００種類程度の集積密度でプローブが並べられていれば、プローブアレイの前述した利点を発揮することができるが、これにとどまらず、プローブ集積密度は高い方が好ましい。
【０００５】
また、一本鎖核酸の中の特定の塩基配列部分に対して特異的に結合するプローブのプローブアレイを用いて、サンプル中に含まれる核酸の塩基配列を決定する方法が提案されているが、この場合もプローブアレイのプローブ集積密度は高い方が好ましい。
【０００６】
しかしながらプローブ集積密度を高めると、それぞれの標的生体高分子に対する検出感度が低下するという不具合が発生する。これは、プローブ集積密度を高めると、一種類のプローブが占有する領域（以下ではこの領域のことをスポットと呼称する）が小さくなり、スポットに含まれるプローブの絶対量（言い換えれば、プローブ分子の絶対数）が減少することに起因する。一般的にプローブアレイは、プローブ分子と標的生体高分子との結合によってもたらされる何らかのシグナルを検出することによって標的生体高分子の存在を認知する。このため、スポット中に含まれるプローブ分子の絶対数が減少すると、プローブ分子と標的生体高分子の結合の絶対数が減少し、結果としてこの結合の発するシグナルが減少するため、検出感度が低下することになる。
【０００７】
例えば、蛍光標識した標的生体高分子がどのスポットに結合しているのかを、各スポットの蛍光量を測定することによって検出するような検出方式を考える。この場合、スポットに含まれるプローブ分子の絶対数が減少すれば、それに結合する蛍光標識された標的生体高分子の絶対数も減少し、その結果、シグナルとなる蛍光量が減少して感度が低下する。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、プレート上の小さな領域の中に大量のプローブ分子を保持できるプローブアレイ用固相基材を提供して、高いプローブ集積密度と高い検出感度を両立するプローブアレイを提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明によるプローブアレイ用固相基材は、単結晶シリコンからなるプレートを備えたプローブアレイ用固相基材において、該プレートを彫りこむことによって形成された竪溝が、該プレートに配列していて、かつ該竪溝が該プレートの表面に対してほぼ垂直な壁面を有していて、かつ該竪溝の幅が１００マイクロメートル以下であって、かつ該竪溝の深さが該竪溝の幅の２倍以上であり、該竪溝が、該プレートの表面とほぼ平行な開口面以外にも開口面を有する。一つ補足すると、該竪溝は該プレートを貫通していてもよい。以下においては、本発明のこのプローブアレイ用固相基材を「竪溝配列固相基材」と呼称する。
【００１０】
本発明によるプローブアレイは、プローブアレイ用固相基材として竪溝配列固相基材を用いていて、該竪溝配列固相基材の竪溝をスポットとしていて、該竪溝の壁面にプローブを保持しているプローブアレイである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
（竪溝配列固相基材の形状例）図１〜４に竪溝配列固相基材の形状の例を示す。ただし図１〜４に示したのはあくまで例であって、本発明の竪溝配列固相基材の形状を限定するものではない。図１〜３の例では、竪溝２はプレート１に設けられた掘りこみであって、図１，２の例では竪溝２がプレート１を貫通している。図４の例では、プレート１の表面上に形成した構造物４の壁面３によって竪溝２を形成している。そして図１〜４に示したいずれの例においても、以下の３つの条件が満たされているものとする。すなわち、（１）竪溝２の壁面３はプレート１の表面に対してほぼ垂直であり、（２）竪溝２の幅（図１〜４においてＷで示した寸法）は１００マイクロメートル以下であり、（３）竪溝２の深さ（図１〜４においてＨで示した寸法）は竪溝２の幅Ｗの２倍以上である。
【００１２】
（竪溝配列固相基材の製造方法概略）これより、竪溝配列固相基材の製造方法をいくつか示す。ただし、以下に示すのは製造方法の例であって、本発明の竪溝配列固相基材の製造方法を限定するものではない。
【００１３】
図１〜３に示した竪溝配列固相基材の例においては、プレート１に竪溝２が掘り込まれているが、このような竪溝配列固相基材を製造する方法の例を図６に示す。まず最初にプレート１の上にフォトレジストからなるパターン１０をフォトリソグラフィーにより形成する（図６ａ）。次に、このフォトレジストのパターン１０をマスクとして、プレート１をプラズマエッチングする（図６ｂ）。ここで、プラズマエッチングとはイオンミリングやＲＩＥ（ＲｅａｃｔｉｖｅＩｏｎＥｔｃｈｉｎｇ）などを指すものとする。プラズマエッチングの終了後、フォトレジストのパターン１０を除去することにより竪溝配列固相基材が完成する（図６ｃ）。
【００１４】
竪溝配列固相基材を製造する際に課題となるのは、竪溝の壁面をプレートの表面に対してほぼ垂直にしなければならないという点と、竪溝の深さを竪溝の幅の２倍以上にしなければならないという点である。図６に示した製造方法の例では、この２つの課題をプラズマエッチングという垂直加工性に優れた加工技術を用いることによって解決した。
【００１５】
図６に示した製造方法とは別の製造方法を図７に示す。図７の製造方法においては、シリコン単結晶の異方性ウェットエッチングという技術を用いる。シリコン単結晶は水酸化カリウム水溶液等のアルカリ水溶液によってエッチングされるが、そのエッチング速度は結晶方位によって異なる。特に（１１１）結晶面は、その他の結晶方位面と比較してエッチング速度が極端に遅い。そのため、シリコン単結晶をアルカリ水溶液でエッチングすることによって掘りこみ加工するさいに、掘りこみの壁面が（１１１）結晶面となるようにパターンを決めておくと、掘りこみの開口幅に対する掘りこみ深さの比（以下、アスペクト比と呼称する）の大きな加工が可能である上、掘りこみの壁面もほぼ完全な平面となる。このことを利用したシリコン単結晶のエッチング加工技術が異方性ウェットエッチング技術であり、アスペクト比が１０以上の加工が可能である。図７の製造方法では、この異方性ウェットエッチングを使用する。まず、プレート１としてシリコン単結晶のプレートを用意する。ここでプレート１の表面は（１１０）結晶面となるようにしておく。このプレート１の両面に窒化ケイ素膜２０をＣＶＤ（ＣｈｅｍｉｃａｌＶａｐｏｒＤｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって数百ナノメートル程度の厚みで成膜する（図７ａ）。つづいて、プレート１の片面の窒化ケイ素膜２０をパターンニングする（図７ｂ）。窒化ケイ素膜２０をパターンニングする方法としては、例えばフォトリソグラフィーによって形成したフォトレジストのパターンをマスクとしたＲＩＥ（ＲｅａｃｔｉｖｅＩｏｎＥｔｃｈｉｎｇ）などの方法が挙げられる。つづいて、パターンニングされた窒化ケイ素膜２０をマスクにして、プレート１のシリコン単結晶を強アルカリ水溶液によってエッチングする（図７ｃ）。そして最後に窒化ケイ素膜２０を加熱した燐酸等で除去すれば竪溝配列型固相基材が完成する（図７ｄ）。ただし図７の方法を用いる場合には、竪溝２の設計形状を工夫することによって、壁面３が全て（１１１）結晶面になるようにしておく必要がある。プレート１の表面を（１１０）結晶面にしておけば、竪溝２の壁面３がすべて（１１１）結晶面になるように設計することが可能である。
【００１６】
図４に示した竪溝配列固相基材の例においては、プレート１の上に形成された構造物４の壁面３によって竪溝２が形成されている。このような竪溝配列固相基材の製造方法の例を図８に示す。まず最初にプレート１を用意して、その表面に金属の薄膜３０を成膜する（図８ａ）。成膜の方法としては、例えば真空蒸着法やスパッタ成膜法が挙げられる。次にフォトレジストからなるパターン３１を、薄膜３０の上にフォトリソグラフィーによって形成する（図８ｂ）。続いて薄膜３０を給電膜として電解メッキを行なうことにより、フォトレジストのパターン３１が存在しない領域（すなわち薄膜３０が露出している領域）に金属４を堆積（析出）させる（図８ｃ）。続いて、フォトレジストのパターン３１を除去すれば、竪溝配列固相基材が完成する（図８ｄ）。図８の製造方法を用いた場合、竪溝２の形状はフォトレジストのパターン３１の形状によって決定される。すなわち、フォトレジストのパターン３１として、壁面がプレート１に対してほぼ垂直な、幅が１００マイクロメートル以下の、アスペクト比が２以上であるパターンを形成すれば、それを鋳型として竪溝２を形成することができる。そして、このようなパターンを形成することのできるフォトレジストは、フォトレジストメーカーから市販されている。このようなフォトレジストの例としては、ＳＵ−８（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍＣｏｒｐ．製）などを挙げることができる。またさらに、Ｘ線によってリソグラフィーを行なうＸ線レジストにおいては、アスペクト比が１００以上のパターンを形成できるレジストが知られているが、図８の製造方法の中でフォトレジストの代わりにこのようなＸ線レジストを使用し、フォトリソグラフィーの代わりにＸ線リソグラフィーを行なえば、よりアスペクト比の大きな竪溝を形成することができる。
【００１７】
図８に示した製造方法と類似の方法として、図８ｃにおいて電解メッキで行なっている金属４の堆積工程を、真空蒸着法やスパッタ成膜法で行なう方法を挙げることができる。この場合、フォトレジストのパターン３１の上にも金属４が堆積するが、フォトレジストのパターン３１を除去する工程において、その部分の金属４は剥離してしまう。
【００１８】
図４に示したような竪溝配列固相基材を製造する方法として、プレート１の上に形成したフォトレジストのパターンを、そのまま構造物４として使用する方法もありうる。
【００１９】
（竪溝配列固相基材にプローブ分子を保持させてプローブアレイを製造する方法の概略）本発明のプローブアレイは固相基材として竪溝配列固相基材を用いていて、該竪溝配列固相基材の竪溝をスポットとしていて、該竪溝の壁面にプローブ分子を保持しているプローブアレイである。竪溝配列固相基材の各竪溝の壁面にプローブ分子を保持させてプローブアレイを作製する方法について、その概略を示す。ただし、以下に示す方法はあくまでも例であって、本発明のプローブアレイの製造方法を限定するものではない。
【００２０】
まず最初に、マイクロピペットやインクジェットノズルを用いて、竪溝配列固相基材の各竪溝、にプローブ分子の含まれる液滴を供給する。供給した液滴は、毛細管現象によって竪溝の内部へと吸引される。つづいて、竪溝の壁面に、液滴中のプローブ分子を化学的に結合させる。この方法としては、シランカプラー等の架橋剤を介して竪溝の壁面とプローブ分子とを共有結合させる方法や、金や銀やニッケルからなる竪溝の壁面とプローブ分子の硫黄原子とを配位結合させる方法などを挙げることができる。
【００２１】
（竪溝配列固相基材の竪溝の形状についての補足）本発明のプローブアレイを製造する方法の中には、竪溝配列固相基材の各竪溝に、竪溝ごとに異なった組成の液滴を供給する工程を含むような方法がある（前記した製造方法もその一例である）。その場合、竪溝に供給した液滴が、毛細管現象によってスムーズに竪溝の内部へと吸引されることが好ましい。しかしながら竪溝の形状によっては、竪溝の中に気泡が入ってしまって、供給した液滴が竪溝の中へスムーズに入っていかないことがある。例えば竪溝が細長い垂直な穴であって、かつプレートを貫通していない場合などには、竪溝に液滴を供給したときに気泡が入って、供給した液滴が竪溝の中へスムーズに入っていかない。このような問題を回避するために、竪溝には気泡を逃がすための経路が存在することが好ましい。図１〜４に示した竪溝配列固相基材の例では、いずれも気泡を逃がすための経路が竪溝に存在する。図１，２の例では竪溝がプレートを貫通しているため、プレートの表面側から竪溝に液滴を供給すると、竪溝の中の気泡はプレートの裏面側から抜けていく。図３，４に示した例では竪溝の脇腹が開放されているため、ここから気泡が抜ける。
【００２２】
【作用】
竪溝配列固相基材においては、一つの竪溝がプレートの表面上に占める占有面積を小さくした場合でも、その竪溝の壁面の表面積を大きくしておくことが可能である。そのため、竪溝配列固相基材の竪溝をスポットとして用いて、竪溝の壁面にプローブを保持させれば、竪溝配列固相基材は小さな（プレートの表面における占有面積の小さな）スポットの中に大量のプローブ分子を保持することができる。
【００２３】
本発明によるプローブアレイは、固相基材として竪溝配列固相基材を用いていて、該竪溝配列固相基材の竪溝をスポットとしていて、該竪溝の壁面にプローブを保持しているプローブアレイである。このプローブアレイにおいては、小さなスポットの中に大量のプローブ分子を保持させておくことが可能であるため、高いプローブ集積密度と高い検出感度が両立する。
【００２４】
また、本発明のプローブアレイを製造する過程においては、竪溝配列固相基材の各竪溝にそれぞれ組成の異なる液滴を供給するという工程が含まれることがあるが、このとき供給した液滴が毛細管現象によって竪溝の内部へと吸引されて濡れ広がらないため、隣接する竪溝との間でクロスコンタミネーションを起こす危険が少ない。
【００２５】
【実施例】
（実施例１）竪溝配列固相基材の例（実施例１）を図９に示す。斜視図（一部断面図）を図９ａに示し、図９ａ中において矢印ｂが示す部分の拡大図を図９ｂに示す。図９に示した通り、この竪溝配列固相基材は上層１と中間層５１と下層５０の３層構造になっている。上層１と下層５０とは単結晶シリコンで形成されていて、そこに掘りこみ加工が施されているが、掘り込みの壁面はいずれも（１１１）結晶面となっている。また、上層１に形成された掘りこみが竪溝２となっており、竪溝２の幅は１０マイクロメートル、深さは１００マイクロメートルである。
【００２６】
図９の竪溝配列固相基材について、その製造方法を図１０を用いながら以下に示す。まず最初にＳＯＩ（ｓｉｌｉｃｏｎｏｎｉｎｓｕｌａｔｏｒ）基板を用意する（図１０ａ）。ここで、ＳＯＩ基板の構成は以下の通りである。下層５０：単結晶シリコン、ウエハ面の結晶面方位（１１０）、厚み３００マイクロメートル。中間層５１：酸化ケイ素、厚み１マイクロメートル。上層１：単結晶シリコン、ウエハ面の結晶面方位（１１０）、厚み１００マイクロメートル。このようなＳＯＩ基板は、単結晶シリコンウエハと表面に熱酸化膜を形成した単結晶シリコンウエハとを直接接合することによって作製できるし、また、ＳＯＩ基板として市販されている。このＳＯＩ基板の表面に、ＣＶＤ（ＣｈｅｍｉｃａｌＶａｐｏｒＤｅｐｏｓｉｔｌｏｎ）によって、厚み３００ナノメートルの窒化ケイ素膜５２，５３を形成する。ここで、上層１の表面に形成された窒化ケイ素膜を５２として、下層５０の表面に形成された窒化ケイ素膜を５３とする（図１０ｂ）。続いて窒化ケイ素膜５３の上に、フォトリソグラフィーによって、フォトレジストパターン５４を形成する（図１０ｃ）。ここでフォトレジストパターン５４は、下層５０の掘りこみパターンに対応したパターンである。それからフォトレジストパターン５４をマスクとして、ＣＦ_４をエッチングガスとするＲＩＥ（ＲｅａｃｔｉｖｅＩｏｎＥｔｃｈｉｎｇ）を行なうことにより、窒化ケイ素膜５３をパターンニングする（図１０ｄ）。フォトレジストパターン５４を硫酸と過酸化水素水の混合液によって除去した後、水酸化カリウムの水溶液によって下層５０の単結晶シリコンを、２００マイクロメートル程度の深さまで異方性エッチングする（図１０ｅ）。続いて、窒化ケイ素膜５２の上に、フォトリソグラフィーによってフォトレジストパターン５５を形成する（図１０ｆ）。ここでフォトレジストパターン５５は、上層１の掘りこみパターン（竪溝）に対応したパターンである。それからフォトレジストパターン５５をマスクとして、ＣＦ_４をエッチングガスとするＲＩＥ（ＲｅａｃｔｉｖｅＩｏｎＥｔｃｈｉｎｇ）を行なうことにより、窒化ケイ素膜５２をパターンニングする（図１０ｇ）。フォトレジストパターン５５を硫酸と過酸化水素水の混合液によって除去した後、水酸化カリウムの水溶液によって、上層１と下層５０の単結晶シリコンを中間層５１に到達するまで異方性エッチングする（図１０ｈ）。続いて、１６０℃に加熱した燐酸によって窒化ケイ素膜５２と窒化ケイ素膜５３とを除去し、さらにフッ化水素水溶液によって中間層５１の酸化ケイ素をエッチングする（図１０ｉ）。以上の工程によって、図９に示した竪溝配列固相基材を製造できる。
【００２７】
（実施例２）一本鎖ＤＮＡ分子は、相補的な塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡ分子に対するプローブとして働く。したがって、様々な塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡを固相基材の上に並べて保持したものはプローブアレイとなる（特にＤＮＡチップと呼称される）。そして、プローブとなる一本鎖ＤＮＡ分子を、実施例１の竪溝配列固相基材の竪溝２の壁面３に保持したプローブアレイは、本発明の実施例（実施例２）となる。実施例２のプローブアレイを作製する方法について以下に説明する。
【００２８】
まず最初に、実施例１で作製した竪溝配列固相基材の表面にマレイミド基を担持させる。その方法は以下の通りである。実施例１で作製した竪溝配列固相基材を、１１００℃の酸素と水蒸気の雰囲気中に１時間放置する（表面酸化処理）。次いでアミノ基を結合したシラン化合物（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）を含むシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ６６０３；信越化学工業（株）社製）の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間程度攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解する。そしてこの溶液に、表面酸化処理の完了した先の竪溝配列固相基材を２０分間浸漬し（室温）、引き上げて、窒素ガスを吹き付けることにより乾燥させ、１２０℃のオーブン中で１時間ベークする（シランカップリング処理）。シランカップリング処理によって、竪溝配列固相基材の表面にアミノ基が担持される。次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）（以下、ＥＭＣＳと呼称する）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意する。シランカップリング処理を行なった先の竪溝配列固相基材をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸漬して、竪溝配列固相基材の表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基とを反応させる。これにより、竪溝配列固相基材の表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が担持されることになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス板はＤＭＳＯとエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させる。
【００２９】
表面にマレイミド基を担持させた竪溝配列固相基材の各竪溝に、プローブとなる一本鎖ＤＮＡ分子を保持させる方法を以下に示す。５’末端にチオール基を導入した一本鎖ＤＮＡ（プローブ）を用意して、これを濃度が約４００ｍｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８）／１ｍＭＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液を調整する。ここで５’末端にチオール基を導入した一本鎖ＤＮＡの調整方法は公知である。表面にマレイミド基を担持させた竪溝配列固相基材の各竪溝に、調整した一本鎖ＤＮＡ溶液を約２０ｐｌづつマイクロピペットで供給する。一本鎖ＤＮＡ溶液の液滴を竪溝の開口部に接触させれば、毛細管現象によって、液滴は竪溝の内部へと吸引される。ただしこのとき大きな液滴の一部が隣接する竪溝にも接触し、吸引されてしまう危険があるため、一度に約２０ｐｌの液滴を供給するのではなく、３回程度に小分けして液滴を供給することによりこの危険を回避する。一本鎖ＤＮＡ溶液の供給が完了した竪溝配列固相基材を、３０分間加湿チャンバー内に静置して、竪溝配列固相基材表面のマレイミド基と一本鎖ＤＮＡ５’末端のチオール基とを反応させる。以上の処理が完了した竪溝配列固相基材を、１ＭＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄して、未反応のＤＮＡを含む液体を完全に洗い流す。次いで、この竪溝配列固相基材を２％ウシ血清アルブミン水溶液中に２時間浸漬して、竪溝配列固相基材表面上の未反応のマレイミド基をウシ血清アルブミンによってブロッキングする。以上の工程によって、竪溝配列固相基材の各竪溝の壁面にプローブとなる一本鎖ＤＮＡが保持されたプローブアレイ（ＤＮＡチップ）が完成する。
【００３０】
以上のように作製されたプローブアレイは、一般のプローブアレイと同じように使用できる。例えば、蛍光標識した標的ＤＮＡの存在を、竪溝の発する蛍光によって検出することができる。
【００３１】
（実施例３）竪溝配列固相基材の実施例１とは異なる例（実施例３）を図１１に示す。斜視図（一部断面図）を図１１ａに示し、図１１ａ中において矢印ｂが示す部分の拡大図を図１１ｂに示す。図１１に示した通り、ガラス基板１の上に、クロム薄膜６０（厚み５０ナノメートル）と、金薄膜６１（厚み２００ナノメートル）とが形成されていて、その上に金からなる構造物４が形成されている。そして、この構造物４の壁面３によって、竪溝２が形成されている。ここで、竪溝２の幅は３０マイクロメートルで、深さは９０マイクロメートルである。
【００３２】
図１１の竪溝配列固相基材について、その製造方法を図１２を用いながら以下に示す。まず最初に、厚み５００マイクロメートルのガラス基板１を用意する（図１２ａ）。そして、このガラス基板１の上に、厚み５０ナノメートルのクロム薄膜６０と厚み２００ナノメートルの金薄膜６１を真空蒸着法によって成膜する（図１２ｂ）。次に金薄膜６１の上に、フォトリソグラフィーによって、フォトレジストのパターン７０を形成する（図１２ｃ）。ここでフォトレジストとしては、ＳＵ−８（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍＣｏｒｐ．製）を用いる。次いで、金薄膜６１を給電膜として金の電解メッキを行ない、フォトレジストのパターン７０を鋳型とするような、金からなる構造物４を形成する（図１２ｄ）。最後に、硫酸と過酸化水素水の混合液によってフォトレジストのパターン７０を除去する（図１２ｅ）。以上の工程によって、図１１に示した竪溝配列固相基材を製造できる。
【００３３】
（実施例４）一本鎖ＤＮＡ分子は、相補的な塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡもしくは一本鎖ＲＮＡ分子に対するプローブとして働く。したがって、様々な塩基配列を持つ一本鎖ＤＮＡを固相基材の上に並べて保持したものはプローブアレイとなる（特にＤＮＡチップと呼称される）。そして、プローブとなる一本鎖ＤＮＡ分子を、実施例３の竪溝配列固相基材の竪溝２の壁面３に保持したプローブアレイは、本発明の実施例（実施例４）となる。実施例４のプローブアレイを作製する方法について以下に説明する。
【００３４】
プローブとなる一本鎖ＤＮＡとして、５’末端にチオール基を導入した一本鎖ＤＮＡを用意する。そしてこの一本鎖ＤＮＡを、濃度が約４００ｍｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液を調整する。ここで５’末端にチオール基を導入した一本鎖ＤＮＡの調整方法は公知である。次いで実施例３の竪溝配列固相基材の各竪溝に、調整した一本鎖ＤＮＡ溶液を約２００ｐｌづつマイクロピペットで供給する。一本鎖ＤＮＡ溶液の液滴を竪溝２の開口部に接触させれば、毛細管現象によって、液滴は竪溝の内部へと吸引される。ただしこのとき大きな液滴の一部が隣接する竪溝にも接触し、吸引されてしまう危険があるため、一度に約２００ｐｌの液滴を供給するのではなく、１０回程度に小分けして液滴を供給することによりこの危険を回避する。一本鎖ＤＮＡ溶液の供給が完了した竪溝配列固相基材を、２４時間加湿チャンバー内に静置して、竪溝配列固相基材表面の金原子と一本鎖ＤＮＡ５’末端のチオール基とを配位結合させる。以上の処理が完了した竪溝配列固相基材を、ＴＥ溶液で洗浄して、未反応のＤＮＡを含む液体を完全に洗い流す。以上の工程によって、竪溝配列固相基材の各竪溝の壁面にプローブとなる一本鎖ＤＮＡが保持されたプローブアレイ（ＤＮＡチップ）が完成する。
【００３５】
以上のように作製されたプローブアレイは、一般のプローブアレイと同じように使用できる。例えば、蛍光標識した標的ＤＮＡの存在を、竪溝の発する蛍光によって検出することができる。
【００３６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の竪溝配列固相基材は小さな（プレート表面における占有面積の小さい）スポットの中に大量のプローブ分子を保持することができる。したがって、竪溝配列固相基材を用いた本発明のプローブアレイにおいては、高いプローブ集積密度と高い検出感度が両立する。
【００３７】
また、本発明のプローブアレイを製造する過程においては、竪溝配列固相基材の各竪溝にそれぞれ組成の異なる液滴を供給するという工程が含まれることがあるが、このとき供給した液滴が毛細管現象によって竪溝の内部へと吸引されて濡れ広がらないため、隣接する竪溝との間でクロスコンタミネーションを起こす危険が少ない。これも、本発明の竪溝配列固相基材が持つ長所の一つである。
【図面の簡単な説明】
【図１】竪溝配列固相基材（本発明）の一例についての斜視図（一部断面図）である。
【図２】竪溝配列固相基材（本発明）の図１とは異なる一例についての斜視図（一部断面図）である。
【図３】竪溝配列固相基材（本発明）の図１，２とは異なる一例についての斜視図（一部断面図）である。
【図４】竪溝配列固相基材（本発明）の図１〜３とは異なる一例についての斜視図（一部断面図）である。
【図５】従来のプローブアレイの斜視図である。
【図６】図１〜３に示したような竪溝配列固相基材を、製造するためのプロセスを示す概略断面図である。
【図７】図１〜３に示したような竪溝配列固相基材を、製造するためのプロセス（図６に示したプロセスとは異なるプロセス）を示す概略断面図である。
【図８】図４に示したような竪溝配列固相基材を、製造するためのプロセスを示す概略断面図である。
【図９】（ａ）竪溝配列固相基材（本発明）の一例（実施例１）を示す斜視図（一部断面図）である。
（ｂ）図９（ａ）の中の矢印ｂで指し示した付近の拡大図である。
【図１０】図９に示した竪溝配列固相基材（実施例１）を、製造するためのプロセスを示す概略断面図である。
【図１１】（ａ）竪溝配列固相基材（本発明）の一例（実施例３）を示す斜視図（一部断面図）である。
（ｂ）図１１（ａ）の中の矢印ｂで指し示した付近の拡大図である。
【図１２】図１１に示した竪溝配列固相基材（実施例３）を、製造するためのプロセスを示す概略断面図である。
【符号の説明】
１プレート
２竪溝
３竪溝の壁面
４構造物
８０固相基材
８１プローブ

Claims

単結晶シリコンからなるプレートを備えたプローブアレイ用固相基材において、
該プレートを彫りこむことによって形成された竪溝が、該プレートに配列していて、かつ該竪溝が該プレートの表面に対してほぼ垂直な壁面を有していて、かつ該竪溝の幅が１００マイクロメートル以下であって、かつ該竪溝の深さが該竪溝の幅の２倍以上であり、
該竪溝が、該プレートの表面とほぼ平行な開口面以外にも開口面を有することを特徴とするプローブアレイ用固相基材。
該竪溝が該プレートを貫通している請求項１記載のプローブアレイ用固相基材。
該竪溝がＲＩＥによって形成されている請求項１または２記載のプローブアレイ用固相基材。
該竪溝がアルカリ溶液によるエッチングによって形成されていて、該壁面が（１１１）結晶面である請求項１または２記載のプローブアレイ用固相基材。
該プレートの上に形成された構造物の壁面によって該竪溝が形成されている請求項１記載のプローブアレイ用固相基材。
該竪溝が１平方センチメートルあたり１００個以上の密度で該プレートに形成されている請求項１〜５のいずれか一項記載のプローブアレイ用固相基材。
標的とする生体高分子に対して特異的に結合可能であるプローブを固相基材の上に複数種類並べて保持したプローブアレイにおいて、該固相基材として請求項１〜６のいずれか一項記載のプローブアレイ用固相基材を用いていて、該竪溝の壁面に該プローブを保持したことを特徴とするプローブアレイ。
該プローブが一本鎖核酸である請求項７記載のプローブアレイ。
該プローブが一本鎖ＤＮＡである請求項８記載のプローブアレイ。
該プローブがオリゴペプチドあるいはポリペプチドである請求項７記載のプローブアレイ。
該プローブが蛋白質である請求項７記載のプローブアレイ。
該プローブが抗体である請求項１１記載のプローブアレイ。
該プローブが抗原である請求項７記載のプローブアレイ。