CN105779279A - 一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件及其构建方法和应用，所述传感器件包括硅材料基底、二维材料层、纳米孔和生物大分子；所述二维材料层附着在硅材料基底表面，所述硅材料基底上的纳米孔和二维材料层上的小孔贯通，所述纳米孔的另一端锚定有生物大分子。相对于现有技术，本发明结合生物纳米孔对DNA过孔速率控制的特点和固态纳米孔稳定、易于设计与阵列化加工的优点，利用二维层状材料制作的纳米孔突破了纳米孔测序中的空间分辨率的优势，发展一种可直接对分析物进行高效信息读取的纳米器件，以满足目前医学和未来信息器件中DNA编码信息读取的需求，提高纳米孔测序的精度。

Description

一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件及其构建方法，属于纳米传感器件技术领域。
背景技术
纳米孔用于生物分子的检测就是通过电泳，驱动一个生物分子穿过一个直径为几纳米数量级的小孔。1996年，Kasianowicz及其同事首次报道了单链DNA或RNA在电场作用下通过自组装在脂质双分子层上的α-溶血素纳米孔，并且在DNA分子通过孔时改变纳米孔的电导，引起电流变化，从而产生了阻塞电流(blockadecurrent)的现象。由于不同的碱基具有不同的原子组成，所以他们在穿过纳米孔时会产生的阻塞电流大小不同，根据可检测到的信号可以区分出四种不同的碱基A、T、C、G，从而获得了DNA或者RNA分子的序列信息，可以实现直接、快速的检测单链DNA或RNA分子碱基的方法[BrantonD,etal.,NatureBiotechnol.2008,26,1146-1153；DeamerDW,BrantonD.AccChemRes.2002,35,817-825]。这种检测的方法较前两代检测方法具有更快的检测速度，更低的检测成本，是一种极具吸引力的新研究方向，也是达到低成本测序目标的新技术之一，此方法一经报道立刻引起了界内的广泛注视，大量的研究者也投入到此项技术发展的研究中来。
由于生物纳米孔需要组装在脂质双分子层膜上才能使用，脂质双分子层膜的化学稳定性很差，不易保存等缺点使得研究人员考虑到用其他材料代替生物的纳米孔以克服其存在的固有缺点。于是在2001年Li.et.al等人[LiJ,etal.Nature,2001,412,166-169]率先利用自行改装的带离子束反馈监测控制系统的聚焦离子束工作站，实现了Si3N4薄膜上1.8nm的纳米孔可靠制备。这个工作的完成，开启固态纳米孔(solid-statenanopore)研究的先河。固态纳米孔相对于生物纳米孔来说具有更易保存，化学稳定性好，孔径尺寸以及通道长度可控等优势，因此成为近几年纳米孔研究中的热点。
对固态纳米孔的表面进行化学修饰有助于改善纳米孔的理化特性。通过改变纳米孔大小、表面电荷和极性(实现了疏水性和亲水性分子的选择性运输)，使功能性固态纳米孔阵列可以选择性地运输物质。[Jirage,K.B.etal.Science1997,278,(5338),655-658.Chun,K.Y.etal.Langmuir.2002,18,(12),4653-4658.Jirage,K.B.etal.Analyticalchemistry1999,71,(21),4913-4918.Fanzio,P.etal.Biosensors&bioelectronics2015,64,219-26.]Iqbal等[Iqbal,S.M.etal.Naturenanotechnology2007,2,(4),243-8.]在一个小于20nm的固态纳米通道上修饰HPL-DNA(发夹形DNA)，实现了一种选择性固态纳米孔，实现DNA测序，以及进行其他非标记生物分子的检测，如蛋白质或者在低浓度下的生物小分子等。
纳米孔测序的原理是通过将DNA分子电泳通过一个薄而小的纳米孔内，由于不同碱基理化性质的差异，其对孔的电流阻塞效应不同，通过对阻塞电流的分辨可以得知DNA分子内碱基的序列信息。因此，基于纳米孔的测序方法具有相当大的优势，包括(1)非标记，(2)不需要扩增，(3)高通量，(4)成本低廉，(5)样本需求量小，(6)读长长。然而，要对DNA序列进行实时地单碱基分辨还存在一些挑战，其主要有两个限制因素；其一是DNA通过纳米孔的速度非常快(～1μs/bp)，在这个条件下，由单个碱基引起的离子电流的变化难以被捕捉到，因此单一的用自由的DNA通过纳米孔而实现其序列的区分是不可能的。其二，目前所用的纳米孔的厚度相较于碱基之间的距离都很大，这使得在同一时间有超过10个以上的碱基占据了孔，所得到离子电流的阻塞是有这些孔内的碱基一起产生的，因此仅靠这些信息还不足以推测出DNA序列信息。
虽然固态纳米孔有蛋白孔所不具备的优点，如大小可控、稳定性好,但相对于蛋白孔,这些纳米孔都不太适合在原子级别上检测DNA穿孔时特异碱基的信号，因为它们厚度普遍太大，远远超过单链DNA中相邻碱基之间的间距(约0.7nm)。
综上所述，现有纳米孔测序技术中，仍然存在一定缺陷，如待测序列通过纳米孔的速度过快、孔厚度偏大等，从而导致序列测定的准确度偏低。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明提供一种可直接对核酸片段进行高效信息读取的复合纳米孔器件及其构建方法，提高纳米孔传感的精确度，以满足目前医学和未来信息器件中分子信息、分子内信息特别是分子内编码信息读取的需求。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件，包括硅材料基底、二维材料层、纳米孔和生物大分子；所述二维材料层附着在硅材料基底表面，硅材料基底上的纳米孔和二维材料层上的小孔贯通，所述纳米孔的另一端锚定有生物大分子。
作为优选，所述硅材料为硅、二氧化硅、氮化硅中的一种或者几种组合。
作为另一种优选，所述纳米孔的孔径范围为5～60纳米，所述二维材料层上的小孔直径小于5纳米。
作为另一种优选，所述二维材料为二硫化钼、石墨烯、云母、氮化硼中的一种、两种或三种的复合材料结构。
作为另一种优选，所述二维材料层的厚度小于2纳米。
作为另一种优选，所述生物大分子为DNA解旋酶、核酸结合蛋白、单链DNA结合蛋白、核酸外切酶或核酸内切酶。
本发明还提供了所述基于二维层状材料的纳米孔传感器件的构建方法，包括以下步骤：在硅材料基底上构建纳米孔，然后在纳米孔上的一面组装一层二维材料，形成二维材料层，在其上制作小孔，与纳米孔贯通，最后在纳米孔另一面上锚定生物大分子。
作为优选，所述二维材料层是通过物理方法或者化学方法自组装形成。
所述纳米孔传感器件的构建方法包括：在基材表面沉积超薄石墨烯，并在对应的位置刻蚀出贯穿的直径小于5nm的纳米孔，然后在基材的另一面通过化学修饰将生物酶固定，从而形成具有高灵敏度的复合纳米孔传感器。优选的方案如下所示：
一、通过物理方法如机械剥离法、取向附生法、液相或气相直接剥离法在基材表面制备单层或多层石墨烯或双层二硫化钼等层状材料。采用电子束、离子束、γ射线等进行纳米孔蚀刻，形成纳米孔道，间距1nm-5nm之间。然后在基材的另一面，使用硅烷偶联剂等将生物大分子固定在纳米孔内，从而形成高灵敏的纳米孔单分子传感器。
二、通过化学方法如氧化石墨还原法，化学气相沉积法和晶体外延生长法在基材表面制备单层或多层石墨烯。采用电子束、离子束、γ射线等进行纳米孔蚀刻，形成纳米孔道，间距1nm-10nm。在基材的另一面形成磷脂单分子层，然后使用锚定分子如胆固醇分子将生物大分子如phi29DNA聚合酶锚定在纳米孔孔的附近，从而形成对核酸分子具有高灵敏度区分度的纳米孔单分子传感器。
所述硅材料基底纳米孔可以通过以下方法制备：双面抛光的硅晶圆，清洗以去除硅晶圆表面自然氧化形成的二氧化硅。通过溅射或热氧化生长形成一层纳米量级厚的二氧化硅薄膜，使用低压气相化学沉积(LowPressureChemicalVaporDeposition，LPCVD)或等离子增强化学沉积(PECVD)的方法在二氧化硅薄膜沉积一层10-100nm的氮化硅，将这一面定义为正面。硅片的另一面LPCVD或PECVD沉积一层几百纳米的氮化硅，将这一面定义为反面。在反面涂覆光刻胶后曝光显影形成刻蚀窗图形，然后用等离子刻蚀(RIE)刻蚀，在氮化硅薄膜上刻蚀出几百微米的正方形的腐蚀窗(5)，紧接着用50％的四甲基(TMAH)溶液在90℃条件下腐蚀硅基底，直到二氧化硅层停止，最终形成一个低应力自支撑氮化硅薄膜的窗口，构成悬臂结构，窗口氮化硅薄膜即可作为本发明所述基材，然后采用电子束、离子束、γ射线等进行纳米孔蚀刻，形成纳米孔道。
作为另一种优选，所述生物大分子通过化学交联剂或者锚定分子锚定在纳米孔的另一面。
所述化学交联方法可以采用以下方法但不限于以下几种。
方法一：选用适合的双功能的交联剂，对选用的功能蛋白质分子和配合蛋白质进行异源交联剂(分子间交联)，该化学交联剂带有两个不同功能基团，可分别与两个蛋白质的基团交联，可保证方向性。利用蛋白质表面游离氨基的修饰，可以在影响蛋白质空间结构的前提下，尽可能保持蛋白质的生物活性；
方法二：采用生物素标记蛋白质，标记后的蛋白质与链霉亲和素结合，形成新的蛋白质复合物。
方法三：采用带有双功能基团的PEG分子修饰蛋白质，既可用作交联剂，又可单独修饰对蛋白质进行PEG修饰。
本发明最后还提供了所述基于二维层状材料的纳米孔传感器件的应用，所述传感器件应用于分子传感、分子内部信息表征及分子结构信息或状态信息表征。
本发明关键技术：层状材料组装及表征技术；复合纳米孔器件封装技术；生物分子组装技术；微流控测试系统。
技术效果：相对于现有技术，本发明结合生物纳米孔对DNA过孔速率控制的特点和固态纳米孔稳定、易于设计与阵列化加工的优点，利用二维层状材料制作的纳米孔突破了纳米孔测序中的空间分辨率的优势，发展一种可直接对分析物进行高效信息读取的纳米器件，以满足目前医学和未来信息器件中DNA编码信息读取的需求，提高纳米孔测序的精度。
附图说明
图1是本发明纳米孔传感器件结构示意图；
图2是实施例1所述基材1-6的制备流程图；
图3是本发明硅材料基底纳米孔7结构示意图。
图4是本发明二维层状材料8和9示意图；
图5是本发明二维材料层小孔10结构示意图；
图6是蛋白质化学交联试剂11示意图；
图7是蛋白质酶12的交联示意图。
具体实施方式
下面结合附图进一步描述本发明的具体实施方案。
实施例1
本发明基于二维层状材料的纳米孔传感器件的制备，具体包含以下几个步骤：
1.基于半导体Si材料的氮化硅纳米孔的制备：
如图2至图7所示，双面抛光的4寸硅晶圆1，先用浓硫酸和双氧水的混合溶液清洗10-15分钟，接着用BOE清洗，以去除硅晶圆表面自然氧化形成的二氧化硅。通过溅射或热氧化生长形成一层纳米量级厚的二氧化硅薄膜2，使用低压气相化学沉积(LowPressureChemicalVaporDeposition，LPCVD)或等离子增强化学沉积(PECVD)的方法在二氧化硅薄膜沉积一层10-100nm的氮化硅3，将这一面定义为正面。硅片的另一面LPCVD或PECVD沉积一层几百纳米的氮化硅4，将这一面定义为反面。在反面涂覆光刻胶后曝光显影形成刻蚀窗图形，然后用等离子刻蚀(RIE)刻蚀，在氮化硅薄膜上刻蚀出几百微米的正方形的腐蚀窗5，紧接着用50％的四甲基(TMAH)溶液在90℃条件下腐蚀硅基底，直到二氧化硅层停止，最终形成一个低应力自支撑氮化硅薄膜的窗口，构成悬臂结构6。使用电子束、离子束、γ射线等技术在上述制备的氮化硅薄膜上打出纳米量级的小孔，即纳米孔7。
2.二维材料结构自组装
采用分子自组装技术，通过层状材料8和9，在纳米孔7的一侧，实现自组装。层状结构的组装采用自组装技术进行。
使用聚焦电子束在层状材料8和9上打出纳米量级的小孔10，尺度稍小于纳米孔7。
3.生物大分子的组装
应用硅烷偶联剂溶液对硅基底纳米孔表面进行修饰，通过化学修饰，分子组装等方法，在纳米孔7的另一侧，实现化学试剂11的修饰，并通过化学交联，实现生物大分子12在化学试剂11的帮助下固定。另外，生物大分子12也可以在锚定分子13的帮助下锚定在纳米孔表面。生物大分子12的化学交联方法可以采用以下方法但不限于以下几种：
方法一：选用适合的双功能的交联剂，对选用的功能蛋白质分子和配合蛋白质进行异源交联剂(分子间交联)，该化学交联剂带有两个不同功能基团，可分别与两个蛋白质的基团交联，可保证方向性。利用蛋白质表面游离氨基的修饰，可以在影响蛋白质空间结构的前提下，尽可能保持蛋白质的生物活性；
方法二：采用生物素标记蛋白质，标记后的蛋白质与链霉亲和素结合，形成新的蛋白质复合物。
方法三：采用带有双功能基团的PEG分子修饰蛋白质，既可用作交联剂，又可单独修饰对蛋白质进行PEG修饰。
实施例2
实施步骤：
1.选用4英寸多晶硅晶圆，通过硅工艺制备厚度在30nm的低应力自支撑氮化硅薄膜。通过聚焦离子束(FIB)刻蚀(15秒)，或透射电子显微镜(TEM)刻蚀(180-200秒)，得到密度920个/μm2，平均孔径为30nm的固态纳米孔阵列并用激光切割成为边长5mm的正方形纳米孔芯片；
2.边长5mm的正方形纳米孔芯片洁净硅片上使用化学气相沉积法(CVD)生长2层石墨烯薄膜；透射电子显微镜(TEM)刻蚀出纳米孔，直径为2nm；
3.将含有固态纳米孔的氮化硅纳米孔芯片浸入含有98％浓硫酸及过氧化氢溶液(体积比7：3)的混合物中加热至95℃，水合30分钟，使表面带有大量的硅羟基和硅氧键；
4.用有机硅烷分子，如：1％3-氨丙基三乙氧基硅烷乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液50μL室温处理氮化硅薄膜2小时，去离子水洗净并干燥；
5.用1x磷酸缓冲液溶解的1μg/mLDNA解旋酶溶液浸泡纳米孔，室温下处理1小时，去离子水洗净并干燥；
6.在纳米孔阵列的正面加入50μL浓度1pmol/L100bp的polydADNA分子，分散液为1mol/L氯化钾溶液。纳米孔阵列的背面加入1mol/L氯化钾溶液50μL。用膜片钳放大器在纳米孔阵列的两面加100mV的偏置电压，收集信号。
效果：
1.经过3-氨丙基三乙氧基硅烷乙氧基硅烷修饰后的固态纳米孔，蛋白质在纳米孔表面的固定保证了锚定牢固性，
2.在100mV偏置电压的驱动下，DNA分子以约1ms/20bp的速率通过纳米孔，大大降低了DNA通过纳米孔速率。
实施例3
实施步骤：
1.纳米孔基材的制备同实施实例1；
2.边长5mm的正方形纳米孔芯片洁净硅片上使用化学气相沉积法(CVD)生长2层二硫化钼；使用透射电子显微镜(TEM)刻蚀出纳米孔，直径为5nm；
3.氧等离子体(功率100W)处理纳米孔阵列2分钟，氨气等离子体(功率100W)处理纳米孔阵列3分钟，使阵列表面携带活性氨基；
4.对纳米孔修饰戊二醛作为手臂分子。在弱碱性(pH8-8.5)条件下，戊二醛的一端醛基连接纳米孔壁上的氨基，形成希夫氏碱，再经过硼氰化钠还原，形成稳定的酰胺键；
5.使用1μg/mLRNA酶抗体(anti-RNaseA)水溶液(含0.9％氯化钠和0.1％TritonX-100表面活性剂)，室温下处理纳米孔阵列1小时，超纯水冲洗3遍洗脱未牢固结合的抗体分子。手臂分子(戊二醛)的存在可以使得抗体的结合位点暴露在溶液中，保证抗体的结合活性；
6.在纳米孔一面加入20μL含有浓度为5nmol/L牛血清白蛋白(BSA)和5nmol/LRNA酶A(RNaseA)水溶液，并加入足量0.9％氯化钠溶液，施加100mV偏置电压电泳60分钟，在纳米孔的另一侧收集到的溶液，使用酶联免疫反应(ELISA)或高效液相色谱(HPLC)均能够检出BSA，但均无法检出RNA酶A的存在，说明修饰过的纳米孔阵列通过抗原——抗体反应与纳米孔阵列中的RNA酶A发生特异性结合。因此，痕量RNA酶无法通过纳米孔阵列进入另一侧的溶液中，而溶液中其他成分可以自由通过纳米孔阵列。
效果：
1.本实施实例通过特异性抗原——抗体结合原理，构建特异性分子筛，分离和去除溶液中的单分子蛋白质杂质，如RNA酶A；
2.通过纳米孔阵列后的溶液中不含有RNA酶A，可以用作RNA合成、剪切等操作及RNA表达谱分析等研究。
3.提升了RNA酶A检测的精确度。
实施例4：
实施步骤：
1.纳米孔基材的制备同实施实例1；
2.边长5mm的正方形纳米孔芯片洁净硅片上使用化学气相沉积法(CVD)分别生长1层石墨烯1层云母；然后透射电子显微镜(TEM)刻蚀出纳米孔，直径为1nm；
3.首先使用1mlγ-氨丙基甲基三乙氧基硅烷甲醇溶液(APTES,1.5％v/v)处理纳米孔2小时，超纯水洗净后，再用1mL戊二醛(1.5％v/v)水溶液(含0.1％十二烷基磺酸钠)处理纳米孔1小时，然后用大量超纯水洗净干燥，使孔壁上携带活性醛基；
4.使用1mL浓度为1nmol/L的末端氨基化DNA序列5’-H2N-ATATCGCT-3’处理纳米孔1小时，超纯水洗净。该DNA序列可以通过希夫氏碱经硼氢化钠还原形成酰胺键而连接在纳米孔内壁上；
5.在纳米孔一侧加50μL浓度各为1μmol/L的含有与以上探针例互补的核酸序列5’-AGCGATAT-3’以及两碱基错配5’-AGCCAGAT-3’的水溶液(含0.9％氯化钠)并用电化学工作站施加偏置电压100mV，电泳1小时候对另一面收集液进行PCR和杂交定性检测。经杂交，鉴定收集液中含有5’-AGCCAGAT-3’序列，但与修饰探针完全正配的5’-AGCGATAT-3’几乎无法检出，说明另一侧样品池中不含需要去除的DNA分子序列。
效果：
1.通过核酸探针修饰纳米孔，可以捕获特定的杂质分子，如单链DNA或RNA。核算酸探针长度为6-28bp；
2.杂质捕获的灵敏度高，可实现最低单分子核酸杂质的截留与分离；
因此，本实施例可用于实验室中对核酸溶液中已知序列的微量单链DNA或RNA杂质的高质量高效纯化分离。

Claims (10)

1.一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件，其特征在于，包括硅材料基底、二维材料层、纳米孔和生物大分子；所述二维材料层附着在硅材料基底表面，硅材料基底上的纳米孔和二维材料层上的小孔贯通，所述纳米孔的另一端锚定有生物大分子。
2.根据权利要求1所述的基于二维层状材料的纳米孔传感器件，其特征在于，所述硅材料为硅、二氧化硅、氮化硅中的一种或者几种组合。
3.根据权利要求1所述的基于二维层状材料的纳米孔传感器件，其特征在于，所述纳米孔的孔径范围为5～60纳米，所述二维材料层上的小孔直径小于5纳米。
4.根据权利要求1所述的基于二维层状材料的纳米孔传感器件，其特征在于，所述二维材料为二硫化钼、石墨烯、云母、氮化硼中的一种、两种或三种的复合材料结构。
5.根据权利要求1所述的基于二维层状材料的纳米孔传感器件，其特征在于，所述二维材料层的厚度小于2纳米。
6.根据权利要求1所述的基于二维层状材料的纳米孔传感器件，其特征在于，所述生物大分子为DNA解旋酶、核酸结合蛋白、单链DNA结合蛋白、核酸外切酶或核酸内切酶。
7.权利要求1-6任一项所述基于二维层状材料的纳米孔传感器件的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：在硅材料基底上构建纳米孔，然后在纳米孔上的一面组装一层二维材料，形成二维材料层，在其上制作小孔，与纳米孔贯通，最后在纳米孔另一面上锚定生物大分子。
8.根据权利要求7所述基于二维层状材料的纳米孔传感器件的构建方法，其特征在于，所述二维材料层是通过物理方法或者化学方法自组装形成。
9.根据权利要求7所述基于二维层状材料的纳米孔传感器件的构建方法，其特征在于，所述生物大分子通过化学交联剂或者锚定分子锚定在纳米孔的另一面。
10.权利要求1-6任一项所述基于二维层状材料的纳米孔传感器件的应用，其特征在于，所述传感器件应用于分子传感、分子内部信息表征及分子结构信息或状态信息表征。
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