CN102423636B - 一种用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法,所述固态纳米孔阵列的面积不小于250μm2,单个纳米孔直径为1~200nm,孔密度不小于1个/μm2,孔内壁修饰有6-28bp的核酸分子、抗原分子、60-200kDa的抗体分子、50-200kDa的蛋白质分子、含6-50个氨基酸的肽分子、硅烷分子)中的一种或两种以上的任意比例的混合物,使1-50μl含浓度为1-10nmol·ml-1杂质分子或1μg/ml以下的杂质颗粒的溶液通过所述固态纳米孔阵列时,杂质分子或颗粒被化学修饰的纳米孔阵列所截留,所述硅烷分子的结构式为Y(CH2)nSiXmZ3-m,其中,n=0~3;m=0~3。
Description
技术领域
本发明涉及一种用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法。
背景技术
纳米孔是指在纳米至微米级厚度基材上的,直径在1至数百纳米的,贯通基材两面的孔洞。纳米孔从制备方法上分为两类。由生物分子形成的天然纳米孔,称生物纳米孔,以及人们使用微纳加工技术得到的纳米孔,称为固态纳米孔。生物纳米孔的应用起源于1996年,该年Kasianowicz及其同事首次报道了单链DNA或RNA在电场作用下通过α-溶血素纳米孔,并且得到分子通过孔时产生了阻塞电流(Blockade Current)的现象,可以依次获得每一个碱基通过纳米孔时阻塞电流幅度。由于不同的碱基产生的阻塞电流都有相应的降低幅度,根据这个可以区分出四种碱基,以获得了DNA或者RNA分子的序列成分。另外还可以通过阻塞电流持续的时间推算出阻塞整个分子的长度,研究表明通过改进这种方法,原理上可以实现直接、快速的检测单链DNA或RNA分子碱基的方法[Branton D,et al.,Nature Biotechnol.2008,26,1146-1153;Deamer D W,Branton D.Acc Chem Res.2002,35,817-825]。这种检测的方法较前两代检测方法具有更快的检测速度,更低的检测成本,是一种极具吸引力的新研究方向,也是达到低成本测序目标的新技术之一,此方法一经报道立刻引起了界内的广泛注视,大量的研究者也投入到此项技术发展的研究中来。
在首次报道的纳米孔检测方法之后Hagan Bayley及其研究小组[Bayley H. et al.J.Am.Chem.Soc,2006,128,1705-1710;Wu H C,et al.J.Am.Chem.Soc.2007,129,16142-16148]通过化学修饰生物纳米孔的方法,使得纳米孔具备检测特异性。
由于生物纳米孔的为生物活性分子所构成,因此工作条件苛刻,稳定性不佳,使用寿命短且保存不易。研究人员考虑到用各种材料经过微纳米加工工艺,形成固态纳米孔,以代替生物的纳米孔以克服其存在的缺点。2001年Li.et.al等人[Li J,et al.Nature,2001,412,166-169]率先利用自制的带离子束反馈控制系统,在Si3N4薄膜上刻蚀出60nm的纳米孔,这是世界上关于固态纳米孔的首次报道。
固态纳米孔相对于生物纳米孔来说具有更易保存,化学稳定性好,大小尺寸控制方便等优势,因此近几年固态纳米孔的研究成为热点。固态纳米孔的制备方法较多,一般使用高能聚焦粒子轰击基材表面形成。例如,Li小组利用自制的离子束反馈控制系统在Si3N4薄膜上刻蚀纳米孔,Dekker小组[Ling X S,et al.Nature Mater,2003,2,537-540]利用300KV的TEM高能电子束SiO2薄膜刻蚀纳米孔,还有其他小组利用FEI公司的电子离子束双束控制系统刻蚀[Gadgil V J,et al.Surf Coat Technol,2009,203,2436-2441;Lo C J,Aref T, Bezryadin A.Nanotechnol,2006,17:3264-3267]。此外,也有使用电化学腐蚀[Siwy Z,Fulinski A.Am.J.Phys.,2004,72,567-574]以及激光加热[Ling X S,et al.Nano Lett,2006,6,2571-2576]等方法制备固态纳米孔的报道。
在生物医学、生命科学、化学工业等领域中,随着对产物纯度要求的不断提高,从大量分子中分离微量杂质,特别是有毒有害杂质成为提高产率和产品质量以及保障使用安全的急需技术。在产物分离纯化领域中,目前常用的技术有电泳分离、层析色谱、超速离心、沉淀分离等方法。这些技术有着各自的应用范围,但其主要缺点有:1)分离过程本身会引入新的杂质;2)分离度有限,无法达到对单分子杂质进行绝对的分离;这些缺点对某些具体应用可能造成不利后果。例如,在DNA克隆和文库制备时,如果无法将杂质DNA分子全部去除,在扩增过程中,杂质会与目标序列同时进行大量扩增,则制备出的克隆或文库的纯度和可靠性都会下降,对这些样品的后续使用如DNA测序等会造成准确度下降、数据后处理困难等。
发明内容
本发明提供一种用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法,可以实现对杂质分子的高效、可控分离。
所述用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法为,所述固态纳米孔阵列的面积不小于250μm2,单个纳米孔直径为1~200nm,孔密度不小于1个/μm2,孔内壁修饰有6-28bp的核酸分子、抗原分子、60-200kDa的抗体分子、50-200kDa的蛋白质分子、含6-50个氨基酸的肽分子、硅烷分子)中的一种或两种以上的任意比例的混合物,使1-50μl含浓度为1-10nmol·ml-1杂质分子或1μg/ml以下的杂质颗粒的溶液通过所述固态纳米孔阵列时,杂质分子或颗粒被化学修饰的纳米孔阵列所截留,所述硅烷分子的结构式为Y(CH2)nSiXmZ3-m,其中,n=0~3;m=0~3,X和Z各自独立的为氯基、甲氧基、乙氧基或甲氧基乙氧基;Y为乙烯基、氨基、环氧基、巯基或脲基。纳米孔密度优选不大于2000个/μm2,更优选为5~1000个/μm2。
作为优选方案,单个纳米孔直径为10-50nm,纳米孔阵列修饰有γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷,在偏置电压驱动下,溶液通过所述固态纳米孔阵列时,粒径大于纳米孔有效孔径的杂质被截留。
作为优选方案,单个纳米孔直径为1~180nm,通过对纳米孔阵列两面加载偏置电压,溶液中的杂质分子在电场作用下泳动至纳米孔附近并与孔内壁修饰的分子结合并被截留,从而无法通过纳米孔阵列进入到另外一侧的溶液中,实现杂质的特异性分离。
本发明制备纳米孔阵列所需的基材主要为硅基材料。硅基材料通常是指单晶或多晶硅、二氧化硅或氮化硅材料。通过热氧化的方式在硅基底上生长一层几十纳米的二氧化硅薄膜,或使用化学气相沉积(Chemical Vapor Deposition,CVD)、溅射等方法在硅片一面沉积一层纳米级氮化硅薄膜,反面涂光刻胶然后曝光显影,并进行干法刻蚀或湿法腐蚀将硅材料去除,形成窗口,窗口上张有低应力自支撑二氧化硅或氮化硅薄膜。市面上亦有商品化基材产品提供。
基材上纳米孔阵列的制备主要通过以下现有方法实现:聚焦离子束(FIB)、电子束曝光、投射电子显微镜(TEM)、印记刻蚀法(Track echting)等。通过这些方法,在基材上刻蚀出两面贯通的,密度大于一个孔/μm2,孔径1-200nm的纳米孔阵列。
可以通过已知的材料表面修饰分子的方法在纳米孔内壁修饰分子。对纳米孔阵列的表面修饰,为了使分子成功修饰在纳米孔内,必须使用低表面张力溶剂,如甲醇等,将待修饰的分子溶于低表面张力的溶剂中。为了获得低表面张力,溶剂中还可以使用0.03-0.5%的离子型或非离子型表面活性剂。同时要修饰的特异性分子作为溶质应在溶液中保持极低浓度(1ngml-1μgml-1)。常用于修饰分子的材料有:戊二醛、聚乙二醇(2-10kDa),或具有结合特异性的分子,如单链DNA分子(8-28bp),抗原,抗体(60-200kDa),有机硅烷(如γ-氨丙基甲基三乙氧基硅烷)等等。其中特异性分子可以特异性地结合溶液中的杂质分子,如与工作目标无关或对工作形成干扰和污染的DNA、蛋白质或抗原等生物小分子,使之无法通过纳米孔进入薄膜另一端的溶液中。这样就实现了通过纳米孔阵列的溶液中杂质颗粒和分子的去除。
固态纳米孔技术物质分离技术可以克服目前微量物质分离方法的不足。通过制备固态纳米孔阵列,并表面修饰以非特异或者特异性的分子,可以控制所需要的分子通过纳米孔,而杂质颗粒和分子被选择性地截留在纳米孔阵列中不得通过。
具体实施方式
实施例1:
实施步骤:
1)选用4英寸多晶硅晶圆,通过硅工艺制备厚度在30nm的低应力自支撑氮化硅薄膜。通过聚焦离子束(FIB)刻蚀(15秒),或透射电子显微镜(TEM)刻蚀(180-200秒),得到密度920个/μm2,平均孔径为30nm的固态纳米孔阵列并用激光切割成为边长5mm的正方形纳米孔芯片;
2)将含有固态纳米孔的氮化硅纳米孔芯片浸入含有98%浓硫酸及过氧化氢溶液(体积比7∶3)的混合物中加热至95℃,水合30分钟,使表面带有大量的硅羟基和硅氧键;
3)用有机硅烷分子,如:1.5%γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷的甲醇溶液50μl(含0.1%Triton-X100非离子型表面活性剂)室温处理氮化硅薄膜2小时,去离子水洗净并干燥;
4)在纳米孔阵列的正面加入50μl含不同大小二氧化硅微球的混合溶液,分散液为1M氯化钾溶液,其中含有8nm和27nm的二氧化硅微球各1μg/ml。纳米孔阵列的背面加入1M氯化钾溶液50μl。用电化学工作站面在纳米孔阵列的两面加一100mV的偏置电压,其中正面接负极。此时微球在电场力作用下通过纳米孔阵列。经过30分钟电泳后,在纳米孔阵列的反面收集到二氧化硅微球。经动态光散射检测,直径为8纳米的二氧化硅微球的浓度接近1μg/ml,而27nm微球浓度极低无法准确检测其浓度。经TEM制样观察,收集液中27nm微球与8nm微球之比约为1∶220,即分离比约为220,即:100mV偏置电压下仅允许8nm微球通过。而其他实验条件不变,将偏置电压调高至400mV时,两种微球都能够顺利通过纳米孔阵列到达芯片的另一侧溶液中,由此实现了不同尺寸纳米颗粒的可控分离。
效果:
1)以γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷为例空间尺寸固定的纳米孔,其在纳米孔表面的2个锚点排列成直线既保证了修饰的牢固性,与常见硅烷化试剂APTES相比该修饰分子又具有溶液中的可摆动性;
2)在偏置电压的驱动下,部分纳米微粒可以通过纳米孔,另一部分则由于修饰层的阻挡作用而无法通过。上例两种微粒的分离比可达220;
3)直径可控的纳米孔阵列“分子筛”可用于高效分离空间尺寸不同但化学组分相近的纳米微粒。
实施例2:
实施步骤:
1)在直径为2.5英寸,厚度为300μm的洁净硅片上使用化学气相沉积法(CVD)生长厚1μm的氮化硅薄膜;
2)在氮化硅薄膜上通过旋涂法,转速为2000rpm制备均匀KodakTMKPR光刻胶层,厚度约1μm;
3)制备微球悬浊液,即直径为20纳米的纳米金的水——甲醇极稀悬液(1ng/ml)。用旋涂法以2000rpm的速度将1μl该悬液均匀涂布于光刻胶上,加热到80℃,使溶剂迅速蒸发。这种方法可以得到纳米颗粒在光刻胶上的松散分布,成为随机掩膜,密度约560个/μm2;
4)经过电子束曝光后,洗去未曝光的光刻胶;
5)使用氢氟酸腐蚀暴露的氮化硅薄膜20分钟,再次洗去光刻胶,最后得到密度约560个/μm2,平均孔径33nm,锥角为83°的锥形纳米孔阵列;最后使用激光切割成为边长5mm的正方形纳米孔阵列芯片;
6)氧等离子体(功率100W)处理纳米孔阵列2分钟,氨气等离子体(功率100W)处理纳米孔阵列3分钟,使阵列表面携带活性氨基;
7)对纳米孔阵列修饰戊二醛作为手臂分子。在弱碱性(pH8-8.5)条件下,戊二醛的一端醛基连接纳米孔壁上的氨基,形成希夫氏碱,再经过硼氰化钠还原,形成稳定的酰胺键;
8)使用1μg/mlRNA酶抗体(anti-RNaseA)水溶液(含0.9%氯化钠和0.1%TritonX-100表面活性剂),室温下处理纳米孔阵列1小时,超纯水冲洗3遍洗脱未牢固结合的抗体分子。手臂分子(戊二醛)的存在可以使得抗体的结合位点暴露在溶液中,保证抗体的结合活性;
9)在纳米孔阵列一面加入20μl含有浓度为5nmol/l牛血清白蛋白(BSA)和5nmol/lRNA酶A(RNase A)水溶液,并加入足量0.9%氯化钠溶液,施加100mV偏置电压电泳60分钟,在纳米孔的另一侧收集到的溶液,使用酶联免疫反应(ELISA)或高效液相色谱(HPLC)均能够检出BSA,但均无法检出RNA酶A的存在,说明修饰过的纳米孔阵列通过抗原——抗体反应与纳米孔阵列中的RNA酶A发生特异性结合。因此,痕量RNA酶无法通过纳米孔阵列进入另一侧的溶液中,而溶液中其他成分可以自由通过纳米孔阵列。
效果:
1)本实施实例通过特异性抗原——抗体结合原理,构建特异性分子筛,分离和去除溶液中的单分子蛋白质杂质,如RNA酶A;
2)通过纳米孔阵列后的溶液中不含有RNA酶A,可以用作RNA合成、剪切等操作及RNA表达谱分析等研究。
3)随着截留的分子增多,纳米孔的有效孔径会不断变小,在检测上体现为电阻变大最后趋于无法导通,但经添加SDS变性剂的的温热磷酸洗液(pH≈4.0)洗脱后,纳米孔的分离活性可部分恢复。
实施例3:
实施步骤:
1)纳米孔阵列制造工艺同实施例2的1)-7)步;其中纳米金平均直径120nm,其余工艺不变,可得到平均孔径为180nm的纳米孔阵列,其密度为8-15个/μm2。
2)用浓度为1μg/ml的抗HIV-1p24单克隆抗体水溶液(含0.9%氯化钠和0.1%TritonX-100)处理纳米孔阵列1小时,大量去离子水洗脱未牢固结合的抗体分子和表面活性剂。
3)在纳米孔阵列正面加入50μl浓度为103μl1HIV病毒悬液,反面加入50μl 0.9%氯化钠溶液,施加100mV偏置电压电泳60分钟,在纳米孔的另一侧收集到的溶液,使用PCR和琼脂糖凝胶电泳方法均无法检测到HIV病毒。虽然纳米孔的孔径大于HIV病毒的平均直径,但HIV病毒无法通过修饰过的纳米孔阵列进入另一侧溶液。说明修饰过的纳米孔阵列通过抗原——抗体反应与纳米孔阵列中的HIV病毒发生特异性结合。因此,HIV病毒无法通过纳米孔隙,保证了另一侧的收集液为无病毒的清洁溶液。
效果:
1)通过修饰纳米孔,可以实现样品中微量病毒的分离,从而得到不含病毒的样品溶液;
2)相比超滤法,此方法的优点在于对病毒有结合特异性;
3)高特异性和高分离度,可有效捕捉单个病毒颗粒;
4)因此该应用实例可用于实验室和临床医学对含微量病毒的样品,如含HIV血清、体液、脑脊液中微量HIV病毒的分离,无病毒的洁净样品。
实施例4:
实施步骤:
1)纳米孔阵列的制备同实施例1中的1)-2)步;
2)首先使用1ml γ-氨丙基甲基三乙氧基硅烷甲醇溶液(APTES,1.5%v/v)处理纳米孔2小时,超纯水洗净后,再用1ml戊二醛(1.5%v/v)水溶液(含0.1%十二烷基磺酸钠)处理纳米孔1小时,然后用大量超纯水洗净干燥,使孔壁上携带活性醛基;
3)使用1ml浓度为1nmol/l的末端氨基化DNA序列5’-H2N-ATATCGCT-3’处理纳米孔1小时,超纯水洗净。该DNA序列可以通过希夫氏碱经硼氢化钠还原形成酰胺键而连接在纳米孔内壁上;
4)在纳米孔阵列一侧加50μl浓度各为1nmol/ml的含有与以上探针例互补的核酸序列5’-AGCGATAT-3’以及两碱基错配5’-AGCCAGAT-3’的水溶液(含0.9%氯化钠)并用电化学工作站施加偏置电压100mV,电泳1小时候对另一面收集液进行PCR和杂交定性检测。经杂交,鉴定收集液中含有5’-AGCCAGAT-3’序列,但与修饰探针完全正配的5’-AGCGATAT-3’几乎无法检出,说明另一侧样品池中不含需要去除的DNA分子序列。
效果:
1)通过核酸探针修饰纳米孔,可以捕获特定的杂质分子,如单链DNA或RNA。核算酸探针长度为6-28bp;
2)杂质捕获的灵敏度高,可实现最低单分子核酸杂质的截留与分离;
因此,本实施例可用于实验室中对核酸溶液中已知序列的微量单链DNA或RNA杂质的高质量高效纯化分离。
Claims (3)
1.一种用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法,其特征在于,所述固态纳米孔阵列的面积不小于250μm2,单个纳米孔直径为1~200nm,孔密度不小于1个/μm2,孔内壁修饰有6-28bp的核酸分子、抗原分子、60-200kDa的抗体分子、50-200kDa的蛋白质分子、含6-50个氨基酸的肽分子、硅烷分子中的一种或两种以上的任意比例的混合物,使1-50μl含浓度为1-10nmol·ml-1杂质分子或1μg/ml以下的杂质颗粒的溶液通过所述固态纳米孔阵列时,杂质分子或颗粒被化学修饰的纳米孔阵列所截留,所述硅烷分子的结构式为Y(CH2)nSiXmZ3-m,其中,n=0~3;m=0~3,X和Z各自独立的为氯基、甲氧基、乙氧基或甲氧基乙氧基;Y为乙烯基、氨基、环氧基、巯基或脲基。
2.如权利要求1所述的用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法,其特征在于,单个纳米孔直径为10-50nm,纳米孔阵列修饰有γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷,在偏置电压驱动下,溶液通过所述固态纳米孔阵列时,粒径大于纳米孔有效孔径的杂质被截留。
3.如权利要求1所述的用化学修饰固态纳米孔阵列分离溶液中杂质的方法,其特征在于,单个纳米孔直径为1~180nm,通过对纳米孔阵列两面加载偏置电压,溶液中的杂质分子在电场作用下泳动至纳米孔附近并与孔内壁修饰的分子结合并被截留,从而无法通过纳米孔阵列进入到另外一侧的溶液中,实现杂质的特异性分离。
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