CN105866398B - 检测抗原抗体特异性结合的纳米通道及其制备方法和检测方法 - Google Patents

检测抗原抗体特异性结合的纳米通道及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种纳米笼结构的纳米通道，包括呈三明治结构的顶部SiN薄膜层、中间SiO2夹层和底部SiN薄膜层；所述顶部SiN薄膜层上加工有一个孔面积略大于待测抗原的最大截面小于待测抗体的最小截面的小纳米孔，所述底部SiN薄膜层上与小纳米孔轴向对齐处加工有一个孔径大于小纳米孔的大纳米孔，所述小纳米孔和大纳米孔之间的SiO2被腐蚀成中空纳米笼结构。将纳米笼结构纳米通道的两端连接两个充满离子溶液的液池单元，将抗原和抗体添加同一液池中，即靠近小纳米孔一侧。当在正反向电压下都测得离子电流变化时，说明抗原和抗体没有特异性结合。如果只在正向电压下测得离子电流变化，说明抗原抗体发生特异性结合，由此可以实现对抗原或抗体分子的辨识检测。

Description

检测抗原抗体特异性结合的纳米通道及其制备方法和检测 方法
技术领域
本发明涉及一种新型纳米笼结构的纳米通道制备，通过将单种抗原分子通过纳米通道时所造成的离子电流阻塞信号和抗原/抗体结合物运动到纳米孔口附近时所造成的碰撞信号对比，达到对某种抗原/抗体特异性结合的检测辨识目的。
背景技术
目前，固态纳米孔主要是在Si3N4、SiO2、Al2O3、石墨烯、MoS2等薄膜上制备。所制备的纳米孔形状可分为两种：一种是在十几纳米厚的薄膜上加工形成的纳米孔，其侧面形状为沙漏状或圆柱状；另一种则是在如单层石墨烯、MoS2等二维材料上加工出纳米孔。以上纳米孔的加工一般涉及如下几种微制造技术：低压力化学气相沉淀(LP-CVD)，主要是在氧化硅、氮化物、多晶硅等基底上沉积一层薄膜，纳米孔的加工在此薄膜上进行。电子束诱导氧化回流：利用电子束光刻技术加工出的直径40nm以上的纳米孔，再利用TEM氧化回流技术，使得纳米孔直径缩至10nm以下。聚焦离子束技术(FIB)，利用离子以物理溅射的方式在薄膜表面加工出纳米孔。此外，还有离子束刻蚀、径迹刻蚀、电子束诱导溅射刻蚀等技术也被用于纳米孔的制备。目前制备的纳米孔在抗原、抗体检测方面普遍存在几个问题：1、抗原分子通过纳米通道时的离子电流阻塞信号和抗原分子运动到孔口附近造成的碰撞信号之间无法有效区分开来。2、从离子电流信号的变化情况上无法直接判断抗原分子是否过孔。3、抗原检测和抗原/抗体结合物检测之间无法连续进行，实验操作复杂，不易保证实验准确性。
发明内容
技术问题：为了克服上述现有纳米孔检测技术的不足，本发明提供了一种新型纳米笼结构的纳米通道，它能有效的区分抗原分子通过纳米孔时的过孔信号和碰撞信号，同时也提供了一种效率高、操作简单、准确性好的抗原/抗体特异性结合物的辨识检测方法。
技术方案：一种纳米笼结构的纳米通道，包括呈三明治结构的顶部SiN薄膜层、中间SiO2夹层和底部SiN薄膜层；所述顶部SiN薄膜层为底部SiN薄膜层的薄膜厚度为中间SiO2夹层的厚度为所述顶部SiN薄膜层上加工有一个孔面积略大于待测抗原的最大截面小于待测抗体的最小截面的小纳米孔，所述底部SiN薄膜层上与小纳米孔轴向对齐处加工有一个孔径大于小纳米孔的大纳米孔，所述小纳米孔和大纳米孔之间的SiO2被腐蚀成中空腔体，所述小纳米孔、中空腔体和大纳米孔呈中空纳米笼结构。所述中空腔体的径向长度为大纳米孔直径的3-6倍。
本发明还提供一种利用所述纳米笼结构的纳米通道对抗原抗体特异性结合的辨识检测方法，具体步骤如下：
(1)选取纳米笼结构的纳米通道，所述纳米通道中小纳米孔的孔面积大于抗原的最大截面小于抗体的最小截面；
(2)取两个盛有离子溶液的液池，分别连接纳米通道的小纳米孔和大纳米孔；
(3)将已知抗体和未知抗原、或者已知抗原和未知抗体加入到连接小纳米孔的液池中，其中，抗原的数量小于抗体的数量；
(4)在小纳米孔处施加正电压，大纳米孔处施加负电压，检测离子电流；
(5)在小纳米孔处施加负电压，大纳米孔处施加正电压，检测离子电流；
(6)若步骤(4)中测得离子电流变化，步骤(5)中未测得离子电流变化，则说明抗原和抗体发生特异性结合；若步骤(4)和步骤(5)中都测得离子电流变化，则说明抗原和抗体没有发生特异性结合。
本发明还提供一种制备所述纳米笼结构的纳米通道的方法，具体步骤如下：
1)利用LP-CVD技术在硅基底上自下而上依次沉积权利要求1中所述呈三明治结构的底部SiN薄膜层、中间SiO2夹层和顶部SiN薄膜层；
2)利用RIE技术和TMAH刻蚀部分硅基底，在悬空的底部SiN薄膜层上加工出大纳米孔，在顶部SiN薄膜层上与大纳米孔轴向对齐处加工出小纳米孔；
3)利用HF将小纳米孔和大纳米孔之间的SiO2腐蚀成中空腔体，得到纳米笼结构的纳米通道。
本发明中顶部SiN薄膜层和底部SiN薄膜层形成大小两个纳米孔，两端分别连接盛有离子溶液的液池，且已知抗体和未知抗原、或者已知抗原和未知抗体加入到连接小纳米孔的液池中。若抗原和抗体没有发生特异性结合，抗原分子最大截面小于小纳米孔面积，当施加正向电压驱动时，抗原分子从小纳米孔进入中空腔体，由于笼内空间和大孔直径的限制，抗原分子不易运动到体态溶液中；当施加反向电压时，抗原分子从小纳米孔逃出，也产生离子电流变化。若抗原和抗体发生特异性结合，结合后的分子最小截面大于小纳米孔面积，当施加正向电压驱动时，抗原和抗体发生特异性结合的分子与小纳米孔发生碰撞，能够离子电流变化；但是当施加反向电压时，无分子从小纳米孔逃出，不能产生离子电流变化。所以若施加正向电压能够测得离子电流变化，施加反向电压不能够测得离子电流变化，则说明抗原和抗体发生特异性结合；若施加正反向电压都测得离子电流变化，则说明抗原和抗体没有发生特异性结合。
有益效果：本发明中纳米孔直径是可控的，可以针对不同的抗原分子加工出不同孔径大小的纳米笼结构的纳米通道。只要保证纳米孔直径略大于待测抗原分子的直径，就能具备较高的灵敏度，能够准确判断抗原分子的过孔情况，实现对抗原分子过孔信号和碰撞信号的甄别。
利用抗原与抗体的特异性结合和上述过孔和碰撞信号区分原理，在已知抗体或抗原的情况下，能够快速有效的检测出对应的抗原或抗体分子。这对于未来疾病诊断和治疗具有重要意义。
该方法成本低制备方法简单，制得的纳米单孔结构强度高、信噪比较低、灵敏度较高，将大规模应用到纳米流体传感器中，大大降低检测的成本。
附图说明
图1是纳米笼结构的纳米通道示意图，
图2是纳米笼结构纳米通道对抗原分子过孔和碰撞信号区分检测示意图，以及在已知抗体(抗原)分子情况下，对抗原分子辨识检测示意图。
在图中有：硅基底1，底部SiN薄膜层2，中间SiO2夹层3，顶部SiN薄膜层4，大纳米孔5，中空腔体6，小纳米孔7，抗原分子8，抗原抗体结合物9。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
如图1所示，一种纳米笼结构的纳米通道，包括呈三明治结构的顶部SiN薄膜层、中间SiO2夹层和底部SiN薄膜层；所述顶部SiN薄膜层为底部SiN薄膜层的薄膜厚度为中间SiO2夹层的厚度为所述顶部SiN薄膜层上加工有一个孔面积略大于待测抗原的最大截面小于待测抗体的最小截面的小纳米孔，所述底部SiN薄膜层上与小纳米孔轴向对齐处加工有一个孔径大于小纳米孔的大纳米孔，所述小纳米孔和大纳米孔之间的SiO2被腐蚀成中空腔体，所述小纳米孔、中空腔体和大纳米孔呈中空纳米笼结构。所述中空腔体的径向长度为大纳米孔直径的3-6倍。
一种制备所述纳米笼结构的纳米通道的方法，具体步骤如下：
1)利用LP-CVD技术在硅基底上自下而上依次沉积权利要求1中所述呈三明治结构的底部SiN薄膜层、中间SiO2夹层和顶部SiN薄膜层；沉积时，硅基底下表面在加工上表面时自然形成与上表面类似结构，利用反应离子刻蚀(RIE)技术对该结构的下表面刻蚀出正方形槽，将槽中三明治结构剥离。
2)利用RIE技术和TMAH刻蚀部分硅基底，在悬空的底部SiN薄膜层上加工出大纳米孔，在顶部SiN薄膜层上与大纳米孔轴向对齐处加工出小纳米孔；
3)利用HF将小纳米孔和大纳米孔之间的SiO2腐蚀成中空腔体，得到纳米笼结构的纳米通道。
对于抗原抗体特异性结合的辨识检测方法如图2所示。由于离子电流大小往往由纳米通道的最窄处决定，所以让抗原分子从小孔进入能够提高装置灵敏度。本发明中顶部SiN薄膜层和底部SiN薄膜层形成大小两个纳米孔，两端分别连接盛有离子溶液的液池，且已知抗体和未知抗原、或者已知抗原和未知抗体加入到连接小纳米孔的液池中。若抗原和抗体没有发生特异性结合，抗原分子最大截面小于小纳米孔面积，当施加正向电压驱动时，抗原分子从小纳米孔进入中空腔体，由于笼内空间和大孔直径的限制，抗原分子不易运动到体态溶液中；当施加反向电压时，抗原分子从小纳米孔逃出，也产生离子电流变化。若抗原和抗体发生特异性结合，结合后的分子最小截面大于小纳米孔面积，当施加正向电压驱动时，抗原和抗体发生特异性结合的分子与小纳米孔发生碰撞，能够离子电流变化；但是当施加反向电压时，无分子从小纳米孔逃出，不能产生离子电流变化。所以若施加正向电压能够测得离子电流变化，施加反向电压不能够测得离子电流变化，则说明抗原和抗体发生特异性结合；若施加正反向电压都测得离子电流变化，则说明抗原和抗体没有发生特异性结合。
因而本实施例中，一种利用所述纳米笼结构的纳米通道对抗原抗体特异性结合的辨识检测方法，具体步骤如下：
(1)选取纳米笼结构的纳米通道，所述纳米通道中小纳米孔的孔面积略大于待测抗原的最大截面小于待测抗体的最小截面；
(2)取两个盛有离子溶液的液池，分别连接纳米通道的小纳米孔和大纳米孔，使得离子溶液充满整个纳米通道；
(3)将已知抗体和未知抗原、或者已知抗原和未知抗体加入到连接小纳米孔的液池中，其中，抗原的数量小于抗体的数量；
(4)在小纳米孔处施加正电压，大纳米孔处施加负电压，检测离子电流；
(5)在小纳米孔处施加负电压，大纳米孔处施加正电压，检测离子电流；
(6)若步骤(4)中测得离子电流变化，步骤(5)中未测得离子电流变化，则说明抗原和抗体发生特异性结合；若步骤(4)和步骤(5)中都测得离子电流变化，则说明抗原和抗体没有发生特异性结合。根据实验结果，就能精准判断未知抗原或抗体的种类。在本方法中有几个必要条件需要保证才来实现抗原/抗体特异性结合辨识检测：1、抗原分子的数量小于抗体的数量，这是为了保证所有抗原分子都与抗体结合。2、抗原分子的体积小于小纳米孔直径，抗体的直径要大于小纳米孔的直径，这样才能保证只有抗原能够进入孔内。
本方法制备的纳米单孔的直径在1-100nm,适合不同介质的尺寸范围。由于纳米孔直径略大于待测介质的直径，所以具备较高的灵敏度。该方法成本低制备方法简单，制得的纳米单孔结构强度高、信噪比较低、灵敏度较高，将大规模应用到纳米流体传感器中，大大降低检测的成本。

Claims (3)

1.一种纳米笼结构的纳米通道，其特征在于，包括呈三明治结构的顶部SiN薄膜层、中间SiO2夹层和底部SiN薄膜层；所述顶部SiN薄膜层为底部SiN薄膜层的薄膜厚度为中间SiO2夹层的厚度为所述顶部SiN薄膜层上加工有一个孔面积略大于待测抗原的最大截面小于待测抗体的最小截面的小纳米孔，所述底部SiN薄膜层上与小纳米孔轴向对齐处加工有一个孔径大于小纳米孔的大纳米孔，所述小纳米孔和大纳米孔之间的SiO2被腐蚀成中空腔体，所述小纳米孔、中空腔体和大纳米孔呈中空纳米笼结构；所述中空腔体的径向长度为大纳米孔直径的3-6倍。
2.一种利用权利要求1所述纳米笼结构的纳米通道对抗原抗体特异性结合的辨识检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)选取纳米笼结构的纳米通道，所述纳米通道中小纳米孔的孔面积大于抗原的最大截面小于抗体的最小截面；
(2)取两个盛有离子溶液的液池，分别连接纳米通道的小纳米孔和大纳米孔；
(3)将已知抗体和未知抗原、或者已知抗原和未知抗体加入到连接小纳米孔的液池中，其中，抗原的数量小于抗体的数量；
(4)在小纳米孔处施加正电压，大纳米孔处施加负电压，检测离子电流；
(5)在小纳米孔处施加负电压，大纳米孔处施加正电压，检测离子电流；
(6)若步骤(4)中测得离子电流变化，步骤(5)中未测得离子电流变化，则说明抗原和抗体发生特异性结合；若步骤(4)和步骤(5)中都测得离子电流变化，则说明抗原和抗体没有发生特异性结合。
3.一种制备权利要求1所述纳米笼结构的纳米通道的方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)利用LP-CVD技术在硅基底上自下而上依次沉积权利要求1中所述呈三明治结构的底部SiN薄膜层、中间SiO2夹层和顶部SiN薄膜层；
2)利用RIE技术和TMAH刻蚀部分硅基底，在悬空的底部SiN薄膜层上加工出大纳米孔，在顶部SiN薄膜层上与大纳米孔轴向对齐处加工出小纳米孔；
3)利用HF将小纳米孔和大纳米孔之间的SiO2腐蚀成中空腔体，得到纳米笼结构的纳米通道。
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