CN1799683A - 基于金纳米通道阵列的分离筛选工具及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是基于金纳米通道阵列的分离筛选工具。在固体支撑物中集成有孔径均一的纳米管柱阵列。即是无机金纳米通道阵列的模板材料。该模板材料的金纳米通道阵列的制备分为6个步骤：模板材料的清洗；敏化；活化；纳米金的沉积；通道的清洗；金纳米通道阵列的修饰。由于所用支撑物容易获得，合成方法也简单。该金纳米通道刚性大，其表面上更容易发生各种化学生物反应，修饰简单，容易引入选择因子，可实现对生物活性物质及天然药物大分子以及环境污染物质的分离和检测，而且是无损检测，分离效率高，不需要后续处理，清洗和再生也简单易行，更适合于实际检测分离环境下的应用。本分离筛选工具的制备方法是一个既具有普遍适用性又具有前沿性的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物纳米筛选工具技术的改进，具体讲是一种基于金纳米通道阵列的分离筛选工具及其制备方法，其属于药物、生物大分子、有机分子、离子的分离、纯化和分析科学技术领域。
背景技术
在当今分离和分析科学技术中，如何在保证生物活性的前提下，对生物有关组分进行有效分离和检测，是本领域技术人员们普遍关注的热点问题。例如有一种基于α-溶血素(α-HL)跨磷脂双层细胞膜形成的单通道，其在本领域技术研究中显示出重要的应用价值。该单通道检测技术及其发展为纳米通道技术的创立提供了测量基础。现有技术中利用α-HL形成的通道，通过检测电流的变化，仅对单链DNA和RNA测序有应用价值。但是，由于传统的双层膜结构的稳定性不高，容易破碎，在很多的实际检测技术环境中难以发挥出分离和检测作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种选择性及分离效率大大提高的分离筛选工具，即基于金纳米通道阵列分离筛选工具。该分离筛选工具相对于α-HL形成的单通道，要具有大大增强的通透能力，其通道的刚性比单通道要大，以便使其更适合于实际分离和检测环境下的应用，如使该通道能够选择性透过生物大分子及无机阳阴离子。
发明的目的之二是提供一种选择性及分离效率大大提高的分离筛选工具的制备方法。该方法对制备条件要求不苛刻，所用分离筛选工具之一的模板材料容易获得，其合成制备方法简单，使得该方法是既具有普遍适用性又具有前沿性的方法。
因此，本发明在获取更高的通道选择能力和更稳定的载体方面进行研究，在这方面，纳米通道技术是作为生物纳米技术研究的重要内容之一。纳米通道技术为对生物有关组分进行有效分离和检测问题的解决，提供了一个新的手段。由于金及其离子是良好的导电材料，在电解质溶液中控制电压可使金(Au)及其离子荷正电或负电，其选择性透过生物大分子及无机阳阴离子。所以，金纳米通道更容易发生各种化学生物反应，修饰简单，容易引入选择因子。因此，本发明在纳米通道新的表面上，用金纳米通道为多个单通道的阵列组合构成了新的分离筛选工具。
本发明的基于金纳米通道阵列中主要的化学反应如下：
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了一种基于金纳米通道阵列的分离筛选工具。该工具为固体支撑物，该支撑物中集成有孔径均一的纳米管柱阵列；即，每平方厘米上至少集成有102个内径为1-500nm的、长度至少为5μm的无机金纳米通道阵列。
所述的固体支撑物，其为集成有孔径均一的纳米管柱阵列的模板材料，该模板材料的厚度不大于1cm，在该模板材料的每平方厘米上至少集成有102个内径为5-500nm的无机金纳米通道阵列。
所述的模板材料，其为由聚烷氧类嵌段共聚物，或麦芽糖及其衍生物，或酒石酸及其衍生物，或羟甲基丙酸，或甘油，或季戊四醇，或葡萄糖及其聚合物，其中一种或几种制成的模板材料，还包括：聚碳酸酯滤膜，或氧化铝膜，或氧化硅膜，或塑料膜，或玻璃及其纤维。
一种所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法。所述的方法其制备步骤如下：
1)模板材料的清洗：将模板材料浸入无水乙醇中，超声震荡10-30分钟，再用无水乙醇冲洗2-3次；
2)模板材料的敏化：将清洗后的模板材料在SnCl2溶液中浸泡，浸泡温度控制在4-40℃，浸泡时间0.2-12小时，浸泡过程中持续通入N2；
3)模板材料的活化：将敏化后的模板材料以乙醇溶液充分冲洗，再放到AgNO3溶液中浸泡温度控制在4-40℃，浸泡时间0.1-72小时，并持续通入N2；
4)纳米金的沉积：将活化后的模板材料用水冲洗5遍，再置于金沉积试剂溶液中，保持温度0-5℃于低温摇床上，沉积时间2-144小时；
5)通道的清洗：将上述金通道进一步在浓HNO3中浸洗4-72小时，以除去其表面上未反应的Sn2+和Ag+离子；
6)金纳米通道阵列的修饰：将金纳米通道阵列浸入一定浓度的修饰试剂溶液中浸泡温度控制在4-40℃，浸泡时间2-168小时，浸泡过程中持续通入N2。
所述的SnCl2溶液，其浓度范围为0.1-2400mM。
所述的AgNO3溶液，其浓度范围为0.4-400mM。
所述的金沉积试剂溶液，其中金沉积试剂包括有：三氯二(1，2-乙二胺)金，或亚硫酸金盐，或Au(OH)3，或KAu(OH)4，或HAuCl4；其中还添加相对金沉积试剂过量的葡萄糖溶液，或甲醛液，或肼液，或硼氢化钠溶液。
所述的修饰试剂溶液，其浓度范围0.2-4000mM。
所述的修饰试剂溶液，其为半胱胺酸溶液，或胍溶液，或巯基硫醇溶液。
本发明可带来以下有益效果：由于研制了一种基于金纳米通道阵列的分离筛选工具。该工具为固体支撑物，该支撑物中集成有孔径均一的纳米管柱阵列；即，每平方厘米上至少集成有102个内径为1-500nm的、长度至少为5μm的无机金纳米通道阵列。所述的固体支撑物，其为集成有孔径均一的纳米管柱阵列的模板材料，该模板材料的厚度不大于1cm，在该模板材料的每平方厘米上至少集成有102个内径为5-500nm的无机金纳米通道阵列。尤其对于本发明的模板材料之一的模板膜，其孔率较高，一般可达102-109个孔/cm2。因此，基于金纳米的通道若为集成的纳米管柱阵列，其就充分发挥了纳米尺度的巨大的比表面积效应，增大了有效分离面积；同时，该模板膜的厚度只有4-25μm，金沉积后所得通道的长度不过几十μm。检测样品在该金纳米通道内的滞留时间非常短，这样大大降低检测样品在该金纳米通道内的吸附，所以提高了检测样品的分离效率。该金纳米通道对检测样品的分离过程是无损过程，因此不需要后续处理，这样大大简化了操作过程。本发明的金纳米通道阵列的清洗和再生过程也很简单易行，因此不存在由于膜污染严重，而引起检测模板膜的使用寿命缩短的问题，这样大大缩短了检测样品的分离运行费用。本发明的金纳米通道阵列的模板膜还容易修饰和再生，这也降低了检测样品的分离操作费用。本发明的基于金纳米通道阵列分离筛选工具相对于α-HL形成的单通道，以金纳米通道为多个单通道的阵列组合，因此其通透能力大大增强。本发明的金纳米通道的刚性比单通道的大，更适合于实际检测样品的分离环境下的应用。由于在区别于单通道膜的新的金纳米通道表面上，金纳米通道更容易发生各种化学生物反应，修饰简单，容易引入选择因子。
本发明的制备方法还有以下优点：其能合成直径很小的管状或纤维材料(最小可到1nm)的固体支撑物。这种固体支撑物中每平方厘米截面上至少集成有102个内径为1-500nm的、长度至少为5μm的无机金纳米通道阵列。由于其通道的孔径大小一致，因此合成的固体支撑物材料(如玻璃及其纤维)同样是具有孔径相同、单分散的金纳米管柱阵列的固体支撑物。在其通道的孔中形成的金纳米通道和金纳米纤维容易从固体支撑物中分离出来。本发明的基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法对制备条件要求不苛刻，所用的固体支撑物也容易获得，其合成方法也简单。因此，本发明的制备方法可以实现糖类，蛋白质，酶，DNA，激素等生物活性物质及天然药物等生物大分子以及环境有机污染分子、无机分子、阴阳离子等物质的分离和检测，是一个既具有普遍适用性又具有前沿性的方法。
附图及其具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步说明如下：
图1为基于金纳米通道阵列分离筛选工具的分离装置示意图(左右分离方式)。
图2为基于金纳米通道阵列的模板材料膜的原子力显微镜表面成像图。
图3为修饰的金纳米通道阵列的模板材料膜对两种有机物质的分离效果图。
图4为金纳米通道阵列的模板材料膜上电位Em的变化趋势图。
本发明实际研制了一种基于金纳米通道阵列的分离筛选工具。该工具为固体支撑物2，该支撑物2中集成有孔径均一的纳米管柱阵列；即，每平方厘米上至少集成有102个内径为1-500nm的、长度至少为5μm的无机金纳米通道阵列。图1中进样液1通过固体支撑物2的模板材料2′中的金纳米通道阵列的吸附分离作用，得到了图1的分离装置图中所要分离的透过液3，该模板材料2′中的金纳米通道选择性只允许透过液3通过，实现了透过分离检测效果，见图1中放大的透过原理4所示。
所述的固体支撑物2，其为集成有孔径均一的纳米管柱阵列的模板材料2′，该模板材料2′的厚度不大于1cm，在该模板材料2′的每平方厘米上至少集成有102个内径为5-500nm的无机金纳米通道阵列。
所述的模板材料2′，其为由聚烷氧类嵌段共聚物，或麦芽糖及其衍生物，或酒石酸及其衍生物，或羟甲基丙酸，或甘油，或季戊四醇，或葡萄糖及其聚合物，其中一种或几种制成的模板材料2′，还包括：聚碳酸酯滤膜，或氧化铝膜，或氧化硅膜，或塑料膜，或玻璃及其纤维膜。
一种所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法。所述的方法其制备步骤如下：
1)模板材料2′的清洗：将模板材料2′浸入无水乙醇中，超声震荡10分钟，再用无水乙醇冲洗3次；
2)模板材料2′的敏化：将清洗后的模板材料2′在SnCl2溶液中浸泡，浸泡温度控制在25℃，浸泡时间1-8小时，浸泡过程中持续通入N2；
3)模板材料2′的活化：将敏化后的模板材料2′以乙醇溶液充分冲洗，再放到AgNO3溶液中浸泡温度控制在25℃，浸泡时间10分-12小时，并持续通入N2；
4)纳米金的沉积：将活化后的模板材料2′用水冲洗5遍，再置于金沉积试剂溶液中，保持温度3℃于低温摇床上，沉积时间72小时；
5)通道的清洗：将上述金通道进一步在浓HNO3中浸洗4-72小时，以除去其表面上未反应的Sn2+和Ag+离子；
6)金纳米通道阵列的修饰：将金纳米通道阵列浸入一定浓度的修饰试剂溶液中浸泡温度控制在20℃，浸泡时间12-24小时，浸泡过程中持续通入N2。
所述的SnCl2溶液，其浓度为2000mM。
所述的AgNO3溶液，其浓度为200mM。
所述的金沉积试剂溶液，其中金沉积试剂包括有：三氯二(1，2-乙二胺)金，或亚硫酸金盐，或Au(OH)3，或KAu(OH)4，或HAuCl4；其中还添加相对金沉积试剂过量的葡萄糖溶液，或甲醛液，或肼液，或硼氢化钠溶液。
所述的修饰试剂溶液，其浓度范围2500mM。
所述的修饰试剂溶液，其为半胱胺酸溶液，或胍溶液，或巯基硫醇溶液。
实施例1，基于金纳米通道阵列的模板材料2′的制备：
将模板材料2′(由聚烷氧类嵌段共聚物，或麦芽糖及其衍生物，或酒石酸及其衍生物，或羟甲基丙酸，或甘油，或季戊四醇，或葡萄糖及其聚合物，其中一种或几种制成的模板材料2′；或氧化铝膜，或玻璃膜，或聚碳酸酯滤膜，或氧化铝膜，或氧化硅膜，或塑料膜，或玻璃纤维膜)浸入无水乙醇中，超声震荡10min，再用无水乙醇冲洗2-3次。将清洗后的模板材料2′在SnCl2溶液中浸泡60min。充分冲洗后，放到AgNO3溶液中浸泡10min。将活化后的模板材料2′用水冲洗5遍，置于添加葡萄糖的HAuCl4金沉积液中，保持温度5℃于低温摇床上沉积过夜。将通道进一步在25％HNO3中浸洗24小时，以原子力显微镜观察100nm(上)、50nm(下)模板材料2′金沉积前(左1)后(右2)表面性貌(见图2)。
实施例2，基于金纳米通道阵列的模板材料2′(膜)对药物的分离性能：
以孔径为100nm的多孔氧化铝为模板材料2′(膜)，以添加甲醛液的亚硫酸金盐沉积液，按照实施例1的过程制备金纳米通道阵列模板材料2′(膜)。将制备的金纳米通道阵列模板材料2′(膜)浸入半胱氨酸溶液中，浸泡过程中持续通入N2。半胱氨酸通过巯基自组装到金的表面，然后将金纳米通道阵列模板材料2′(膜)用乙醇润洗，在空气中自然晾干。
采用如图1所示的分离装置，将本发明的金纳米通道阵列模板材料2′(膜)置于流通池的中间，并以O型圈加以密封，作为分离实验装置。该装置可以同时检测流通模板材料2′(膜)两边的进样液和透过液。实验时，将荧光素(FL)和维生素B2(VB2)的溶液置于进样池中，透过液中空白溶液，保持两溶液的体积相同，对该模板材料2′(膜)的金纳米通道进行修饰。同一时刻分别从进样液和透过液中取样，测量两液样品的荧光强度，测量后将溶液放回该分离装置中，以保持实验的平行可比性。
修饰后的金纳米通道阵列模板材料2′(膜)对荧光素(FL)和维生素B2(VB2)的选择性传输如图3所示。其中C/C0为透过液中被测物质的浓度与进样液中被测物质的浓度的比值。图3表明金纳米通道阵列膜具有良好的选择性。
实施例3，基于金纳米通道阵列的模板材料2′(膜)对生物大分子的分离性能：
以玻璃膜为模板材料2′(膜)制备金纳米通道阵列。通过原子力显微镜观察，每平方厘米上大约有108个内径为55nm左右、长度为10μm的金纳米通道。将半胱氨酸修饰的金纳米通道阵列模板材料2′(膜)作为分离的载体，测定了pH值为4.5时该膜对牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白(IGg)混合溶液在的分离效果，分别以S’和S表示。S’为透过池中单位面积上BSA和IgG的质量(mg/cm2)随时间t(h)的变化的比值)，S为透过池中单位面积上BSA和IgG的百分透过量(％/cm2)随时间t(h)的变化的比值。经过一定的时间后，S’和S分别为252.8和31.6。
与前人研究相比，如Stroeve利用直径为8.7nm的Au纳米通道分离了BSA/BHb(Stokes半径分别为3.55nm和2.79nm)，最高分离度为4.2。本文所用的分离载体孔径为55nm左右，相对BSA和IgG(Stokes半径分别为3.55nm和5.90nm)来说，非常不利于分离，但获得了高达31.6的绝对分离度，同时分离载体孔径的增大使迁移速率加快，这表明本发明的基于金纳米通道阵列模板材料2′(膜)提出的分离方法具有很高的分离效率，其中的半胱氨酸修饰试剂在分离的过程中发挥了重要的作用。
实施例4，基于金纳米通道阵列的模板材料2′(膜)对环境有机污染物的分离性能：
以聚碳酸酯膜为模板材料2′(膜)制备金纳米通道阵列。以胍溶液修饰的金纳米通道阵列模板材料2′(膜)为分离载体，将金纳米通道阵列模板材料2′(膜)固定在如图1所示的流通分离装置。其 中，苯胺盐酸盐和罗丹明B的混合溶液注入进样池中。透过池中为20mmol/L的Na3PO4溶液，进样池和透过池中溶液的体积均为20ml，分别测试了pH值为1.98、5.15和11.98时金纳米通道的选择分离性能，以相对选择分离系数K1表示。其中，C10、C20为进样池中溶液的初始浓度。
分离实验结果表明，在不同的pH值下，苯胺盐酸盐和罗丹明B均可透过半胱氨酸修饰的金纳米通道阵列迁移，但通道对苯胺盐酸盐和罗丹明B的分离效果不同。pH值分为1.98时，K1为1.8；pH值为5.15时，K1为1.2；pH值为11.98时，K1为6.1。因此，pH值为11.98时，修饰的金纳米通道对苯胺盐酸盐和罗丹明B的混合溶液分离能力最大。同时当pH值为11.98时，苯胺盐酸盐的迁移速度较最高，因此，分离效果最好。
实施例5，基于金纳米通道阵列的模板材料2′(膜)的典型及阴阳离子分离性能：
以塑料膜为模板材料2′(膜)制备金纳米通道阵列。将基于金纳米通道阵列模板材料2′(膜)固定在如图1所示的流通分离装置池上。对模板材料2′(膜)加负电位时，该金纳米通道表现出理想的阳离子选择性渗透。反之，则表现出理想的阴离子选择性渗透。即加负电位时，金纳米通道内壁存在过量的负电荷(Cl-)，排斥阴离子；加正电位时发生了相反的情况，阳离子被排斥而阴离子可通过。不同浓度的KCl溶液中模板材料2′(膜)膜电位(Em)的变化(见图4)明确的表明了这一点。
实施例6，基于金纳米通道阵列的模板材料2′(膜)对离子的分离性能：
以玻璃纤维膜为模板材料2′(膜)制备金纳米通道阵列。将巯基硫醇修饰的金纳米通道阵列模板材料2′(膜)安装在如图1所示的流通分离装置池上。将一定浓度的MV2+离子和Ru(bpy)3 2+离子溶液注入进样池中。按照不同的间隔时间的测定透过池中MV2+离子和Ru(bpy)3 2+离子的浓度。结果，MV2+离子可以透过，而Ru(bpy)3 2+离子未检到。从而实现了离子对的分离。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
Claims (9)
1、一种基于金纳米通道阵列的分离筛选工具，其特征在于：该工具为固体支撑物，该支撑物中集成有孔径均一的纳米管柱阵列；即，每平方厘米上至少集成有102个内径为1-500nm的、长度至少为5μm的无机金纳米通道阵列。
2、根据权利要求1所述基于金纳米通道阵列的分离筛选工具，其特征在于：所述的固体支撑物，其为集成有孔径均一的纳米管柱阵列的模板材料，该模板材料的厚度不大于1cm，在该模板材料的每平方厘米上至少集成有102个内径为5-500nm的无机金纳米通道阵列。
3、根据权利要求2所述基于金纳米通道阵列的分离筛选工具，其特征在于：所述的模板材料，其为由聚烷氧类嵌段共聚物，或麦芽糖及其衍生物，或酒石酸及其衍生物，或羟甲基丙酸，或甘油，或季戊四醇，或葡萄糖及其聚合物，其中一种或几种制成的模板材料，还包括：聚碳酸酯滤膜，或氧化铝膜，或氧化硅膜，或塑料膜，或玻璃及其纤维膜。
4、一种如权利要求1所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法，其特征在于：所述的方法其制备步骤如下：
1)模板材料的清洗：将模板材料浸入无水乙醇中，超声震荡10-30分钟，再用无水乙醇冲洗2-3次；
2)模板材料的敏化：将清洗后的模板材料在SnCl2溶液中浸泡，浸泡温度控制在4-40℃，浸泡时间0.2-12小时，浸泡过程中持续通入N2；
3)模板材料的活化：将敏化后的模板材料以乙醇溶液充分冲洗，再放到AgNO3溶液中浸泡温度控制在4-40℃，浸泡时间0.1-72小时，并持续通入N2；
4)纳米金的沉积：将活化后的模板材料用水冲洗5遍，再置于金沉积试剂溶液中，保持温度0-5℃于低温摇床上，沉积时间2-144小时；
5)通道的清洗：将上述金通道进一步在浓HNO3中浸洗4-72小时，以除去其表面上未反应的Sn2+和Ag+离子；
6)金纳米通道阵列的修饰：将金纳米通道阵列浸入一定浓度的修饰试剂溶液中浸泡温度控制在4-40℃，浸泡时间2-168小时，浸泡过程中持续通入N2。
5、根据权利要求4所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法，其特征在于：所述的SnCl2溶液，其浓度范围为0.1-2400mM。
6、根据权利要求4所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法，其特征在于：所述的AgNO3溶液，其浓度范围为0.4-400mM。
7、根据权利要求4所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法，其特征在于：所述的金沉积试剂溶液，其中金沉积试剂包括有：三氯二(1，2-乙二胺)金，或亚硫酸金盐，或Au(OH)3，或KAu(OH)4，或HAuCl4；其中还添加相对金沉积试剂过量的葡萄糖溶液，或甲醛液，或肼液，或硼氢化钠溶液。
8、根据权利要求4所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法，其特征在于：所述的修饰试剂溶液，其浓度范围0.2-4000mM。
9、根据权利要求8所述基于金纳米通道阵列分离筛选工具的制备方法，其特征在于：所述的修饰试剂溶液，其为半胱胺酸溶液，或胍溶液，或巯基硫醇溶液。
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