CN115112729B - 基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，通过镧基金属有机笼与磷酸基分子结合，从而实现对磷酸基分子的检测。本发明所述的方法包括：制备具有三位空间结构的镧基金属有机笼；镧基金属有机笼与待测磷酸基分子连接；搭建固态纳米孔检测平台并进行检测。本发明克服了在纳米孔传感器检测小目标物难以被检测到的缺陷，放大了检测信号，样品消耗量少，扩展了纳米孔传感器对目标物的检测范围。
Description
技术领域
本发明属于固态纳米孔单分子检测领域，尤其涉及一种基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法。
背景技术
基于纳米孔的电阻脉冲传感已成为一种用于无标记单分子检测的通用技术。在典型的纳米孔传感器中，包含嵌入悬浮隔离膜中的纳米孔的纳米孔芯片连接两个充满电解质溶液的腔室。通过浸入两个腔室中的一对Ag/AgCl电极施加的电场，目标分析物在电泳力的驱动下，依次通过纳米孔，引起一系列电流阻断，从而提供了有关大小、电荷和分析物的生物分子相互作用的丰富信息。固态纳米孔在悬浮薄膜(通常是绝缘的无机硅基材料)中制造，与生物对应物相比，具有可调节的几何形状和卓越的稳定性，已将分析物的多样性扩大到包括核酸、蛋白质和生物分子复合物。然而，与其生物对应物相比，固态纳米孔的几何结构也存在重复性差的缺点。生物纳米孔可以在埃级别上复制出相同直径的纳米孔，但是使用TEM重复地制造小于5nm的固态纳米孔仍然具有挑战性，它极大地阻碍了固态纳米孔作为高通量生物传感平台的未来应用。如今，氦离子显微镜已成为一种流行的制造装置，在快速、可重复地制造固态纳米孔或纳米孔阵列方面具有巨大潜力。大于5nm的纳米孔尺寸是制造纳米孔的最佳区域。
同时，大家公认纳米孔的尺寸是影响固态纳米孔器件灵敏度的主要因素。由于商业仪器的时间分辨率不足和分析物的排除体积不足，无法使用大纳米孔探测亚4kDa蛋白质或短肽。在大纳米孔的情况下，通常使用载体来放大小分析物的输出信号。因此，提出一种具有信号放大增加易位事件检测率的固态纳米孔单分子传感方法以克服当前单分子生物分子纳米孔传感的不足显得尤为必要。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法。
技术方案：本发明的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，包括以下步骤：
(1)制备具有三维空间结构的镧基金属有机笼：首先将苯-1，3，5-三羧酸反应生成1，3，5-苯三羰基氯化物，然后将苯丙氨酸溶液添加到亚硫酰氯中，混合反应生成苯丙氨酸甲酯；将苯丙氨酸甲酯和1，3，5-苯三羰基氯化物反应得到L-Me3，将其加入到LiOH中，得到H3L配体；在甲酸中混合加热La(NO3)·6H2O和H3L，得到PCC-57。
(2)镧基金属有机笼与磷酸基分子连接：将步骤(1)制备的镧基金属有机笼溶于二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，常温超声混合，加入待测磷酸基分子，形成镧基金属有机笼与磷酸基分子复合物；所述磷酸基分子为核酸、核酸与肽链复合物、磷酸盐中的一种；
(3)搭建固态纳米孔检测平台；
(4)采用固态纳米孔检测平台进行检测：将步骤(2)中制备的镧基金属有机笼与磷酸基分子复合物加入到步骤(3)搭建的固态纳米孔检测平台进行检测。
进一步地，步骤(2)中，所述镧基金属有机笼与磷酸基分子的浓度比优选的为1：1。
作为本发明所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子方法的一个优选方案：步骤(2)中，将所述镧基金属有机笼溶于DMSO溶剂中常温超声1h。
作为本发明所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子信号方法的一个优选方案：所述镧基金属有机笼称取量为1mg，溶于1ml DMSO溶液中常温超声1h。
作为本发明所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子信号方法的一个优选方案：镧基金属有机笼的浓度为374nM。
进一步地，所述步骤(3)中固态纳米孔检测平台通过以下方法构建：采用特氟龙检测池，检测池上具有3mm流体通道，将带有纳米尺度孔洞的固态纳米孔芯片安装在检测池中，并将电解质溶液加入到检测池的流道内，形成固态纳米孔检测平台。金属有机笼溶液与作为电解质的0.3M NaCl溶液的体积比为1：9；上述溶液在应用时，总体积优选为50μL。
进一步地，所述固态纳米孔芯片为厚度为10～40nm的氮化硅纳米孔芯片，采用透射电镜法(TEM)制备得到后用体积比为3：1的H2SO4溶液与H2O2的混合溶液处理，100～130℃浸泡8～12min，超纯水清洗后氮气吹干。
进一步地，步骤(4)中，所述采用固态纳米孔检测平台进行检测，包括将所述镧基金属有机笼与磷酸基分子复合物溶液加入到固态纳米孔检测平台的检测池的一侧流道内，将一对Ag/AgCl点击分别浸入所述检测池流道内的电解质溶液中，施加-1000mV～1000mV的跨膜电压，采集电流时间轨迹图。
进一步地，所述固态纳米孔检测平台通过以下方法构建：采用特氟龙检测池，检测池上具有3mm流体通道，将带有纳米尺度孔洞的固态纳米孔芯片安装在检测池中，并将电解质溶液加入到检测池的流道内，形成固态纳米孔检测平台。
进一步地，所述固态纳米孔芯片为厚度为10～40nm的氮化硅纳米孔芯片。
进一步地，所述氮化硅纳米孔芯片用体积比为3：1的H2SO4溶液与H2O2的混合溶液处理，100～130℃浸泡8～12min，清洗，氮气吹干。
进一步地，固态纳米孔采用透射电镜法(TEM)制备得到。
本发明制备的PCC-57由于镧基可作为载体，与待检测的磷酸基分子的磷酸根相互作用而连接，形成金属有机笼与磷酸基分子复合物，克服了大孔径下难以检测小目标物的挑战。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子信号放大方法，操作简单高效，无需标记，克服了单分子小目标物在应用纳米孔传感器检测时检测时过孔速度过快的缺陷，增加检测信号的电流变化幅值，样品消耗量小，检测的灵敏度高。本发明能准确、实时实现对单分子磷酸基分子的检测，对生命科学研究中的单分子检测具有重要的指导意义。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的镧基金属有机笼结合磷酸基分子复合物示意图；
图2是本发明实施例2制备的镧基金属有机笼与多聚磷酸结合的多聚磷酸分子复合物在400mV时电流轨迹图；
图3是本发明实施例3制备的镧基金属有机笼与寡核苷酸结合的寡核苷酸复合物在400mV时电流轨迹图；
图4是本发明实施例2制备的镧基金属有机笼与核酸和肽链复合物结合的核酸与肽链复合物在400mV时电流轨迹图；
图5是本发明对照组1制备的EDTA与镧基金属有机笼结合的寡核苷酸复合物在400mV时电流轨迹图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。
实施例1
多聚磷酸分子的检测
(1)镧基金属有机笼与多聚磷酸分子复合物的制备
①首先将苯-1，3，5-三羧酸反应生成1，3，5-苯三羰基氯化物，然后将苯丙氨酸溶液添加到亚硫酰氯中，混合反应生成苯丙氨酸甲酯；将苯丙氨酸甲酯和1，3，5-苯三羰基氯化物反应得到L-Me3，将其加入到LiOH中，得到H3L配体；在甲酸中混合加热La(NO3)·6H2O和H3L，得到PCC-57。
②将已制备好的1mg镧基金属有机笼PCC-57溶于1ml DMSO中，常温超声1h，混合均匀；将0.2μL多聚磷酸盐(polyP45)溶液加入上述混合溶液，涡旋，离心1min，混合均匀，PCC-57会与polyP45结合，浓度比为4：3。
③制备所得金属有机笼与磷酸基复合物，该结构见图1所示，图中PCC-57通过镧基与磷酸基分子的磷酸基团连接，解决了在大孔径下难以检测到小目标物的问题，放大了目标物信号。
利用固态纳米孔检测平台进行磷酸基分子检测的原理见图1。
(2)搭建固态纳米孔检测平台
①取直径为8nm，厚度为20nm的氮化硅(SiNx)纳米孔芯片，将其用新配置的食人鱼溶液(V(H2SO4)：V(H2O2)＝3：1)处理，浸泡在其中110℃，8min。然后用超纯水清洗，清洗后用氮气吹干。
②将处理后的芯片安装在检测池中，将电解质溶液0.3M NaCl溶液加入到检测池的流道内，确保纳米孔为唯一的电解池连通通道，从而形成固态纳米孔检测平台。
(3)采用固态纳米孔检测平台进行检测
①将氮化硅纳米孔检测平台放置在屏蔽笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统；
②将配制好的PCC-57溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于PCC-57在pH＝7.3条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保金属笼分子在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
③清洗氮化硅纳米孔芯片，并放置在屏蔽笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统。
④将实施例1配制好的polyP45溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于polyP45在pH＝7.3条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保多聚磷酸分子在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
⑤清洗氮化硅纳米孔芯片，并放置在屏蔽笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统。
⑥将配制好的PCC-57与polyP45混合溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于该复合物在pH＝7.3条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保多聚磷酸分子在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
实施例2
寡核苷酸分子的检测
(1)镧基金属有机笼与寡核苷酸分子复合物的制备
①采用实施例1同样方法制备镧基金属有机笼PCC-57。
②将已制备好的1mg镧基金属有机笼PCC-57溶于1ml DMSO中，常温超声1h，混合均匀；将0.2μL寡核苷酸(OligoA25)溶液加入上述混合溶液，涡旋，离心1min，混合均匀，PCC-57会与OligoA25结合，浓度比为1：1。
(2)搭建固态纳米孔检测平台
①取直径为8nm，厚度为30nm的氮化硅(SiNx)纳米孔芯片，将其用新配置的食人鱼溶液(V(H2SO4)：V(H2O2)＝3：1)处理，浸泡在其中120℃，10min。然后用超纯水清洗，清洗后用氮气吹干。
②将处理后的芯片安装在检测池中，将电解质溶液0.3M NaCl溶液加入到检测池的流道内，确保纳米孔为唯一的电解池连通通道，从而形成固态纳米孔检测平台。
(3)采用固态纳米孔检测平台进行检测
①将氮化硅纳米孔检测平台放置在屏蔽笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统；
②将配制好的OligoA25溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于OligoA25在pH＝7.3条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保寡核苷酸分子在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
③清洗氮化硅纳米孔芯片，并放置在屏蔽笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统。
④将配制好的PCC-57与OligoA25混合溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于该复合物在pH＝7.3条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保寡核苷酸分子在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
实施例3
核酸与肽链复合物分子的检测
(1)镧基金属有机笼与核酸与肽链复合物分子复合物的制备
①采用实施例1同样方法制备镧基金属有机笼PCC-57。
②将已制备好的1mg镧基金属有机笼PCC-57溶于1ml DMSO中，常温超声1h，混合均匀；将0.2μL核酸与肽链复合物(Angiopep-2-oligoA20)溶液加入上述混合溶液，涡旋，离心1min，混合均匀，PCC-57会与Angiopep-2-oligoA20结合，浓度比为5：1。
(2)搭建固态纳米孔检测平台
①取直径为8nm，厚度为35nm的氮化硅(SiNx)纳米孔芯片，将其用新配置的食人鱼溶液(V(H2SO4)：V(H2O2)＝3：1)处理，浸泡在其中125℃，12min。然后用超纯水清洗，清洗后用氮气吹干。
②将处理后的芯片安装在检测池中，将电解质溶液0.3M NaCl溶液加入到检测池的流道内，确保纳米孔为唯一的电解池连通通道，从而形成固态纳米孔检测平台。
(3)采用固态纳米孔检测平台进行检测
①将氮化硅纳米孔检测平台放置在屏蔽笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统；
②将配制好的Angiopep-2-oligoA20溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于Angiopep-2-oligoA20在pH＝7.3条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保多聚磷酸分子在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
③清洗氮化硅纳米孔芯片，并放置在屏蔽笼中，将Ag/AgCl电极分别浸入到固态纳米孔检测平台的流道内电解质溶液中，并连接膜片钳检测系统。
④将配制好的PCC-57与Angiopep-2-oligoA20混合溶液样品加入到检测池的一侧，并施加相应的偏置电压，由于该复合物在pH＝7.3条件下显电负性，因此，在检测池的加样侧施加负电压，另一侧施加正电压，确保核酸与肽链复合物在静电力作用下能够穿过纳米孔通道。
电流阻断信号分析：
对采集到的单分子易位信号的阻断电流进行分析。对于电流阻断幅值：PCC-57与polyP45复合物出现信号，PCC-57与OligoA25复合物出现信号，PCC-57与Angiopep-2-oligoA20复合物出现信号。
图2为400mV时多聚磷酸测试图。图2a为PCC-57穿孔电流轨迹图，从图2a中可看出，PCC-57过孔，无信号；图2b为polyP45穿孔电流轨迹图，从图2b中可看出，polyP45过孔，无信号；图2c为PCC-57与polyP45复合物穿孔电流轨迹图，从图3中可看出：PCC-57+polyP45过孔，有信号产生。
图3为400mV时寡核苷酸测试图。图3a为PCC-57穿孔电流轨迹图，从图3a中可看出，PCC-57过孔，无信号；图3b为OligoA25穿孔电流轨迹图，从图3b中可看出，OligoA25过孔，无信号；图3c为PCC-57与OligoA25复合物穿孔电流轨迹图，从图3中可看出：PCC-57+OligoA25过孔，有信号产生。
图4为400mV时核酸与肽链复合物测试图。图4a为Angiopep-2-oligoA20穿孔电流轨迹图，从图4a中可看出，Angiopep-2-oligoA20过孔，无信号；图4b为PCC-57与Angiopep-2-oligoA20复合物穿孔电流轨迹图，从图4中可看出：PCC-57+Angiopep-2-oligoA20过孔，有信号产生。
从以上数据可知：PCC-57作为载体与磷酸基分子结合后可检测到对应目标物。
对照组1：PCC-57与OligoA25的连接
将浓度为0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)加入到PCC-57与OligoA25的混合溶液中，从图5中可看出，无穿孔信号产生，这是由于EDTA与PCC-57的镧基结合占据磷酸根结合位置，导致PCC-57与OligoA25无法结合。
传统的磷酸基分子检测较为复杂耗时，并且由于其分子较小，普通的检测手段难以将其检测到。本发明公开了镧基金属有机笼可以作为通用的分子载体，实现快速对磷酸基分子检测，并放大了检测信号，大大提高了固态纳米孔的灵敏度和选择性，特别是对于传统上难以检测的小型分析物。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备具有三维空间结构的镧基金属有机笼；
（2）镧基金属有机笼与磷酸基分子连接：将步骤（1）制备的镧基金属有机笼溶于二甲基亚砜（DMSO）溶剂中混合均匀，加入待检测磷酸基分子，形成镧基金属有机笼与磷酸基分子复合物；
（3）搭建固态纳米孔检测平台；
（4）采用固态纳米孔检测平台进行检测：将步骤（2）中制备的镧基金属有机笼与磷酸基分子复合物加入到步骤（3）搭建的固态纳米孔检测平台进行检测；
所述步骤（1）中镧基金属有机笼由以下方法制备得到：首先将苯-1，3，5-三羧酸反应生成1，3，5-苯三羰基氯化物，然后将苯丙氨酸溶液添加到亚硫酰氯中，混合反应生成苯丙氨酸甲酯；将苯丙氨酸甲酯和1，3，5-苯三羰基氯化物反应得到L-Me3，将其加入到LiOH中，得到H3L配体；在甲酸中混合加热La(NO3)•6H2O和H3L，得到镧基金属有机笼PCC-57。
2.根据权利要求1所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述镧基金属有机笼与磷酸基分子的浓度比为1：1，所述磷酸基分子为核酸、核酸与肽链复合物、磷酸盐中的一种。
3.根据权利要求1所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述搭建固态纳米孔检测平台具体包括膜片钳仪器，氮化硅芯片，数据输出装置。
4.根据权利要求1所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，所述固态纳米孔检测平台通过以下方法构建：采用特氟龙检测池，检测池上具有3 mm流体通道，将带有纳米尺度孔洞的固态纳米孔芯片安装在检测池中，并将电解质溶液加入到检测池的流道内，形成固态纳米孔检测平台。
5.根据权利要求4所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，所述固态纳米孔芯片采用透射电镜法（TEM）制备得到。
6.根据权利要求4所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，所述固态纳米孔芯片为厚度为10~40 nm的氮化硅纳米孔芯片。
7.根据权利要求6所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，所述氮化硅纳米孔芯片用体积比为3：1的H2SO4溶液与H2O2的混合溶液处理，100~130oC浸泡8~12 min，清洗，氮气吹干。
8.根据权利要求1所述的基于镧基金属有机笼的固态纳米孔检测磷酸基分子的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述采用固态纳米孔检测平台进行检测，具体为将所述镧基金属有机笼与磷酸基分子复合物溶液加入到固态纳米孔检测平台的检测池的一侧流道内，将一对Ag/AgCl点击分别浸入所述检测池流道内的电解质溶液中，施加-1000 mV~1000 mV的跨膜电压，采集电流时间轨迹图。
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