CN111521766A - 人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用。纳米孔结构为在电解质溶液中，人工合成的大环化合物插入磷脂双分子层膜中，形成的纳米尺寸通道的跨膜纳米孔结构；大环化合物一般具有直径为
Figure DDA0002445788180000012
的空腔，大环化合物的空腔具有原子级别厚度为
Figure DDA0002445788180000011
，本发明设计的人工合成的大环化合物在磷脂双分子层上形成稳定的单分子结构独特，与常见的跨膜纳米孔皆不同，空腔厚度仅为原子级别，化学结构统一，化学性质稳定，可以形成稳定的单个纳米孔通道，实验重复性、统一性高。

Description

人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物分析与检测领域，具体地说，是一种人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用。
背景技术
跨膜纳米孔已经成为了化学和生物传感的有力工具，并在DNA测序方面也取得了显著的成功，跨膜生物纳米孔可以由多种结构自组装而成，包括蛋白质、多肽、合成的有机化合物，以及DNA折纸等。与固态纳米孔相比，跨膜生物纳米孔通过插入脂质双层，可以与涉及囊泡和细胞以及基于膜的分析平台的应用兼容的更好。此外，跨膜生物纳米孔由于蛋白质结构均一，在检测和DNA测序方面重复性强。但是目前大多数生物纳米孔技术所采用的蛋白质通道存在着分辨率和灵敏度较低等问题。这是由于，传统的生物纳米孔有效厚度或传感长度大于2nm，这导致了目前所公开最好的蛋白质纳米孔进行DNA测序时识别4个(例如MspA 孔，Laszlo,A.,Derrington,I.,Ross,B.et al.Decoding long nanoporesequencing reads of natural DNA.Nat Biotechnol 32,829–833(2014). https://doi.org/10.1038/nbt.2950)或者更多的核苷酸组合序列，无法直接提供单碱基分辨率，大大影响了纳米孔技术的空间分辨率，也限制了目前纳米孔技术从DNA测序发展到蛋白质测序的进一步应用。
大环化合物最早出现在1890年，近期也引发了超分子化学研究和发展的热潮。包括柱芳烃，冠醚，杯芳烃，葫芦脲，环糊精等。下列大环化合物结构集合图中列出了迄今为止大部分大环化合物的种类，其中如由开环合成法构成的柱[n] 芳烃化合物或芳烃乙炔平面刚性大环的衍生物等孔径可达10nm以上。超分子化学在各个领域应用广泛，例如分子识别、传感、分子机器和设备、超分子聚合物、激发态响应材料、超分子催化和药物传递系统等方面。由于大环化合物结构独特，因此将其应用到跨膜纳米孔方向也成为可能。
Figure BDA0002445788160000021
Figure BDA0002445788160000031
本发明的核心设计是采用有机合成的大环结构作为跨膜纳米孔。该结构分子跨膜纳米孔可以通过简单的设计在原子精度级别上更大程度地调节孔的尺寸，动力学和与其他分子的相互作用。除此以外，这些合成的跨膜纳米结构中的孔厚度和大小都可以通过设计调控至单个核苷酸或氨基酸的大小，因此，它们可以为纳米孔DNA测序甚至蛋白质测序提供必要的原子级别空间分辨率。此外，跨膜纳米孔在化学，结构和纳米机械可调性方面都有很大的优势和更大的可能性。
迄今为止，大多数纳米孔传感研究采用包含β-barrel类型的具有疏水表面的孔隙形成跨膜蛋白质等。因为这些蛋白质更容易插入到平面脂质双分子层膜中，这使它们成为传感应用的完美候选，如气溶素，α-溶血素等。然而，其他非β-barrel类型的蛋白质或人工合成的跨膜纳米结构也可能提供优越的分析物识别属性，但使用这类型的纳米孔传感实验受到能否稳定插入脂质中的影响。
比如，亲水性含孔结构，如本发明设计的人工合成的大环结构，需要适当的的化学修饰使其具有脂质锚点(疏水带)，使它们更容易插入到磷脂双分子层中形成跨膜纳米孔结构。对该类纳米孔结构的化学修饰常用的有例如卟啉，胆固醇，硫代磷酸乙酯(EP)，生育酚，长的烷烃链，或多个多肽连接形成的锚等，具体修饰的结构如下表1所示。
表1跨膜纳米结构的侧链修饰类型及结构式
Figure BDA0002445788160000051
Figure BDA0002445788160000061
另外其他非β-barrel型的跨膜纳米结构还有例如含孔的极性蛋白质，也可以加以修饰卟啉使其能稳定存在于脂质中；
因此从结构上看，这些大环结构同传统生物纳米孔结构具有一定的类似性，但是可以实现更高精度的结构控制和理论上单核苷酸或者单氨基酸的空间分辨率，所需化学合成和修饰方案相对传统的蛋白质纳米孔制备也有明显的批量化制备和成本优势。将大环化合物应用于跨膜纳米孔结构进行离子运输应用或生物大分子检测或测序具有很大的发展前景和应用价值。
发明内容
本发明公开了一种人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明公开了一种人工合成的大环化合物在磷脂双分子层上形成稳定的单分子纳米孔结构，纳米孔结构为在电解质溶液中，人工合成的大环化合物插入磷脂双分子层膜中，形成的纳米尺寸通道的跨膜纳米孔结构；人工合成的大环化合物通过自上而下合成的手段解决跨膜纳米孔空腔尺寸和孔径厚度问题，相对于传统蛋白质构成的生物纳米孔可以做到更薄，也可以相对自由的控制空腔孔径。大环化合物一般具有直径为
Figure BDA0002445788160000072
的空腔，如上所述，开环合成法构成的柱[n]芳烃化合物或芳烃乙炔平面刚性大环的衍生物等孔径甚至可达10nm以上。直径为
Figure BDA0002445788160000073
的大环化合物形成的纳米孔可用于选择性离子传输，直径大于
Figure BDA0002445788160000074
可用于DNA单链测序，孔径大于
Figure BDA0002445788160000077
可用于DNA双链测序，直径大于
Figure BDA0002445788160000075
可用于蛋白质测序和蛋白质识别检测等；大环化合物的空腔具有原子级别厚度为
Figure BDA0002445788160000076
形成纳米孔后，在DNA或蛋白质等生物大分子通过空腔时，提高了空间分辨率。对于其他更大尺寸的需求，也可以进一步采用更大的空腔结构。
作为进一步地改进，本发明所述的人工合成的大环化合物具有帮助大环分子镶嵌到磷脂膜中去的侧链，以便于形成稳定的跨膜结构。
作为进一步地改进，本发明所述的侧链以酰胺键或醚键或碳碳键与大环相连。
作为进一步地改进，本发明所述的人工合成的大环化合物为柱芳烃衍生物大环化合物或杯芳烃衍生物或或葫芦脲衍生物或环糊精衍生物或冠醚衍生物或由芳烃构成的大环化合物衍生物。
作为进一步地改进，本发明所述的柱[6]芳烃衍生物大环化合物为EPM，EPM 的分子式为C372H376N32O56，结构式为：。
Figure BDA0002445788160000071
本发明还公开了一种人工合成的大环化合物在磷脂双分子层上形成稳定的单分子纳米孔结构的制备方法，制备步骤为：
1)、通过化学方法合成柱[6]芳烃衍生物大环分子EPM；
2)、流体槽的结构设计；
流体槽用于在磷脂双分子层上进行离子通道的实验，流体槽通过槽壁分隔为顺式侧和反式侧两个腔室，槽壁上开设有支撑孔，磷脂双分子层构建于支撑孔上进而用于镶嵌大环化合物纳米孔结构；
3)、溶解人工合成的大环化合物分子；
将大环化合物分子溶于水中，超声溶解后过滤未溶物质，再将分子溶液分装冷冻保存，每次实验前超声解冻；
4)、电极的制备与器件的连接；
取两段银丝，使用砂纸抛光以除去表面的氧化层，在电镀液中浸入银丝和铂电极，分别作为阳极和阴极，施加电压以制备银/氯化银电极，然后将两根银/ 氯化银电极分别连接膜片钳仪器的探头上，作为正极和地线；
5)、脂质溶液的配制；
6)、脂质溶液的涂抹；
使用毛笔将脂质溶液均匀涂抹在支撑孔两侧，直至孔被均匀覆盖，在室温下等待干燥脂质；
7)、电解质溶液的添加；
每次各移取电解质溶液到顺式侧和反式侧两个腔室中；
8)、实验装置的放置与仪器；
将整个装置放在光学平台上的法拉第箱中，以避免振动和电气干扰，保持单通道电流记录的低噪声，将正极和地线的银/氯化银电极分别浸入顺式侧和反式侧的腔室的溶液中；
打开膜片钳仪器并通过银/氯化银电极向反面施加正电位，顺式侧接地；
9)、磷脂双分子层膜的构建；
使用移液枪在支撑孔上下提拉溶液界面，由于磷脂分子烃链的疏水性，两个脂质溶液形成的脂质单层将开始形成磷脂双分子层膜；
10)、确定磷脂双分子层膜为双层结构；
通过测定磷脂双分子层膜的电容或通过施加破膜电压来确定磷脂双分子层膜为双层结构；
11)、将单个人工合成的大环化合物分子插入磷脂双分子层膜中；
将人工合成的大环化合物分子进行超声解冻，然后使用超纯水稀释，加入 1％wt的非离子表面活性剂，使分子更加分散，防止团聚；
在顺式腔室中非常靠近支撑孔的位置加入人工合成的大环化合物分子的溶液，施加电压，当电流发生跃升说明人工合成的大环化合物分子在磷脂双分子层膜上形成了稳定的纳米孔通道。
作为进一步地改进，本发明所述的流体外槽外表面开设有小孔连通至其圆周槽内，所述的脂质溶液为1,2-二乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱或棕榈酰油酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰甘油溶于癸烷中；所述的步骤 10)中，当磷脂双分子层膜为双层时，电容值应在35-90pF；或者当磷脂双分子层膜为双层时，磷脂双分子层膜在300-400mV的施加电位内破裂；述的步骤 11)中，在加入人工合成的大环化合物分子溶液时不要加入任何气泡；在当电流发生台阶式跳跃时，要及时将电压降低。
作为进一步地改进，本发明所述的流体槽和槽壁材质为聚甲醛树脂或聚四氟乙烯或聚苯乙烯。所述材料皆为疏水性材质，由于磷脂分子尾部烃链的疏水性，两个脂质单层形成磷脂双分子层，所以流体槽材质为疏水性使磷脂双分子层更易在支撑孔两侧形成。
本发明还公开了一种人工合成的大环化合物在磷脂双分子层上形成稳定的单分子纳米孔结构在人工构筑离子通道方面的应用，应用该结构实现高效的钾离子/钠离子选择性运输和其分离。
本发明还公开了一种人工合成的大环结构分子纳米孔结构在生物大分子检测或测序方面的应用，应用该结构实现蛋白质多肽序列测序，或基于相同原理类似生物大分子、化学分子检测及测序。
本发明还公开了一种人工合成的大环结构分子纳米孔结构在生物大分子检测或测序方面的应用，应用该结构实现DNA核酸序列或RNA序列测序。
本发明人工合成的大环化合物在化学，结构和纳米机械可调性方面都有很大的优势和更大的可能性，因此将其应用到纳米孔方面为纳米孔DNA测序甚至蛋白质测序提供了必要的空间分辨率。
本发明的有益效果：
(1)设计的人工合成的大环化合物在磷脂双分子层上形成稳定的单分子结构独特，与常见的跨膜纳米孔皆不同，空腔厚度仅为原子级别，化学结构统一，化学性质稳定，可以形成稳定的单个纳米孔通道，实验重复性、统一性高。
(2)与其他具有钾离子选择性的人工纳米孔相比，EPM分子不需要进行额外的化学修饰就具有相对较高的钾离子选择性，钾离子/钠离子选择因子高达 20。
(3)具有空腔结构的大环分子种类众多，本发明以EPM分子为典型例子论证该类大环分子可以形成稳定纳米孔通道，并且与其他跨膜纳米孔结构相比，人工合成的大环化合物分子空腔厚度为原子级别，为蛋白质测序提供了更高的空间分辨率。
(4)人工合成的大环化合物分子为人工合成的化学结构，空腔上有丰富的修饰位点，因此可以广泛的选择修饰基团使其具有更多不同的化学性质，为其作为纳米孔的应用提供了更高的可能性。
(5)人工合成的大环化合物分子的空腔大小可以根据苯环数量进行自由的调整，为扩孔后将其应用于DNA测序提供了可能性。
(6)实验操作简单，无需多余的修饰或其他后处理即可应用。
附图说明
图1为EPM分子结构示意图；
图中，a为EPM分子的3D几何结构示意图，b为EPM纳米孔的化学结构图， c为EPM分子的MALDI-TOF质谱结果图，d为EPM分子与双层磷脂囊泡结合的冷冻电镜结果图，比例尺为20nm；
图2为流体槽整个纳米孔装置的结构示意图；
图中，1是银/氯化银电极，2是支撑孔，3是反式侧，4是顺式侧，5是电解质溶液，6是磷脂双分子层，7是柱[6]芳烃衍生物大环化合物EPM；8是槽壁。
图3为单个EPM纳米孔离子传输的单通道记录结果图组；a为单个EPM纳米孔在-120mV的500mM氯化钾溶液中逐步插入脂质双层膜中的电流变化示意图；b为EPM纳米孔结构示意图；c为94个单个EPM纳米孔插入双层磷脂膜形成离子通道的电导直方图；d为单个EPM纳米孔的I-V曲线图；e为不同浓度氯化钾溶液中单个EPM纳米孔和门控行为的电流轨迹和归一化电流直方图；
图4EPM纳米孔的钾离子选择性图组。a-c为单个EPM纳米孔在不同浓度氯化钾/氯化钠溶液中的I-V曲线图；d为EPM纳米孔的钾离子选择性与离子强度的关系。e.混合溶液中单个EPM纳米孔的I-V曲线图；f为混合溶液中单个EPM 纳米孔的钾离子选择性与混合溶液中钾离子浓度百分比的关系图；
图5中，a-c为在不同浓度梯度氯化钾和氯化钠溶液中的I-V曲线图；d 为在1M氯化钾-1M氯化钠溶液中的I-V曲线图；
图6中，a.为短肽链GG在100mV下穿过EPM纳米孔时的电流堵塞时间与电流堵塞值之间的关系图；b为短肽链GG在100mV下穿过EPM纳米孔时的电流堵塞时间与电流堵塞事件数量之间的关系图；c为短肽链GG在120mV下穿过EPM 纳米孔时的电流堵塞时间与电流堵塞值之间的关系图；d为短肽链GG在120mV 下穿过EPM纳米孔时的电流堵塞时间与电流堵塞事件数量之间的关系图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步地说明：
本实施例人工合成了一种带有两亲性侧链的柱芳烃大环分子EPM，利用EPM 的特点，以膜片钳实验为基础，成功地在磷脂双分子层6上完成了跨膜纳米孔的单分子通道实验，并以单分子通道为前提进行了一系列实验，发现EPM形成的纳米孔具有选择因子高达20的钾离子选择性，除此之外通过实验证明EPM形成的纳米孔具有蛋白质测序的潜力及应用于DNA测序的可能性。
两亲性侧链的柱芳烃大环分子EPM该分子只具有一个大的刚性的空腔，且稳定性更好，空腔更大，理论直径即原子之间最大距离约为
Figure BDA0002445788160000111
是常见柱[5]芳烃、柱[6]芳烃空腔直径的两倍，本实施例选择的侧链为四个苯丙氨酸连接一个酯乙基，修饰在EPM分子上下端共8个位点上，使其同时具有一定的亲脂性亲水性，且上下两层各带有四个苯丙氨酸的侧链的长度约与磷脂双分子层6厚度(5nm) 相当，增加了分子形成跨膜纳米孔的稳定性。
一种人工合成的大环化合物在磷脂双分子层6上形成稳定的单分子纳米孔结构柱[6]芳烃衍生物大环化合物EPM7，纳米孔结构为在电解质溶液5中，人工合成的大环化合物插入磷脂双分子层6膜中，形成的纳米尺寸通道的跨膜纳米孔结构；大环化合物具有原子级别厚度为
Figure BDA0002445788160000121
及帮助大环分子镶嵌到磷脂膜中去的侧链,EPM的分子式为C372H376N32O56，结构式为：
Figure BDA0002445788160000122
EPM分子的具体结构，尺寸及MALDI-TOF质谱结果见图1。图1为EPM分子结构示意图，图中，a为EPM分子的3D几何结构示意图，b为EPM纳米孔的化学结构，c为EPM分子的MALDI-TOF质谱结果，d为EPM分子与双层磷脂囊泡结合的冷冻电镜结果图，比例尺为20nm。
柱[6]芳烃衍生物大环化合物EPM7的制备方法如下：
1)通过化学方法合成柱[6]芳烃衍生物大环分子EPM：
在4,4'-双(氯甲基)-1,1'-联苯和1,4-二乙氧基苯在二氯甲烷中的溶液中加入氯化铝。反应后分离有机相并浓缩，经柱色谱纯化后重结晶，获得白色固体形式的纯产物。在三氯甲烷中搅拌上述产物和低聚甲醛，然后注入BF3·OEt2，反应后在柱色谱上纯化，得到白色固体的纯产物。在氩气保护下，将该白色固体纯产物溶解在三氯甲烷中，然后加入过量的BBr3。反应后过滤沉淀物。在氩气的保护下，将上述沉淀物，碳酸钾和2-溴乙酸乙酯溶解在的乙腈中，将悬浮液过滤并将滤液浓缩。在柱色谱上纯化，得到白色固体纯产物，为取代基是 -CH3COOCH2CH3的柱[6]芳烃衍生物。
将上述产物即取代基是-CH3COOCH2CH3的柱[6]芳烃衍生物悬浮在水和乙醇的混合物中。加入氢氧化钠后，将混合物回流过夜。将均匀溶液倒入盐酸中；然后将其倒入水中，过滤得白色沉淀产物。将上述白色沉淀， H2N-Phe-Phe-Phe-Phe-Phe-OEt，4-二甲氨基吡啶和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐悬浮在二甲基甲酰胺中，再将悬浮液倒入盐酸中。将产物过滤并干燥。由于多个酰胺键，产物无法通过常规方法纯化，并且将混合物直接用于以下实验中。MALDI-TOF质量的结果表明取代基为 -CH2-CO-NH-Phe-Phe-Phe-Phe-Phe-OEt的柱[6]芳烃衍生物大环分子EPM已成功制备：实测值6254.57。MALDI-TOF谱中的其他峰可归因于部分肽取代的大环和酰胺水解。具体结构，尺寸及MALDI-TOF质谱结果见附图1。
2)、流体槽的结构设计；
图2为流体槽及整个纳米孔装置的结构示意图；流体槽用于在磷脂双分子层 6上进行离子通道的实验，要一个带有支撑孔2的流体槽作为基础，将磷脂双分子层6膜构建在支撑孔2上，进而使用合成的大环分子形成纳米孔。流体槽通过槽壁8分隔为顺式侧4和反式侧3两个腔室，两个腔室用来承载电解质溶液5，两个腔室内分别放入银/氯化银电极1，槽壁8上开设有支撑孔2，磷脂双分子层 6构建于支撑孔2上进而合成大环化合物纳米孔结构。
3)、溶解EPM分子
取1mg EPM分子溶于10mL水中，超声溶解后过滤未溶物质，再将分子溶液分装保存在-80℃的冰箱中，每次实验前取一定量进行超声解冻。
4)电极的制备与仪器的连接
取两段长度约为3cm的银丝，使用砂纸抛光以除去表面的氧化层。在1M氯化钾溶液中浸入四分之三的银丝长度和铂电极(分别作为阳极和阴极)。施加3V 以下电压一段时间以制备银/氯化银电极1。然后将两根银/氯化银电极1分别连接在数模转换器DigiData1550B的电流放大器Axopatch 200B的探头上，作为正极和地线。
Axopatch 200B在使用前需用标准模块进行校准，消除误差。
5)脂质溶液的配制
取3mg 1,2-二乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱溶于100uL癸烷中，制备浓度为30mg/mL的脂质溶液。该溶液可在4℃下保存一周，一周后应重新配制。
6)脂质溶液的涂抹
使用移液枪移取1uL脂质溶液于000号毛笔尖端，然后将溶液均匀涂抹在支撑孔2两侧，直至孔被均匀覆盖。在室温下等待几分钟干燥脂质。
7)电解质溶液5的添加
每次各移取1mL氯化钾或1mL氯化钠溶液到顺式侧4和反式侧3两个腔室中。
8)实验装置的放置与仪器开启
将整个装置放在光学平台上的法拉第箱中，以避免振动和电气干扰，保持单通道电流记录的低噪声。将正极和地线的银/氯化银电极1分别浸入顺式和反式腔室的溶液中。
利用膜片钳仪器并通过银/氯化银电极1向反面施加正电位(顺式侧4接地)。
9)磷脂双分子层6膜的构建
使用1000uL规格的移液枪缓慢的将顺式侧4的电解质溶液5移动到支撑孔 2孔径以下，当空气-电解质溶液5界面低于孔径时离子电流降为0，再将电解质溶液5水平缓慢的移动到支撑孔2孔径上方，由于磷脂分子烃链的疏水性，两个脂质单层将开始形成磷脂双分子层6膜。
10)确定磷脂双分子层6膜为双层结构
对于150um的支撑孔2来说，磷脂双分子层6膜的电容值应在35-90pF 范围内，具体范围根据实验装置与环境的不同而不同，应在实验中摸索。使用膜片钳对磷脂双分子层6膜的电容进行测量，若电容大于该范围，说明脂质膜过薄，此时应使取脂质溶液(<1uL)于毛笔尖端，涂抹在支撑孔2上。若电容小于该范围，说明膜过厚，应取另一只干净的毛笔刷孔直至膜破裂(电流不再为0)，然后按照步骤9)中操作重新形成磷脂双分子层6膜，直到电容值处在合适的范围内。
可以通过施加电压来测试磷脂膜是否为双层。如果形成的磷脂膜可以在 300-400mV的施加电位内破裂，则在上述步骤9)下重新形成膜，再重新形成后，磷脂双分子层6膜具有适当的孔插入厚度。
11)将单个EPM分子插入磷脂双分子层6膜中
将EPM分子进行超声解冻，然后使用超纯水稀释，加入1％wt的非离子表面活性剂(聚乙二醇单油醚)，使分子更加分散，防止团聚。
顺式腔室中非常靠近支撑孔2的位置加入40-50uL EPM分子的溶液，施加电压，当电流发生跃升说明EPM分子在磷脂双分子层6膜上形成了稳定的纳米孔通道。注意加入分子溶液时不要加入任何气泡，防止脂质双层变得不稳定和破裂。
注意观察当电流发生台阶式跳跃时，要及时将电压降低，因为高电位可能会导致第二次分子插入的可能性，而我们的目的是在单分子通道的基础上进行观察。最后EPM分子逐个插入磷脂膜成功形成纳米孔的的电流轨迹见图3a，均匀的台阶式的电流跳跃说明为单个的EPM分子依次插入到磷脂双分子层6膜上形成纳米孔。根据大量经验，每一个电流台阶对应单个纳米孔嵌入磷脂层中，形成纳米孔结构示意图如图3b所示。
当单个EPM分子插入到磷脂双分子层6膜中后，改变EPM纳米孔两侧的电压值，读取电流值以绘制电流-电压I-V曲线，通过计算曲线斜率得到单个EPM纳米孔的电导值，结果如图3d所示。通过读取多次I-V曲线的斜率或通过连续的台阶跳跃间隔值，绘制统计分布图确定了单个EPM分子形成纳米孔时的统计电导值，见图3c。
并且记录了不同浓度氯化钾溶液中单个EPM纳米孔和门控行为的电流轨迹和归一化电流直方图并进行对比，见图3e。图3a，c-e皆证明EPM分子成功形成了稳定的单通道纳米孔结构。
下面通过实施例说明人工合成的大环化合物在磷脂双分子层6上形成稳定的单分子纳米孔结构在钾离子选择性及多肽测序的应用。
(12)EPM分子钾离子选择性实验
不同浓度氯化钾和氯化钠溶液中EPM纳米孔对钾离子选择性的实验：
重复(7)、(9)、(10)实验步骤，其中步骤(7)中注入的溶液为50mM氯化钾溶液，当单个EPM分子插入到磷脂双分子层6膜中后，改变EPM纳米孔两侧的电压值，读取电流值以绘制I-V曲线，计算I-V曲线的斜率得到在50mM氯化钾溶液中单个EPM纳米孔的电导值。
重复(7)、(9)、(10)实验步骤，其中步骤(7)中注入的溶液为50mM氯化钠溶液，当单个EPM分子插入到磷脂双分子层6膜中后，改变EPM纳米孔两侧的电压值，读取电流值以绘制I-V曲线，计算I-V曲线的斜率得到在50mM氯化钠溶液中单个EPM纳米孔的电导值。
将50mM氯化钾溶液中单个EPM纳米孔的电导值与50mM氯化钠溶液中单个EPM纳米孔的电导值进行比较，得到在50mM溶液中EPM纳米孔对钾离子的选择性因子。
在100mM，200mM，300mM，400mM，500mM，600mM，800mM，1000mM，2000mM的氯化钾或氯化钠溶液中重复上述步骤，最后将相同浓度氯化钾溶液和氯化钠溶液中得到的单个EPM纳米孔的电导值进行比较，得到不同浓度氯化钾和氯化钠溶液中EPM纳米孔对钾离子的选择性因子，检测EPM纳米孔对钾离子的选择性，结果见图4a-d，在没有进行额外的修饰下，EPM纳米孔在2M溶液中对钾离子的选择性高达20倍。
下面通过混合溶液中EPM纳米孔对钾离子选择性的实验来进一步说明EPM 具有钾离子选择性。
配制总离子强度为500mM的混合溶液，其中氯化钾和氯化钠的浓度分别为： 500mM氯化钾+0mM氯化钠，400mM氯化钾+100mM氯化钠，250mM氯化钾+250mM氯化钠，100mM氯化钾+400mM氯化钠，0mM氯化钾+500 mM氯化钠。根据需要还可以采用相应的缓冲溶液，如HEPES缓冲溶液，Tris-EDTA 缓冲溶液。
重复(7)、(9)、(10)实验步骤，其中步骤(7)中注入的溶液为500mM氯化钾+0mM氯化钠混合溶液，当单个EPM分子插入到磷脂双分子层6膜中后，改变EPM纳米孔两侧的电压值，读取电流值以绘制I-V曲线，计算I-V曲线的斜率得到在500mM氯化钾+0mM氯化钠混合溶液中单个EPM纳米孔的电导值。
在400mM氯化钾+100mM氯化钠，250mM氯化钾+250mM氯化钠， 100mM氯化钾+400mM氯化钠，0mM氯化钾+500mM氯化钠混合溶液中重复上述步骤，将5种混合溶液中得到单个EPM纳米孔的I-V曲线进行比较，检测 EPM纳米孔对钾离子的选择性。结果见图4e-f，随着混合溶液中钾离子浓度的升高，EPM纳米孔的电导也随之升高，进一步说明了EPM具有钾离子选择性。
不同浓度梯度实验中EPM纳米孔对钾离子选择性的实验：
重复(7)、(9)、(10)实验步骤，其中步骤(7)中注入的溶液为顺式侧4 为100mM氯化钾溶液，反式侧3为500mM氯化钾溶液，当单个EPM分子插入到磷脂双分子层6膜中后，改变EPM纳米孔两侧的电压值，读取电流值以绘制 I-V曲线，读取当电流值为0时对应的电压值。将测量使用的银/氯化银电极1 与标准银/氯化银电极1分别在100mM氯化钾溶液和500mM氯化钾溶液中测量电极自带的电势差，最后将I-V曲线中读取的电流值为0时的电压值与电极自带的电势差相减得到在该浓度梯度的氯化钾溶液中EPM纳米孔的氧化还原电位值。
重复(7)、(9)、(10)实验步骤，其中步骤(7)中注入的溶液为顺式侧4 为100mM氯化钠溶液，反式侧3为500mM氯化钠溶液，当单个EPM分子插入到磷脂双分子层6膜中后，改变EPM纳米孔两侧的电压值，读取电流值以绘制 I-V曲线，读取当电流值为0时对应的电压值。将测量使用的银/氯化银电极1 与标准银/氯化银电极1分别在100mM氯化钠溶液和500mM氯化钠溶液中测量电极自带的电势差，最后将I-V曲线中读取的电流值为0时的电压值与电极自带的电势差相减得到在该浓度梯度的氯化钠溶液中EPM纳米孔的氧化还原电位值。
利用GHK方程，将相同浓度梯度中氯化钾溶液和氯化钠溶液中得到的单个 EPM纳米孔的氧化还原电位值代入，计算EPM纳米孔对钾离子的选择性因子。
更换浓度梯度为1M氯化钾–100mM氯化钾，1M氯化钠–100mM氯化钠，2M氯化钾–200mM氯化钾，2M氯化钠–200mM氯化钠，重复上述步骤，得到不同浓度梯度中EPM纳米孔对钾离子的选择性因子，并可与不同浓度氯化钾和氯化钠溶液实验中得到的EPM纳米孔对钾离子的选择性因子进行对比，验证实验结果的准确性。结果见图5a-c，进一步说明了EPM具有钾离子选择性。
不对称溶液中EPM纳米孔对钾离子选择性的实验：
重复(7)、(9)、(10)实验步骤，其中步骤(7)中注入的溶液为顺式侧4 为1M氯化钾溶液，反式侧3为1M氯化钠溶液，当单个EPM分子插入到磷脂双分子层6膜中后，改变EPM纳米孔两侧的电压值，读取电流值以绘制I-V曲线，观察电位值在正负值时的差别，以检验EPM纳米孔对钾离子的选择性。结果见图 5d。
(13)EPM纳米孔应用于生物大分子检测或测序，以多肽实验进行原理论证，
重复(7)、(9)、(10)实验步骤，得到稳定的单个EPM纳米孔后，再将GG 多肽短链溶液加入到顺式侧4，施加电压，观察电流阻塞事件，记录电流轨迹，结果见图6a-b。再改变电压，观察电流阻塞事件，记录电流轨迹，结果见图6c-d。
当每个氨基酸通过该纳米孔时，由于氨基酸在孔内造成一定的空间阻塞使离子电流发生改变的程度不同，由于氨基酸种类的不同，造成的电流阻塞信号差异也有所不同。鉴于构成蛋白质的氨基酸种类多达20种，是DNA测序中4种碱基的5倍，例如MspA孔(Laszlo,A.,Derrington,I.,Ross,B.et al.Decoding long nanopore sequencing reads ofnatural DNA.Nat Biotechnol 32,829–833 (2014).https://doi.org/10.1038/nbt.2950)等，孔内可同时存在4个或更多氨基酸，使蛋白质通过纳米孔时造成的电流阻塞信号种类多达204，所以利用这种传统的纳米孔进行单分子蛋白质测序面对诸多困难。但与已经尝试应用于的蛋白质测序的其他跨膜纳米孔结构的孔厚度相比，本发明公开的EPM纳米孔孔径厚度仅为原子级别(
Figure BDA0002445788160000181
见附图1)，因此同时存在于孔径中的氨基酸个数理论上可减少至1个，大大提高了空间分辨率，为单分子蛋白质测序提供了巨大的可能性，且EPM纳米孔由化学方法合成，结构统一，可以形成稳定的纳米孔结构，实验重复性好，所以理论上该方法可以进行蛋白质测序不存在技术障碍。
经初步实验发现，EPM纳米孔可以观察到蛋白质多肽穿孔造成的电流阻塞现象，即具有实现蛋白质测序的可能性，之后可进一步尝试采用不同长度的多肽链来确定EPM纳米孔的“感应长度”，进而将其应用于单分子蛋白质测序。
基于目前手段发展，设计更大空腔的大环化合物并运用于跨膜纳米孔已经成为可能，孔径大于
Figure BDA0002445788160000182
的大环分子形成的纳米孔即可以允许DNA单链分子穿过用于DNA单链测序，孔径大于
Figure BDA0002445788160000183
的大环分子形成的纳米孔可以用于DNA双链测序。
以上所述并非是对本发明的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实质范围的前提下，还可以做出若干变化、改型、添加或替换，例如丰富的化学机构选择可以提供具有类似孔结构的其他大环分子，通过增加化学基团进行孔径调节，利用丰富的修饰化学对大环分子纳米孔进行不同的侧链衍生化，利用该类纳米孔结构进行基于同样原理的其他生物或化学分析，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种人工合成的大环结构分子纳米孔结构，其特征在于，所述的纳米孔结构为在电解质溶液(5)中，人工合成的大环化合物插入磷脂双分子层(6)膜中，形成的纳米尺寸通道的跨膜纳米孔结构；所述的人工合成的大环化合物具有直径为
Figure FDA0002445788150000012
的空腔孔径，所述的人工合成的大环化合物的空腔具有原子级别厚度为
Figure FDA0002445788150000013
2.根据权利要求1所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构，其特征在于，所述的人工合成的大环化合物具有帮助大环分子镶嵌到磷脂膜中去的侧链,以便于形成稳定的跨膜结构。
3.根据权利要求3所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构，其特征在于，所述的侧链以酰胺键或醚键或碳碳键与大环相连。
4.根据权利要求1或2或3所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构，其特征在于，所述的人工合成的大环化合物为柱芳烃衍生物大环化合物或杯芳烃衍生物或葫芦脲衍生物或环糊精衍生物或冠醚衍生物或由芳烃构成的大环化合物衍生物。
5.根据权利要求4所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构，其特征在于，所述的人工合成的大环化合物为柱[6]芳烃衍生物大环化合物EPM(7)，所述的EPM的分子式为C374H388N40O56，结构式为：
Figure FDA0002445788150000011
6.一种如权利要求1或2或3所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构的制备方法，其特征在于，所述的制备步骤为：
1)、通过化学方法合成柱[6]芳烃衍生物大环分子EPM；
2)、分子结构纳米孔磷脂双分子层(6)载体流体槽的结构设计；
所述的流体槽用于在磷脂双分子层(6)上进行离子通道的实验，流体槽通过槽壁(8)分隔为顺式侧(4)和反式侧(3)两个腔室，所述的槽壁(8)上开设有支撑孔(2)，磷脂双分子层(6)构建于支撑孔(2)上进而合成大环化合物纳米孔结构；
3)、溶解人工合成的大环化合物分子；
将大环化合物分子溶于水或者缓冲溶液中，超声溶解后过滤未溶物质，再将分子溶液分装冷冻保存，每次实验前超声解冻；
4)、电极的制备与器件的连接；
取两段银丝，使用砂纸抛光以除去表面的氧化层，在电镀液中浸入银丝和铂电极，分别作为阳极和阴极，施加电压以制备银/氯化银电极(1)，然后将两根银/氯化银电极(1)分别连接膜片钳仪器的探头上，作为正极和地线；
5)、脂质溶液的配制；
6)、脂质溶液的涂抹；
使用毛笔将脂质溶液均匀涂抹在流体内槽的支撑孔(2)(2)两侧，直至孔被均匀覆盖，在室温下等待干燥脂质；
7)、电解质溶液(5)的添加；
每次各移取电解质溶液(5)到顺式侧(4)和反式侧(3)两个腔室中；
8)、实验装置的放置与仪器开启；
将整个装置放在光学平台上的法拉第箱中，将正极和地线的银/氯化银电极(1)分别浸入顺式侧(4)和反式侧(3)的腔室的溶液中；
打开膜片钳仪器并通过银/氯化银电极(1)向反面施加正电位，顺式侧(4)接地；
9)、磷脂双分子层(6)膜的构建；
使用移液枪在支撑孔(2)(2)上下提拉溶液界面，由于磷脂分子烃链的疏水性，两个脂质溶液形成的脂质单层将开始形成磷脂双分子层(6)膜；
10)、确定磷脂双分子层(6)膜为双层结构；
通过测定磷脂双分子层(6)膜的电容或通过施加破膜电压来确定磷脂双分子层(6)膜为双层结构；
11)、将单个人工合成的大环化合物分子插入磷脂双分子层(6)膜中；
将人工合成的大环化合物分子进行超声解冻，然后使用超纯水稀释，加入1％wt的非离子表面活性剂；
顺式腔室中非常靠近支撑孔(2)(2)的位置加入人工合成的大环化合物分子的溶液，施加电压，当电流发生台阶式跃升说明人工合成的大环化合物分子在磷脂双分子层(6)膜上形成了稳定的纳米孔通道。
7.根据权利要求6所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构的制备方法，其特征在于，所述的流体外槽外表面开设有小孔连通至其圆周槽内，所述的脂质溶液为1,2-二乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱或棕榈酰油酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰甘油溶于癸烷中；所述的步骤10)中，当磷脂双分子层(6)膜为双层时，电容值应在35-90pF；或者当磷脂双分子层(6)膜为双层时，磷脂双分子层(6)膜在300-400mV的施加电位内破裂；述的步骤11)中，在加入人工合成的大环化合物分子溶液时不要加入任何气泡；在当电流发生台阶式跳跃时，要及时将电压降低。
8.根据权利要求4所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构的制备方法，其特征在于，所述的流体槽和槽壁(8)的材质为聚甲醛树脂或聚四氟乙烯或聚苯乙烯。
9.根据权利要求1或2或3所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构在人工构筑离子通道方面的应用，应用该结构实现高效的钾离子/钠离子选择性运输和其分离。
10.根据权利要求1或2或3所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构在生物大分子检测或测序方面的应用，应用该结构实现蛋白质多肽序列测序，或基于相同原理类似生物大分子、化学分子检测及测序。
11.根据权利要求1或2或3所述的人工合成的大环结构分子纳米孔结构在生物大分子检测或测序方面的应用，应用该结构实现DNA核酸序列或RNA序列测序。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113416344A (zh) * 2021-07-06 2021-09-21 四川大学 一种纳米孔基因测序用光交联磷脂双层膜及其制备方法
WO2021204304A1 (zh) * 2020-04-10 2021-10-14 浙江大学 人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用
CN113804869A (zh) * 2021-09-29 2021-12-17 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法
WO2023030180A1 (zh) * 2021-08-30 2023-03-09 四川大学 基于小电导机械力敏感性通道的生物埃米孔系统

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080237063A1 (en) * 2006-04-19 2008-10-02 Chen Ellen T Nanopore structured electrochemical biosensors
CN101747286A (zh) * 2009-12-24 2010-06-23 南京信息工程大学 一种纳米孔径30元三苯胺刚性大环化合物及其制备方法
CN102040562A (zh) * 2010-11-18 2011-05-04 南京信息工程大学 一类大环型芳胺结构化合物及其制备方法和应用
CN104651500A (zh) * 2015-01-30 2015-05-27 华东理工大学 气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法及其应用
CN105026002A (zh) * 2013-02-08 2015-11-04 康奈尔大学 生物分子处理平台及其用途
CN105779279A (zh) * 2016-02-29 2016-07-20 东南大学 一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件及其构建方法
CN107002009A (zh) * 2014-12-04 2017-08-01 株式会社日立高新技术 生物分子测定装置及生物分子测定方法
CN110514719A (zh) * 2019-08-28 2019-11-29 东南大学 一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤dna辨识装置及方法
CN110607349A (zh) * 2019-08-27 2019-12-24 中国科学院化学研究所 主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111521766B (zh) * 2020-04-10 2022-02-15 浙江大学 人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080237063A1 (en) * 2006-04-19 2008-10-02 Chen Ellen T Nanopore structured electrochemical biosensors
CN101747286A (zh) * 2009-12-24 2010-06-23 南京信息工程大学 一种纳米孔径30元三苯胺刚性大环化合物及其制备方法
CN102040562A (zh) * 2010-11-18 2011-05-04 南京信息工程大学 一类大环型芳胺结构化合物及其制备方法和应用
CN105026002A (zh) * 2013-02-08 2015-11-04 康奈尔大学 生物分子处理平台及其用途
CN107002009A (zh) * 2014-12-04 2017-08-01 株式会社日立高新技术 生物分子测定装置及生物分子测定方法
CN104651500A (zh) * 2015-01-30 2015-05-27 华东理工大学 气单胞菌溶素纳米孔通道的制备方法及其应用
CN105779279A (zh) * 2016-02-29 2016-07-20 东南大学 一种基于二维层状材料的纳米孔传感器件及其构建方法
CN110607349A (zh) * 2019-08-27 2019-12-24 中国科学院化学研究所 主客体探针结合纳米孔技术联用的酶活性浓度检测方法
CN110514719A (zh) * 2019-08-28 2019-11-29 东南大学 一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤dna辨识装置及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BY NEZHA BADI: "Synthesis of Half-Channels by the Anionic Polymerization of Ethylene Oxide Initiated by Modified Cyclodextrin", 《ADV. MATER》 *
LI-QUN GU ET AL.: "Stochastic sensing of organic analytes by a pore-forming protein containing amolecular adapter", 《LETTERS TO NATURE》 *
YI YOU, ET AL.: "Measuring Binding Constants of Cucurbituril-Based Host−Guest Interactions at the Single-Molecule Level with Nanopores", 《ACS SENSORS》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021204304A1 (zh) * 2020-04-10 2021-10-14 浙江大学 人工合成的大环结构分子纳米孔结构及制备方法及应用
CN113416344A (zh) * 2021-07-06 2021-09-21 四川大学 一种纳米孔基因测序用光交联磷脂双层膜及其制备方法
WO2023030180A1 (zh) * 2021-08-30 2023-03-09 四川大学 基于小电导机械力敏感性通道的生物埃米孔系统
CN113804869A (zh) * 2021-09-29 2021-12-17 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法
CN113804869B (zh) * 2021-09-29 2023-09-05 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法

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