CN110514719A - 一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤dna辨识装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置及方法，所述辨识装置包括电源、Ag/AgCl银电极以及电解质溶液，所述电解质溶液内设有串联纳米孔装置，所述串联纳米孔装置包括两个纳米孔，所述两个纳米孔之间设有空腔；所述电源负极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，Ag/AgCl银电极插入电解质溶液中，所述电源正极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，电解质溶液中的离子聚集到Ag/AgCl银电极上形成阳极；DNA分子在电场作用下通过纳米孔‑空腔‑纳米孔组成的流道，并在两个纳米孔中都产生离子电流阻塞信号，利用DNA长度与串联纳米孔通道长度的尺寸差，能够实现不同长度DNA的定位。

Description

一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置及方法

技术领域

本发明涉及一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置及方法，属于生物分子检测技术领域。

背景技术

癌症是威胁人类健康的常见病，是人类三大疾病之一，占全部死亡人数的四分之一。癌症的早期诊断与治疗依然是一项世界性难题。为了洞悉癌症的发生机制，开拓癌症的诊断和治疗方法，精准肿瘤学的焦点愈发转向液体活检。液体活检是一种全面而精准的基因分析技术，主要依靠提取身体循环系统，如外周血、尿液、脑脊液等液体中的标志物来获得疾病信息，相比传统技术克服了取材困难、肿瘤异质性等难题，而且它不具侵袭性，创伤小，可以持续跟踪观测病情变化，为临床肿瘤早期筛查和个体化治疗提供新的方法。

ctDNA (Circulating tumor DNA, 循环肿瘤细胞)是目前在临床中应用最多的液体活检标志物。肿瘤细胞的凋亡，会导致细胞中的DNA进入到人体的循环系统之中，而携带有驱动肿瘤基因突变产生与进化信息（包括异常突变、甲基化、拷贝数异常等）的ctDNA,也会被细胞释放到人体血液当中。通过对患者血液中ctDNA含量的测量，可以实现对患者癌症阶段的判断与肿瘤药物治疗效果的检测，是未来对癌症患者进行“精准医疗”的有效手段。

然而，ctDNA在人体血液样本中的含量极少。由于正常的细胞也会存在凋亡现象，ctDNA在血液中所有循环DNA（cfDNA）中的比例不超过5%。如何从cfDNA中精准检测出ctDNA，仍然是有待克服的难题。目前检测ctDNA的方法主要是通过区分DNA的长度来实现，由于DNA的长度分布很广(1-1000bp),而ctDNA多集中于167bp长度附近,通过定位出167bp左右长度的DNA分子，就可以得到ctDNA用于检测分析。

纳米孔技术作为第三代基因测序技术，是辨识ctDNA的理想方案。如下图所示，把纳米孔并入能分离两个充满盐溶液的液池中，在纳米孔膜两端电极施加电压时，可以产生一个恒定的基准离子电流，当带电分子通过时，由于带电分子在纳米孔中占位，会产生离子电流的变化，事件信号的波形与生物分子的物理信息直接相关，通过分析离子电流变化的信号的幅度、持续时间，就有可能辨识相应分子。当DNA分子受到电场驱动通过单层纳米孔，会由于体积占位产生离子电流阻塞信号，通过膜片钳技术能够精准捕捉到DNA分子的过孔事件，从而统计样本中的DNA数量。纳米孔技术近年来发展迅猛，已取得巨大的进展。在生物分子通过纳米孔的检测方面，科研人员已经运用纳米孔技术检测出了DNA分子、RNA分子以及一些蛋白质分子的过孔信号，其原理在于不同分子引起的堵塞信号不同。

然而，由于膜片钳的采样频率有限，DNA过孔速度极快，通过过孔时间来准确区分DNA分子的长度显然难以实现。所以，通过单个纳米孔精准定位出ctDNA分子存在一定困难。根据理论分析，一个分子越长，其过孔时所引起的占位时间也应该越长，但是实际情况是不同的DNA分子其过孔时间很难区别，特别是当两个DNA长度接近时，因为DNA的过孔速度太快，细节信号很难采集。其次，纳米孔作为单分子（如DNA、RNA或蛋白质）的通用传感器可分为固态纳米孔和生物纳米孔。与生物纳米孔相比，制备的固体纳米孔具有稳定性高、几何形状可调、表面性能好、集成器件潜力大等明显优势，但是噪声信号问题一直很难解决。低频噪声与组成通道壁的聚合物亚基的运动以及纳米孔内存在纳米级气泡有关，不同的DNA分子通过单纳米孔通道时存在噪音信号，细节信号区分不清楚，区分率较低，也会影响ctDNA的区分和检测。综合以上两个原因，用单个纳米孔直接测量DNA长度的方案是难以实现的。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置及方法，以解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置，包括DNA分子，所述辨识装置包括电源、Ag/AgCl银电极以及电解质溶液，所述电解质溶液内设有串联纳米孔装置，所述串联纳米孔装置包括两个纳米孔，所述两个纳米孔之间设有空腔；所述电源负极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，Ag/AgCl银电极插入电解质溶液中，所述电源正极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，电解质溶液中的离子聚集到Ag/AgCl银电极上形成阳极。

作为本发明的一种改进，所述导线上设有电流表。

作为本发明的一种改进，所述纳米孔A的直径为10-20nm。所述纳米孔B的直径为10-20nm。

作为本发明的一种改进，所述的串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置的辨识方法，具体步骤如下：电源、电流表、Ag/AgCl银电极、电解质溶液中的离子形成电流回路，DNA分子通过串联纳米孔装置时，回路电流下降，根据电流表所检测到的电流的信号，检测DNA分子的存在与移动。

作为本发明的一种改进，所述检测方法步骤如下：当DNA分子的长度大于空腔厚度时，DNA分子穿过两个纳米孔，并且同时在两个纳米孔内进行占位，电流信号为“台阶式”的信号；当DNA分子的长度小于空腔厚度时，DNA分子会依次穿过两个纳米孔，电流信号为“脉冲式”的信号。

0-1000mV电压通过电源输出到回路中，精密电流表测量回路中的电流，通过导线连接回路，通过导线末尾的Ag/AgCl银电极插入电解质溶液中，与溶液形成电流回路。电解质溶液中的离子，其在电场下的定向移动起到构成电流基线的作用。串联纳米孔装置的两孔直径一般为10-20nm，空腔厚度可由加工工艺控制。当DNA分子进入上孔时，纳米孔中的部分空间被DNA分子占据，原本由溶液中定向迁移的离子通过的空间被占据，孔中离子迁移量减少，电流表所检测到的电流因此减小，由此可以检测出DNA分子的存在与移动。

所述两孔之间空腔起到辨识DNA长度的决定作用。对于长度大于空腔厚度的DNA分子，会依次穿过两个纳米孔，并且存在同时在两个孔内的占位现象，使得离子电流过孔信号在第一个纳米孔下降的基础上，在第二个纳米孔再次下降，呈现“台阶式”的信号。而对长度小于空腔厚度的DNA分子，其过孔信号将是两个连续的离子电流降低现象，降低幅度相同，呈现“脉冲式”的信号。

所述电源起到给溶液中离子和带电DNA分子施加外加电场的作用，使得它们能够在电场力驱动下发生定向移动。

所述电流表起到检测孔内通过的电流作用，电流由孔中通过的离子作为载体。

所述电解质溶液起到作为DNA注入的环境及提供电流载体离子。

所述DNA分子为人体血液中的循环DNA分子，其中包括可用作癌症检测的循环肿瘤DNA分子，其长度存在差异，可通过测量长度来区分。

电流回路，由电压源提供电压，电流表测量回路电流值，导线连接回路，Ag/AgCl银电极连接导线回路与溶液回路，电解质溶液中的离子通过串联纳米孔装置形成回路电流，DNA分子通过纳米孔时，由于串联纳米孔装置内空间有限会抑制部分离子通过，使得回路电流下降。对于长度大于空腔厚度的DNA分子，会依次穿过两个纳米孔，并且存在同时在两个孔内的占位现象，使得离子电流过孔信号在第一个纳米孔下降的基础上，在第二个纳米孔再次下降，呈现“台阶式”的信号。而对长度小于空腔厚度的DNA分子，其过孔信号将是两个连续的离子电流降低现象，降低幅度相同，呈现“脉冲式”的信号。

对于不同长度的DNA分子，可以通过在加工串联纳米孔芯片控制工艺实现不同空腔厚度，从而实现区分。

由于采用了以上技术，本发明较现有技术相比，具有的有益效果如下：

1、本方法采用的基于双纳米孔和中间通道的串联纳米孔结构，能够充分发挥纳尺度的尺寸效应，运用纳米加工技术改变通道长度，实现准确的特定长度DNA分子检测。通过判断DNA分子的离子电流过孔信号，能够快速分辨DNA分子的长度，达到区分ctDNA与其他cfDNA的目的，实现简单快速的液体活检技术。

2、本方法不破坏血液DNA样本的活性，运用生物分子的自身特性进行检测，方法具有普适性。

3、本发明装置结构简单，检测快速，时间和金钱成本低廉。

附图说明

图1是一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置的结构示意图；

图2是“分级精准辨识”方法示意图；

图3是串联纳米孔通道结构加工示意图；

图4是现有技术中纳米孔膜装置的结构示意图；

图中：1、电源，2、电流表，3、导线，4、Ag/AgCl银电极，5、离子，6、电解质溶液，7、纳米孔A，8、空腔，9、纳米孔B，10、DNA分子。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明。

结合附图可见，一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置，包括DNA分子10，所述辨识装置包括电源1、Ag/AgCl银电极4以及电解质溶液6，所述电解质溶液6内设有串联纳米孔装置，所述串联纳米孔装置包括两个纳米孔（纳米孔A 7以及纳米孔B 9），所述两个纳米孔之间设有空腔8；所述电源1负极通过导线3与Ag/AgCl银电极4相连，Ag/AgCl银电极4插入电解质溶液6中，所述电源1正极通过导线3与Ag/AgCl银电极4相连，电解质溶液6中的离子5聚集到Ag/AgCl银电极4上形成阳极。

所述导线3上设有电流表2。

所述两个纳米孔的直径为10-20nm。

纳米孔技术是一种利用生物分子在电泳力驱动下在纳米孔中物理占位造成过孔离子5电流信号变化的方法，在本发明中，如图2所示，DNA分子10所受的电场力通过电源1施加，通过串联纳米孔通道的离子5电流由电流表2测量，导线3串接仪器电路，Ag/AgCl银电极4用于连接电解质溶液6导电电路，离子5作为溶液中的电流载体。电解质溶液6内设有串联纳米孔装置，所述串联纳米孔装置包括两个纳米孔（纳米孔A 7以及纳米孔B 9），所述两个纳米孔（纳米孔A 7以及纳米孔B 9）之间设有空腔8。DNA分子10带负电，在电场力作用下由负电极向正电极移动，途中穿越串联纳米孔装置，引起离子5电流的变化。

图3所示为具体的不同长度DNA辨识方法，简称“分级精准辨识”法。循环肿瘤DNA的长度约为167bp,因此，在第一步辨识中，大于170bp长度的DNA分子10将会同时占据两个纳米孔（纳米孔A 7以及纳米孔B 9），产生的电流信号如虚线框中所示，DNA通过第一个孔时电流值会减小，产生一个向下的突变信号，再次通过第二个孔会在这个电流值基础上再次产生一个向下的突变信号，形成“台阶状”的DNA过孔信号。而长度小于170bp的DNA，通过串联纳米孔时，其始终不会同时占据两个纳米孔（纳米孔A 7以及纳米孔B 9），而是逐一通过，所以其离子5电流信号为顺序的单个电流下降的突变信号，形成“脉冲式”的DNA过孔信号。

通过硅芯片加工工艺，可以控制串联纳米孔中的空腔8厚度，操控空腔8厚度处于需要辨识的DNA分子10长度之间，则可实现精确辨识。

图4为串联纳米孔装置（硅基串联纳米孔芯片装置）的加工工艺流程。第一步，在硅基底上通过化学气相沉积沉积一层氮化硅，第二步，通过光刻与反应离子刻蚀结合，在底面氮化硅层上开出释放窗口，通过湿法刻蚀，去除中间硅层。第三步，在正面氮化硅层通过光刻与反应离子刻蚀结合，刻蚀出一定深度的槽，作为串联纳米孔之间的空腔8结构，其厚度依赖于反应离子刻蚀的时间。第四步，在正面槽内剩下的氮化硅膜上使用聚焦离子束技术穿透薄膜，形成串联纳米孔结构所需的纳米孔道。第五步，通过原子间范德华力吸引将石墨烯薄膜覆盖在正面氮化硅槽上，通过聚焦离子束技术再次在石墨烯薄膜上开孔，最终形成串联纳米孔结构。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置，包括DNA分子，其特征在于：所述辨识装置包括电源、Ag/AgCl银电极以及电解质溶液，所述电解质溶液内设有串联纳米孔装置，所述串联纳米孔装置包括两个纳米孔，所述两个纳米孔之间设有空腔；所述电源负极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，Ag/AgCl银电极插入电解质溶液中，所述电源正极通过导线与Ag/AgCl银电极相连，电解质溶液中的离子聚集到Ag/AgCl银电极上形成阳极。

2.根据权利要求1所述的一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置，其特征在于：所述导线上设有电流表。

3.根据权利要求1所述的一种采用串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置，其特征在于：所述两个纳米孔的直径为10-20nm。

4.一种采用权利要求1-3所述的串联纳米孔结构的循环肿瘤DNA辨识装置的辨识方法，其特征在于，具体步骤如下：电源、电流表、Ag/AgCl银电极、电解质溶液中的离子形成电流回路，DNA分子通过串联纳米孔装置时，回路电流下降，根据电流表所检测到的电流的信号，检测DNA分子的存在与移动。

5.根据权利要求4所述的辨识方法，其特征在于，所述检测方法步骤如下：当DNA分子的长度大于空腔厚度时，DNA分子穿过两个纳米孔，并且同时在两个纳米孔内进行占位，电流信号为“台阶式”的信号；当DNA分子的长度小于空腔厚度时，DNA分子会依次穿过两个纳米孔，电流信号为“脉冲式”的信号。