KR102657461B1 - 단일-세포 세포내 나노-ｐｈ 프로브 - Google Patents
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Abstract
살아있는 단일 세포 내 pH를 감지하는 방법 및 장치가 개시되어 있다. 본 장치는 나노크기의 프로브가 단일 세포를 관통하여 정확한 pH 측정 값을 실시간으로 추출하도록 지시하기 위해 제작되었다. 전극을 포함하는 나노피펫은 매우 작은 구멍 크기(~97nm)를 가진 고도로 하이드록실화된 석영 나노피펫 상에 생체적합성 pH-반응성 고분자인 키토산을 물리 흡착함으로써 제조된다. pH의 변화는 키토산의 표면 전하를 변화시키며, 이는 나노포어에서 이온 전류의 변화로 측정될 수 있다. 나노-pH 프로브의 동적 pH 범위는 2.6~10.7이었고, 민감도는 0.09 pH 단위였다. 본 장치는 예를 들어, 인간 섬유아세포 및 HeLa(상피 경부)와 같은 모델 세포를 포함하는 비-암성 및 암성 인간 세포를 사용하는 단일-세포 세포내 pH 측정에 사용될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2015년 2월 25일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/120,624호에 대하여 우선권을 청구하며, 이는 본원에 참고로 전문통합된다.
정부 지원 진술
본 발명은 국립 암 연구소(National Cancer Institute)가 부여한 계약 번호 U54CA143803, 국립 보건원(National Institutes of Health)이 부여한 계약 번호 P01-35HG000205 및 신경계 장애 및 뇌졸중 국립 연구소가 부여한 계약 번호 R21NS082927에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
서열 목록, 컴퓨터 프로그램 또는
컴팩트
디스크 참조
없음.
발명의 분야
본 발명은 특히, 단일 세포 내에서 유체 및 용액의 pH 감지를 위한 나노포어 규모의 장치 및 센서 분야에 관한 것이다.
아래에 제시된 것은 본 발명의 특정 양태에 관한 배경 정보이며, 상세한 설명에서 언급된 기술적인 특징과 관련될 수 있지만, 반드시 상세히 기술되지는 않는다. 즉, 본 발명에서 사용되는 개개의 조성물 또는 방법은 하기에 기술된 공보들 및 특허에서 보다 상세히 기술될 수 있으며, 이는 청구된 바와 같이 본 발명의 특정 양태를 제조 또는 사용하기 위해 당업자에게 추가의 지침을 제공할 수 있다. 다. 아래의 논의는 설명된 특허 또는 공보들의 관련성 또는 선행 기술 효과에 대한 인정으로 해석되어서는 안된다.
개인화된 약은 특히 암 치료에 있어 큰 잠재력을 지니고 있으며, 이는 종래의 화학 요법들에 대한 내재적 및 후천적 저항으로 인해 주요한 의학적 과제로 남아 있다1-3. 지난 10년 동안 화학 요법의 효능을 증가시키기 위해 개인화된 암 치료제 개발에 진전이 있었다4. 약물을 개인에게 맞춰주기 위한 모든 노력에도 불구하고 결과는 다양하다5. 이 사실은 개별 종양 내에 유전적으로 구별되는 세포들이 존재하는 것과 관련되어 있다6. 최근의 연구에서, 많은 세포 집단에서 이러한 유전적 변이를 확인하기 위해 게놈 시퀀싱 기술이 사용되어왔다7-9. 암세포 이질성의 유전적 측면 및 돌연변이와 약물 내성 사이의 관계가 광범위하게 연구되어 왔지만, 이질성을 검출하기 위한, 즉 거대 세포 집단 내에서 세포 대사와 생리가 다른 암세포를 발견하기 위한, 사전-스크리닝 기술의 개발이 과소 평가되고있다.
세포 이질성의 평가는 세포질 이온 및 분자의 측정을 통해 수행될 수 있다. 금속 이온의 축적10, 반응성 산소(ROS)와 질소 종류(RNS) 수준의 변화11, 및 단백질 발현12은 세포 집단 내의 암세포의 중요한 마커이다. 덜 인식되지만, pH도 또한 암 세포의 특유한 요소이다. pH는 종양에서의 다중-약물 내성13, 단백질 처리14, 엔도사이토시스15 및 세포 사멸16과 같은 수많은 세포 활동을 개시하고 조절하는 데 가장 흥미로운 특징들 중 하나이다. 그것의 생명 유지와 관련된 중요성으로 인해, 세포내 환경의 pH는 알칼리 양이온-H+ 교환기, 중탄산염 및 산 부하 전달체와 같은 다양한 이온 채널 및 세포내 약산 및 염기를 통해 엄격하게 조절된다. 포유류 세포에서 세포아래 구획은 특정 대사 작용을 위한 최적의 작동 조건을 유지하기 위해 다른 pH 값들을 가진다17. 정상 생리 조건에서 포유류 세포의 휴식 세포내 pH는 6.8 내지 7.3에서 유지된다18. 반면에, 세포외 pH 값은 7.2 내지 7.4의 범위에서 약간 알칼리성이다. 세포내 pH의 조절 장애는 종종 세포 기능의 변화, 증식 및 약물 내성과 관련이 있으며, 암 종양에서 관찰된다19. 게다가, pH는 종양 성장과 암 세포 이동에 큰 영향을 미치므로 전이의 가능성이 있다20,21.
발암성 종양은 이질적이며, 암세포의 높은 신진 대사율과 혈액 공급 부족으로 인해 산성인 것으로 널리 알려져 있다. 이러한 국부적 높은 신진 대사와 재관류 부족은 세포외 pH 수준을 ~6.0로 감소시키는 혐기성 신진 대사를 유발한다22. 또한, 호기성 신진 대사는 이산화탄소(CO2)의 세포내 농도를 증가시켜 국부적인 pH 수준을 감소시킬 수 있다. 산증(acidosis)의 이 두 메카니즘은 암 연구에서 일반적으로 받아들여진다. 그러나 세포내 pH 수준이 종양내 이질성에 기여하는지 여부와 그것이 큰 세포 집단의 암세포에서 기존의 대사 이질성의 지표인지는 거의 알려져 있지 않다. 대부분의 신약 전달 시스템이 pH 민감성 고분자 또는 pH 민감성 고분자 나노 입자를 사용할 것을 제안함에 따라 pH 데이터의 보다 정밀한 세분성은 새로운 항암제 및 담체의 개발뿐만 아니라 항암제가 치료과정동안 얼마나 효과적으로 작동하는 지를 확인하는데 매우 중요할 것이다. 따라서 세포내 pH의 실시간 정량 측정은 효과적인 치료를 위해 종양 세포 이질성, 약물 내성 및 약물 전달 시스템을 연결하는 데 중요할 수 있다.
pH는 종양 조직에서 암세포의 변이종을 확인하기 위한 마커로 사용될 수 있다. 일단 확인되면, 약물 치료 과정에서 이 세포에 태그를 붙여 추적할 수 있다. 그런 다음, 태그가 있는 세포에서 샘플을 수집하여, RNA와 DNA를 시퀀싱하여 약물 내성이 있는 세포를 밝혀낼 수 있다.
세포 수준에서 pH를 검출하는 것은 종양 환경에서 단일 암세포 및 세포 이질성을 조사하는 것뿐만 아니라 신경 퇴행 및 노화를 이해하는데 중요하다. 파킨슨 병과 알츠하이머 질환과 같은 신경퇴행성 질환은 미토콘드리아 산화 인산화로 인해 이질적인 물리-화학적 환경을 조성하므로 pH를 측정하고 뇌 손상 부위의 신경 회복에 미치는 영향을 이해하는 것이 중요하다23. 또한, 대뇌 pH는 뇌 손상 후 대사 장애 및 치사의 주요 마커들 중 하나인 것으로 밝혀졌다24. 이러한 많은 연구는 적절한 분석 도구가 부족하여 어려움을 겪고 있다.
세포내 pH 값을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 분석 기술은 핵 자기 공명(NMR)25, 전기화학26,27, 공초점 현미경28 및 흡광도 및 형광 분광법29-31을 포함한다. 이 중 형광 분광법과 이미징이 가장 널리 사용되는 기술이다. 그러나 형광 강도는 직접 정량화하기 어려우므로 염료 위치측정, 광 표백, 여기 파장 및 세포 흡수 및 방출 속도와 같은 실험적 요인들로 인해 어려움을 겪는다. 또한 형광 강도는 자가 형광에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한, 형광 프로브는 세포내 pH 수준의 연속적이고 부위별 검출을 허용하지 않는다.
따라서, 세포내 pH는 세포 신진 대사의 지표이며, 또한 다제 내성, 단백질 처리 및 세포 사멸과 같은 무수한 세포 기능의 개시 및 조절에 중요한 역할을 한다. 암 종양 개체와 같은 큰 클론 개체 내에서도 세포가 동일하지 않으며, 개별 세포의 세포내 pH 수준의 차이가, 특히 보다 개인화된 제약쪽으로 이동함에 따라 임상 수행과 관련이 있을 수 있는 이질성의 중요한 지표일 수 있다. 따라서, 단일-세포 수준에서 세포내 pH의 검출은 외곽(outlier) 세포를 확인하고 연구하는데 매우 중요하다. 그러나 세포 집단 내의 개별 세포의 세포내 pH를 정량적으로 실시간 측정하는 것은 기존의 기술로는 어려움이 있으며, 새로운 방법론을 개발할 필요가 있다.
특정 특허 및 공보
Functionalized Nanopipette Biosensor, Karhanek et al. 2010년 3월 25일자로 공개된 미국 특허출원공개 제2010/0072080호에는 나노규모 치수의 원뿔형 팁 개구를 갖는 중공 불활성, 비-생물학적 구조로서 예시되고, 팁 개구를 통과할 때 검출 될 단백질 생체분자와 같은 분석물을 함유할 수 있는 전해질 용액을 홀딩하는데 적당한, 나노피펫을 포함하는 생체분자 검출을 위한 방법 및 장치가 개시되어 있다.
Nanopore Device for Reversible Ion and Molecule Sensing or Migration, Pourmand et al. 2012년 9월 6일에 공개된 미국 특허출원공개 제2012/0222958호에는 전기화학적 감지 회로에 사용하기에 적합한 나노피펫을 사용하여, 이온 이동 및 결합을 검출하는 방법 및 장치가 개시되어 있다. 키토산은 나노피펫에 먼저 부착된 PAA(폴리아크릴산) 층 상에 사용되며, 구리와 같은 이온의 결합을 측정한다.
Actis et al. "Functionalized Nanopipettes: toward label-free, single cell biosensors," Bioanalytical Reviews 1:177-185(2010)는 DNA와 단백질을 식별할 수 있는 라벨없는 바이오 센서로서의 나노피펫을 개시한다.
Umehara et al. "Label-free biosensing with functionalized 나노피펫 probes", Proc. Nat Acad. Sci. 106(12): 4611-4616(2009)은 기능화된 나노피펫 전극을 사용한, 라벨없는 실시간 단백질 분석을 개시한다. 단백질은 프로브 분자로 코팅된 나노피펫 팁과 상호 작용한다. 나노피펫 팁 표면의 정전기, 바이오틴-스트렙타비딘 및 항체-항원 상호작용이 50nm 구멍을 통과하여 흐르는 이온 전류에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
발명의 요약
이하의 간략한 요약은 본 발명의 모든 특징 및 측면을 포함하는 것은 아니며, 본 발명이 본 요약에서 논의된 모든 특징 및 측면을 포함해야 한다는 것을 의미하지는 않는다.
본 발명은 특정 실시양태에서, (a)(i)지지체 상에 세포를 관통시키기 위한 마이크로조작기 및 감지 장치에 작동가능하게 연결가능하고, (ii)그 안에 작업 전극을 함유하고, (iii)수소 이온을 선택적으로 흡수하는 고분자 코팅을 함유하는, 나노피펫 구조; (b)용액 내의 작업 전극과 기준 전극 사이에 상이한 전압을 인가하도록 구성되고, 상이한 전압 하에서 작업 전극과 기준 전극 사이의 이온 전류를 측정하도록 추가로 구성된 증폭기 회로에 추가로 연결된 상기 나노피펫 구조; 및 (c)상기 증폭기 회로에 의해 측정된 상이한 이온 전류를 나노피펫 구조 외부의 세포내 pH 값과 상관시키기 위한 논리 수단을 포함하는, 단일 세포 내부의 pH를 측정하는 장치를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 마이크로조작기 및 감지 장치가 SICM(주사 이온전도 현미경) 및 단일 세포로의 이동을 위해 나노피펫을 제어하는 xyz 제어기를 포함하는 장치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 증폭 회로가 이득 제어를 갖고 이온 전류를 검출하기 위한 저역 통과 필터를 갖는 검출 회로를 포함하는 장치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 도 16에 도시된 바와 같은, 단일 논리 수단에 연결된 나노피펫 구조의 어레이를 포함하는 장치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키토산은 약 30,000 내지 60,000 단위의 단량체 수를 갖는다. 키토산은 그에 부착된 헴단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 고분자 코팅이 설폰화 테트라플루오르에틸렌 공중합체(Nafion®), 폴리-l-리신 및 알기네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 장치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 증폭기 회로가 기준 전극에 연결되고 작업 전극으로부터의 입력을 갖는 증폭기로부터의 입력에 반응하는 퍼텐시오스태트(potentiostat)를 포함하는 장치를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 퍼텐시오스태트가 퍼텐시오스태트의 기준 전극에 또한 연결된 상대 전극에 연결되는 장치를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 작업 전극 및 상대 전극이 Ag/AgCl인 장치를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a)다양한 전위에서 이온 전류 대 전위를 측정하는 회로에 전기적으로 연결되고, 단일 세포에 나노피펫을 삽입하기 위한 삽입 장치에 부착된 나노피펫; (b)정류 값을 공지된 pH 값과 상관시키기 위한 논리 수단으로서, 세포에서 얻어진 정류 값을 공지된 정류 값과 상관시켜, 측정된 pH 값을 식별하는 출력을 제공할 수 있는 수단; (c)상기 나노피펫의 표면에 직접 결합되고 수소 이온에 대해 다공성인 키토산 물질의 층을 갖는 상기 나노피펫; 및 (d)보조 전극으로서 기능하고 퍼텐시오스태트에 연결되는 기준 전극을 포함하는 회로를 포함하는, 단일 세포 내부의 pH를 측정하기 위한 장치를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 보조 전극에서의 전류를 측정함으로써 기준 전극에 대해 주어진 전위 범위에서 작업 전극의 전위를 스캐닝하도록 논리 수단이 프로그램되는 장치를 포함한다. 상기 장치는 필터 선택 및 민감도 선택 회로에 의해 브릿지된 i/V 증폭기를 포함할 수 있으며, 상기 구성 요소는 전해질 용액을 통과하는 전류에 기초하여 검출 가능한 전류 범위를 조정하도록 조정된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a)(i)지지체 상에 세포를 관통시키기 위한 마이크로조작기 및 감지 장치에 작동가능하게 연결가능하고, (ii)그 안에 작업 전극을 함유하고, (iii)수소 이온을 선택적으로 흡수하는 폴리머 코팅을 함유하는, 나노피펫 구조를 제조하는 단계; (b)용액 내의 작업 전극과 기준 전극 사이에 상이한 전압을 인가하도록 구성되고, 상이한 전압 하에서 작업 전극과 기준 전극 사이의 이온 전류를 측정하도록 추가로 구성된 증폭기 회로에 상기 나노피펫 구조를 연결하는 단계; (c)상기 증폭기 회로에 의해 측정된 상이한 이온 전류를 나노피펫 구조 외부의 세포내 pH 값과 상관시키기 위한 논리 수단에 상기 나노피펫 구조를 연결하는 단계를 포함하는, 단일 세포 내부의 pH를 측정하는 장치를 제조하는 방법을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 키토산 물질 층을 나노피펫에 결합시킴으로써 상기 고분자 코팅이 도포되는, 상기 기술된 바와 같은 방법으로서; 상기 나노피펫을 통한 이온 전류에 대한 I-V 곡선을 전도 및 측정하는 증폭기에 상기 작업 전극을 연결하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (a)pH 이온에 반응하는 내층을 갖고, 상기 나노피펫 구조를 통과하는 이온 전류 대 상기 나노피펫 구조 및 기준 전극을 포함하는 전기화학 셀에서 다양한 전위에서의 전위를 측정하기 위해 구성된 퍼텐시오스태트를 포함하는 회로에 작업 전극에 의해 전기적으로 연결되는 나노피펫 구조를 제공하는 단계; (b)상기 나노피펫 구조를 상기 전기화학 셀내 세포에 삽입하는 단계; 및 (c)상기 이온 전류를 측정하기 위해 상기 회로를 사용하는 단계로서, 상기 전류는 알려진 pH와 상관 관계가 있는 단계를 포함하는, 세포내 pH를 측정하는 방법을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 나노피펫을 삽입하는 단계가 SICM 및 x-y-z 제어기를 사용하는 것을 포함하는 상기 기술된 방법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 이득 제어를 갖는 검출 회로 및 이온 전류를 검출하기 위한 저역 통과 필터를 포함하는 증폭 회로를 상기 회로가 추가로 포함하는 방법을 포함한다. 특정 양태 및 실시양태에서, 본 발명은 상기 내부 층이 50nm 내지 150nm 직경의 평균 구멍 크기를 갖는 키토산 물질의 층을 포함하는 방법을 포함한다. 키토산은 약 30,000 내지 60,000 단위의 단량체 수를 가질 수 있으며, 그것에 부착된 헴단백질을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 내부 층이 설폰화 테트라플루오르에틸렌 공중합체(Nafion®), 폴리-l-리신 및 알기네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 고분자 코팅을 포함하는 상기 기술된 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 기준 전극에 연결되고 작업 전극으로부터의 입력을 갖는 증폭기로부터의 입력에 차례로 반응하는 퍼텐시오스태트를 회로가 포함하는 상기 기술된 방법을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 기준 전극에 연결된 상대 전극에 퍼텐시오스태트가 연결되는 방법을 포함한다. 작업 전극 및 상대 전극은 Ag/AgCl일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 전압이 0.5V 내지 0.7V인 상기 기술된 방법을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 다양한 전압들이 퍼텐시오스태트 상에 설정되는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 pH 값이 암세포 상에서 취해지고 암세포가 아닌 세포에서의 pH와 비교되는 상기 기술된 방법을 포함한다.
도 1a, 도 1b, 도 1c 및 도 1d는 본 발명의 나노피펫의 특성을 나타내는 그래프 및 주사 전자 현미경 사진으로 구성된다. 도 1a의 그래프는 기본적인(bare) 나노피펫 및 키토산-변형된 석영 나노피펫의 이온 전류 정류의 비교이다. 두 측정 모두 10mM PBS(pH 7.0)로 채워진 석영 나노피펫으로 수행하였다. 키토산 물질이 없으면, 전류는 전위 대 Ag/AgCl에 대하여 선형적으로 증가한다. 도 1b는 전형적인 나노피펫 구멍 개구를 보여주는 주사 전자 현미경사진이다. 또한 집중 이온빔 컷 기본(bare) 나노피펫 팁(도 1c)과 나노피펫의 내부 표면에 키토산 층을 나타내는 키토산-변형된 나노피펫(도 1d)의 SEM 이미지가 도시되어 있다.
도 2a-2b는 나노피펫 팁의 측면도(도 2a) 및 키토산-변형된 나노피펫의 구멍(도 2b)을 보여주는 한 쌍의 주사 전자 현미경사진이다.
도 3a-3b는 pH의 결과로서의 본 발명의 나노피펫의 표면 전하의 가역적 변화를 나타내는 개략도(도 3a) 및 6.02 내지 8.04의 생리적으로 관련있는 pH 범위 내에서 키토산-변형된 나노피펫의 보정(calibration)을 나타내는 그래프(도 3b)로 구성된다. 모든 데이터 포인트는 +/-0.5V 대 Ag/AgCl 기준 전극에서 상대 정류 비로 표시된다. 오차 막대는 n=4의 반복 측정에 대한 표준 편차를 나타낸다. 0.1M PBS를 지지 전해질로 사용하였다. 알 수 있듯이, 산성 조건에서, 키토산 층은 음이온 표면으로부터 음이온과 양이온의 혼합물로 변할 것이다. pH 감소는 고분자의 양성자화를 일으키고, 표면 전하의 변화는 현 회로에서 검출되는 전류 정류를 유발할 것이다.
도 4a, 도 4b, 도 4c는 키토산-변형된 나노피펫의 산 적정에 대한 전형적인 선형 주사 전위법(linear sweep voltammogram)(도 4a) 및 키토산-변형된 나노피펫의 염기 적정에 대한 전형적인 선형 주사 전위법(도 4b)을 도시하는 그래프 세트이다. 그래프 (도 4c)는 2.59 내지 10.83의 해당 보정 나노-pH 프로브이다. 추적은 원래의 색상으로 되어있다. 도 4a에서, 측정된 최저 pH는 6.96으로, 화살표로 도시된다. 낮은 pH 값은 표시된 -0.5 지점에서 더 높은 전류를 나타낸다. 도 4b에서 가장 높은 pH인 10.83이 화살표와 함께 표시되어 있다.
도 5는 기본 나노피펫의 pH 반응을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 n=3 반복 측정에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 6a-6b는 세포 배양 배지에서 키토산-변형된 나노피펫의 보정을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. 도 6a의 배지는 1X MEM이고, 도 6b의 배지는 DMEM이다. 전류 반응은 0.6V의 고정 바이어스 전위에서 측정되었다. 오차 막대는 n=4 반복 측정에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 7a-7b는 세포 배양 배지 MEM(도 7a) 및 DMEM(도 7b)에서 산 적정을 위한 키토산-변형된 나노피펫의 전류-전위 곡선을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 높은 pH 값은 화살표로 표시된다.
도 8a-8b는 키토산-변형된 나노피펫으로 얻어진 전류 추적 및 나노피펫의 현미경 사진이다. 도 8a는 Axopatch 200B 증폭기를 사용하여 세포 침투 전, 도중 및 후에 기록된 맞춤형 주사 이온 전도도 현미경 전류-피드백 신호를 나타낸다. y-축의 진폭은 나노암페어이다. 도 8b는 삽입된 키토산-변형된 나노피펫의 대응하는 현미경 사진이다.
도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d는 키토산-변형된 나노피펫에 의해 측정된 개별 세포의 세포내 pH 수준을 나타내는 그래프 세트이다. pH 수준은 인간 섬유아세포(도 9a), HeLa(도 9b), MCF-7(도 9c) 및 MDA-MB-231 세포(도 9d)에 대해 기록되었다. 수평선은 나노-pH 프로브로 측정한 평균 세포내 pH를 나타낸다.
도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d는 상이한 세포 유형에 대한 키토산-변형된 나노피펫을 사용한 세포내 pH 측정의 대표적인 전류-전위 곡선을 나타내는 그래프 셋트이다: 인간 섬유아세포(도 10a), HeLa(도 10b), MCF7(도 10c) 및 MDA-MB-231(도 10d). 각 세포주 유형에 대한 모든 수치는 단일 pH 나노프로브로 얻어졌다. 셀 1은 (도 10a), (도 10c) 및 (도 10d)에서 화살표로 도시된다.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 나노-pH 프로브 삽입을 나타내는 대표적인 현미경 사진 및 나노-pH 프로브로 얻어진 전류-전압 곡선의 그래프로 구성된다. 현미경 사진은 MDA-MB-231 세포에 삽입된 나노-pH 프로브(도 11a) 및 프로브 철회 후 삽입 지점(도 11b)을 나타낸다. 세포는 어떠한 형태학적 변화도 나타내지 않았으며, 삽입 및 측정 과정동안 온전하게 유지되었으며, 철회 후에도 생존했다. 0.1M PBS(pH 7.0)에서 세포 조사(interrogation) 후 나노-pH 프로브의 재생 기준선의 선형 주사 전위법(도 11c).
도 12는 나노-pH 프로브를 이용한 실시간 세포내 pH 측정을 나타내는 그래프이다. pH 측정은 100μM NPPB(Cl-채널 차단제)의 부재(다이아몬드) 및 존재(큐브)하에 MDA-MB-231 세포 상에서 수행되었다. 도면의 화살표는 NPPB의 추가 시간을 나타낸다. 판독 값은 채널 차단제 노출 후 7분동안 21초마다 얻어진다. 오차 막대는 n=3 반복에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 100μM NPPB(Cl-채널 차단제) 노출의 결과로서 3개의 MDA-MB-231 세포의 시간에 따른 pH 변화를 나타내는 그래프이다. 판독은 채널 차단제 노출 후 21초마다 얻어졌다.
도 14a-14b는 나노-pH 프로브가 키토산 물질 층을 포함하는 본 장치의 개략도를 도시한다(도 14a). 도 14b는 산성 조건이 고분자 층(상부 패널) 상에 양성자 존재를 증가하는 pH의 변화를 도시하며; 그것은 또한 6(~0.7) 내지 8(~1.1)의 pH 범위(하단 패널)에 걸쳐 증가하는 정류 비(RpH/R중성)를 보여준다.
도 15는 도 14a에 도시된 장치를 더 명확히 나타내는 본 회로의 개략도이다.
도 16은 나노프로브 어레이의 2D 단면도를 도시하는 개략도이다. 전도성 물질을 함유하고 작업 전극에 연결된 나노피펫을 각각 포함하는 나노 프로브는 어레이 상에 장착된다. 각각의 작업 전극은 나노피펫 외부에서, 작업 전극 및 공통 기준 전극으로부터의 입력을 갖는 신호 증폭기에 연결된다.
도 2a-2b는 나노피펫 팁의 측면도(도 2a) 및 키토산-변형된 나노피펫의 구멍(도 2b)을 보여주는 한 쌍의 주사 전자 현미경사진이다.
도 3a-3b는 pH의 결과로서의 본 발명의 나노피펫의 표면 전하의 가역적 변화를 나타내는 개략도(도 3a) 및 6.02 내지 8.04의 생리적으로 관련있는 pH 범위 내에서 키토산-변형된 나노피펫의 보정(calibration)을 나타내는 그래프(도 3b)로 구성된다. 모든 데이터 포인트는 +/-0.5V 대 Ag/AgCl 기준 전극에서 상대 정류 비로 표시된다. 오차 막대는 n=4의 반복 측정에 대한 표준 편차를 나타낸다. 0.1M PBS를 지지 전해질로 사용하였다. 알 수 있듯이, 산성 조건에서, 키토산 층은 음이온 표면으로부터 음이온과 양이온의 혼합물로 변할 것이다. pH 감소는 고분자의 양성자화를 일으키고, 표면 전하의 변화는 현 회로에서 검출되는 전류 정류를 유발할 것이다.
도 4a, 도 4b, 도 4c는 키토산-변형된 나노피펫의 산 적정에 대한 전형적인 선형 주사 전위법(linear sweep voltammogram)(도 4a) 및 키토산-변형된 나노피펫의 염기 적정에 대한 전형적인 선형 주사 전위법(도 4b)을 도시하는 그래프 세트이다. 그래프 (도 4c)는 2.59 내지 10.83의 해당 보정 나노-pH 프로브이다. 추적은 원래의 색상으로 되어있다. 도 4a에서, 측정된 최저 pH는 6.96으로, 화살표로 도시된다. 낮은 pH 값은 표시된 -0.5 지점에서 더 높은 전류를 나타낸다. 도 4b에서 가장 높은 pH인 10.83이 화살표와 함께 표시되어 있다.
도 5는 기본 나노피펫의 pH 반응을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 n=3 반복 측정에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 6a-6b는 세포 배양 배지에서 키토산-변형된 나노피펫의 보정을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. 도 6a의 배지는 1X MEM이고, 도 6b의 배지는 DMEM이다. 전류 반응은 0.6V의 고정 바이어스 전위에서 측정되었다. 오차 막대는 n=4 반복 측정에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 7a-7b는 세포 배양 배지 MEM(도 7a) 및 DMEM(도 7b)에서 산 적정을 위한 키토산-변형된 나노피펫의 전류-전위 곡선을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 높은 pH 값은 화살표로 표시된다.
도 8a-8b는 키토산-변형된 나노피펫으로 얻어진 전류 추적 및 나노피펫의 현미경 사진이다. 도 8a는 Axopatch 200B 증폭기를 사용하여 세포 침투 전, 도중 및 후에 기록된 맞춤형 주사 이온 전도도 현미경 전류-피드백 신호를 나타낸다. y-축의 진폭은 나노암페어이다. 도 8b는 삽입된 키토산-변형된 나노피펫의 대응하는 현미경 사진이다.
도 9a, 도 9b, 도 9c, 도 9d는 키토산-변형된 나노피펫에 의해 측정된 개별 세포의 세포내 pH 수준을 나타내는 그래프 세트이다. pH 수준은 인간 섬유아세포(도 9a), HeLa(도 9b), MCF-7(도 9c) 및 MDA-MB-231 세포(도 9d)에 대해 기록되었다. 수평선은 나노-pH 프로브로 측정한 평균 세포내 pH를 나타낸다.
도 10a, 도 10b, 도 10c, 도 10d는 상이한 세포 유형에 대한 키토산-변형된 나노피펫을 사용한 세포내 pH 측정의 대표적인 전류-전위 곡선을 나타내는 그래프 셋트이다: 인간 섬유아세포(도 10a), HeLa(도 10b), MCF7(도 10c) 및 MDA-MB-231(도 10d). 각 세포주 유형에 대한 모든 수치는 단일 pH 나노프로브로 얻어졌다. 셀 1은 (도 10a), (도 10c) 및 (도 10d)에서 화살표로 도시된다.
도 11a, 도 11b 및 도 11c는 나노-pH 프로브 삽입을 나타내는 대표적인 현미경 사진 및 나노-pH 프로브로 얻어진 전류-전압 곡선의 그래프로 구성된다. 현미경 사진은 MDA-MB-231 세포에 삽입된 나노-pH 프로브(도 11a) 및 프로브 철회 후 삽입 지점(도 11b)을 나타낸다. 세포는 어떠한 형태학적 변화도 나타내지 않았으며, 삽입 및 측정 과정동안 온전하게 유지되었으며, 철회 후에도 생존했다. 0.1M PBS(pH 7.0)에서 세포 조사(interrogation) 후 나노-pH 프로브의 재생 기준선의 선형 주사 전위법(도 11c).
도 12는 나노-pH 프로브를 이용한 실시간 세포내 pH 측정을 나타내는 그래프이다. pH 측정은 100μM NPPB(Cl-채널 차단제)의 부재(다이아몬드) 및 존재(큐브)하에 MDA-MB-231 세포 상에서 수행되었다. 도면의 화살표는 NPPB의 추가 시간을 나타낸다. 판독 값은 채널 차단제 노출 후 7분동안 21초마다 얻어진다. 오차 막대는 n=3 반복에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 100μM NPPB(Cl-채널 차단제) 노출의 결과로서 3개의 MDA-MB-231 세포의 시간에 따른 pH 변화를 나타내는 그래프이다. 판독은 채널 차단제 노출 후 21초마다 얻어졌다.
도 14a-14b는 나노-pH 프로브가 키토산 물질 층을 포함하는 본 장치의 개략도를 도시한다(도 14a). 도 14b는 산성 조건이 고분자 층(상부 패널) 상에 양성자 존재를 증가하는 pH의 변화를 도시하며; 그것은 또한 6(~0.7) 내지 8(~1.1)의 pH 범위(하단 패널)에 걸쳐 증가하는 정류 비(RpH/R중성)를 보여준다.
도 15는 도 14a에 도시된 장치를 더 명확히 나타내는 본 회로의 개략도이다.
도 16은 나노프로브 어레이의 2D 단면도를 도시하는 개략도이다. 전도성 물질을 함유하고 작업 전극에 연결된 나노피펫을 각각 포함하는 나노 프로브는 어레이 상에 장착된다. 각각의 작업 전극은 나노피펫 외부에서, 작업 전극 및 공통 기준 전극으로부터의 입력을 갖는 신호 증폭기에 연결된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 균등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기술된다. 일반적으로, 세포 및 분자 생물학 및 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 당해 기술 분야에서 널리 사용되는 명명법이 있다. 구체적으로 정의되지 않은 특정 실험 기술은 일반적으로 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 그리고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반 및 보다 구체적인 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 명확성을 위해 다음 용어가 이하에 정의된다.
범위: 간결성을 위해, 구체적으로 언급하지 않는 한, 임의의 명시된 범위는 명시된 범위 내의 임의의 하위 범위를 포함하는 것으로 의도된다. 비-한정적인 예로서, 120 내지 250의 범위는 120-121, 120-130, 200-225, 121-250 등의 범위를 포함하도록 의도된다. 용어 "약"은 그 대략의 통상적인 의미를 가지며, 실험적 다양성에 의해 맥락에서 결정되어야 한다. 의심스러운 경우, "약"이라는 용어는 명시된 수치의 ±5%를 의미한다.
용어 "나노피펫"은 0.05nm 내지 약 500nm, 바람직하게는 약 (+ 또는-20%) 50nm 또는 약 80nm 또는 약 100nm의 팁 개구를 갖는 나노규모의 원뿔형 팁 개구, 즉 나노포어를 갖는 중공 자체-지지, 불활성, 비-생물학적 구조를 의미한다. 중공 구조는 예를 들어, 유리 또는 석영으로 이루어지며, 팁 개구를 통과하는 유체를 그 내부에 유지하기에 적합하다. 나노피펫의 내부는 분석물의 비특이적 결합을 최소화하도록 선택되거나 변형된다. 나노피펫의 내부는 전형적으로 석영 또는 다른 생물학적으로 불활성인 물질의 단일층의 균일한 벽 두께를 갖는 긴 콘형 형태이며, 나노피펫의 용액과 접촉하는 전극을 삽입할 수 있는 크기로 되어있다. 본 명세서에서 사용되는 나노피펫은 전형적으로 단일 보어(bore)를 가지지만, 다수의 동심원 보어를 갖는 나노피펫은 이중 보어 모세관을 당김으로써 제조될 수 있다. 외경은 전형적으로 팁 영역에서 약 1㎛ 미만이다.
용어 "나노포어"는 설명된 바와 같이, 전기적 절연막, 바람직하게는 나노피펫의 팁에 있는 작은 구멍을 의미한다. 나노포어는 팁 영역에 있을 것이며, 나노포어에 인접한, 나노피펫 보어의 마지막 몇 mm이다. 아래에 설명된 바와 같이, 나노포어는 소분자 복합체가 나노포어를 통한 이온 및 분자의 이동에 영향을 미칠 수 있는 크기로 되어있다. 나노포어는 막을 가로 질러 전압이 인가될 때 나노포어를 통과하는 이온 전류를 모니터링하는 장치에서 기능하도록 설계되었다. 나노포어는 나노피펫체에 의해 형성된 채널 영역을 가질 것이고, 바람직하게는 테이퍼 형, 예를 들어 원뿔대 구성으로 되어 있을 것이다. 아래에 설명되는 바와 같이, 석영 모세관을 당김으로써 재현가능하고, 정의된 나노포어 모양이 얻어질 수 있다.
하기에서 설명되는 바와 같이, 용어 "나노-pH 프로브"는 내부에 전극을 포함하는 나노피펫 및 기능화된 내부 부분을 포함하는 장치를 지칭하며, 물질의 pH를 나타내는, 나노피펫 내의 이온 전류의 작은 변화를 감지하기 위해 전극에 연결된 회로를 추가로 포함한다.
"석영"이란 용어는 결정 석영보다 저렴한 용융 실리카 또는 무정형 석영인 나노피펫 매질을 의미한다. 그러나, 결정 석영이 이용될 수 있다. 세라믹 및 유리 세라믹 및 붕규산 유리도 사용할 수 있지만, 정확도는 석영만큼 좋지 않다. "석영"이라는 용어는 특수 재료 뿐만 아니라, 적용가능한 세라믹, 유리 세라믹 또는 붕규산 유리를 포함하도록 의도되고 정의된다. 본 발명의 나노피펫 제조에 다양한 유형의 유리 또는 석영이 사용될 수 있음을 알아야한다. 가장 중요한 고려 사항은 좁은 직경의 개구에 재료를 끌어들이는 능력이다. 바람직한 나노피펫 재료는 다양한 형태의 유리 및 석영의 형태로 포함된 이산화 규소를 필수구성요소로 갖는다. 용융 석영 및 용융 실리카는 비정질 (비-결정성) 형태의 실리카를 주로 함유하는 유리의 유형이다.
용어 "키토산"은 임의로 분포된 β-(1-4)-결합된 D-글루코사민(탈아세틸화된 단위) 및 N-아세틸-D-글루코사민(아세틸화된 단위)로 이루어진 선형 폴리사카라이드를 의미한다. 키토산의 아미노기는 ~6.5의 pKa 값을 가지며, pH에 따른 전하 밀도 및 %DD(탈아세틸화) 값으로 산성에서 중성 용액으로의 양성자화를 유도한다. 이것은 키토산을 수용성으로 만들고, 점막과 같은 음으로 하전된 표면에 쉽게 결합하는 생체접착성으로 만든다. 키토산은 상피 표면을 가로 질러 극성 약물의 수송을 개선시키고, 생체적합성 및 생분해성이다. 키토산은 갑각류(게, 새우 등)의 외골격과 균류(fungi)의 세포벽에서 구조적 요소인 키틴의 탈아세틸화에 의해 상업적으로 생산된다. 탈아세틸화의 정도(%DD)는 NMR 분광법에 의해 측정될 수 있으며, 상업적 키토산의 %DD는 60-100% 범위이다. 평균적으로, 상업적으로 제조된 키토산의 분자량은 3800 내지 20,000달톤이다.
용어 "키토산 물질"은 상기 기술된 천연 키토산 폴리사카라이드 및 다양한 동소체 및 유도체를 의미하며, 예를 들어 Rinaudo, "Chitin and chitosan: Properties and application," Prog. Polym. Sci 31:603-632 (2006)에 기술되어 있다. 기술된 바와 같이, 키토산은 다양한 정도의 용해도, 아세틸화 또는 분자량을 가질 수 있다. 기술된 바와 같이, 키토산 물질 또는 천연 키토산은 층내에서 이온을 수용하는 나노유효범위의 또는 미세한 구멍이 얻어지도록 얇고 희박한 층 내에 형성될 수 있다.
용어 "고도로 하이드록실화된"은 하이드록실기를 갖는 본 나노포어에 사용된 석영 물질(SiO2)과 관련하여 사용된다. 예를 들어, α-석영(0001)은 Yang et al. "Water adsorption on hydroxylated α-quartz (0001) surfaces," Phys. Rev. b 73:035406 (2006)에 기술된 바와 같이 하이드록실화될 수 있다. 예를 들면, Konecny et al. "Reactivity of free radicals on hydroxylated quartz surface and its implications for pathogenicity experimental and quantum mechanical study," J. Environ Pathol Toxicol Oncol. 2001;20 Suppl 1:119-32를 참조한다.
용어 "헴단백질"은 단백질이 혼자할 수 없는 여러 기능을 수행할 수 있게 하는 유기 화합물인 헴 보결분자단을 포함하는 금속단백질을 의미한다. 헴은 매우 소수성이고 평면인 포르피린 고리의 중앙에 환원된 철 원자, Fe2+를 함유한다. 헴단백질에는 헤모글로빈, 미오글로빈, 뉴로글로빈, 사이토글로빈 및 레그헤모글로빈이 포함된다.
용어 pH는 일반적으로 수용되는 정의, 즉 수용성 물질의 산도 또는 알칼리도의 측정치(pH는 '수소의 전위'을 의미함)를 갖는다. pH 값은 1 내지 14의 숫자이며, 가운데(중성) 지점은 7이다. 7 이하의 값은 숫자가 감소함에 따라 증가하는 산도를 가리키며, 1이 가장 산성이다. 7 이상의 값은 알칼리도를 나타내며, 이는 숫자가 증가할수록 증가하고, 14가 가장 알칼리성이다. 그러나, 이 눈금은 센티미터 또는 인치 눈금과 같은 선형 눈금이 아니다(두 개의 인접한 값이 같은 차이를 가짐).
"논리 수단"이라는 용어는 일련의 전자 신호를 하나 이상의 유형 측정가능 값(들)로 변환하도록 프로그램가능하거나 프로그래밍된 논리 회로를 의미한다. 예를 들어, Birkner 등의 미국특허 제4,124,899호는 프로그래머블 어레이 논리 또는 PAL, 회로로 지칭되는 프로그래머블 논리 회로를 도시하고 있다. 본 발명의 논리 수단은 기준 프로브에 대해 기술된 프로브(수소 이온에 민감하고 반응성이며 전극을 함유하는 나노피펫을 함유함)를 통한 이온 전류의 주어진 변화에 기초하여 pH 값을 생성한다. 이해될 수 있는 바와 같이, 임의의 요구된 컴퓨터 프로그램은 범용 컴퓨터 또는 특수 목적 컴퓨터, 또는 기계를 생산하기 위한 다른 프로그래머블 처리 장치를 제한없이 포함하는 컴퓨터 상으로 로딩될 수 있어, 컴퓨터 또는 다른 프로그램 가능한 처리 장치 상에서 실행되는 컴퓨터 프로그램 명령은 기능을 구현하기 위한 수단을 생성한다. 따라서, 여기에 사용된 바와 같은 적절한 논리 수단은 본 장치를 감지하고 제어하도록 프로그램된 외부 컴퓨터 상에서 사용자가 사용하기 위해 제공되는 소프트웨어일 수 있다.
발명의 개요 및 실시양태
본 발명은 임의의 외인성 물질을 필요로 하지 않으면서, 단일 세포 내 pH 및 세포내 pH의 변화를 측정할 수 있는 수단 및 장치를 제공한다. 측정은 실시간으로 이루어지며, 나노피펫이 세포에 삽입되는 동안 pH의 변화를 추적할 수 있고, 민감한 회로는 세포내, 예를 들면 세포질, 핵, 미토콘드리아 등에 있는 나노피펫의 나노포어 개구에서 이온 전류를 측정한다. 검출 회로는 0.09 pH 단위의 검출을 나타내는 기술된 예와 함께, 0.1-0.01 pH 단위에 따라 고도의 민감도를 제공한다. 또한, 시스템은 약 2 내지 11의 pH 범위의 큰 동적 범위를 갖는다.
본 발명은 세포내 내의 용액에서의 pH 변화에 반응하여 변화하는 전류를 측정하는 방법 및 장치를 추가로 포함한다. 하나의 방법에서, 장치는 상이한 표준 pH 용액을 사용하여 보정된다. 보정곡선은 전류 대 pH를 반영하여 계산되며, 시료의 pH를 측정하는데 사용된다. 전류 측정을 위한 바람직한 전압 설정은 0.6V 또는 0.5V-0.7V 범위이다. 측정된 전류(퍼텐시오스태트로 측정됨)는 시료의 pH가 감소함에 따라 증가한다. 퍼텐시오스태트는 전류를 보고하고, 다양한 반응을 결정하고/하거나 최적의 작동 전압을 결정하기 위해 전압 범위에서 스위프된다. 전형적으로,인가된 전압은 약 0.2 내지 0.6V에서 스위핑된다. 현재 선호되는 사용방법에서, 퍼텐시오스태트는 선택된 전압을 시스템에 인가하고, pH에 상관되는 전류를 기록한다.
일 양태에서, 본 발명은 도 1a, 도 4a, 4b 등의 흔적에 도시된 바와 같이, 이온 정류를 증가시키기 위해 H+를 포함하는 이온을 포획하는 분자 스폰지를 형성하는 제어된 농도의 고도의 다공성 키토산 물질의 사용을 포함한다. 고도의 다공성 코팅(구멍 크기 약 50-150nm, 평균 평균 직경(average mean diameter) 약 100nm)은 나노-pH 프로브에 존재하는 수소 이온과 직접 상호작용할 수 있다. 투과성 수소 이온(양성자)은 일반적으로 약 0.012옹스트롬의 이온 반경을 갖는다. 평균 구멍 크기는 현미경적 수단에 의해 측정되거나 다공도 값으로부터 계산될 수 있다. 예를 들어 Zeng 등, "Control of Pore Sizes in Macroporous Chitosan and Chitin Membranes," Ind. Eng. Chem. Res., 1996, 35 (11), pp 4169-4175를 참조한다.
이온 전류 정류는 당 분야에 알려져 있는 바와 같이, 하나의 전압 극성에 대한 이온 전도의 증가를 특징으로 하지만 반대 극성을 갖는 동일한 전압 크기에 대한 이온 전도의 감소에 의해 비대칭 I-V 곡선을 생성한다. 양 및 음 전압이 전극에인가되며; 이온 전류 반응 사이의 차이는 구멍 내의 pH 및 결과적으로 세포내 pH를 나타낸다.
고도의 다공성 키토산 물질은 나노피펫 내부 구멍을 코팅하는데 비교적 낮은 농도의 키토산 물질을 사용함으로써 제조될 수 있다. 일부 양태에서, 키토산 물질은 0.25% 내지 1% 키토산 물질의 농도로 적용된다. 키토산 물질은 나노포어의 내부 부근에서 나노피펫의 석영 물질상의 하이드록실기에 직접 결합된다. 바람직하게는 약 30,000 내지 60,000의 단량체 수를 갖는 단쇄 키토산 물질이 사용된다. 결합은 석영을 표면 기능을 증가시키는 화학 물질, 예컨대 황산, 수산화 수소, 수산화 암모늄 등과 반응시킴으로써 개선될 수 있다. 이것은 오염 물질을 감소시키고 석영을 하이드록실화시키는 역할을 할 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 세포에서 산화환원 전위에 민감한 물질을 함유하도록 키토산 물질 층의 변형을 포함한다. 세포의 산화환원 전위는 전자 전달과 관련된 반응의 방향 및 자유 에너지 비용을 추론하는 데 사용되는 측정법을 의미하기 위해, 일반적인 의미로 사용된다. 화합물의 산화환원 전위, 또는 보다 정확하게 환원 전위는 전자를 획득하여 환원되는 경향을 의미한다.
예를 들어, 산화환원 전위를 이용하여 두 분자 주역을 연결하고, (예를 들어, TCA 주기에서 생성된) NADH의 산화로부터 생성될 수 있는 ATP 분자의 수에 대한 상한을 추정할 수 있다. 세포의 산화환원 전위는 다양한 질병에 의해 교란될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 벌크 용액과 나노피펫의 내부 사이에 사용되는 민감한 전자 장치 및 작업 전극 및 기준 전극의 배열을 포함한다. 기준 전극은 또한 보조 전극으로서 기능하고, 퍼텐시오스태트에 연결된다. 시스템은 보조 전극에서 전류를 측정함으로써 기준 전극에 대해 주어진 전위 범위에서 작업 전극의 전위를 스캐닝함으로써 기능한다. i/V 증폭기는 필터 선택 및 민감도 선택 회로에 의해 브릿지된다. 이들은 전해질 용액을 통과하는 전류를 기반으로 탐지가능한 전류 범위를 조정하는데 사용된다.
이제 도 14a를 참조하면, 본 장치는 내부에 pH 반응성 고분자(예를 들면, 키토산)를 갖는 나노피펫(142)을 포함한다. 키토산(반응성 고분자, 도 14b)은 나노피펫의 내부 표면 상에 직접 흡착된다. 나노피펫은 나노피펫(개구부 약 200nm 미만, 바람직하게는 10 내지 20nm 미만)에 의해 주입된 세포에서 액체를 감지하도록 구성된 작은 개구부를 포함한다. 나노피펫(142)은 기준 전극(150)(도 15에도 또한 도시 됨)을 또한 포함하는 시스템에 포함된다. 기준 전극(150)은 저역 통과 필터(146)에 추가로 연결되고 저역 통과 필터(146)로부터 출력(148)에 추가로 연결된 퍼텐시오스태트의 입력에 연결된다. 이하에 기술되는 바와 같이, 작업 전극은 기준 전극을 통해 전기화학 셀(152)에 전류를 주입하는 퍼텐시오스태트에 또한 연결된다. 전기화학 셀의 작업 용액은 또한 퍼텐시오스태트 및 외부 전극(도 14a에 미도시)에 연결된 기준 전극(150)을 포함한다. 나노피펫(142)은 기준 전극(150)이 잠긴 전기화학 셀 내의 작업 용액(매질)의 셀에 삽입된다.
이하에 기술된 바와 같이, 나노피펫(나노-pH 프로브)은 나노피펫을 위치시키고, 선택된 세포에 삽입하기 위한 전류 피드백을 검출하는 주사 이온 전도도 현미경과 같은 마이크로조작기(미도시)에 작동가능하게 연결된다.
도 14b에 개략적으로 도시된 바와 같이, 세포에서의 pH 감소는 나노피펫(142) 내의 코팅과 접촉할 때 용액으로부터 양성자를 회수할 수 있는 키토산 또는 등가의 고분자의 양성자화를 초래한다. 나노포어 영역내 키토산 층의 표면 변화는 구멍을 통과할 수 있는 이온 전류에 영향을 미친다. 이온 전류의 변화는 일반적으로 144로 도시된 피드백 증폭기로부터의 출력을 변경시킨다. 출력은 저역 통과 필터(146)에 의해 필터링되고, 도 15와 관련하여 설명된 바와 같이 148에서 모니터로 출력된다. 퍼텐시오스태트는 이득 선택기(154) 및 디지털 감쇠기(156)에 추가로 연결된다.
도 15는 본 장치에 배치된 퍼텐시오스태트가 세포내에서 pH 측정의 높은 민감도를 달성하는 방법을 도시한다. 나노피펫(도 14a에 도시된 142)은 전기화학 셀(152) 내에 작업 전극을 포함하고, 육각형으로 도시된다. 전기화학 셀(152)은 상기 언급된 단일 세포를 함유하는 용액, 및 작업 전극과 기준 전극(150)을 연결하는 도전성 용액이다. 기준 전극(150)은 또한 보조 전극 또는 상대 전극으로서 기능하고, 퍼텐시오스태트에 연결된다. 도시되고 알려진 바와 같이(자세한 내용은 미국특허 제5,466,356호 참조), 퍼텐시오스태트는 전기화학 셀에서 작동하는 하드웨어를 제공한다. (나노피펫내)작업 전극은 전위가 제어되고 전류가 측정되는 전극이다. 기준 전극은 작업 전극 전위를 측정하는데 사용된다. 기준 전극은 전류가 흐르지 않는 한 일정한 전기화학 전위를 가져야한다. 상대 전극은 작업 전극과 함께 회로를 완성한다. 전기화학적 환경이 매우 전도성이 없으면(1uA 미만), 기준 전극과 상대 전극을 동일한 전극에 부착할 수 있다.
도 15에 도시된 두 회로는 동시에 동작한다: 기준 전극과 작업 전극 사이의 전위차를 측정하여 전기화학 셀의 전압을 확인하며; 작업 전극과 상대 전극 사이에서 전류가 측정된다. 작업 전극과 상대 전극 사이의 전류 측정은 pH의 변화를 감지할 것이다. 전류가 매우 작고 전극 재료가 Ag/AgCl인 경우, 두 가지 동시 반응(event)이 아무런 간섭없이 발생할 수 있기 때문에 상대 전극과 기준 전극 둘다 단일 전극 상에서 작업할 수 있다.
시스템은 보조 전극에서 전류를 측정함으로써 기준 전극에 대해 주어진 전위 범위에서 작업 전극의 전위를 스캐닝함으로써 기능한다. 퍼텐시오스태트는 신호 증폭이 수행되는 주파수를 제어하는데 사용되는 이득 선택기(154)에 연결된다. (나노피펫에서) 작업 전극은 디지털 감쇠기(156)에 출력하고, 그로부터 (상기 기술한 바와 같이) 기준 전극에 출력하여 피드백 회로를 생성하는 i/V(전류 대 전압) 증폭기(158)의 입력에 연결된다. i/V 증폭기(158)는 또한 필터 선택(162) 및 민감도 선택 회로(164)에 의해 브릿지된다. 이들은 전해질 용액을 통과하는 전류에 기초하여 검출가능한 전류 범위를 조정하는데 사용된다.
증폭기(158)는 저역 통과 필터(146), 및 저역 통과 필터에 연결된 것으로 도시된 출력 연결부(148)(원)로 출력한다. 이 장치와 퍼텐시오스태트는 나노피펫을 통해 이온 전류를 측정하고 기록할 수 있는 모니터에 입력 단자(원)를 제공한다. 모니터는 상기 구성 요소에 의해 생성된 신호를 모니터링하고 제어하도록 프로그램된 컴퓨터를 포함할 수 있다.
사용 중에 설정되거나, 장치에 선택적으로 내장된 보정에 기반하여, 컴퓨터는 퍼텐시오스태트 회로에서 검출된 전류를 pH 값으로 변환하는 논리 수단을 포함할 것이다.
나노피펫이 삽입된 단일 세포는 액체 배양된 세포일 수도 있으며, 기판 상에 부동화된 세포일 수도 있다. 단일 세포는 조직의 일부일 수 있다. 이것은 현미경으로 확인되며, 나노피펫은 세포에 삽입될 x-y-z 제어장치에 의해 제어된다. 주사 이온-전도도 현미경법(SICM)이 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
본 나노-pH 프로브는 pH와 다양한 질병 사이의 관계를 조명하는 분석 도구로 사용될 수 있다. 본 나노-pH 프로브는 주사 이온-전도도 현미경법(SICM) 원리를 활용할 수 있다32. 나노피펫은 나노포어에서 이온 전류의 차이를 측정할 수 있는 전기 장치이다. 이들의 작은 크기는 높은 공간 분해능 및 감소된 침습성으로 직접적인 실시간 시험관내 측정을 가능하게 하여 약물 치료 과정에서 개별 세포의 세포내 변화를 모니터링할 수 있게 한다. 최근 나노피펫은 새로운 감지 도구로서 중요성을 가지며, 단백질33,34, 금속 양이온32,35, DNA36 및 탄수화물37의 검출을 위해 연구되었다. 석영 나노피펫은 다양한 인식 재료로 기능화될 수 있다. 이 연구에서 키토산 물질인 생체 고분자는 나노피펫의 내부 표면의 pH-민감성 표면 코팅으로 사용된다. 키토산은 생체 적합성이 있으며, 독성이 낮아 생물학적인 목적에 이상적이다. 독특한 필름-형성 능력, 표면에 대한 높은 밀착성 및 현저한 기계적 강도를 가지고 있다. 또한, 키토산은 바이오센서 제조를 위한 선택적 코팅으로 보여진다38-40.
생리 버퍼와 세포 배지에서 pH 측정을 위한 키토산-변형된 석영 나노피펫의 개발과 특성을 여기에 나타낸다. 인간 섬유아세포, HeLa, MCF-7 및 MDA-MB-231을 포함하는 4개의 상이한 세포 유형에서 세포내 pH의 직접 측정에 키토산-변형된 나노피펫을 사용하였다. 기술된 바와 같이, 클로라이드 채널 차단제를 사용하여 키토산-변형된 나노-pH 프로브의 시험관내 특이성을 달성할 수 있다. 나노-pH 프로브는 암 종양을 포함한 다양한 병리학적 상태에서, 뿐만 아니라 신경퇴행성 상태 및 노화에서, 세포 이질성을 조사할 강력한 후보이다.
본 장치는 단일-세포 수준에서 세포내 pH 측정의 한계를 극복하는 것으로 나타났다. 세포내 pH의 직접 측정은 키토산 물질의 석영 나노피펫으로의 간단한 물리흡착을 통해 새로운 방식으로 입증되었다. 이 접근법은 단일 세포 수준에서 세포내 pH 측정을 위한 pH-반응성 키토산 고분자 층 및 작은 크기의 나노피펫을 이용한다. 여기에는 매우 작은 구멍 크기(~97nm)를 가진 고도로 하이드록실화된 석영 나노피펫에 생체 적합성 pH-반응성 고분자인 키토산의 물리흡착을 통해 제조된 나노-pH 프로브가 설명되어있다. pH의 변화는 키토산의 표면 전하를 변화시키며, 이는 나노포어에서 이온 전류의 변화로서 측정될 수 있다. 나노-pH 프로브의 동적 pH 범위는 2.6~10.7이었고, 민감도는 0.09 pH 단위였다. 단일-세포 내비게이션을 위해 맞춤화된 주사 이온 전도도 현미경을 활용하여 나노-pH 프로브를 개별 세포에 삽입할 수 있었다. 본 발명자들은 인간의 섬유아세포, HeLa, MDA-MB-231 및 MCF-7을 포함한 비-암성 세포주 및 암성 세포주를 사용하여 단일-세포 세포내 pH 측정을 나노-pH 프로브와 함께 수행했다. 시험관내 결과는 키토산-작용화 나노피펫이 높은 시간 해상도(temporal resolution)로 선택적으로 세포내 pH를 측정한다는 것을 보여 주었다. 인간 섬유아세포, HeLa, MCF-7 및 MDA-MB-231에 대한 평균 세포내 pH 수준은 각각 7.37±0.29, 6.75±0.27, 6.91±0.20 및 6.85±0.11이었다. 이 결과는 섬유아세포와, 비-암세포보다 산성인 세포질 환경을 가진 암세포 사이의 양호한 분리를 나타낸다. 또한, 본 발명자들의 연구 결과는 집단 내의 개별 세포가 세포내 pH가 다를 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 센서의 실시간 연속 단일-세포 pH 측정능력을 입증하여, 의약품 조작에 대한 세포 pH 반응을 보여주었다. NPPB 노출 실험은 나노-pH 프로브가 세포내 pH의 생화학적으로 유도된 변화에 따라 단일 세포의 실시간 연속 조사를 가능하게한다는 것을 입증한다.
본 발명자들의 데이터는 키토산-변형된 나노피펫 감지 기술이 높은 선택성과 민감성으로 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 단일-세포 pH 수준을 조사하기 위한 강력한 접근 방법이라는 것을 나타낸다. 이 나노-pH 프로브 기술을 적용하면 세포의 이질성과 약물 내성에 대하여 더 깊이 이해할 수 있다. 이 목표를 달성하기 위해 본 발명자들은 약물 치료 과정에서 세포 집단의 고효율 스크리닝을 위한 완전 자동화 시스템을 개발하기 위해 노력하고 있다. 또한 본 발명자들은 종양 미세 환경(예를 들면, 종양 조직)에서의 pH 변화와 차이를 조사하기 위해 나노-pH 프로브를 사용할 것이다.
일반적인 방법 및 재료들
시약 및 재료. 키토산(저 분자량), 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)-벤조에이트(NPPB), 제1 및 제2 인산나트륨은 Sigma Aldrich로부터 구입하였다. 염화나트륨(ACS 등급), 염산, 수산화나트륨 및 과산화수소를 Fisher Scientific으로부터 입수했다. 아세트산(빙초산)은 Riedel-de-Haen에서 공급받았다. 2-프로판올은 Spectrum Chemicals로부터 입수했다. 2',7'-비스-(2-카르복시에틸)-5-(및-6)-카르복시플루오레신 아세톡시메틸 에스테르(BCECF-AM)를 Invitrogen에서 구입하였다. 디메틸 설폭시드(무수물)는 Fluka에서 공급했다. 최소 필수 배지 이글(MEM), Dulbecco 변형 이글 배지(DMEM) 및 트립신을 CellGro에서 구입한 반면, 소태아혈청(FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 Gibco에서 구입했다. 모든 수용액은 저항률이 18.2Ωcm인 증류된 탈이온수(Millipore, Synthesis System)로 제조된다.
나노-pH 프로브 제조. 필라멘트(QF100-70.7.5, Sutter Instrument)를 갖는 석영 모세관으로부터 나노피펫이 제작되었다. 당기기 전에, 모세관을 피라나 용액(황산:과산화수소, 3:1 v/v)으로 처리하고(주의: '피라나 용액'은 유기 물질과 격렬하게 반응하여 제조시 극도로 뜨거워질 수 있음), 증류수와 2-프로판올로 완전히 헹군다. 처리된 모세관은 오염을 방지하기 위해 사용할 때까지 2-프로판올에 보관했다. 모세관은 P-2000 레이저 풀러(Sutter Instrument)를 사용하여 다음과 같은 매개 변수가 있는 2-행 프로그램으로 꺼냈다; Line 1: Heat 700, Fil 4, Vel 20, Del 170, Pull 0 및 Line 2: Heat 680, Fil 4, Vel 40, Del 170, Pull 200. 결과로 생긴 나노피펫은 FEI Quanta 3D 전계 방출 현미경에 의해 검출된 ~97nm의 구멍 직경을 가졌다. 나노피펫은 변형될 때까지 봉인된 상자에 보관되었다. 나노피펫은 0.25% 키토산 용액 10㎕를 뒤채움(backfilling)하여 기능화하고, 키토산 매트릭스에 의한 나노피펫 팁의 커버범위를 보장하기 위해 4000rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 과량의 키토산을 흡인하고, 나노피펫을 밤새 공기-건조시켰다. 건조된 나노피펫은 pH 7.0의 10mM 인산 버퍼 식염수(PBS) 용액으로 뒤채움한 후, 원심분리하여, 나노피펫의 팁에 포획된 잔류 기포들을 제거하였다. 일단 채워지면, 나노포어의 막힘(clogging)을 막기 위해 pH 측정할때까지 10mM PBS(pH 7.0)에 모든 나노피펫을 보관했다.
감지 설정. 키토산-변형된 나노피펫 센서의 분석 특성화 실험을 수행하기 위해, 퍼텐시오스태트(1030C, CH Instruments Inc.)에 연결된 2-전극 설정이 감지에 사용되었다. 전해질로 채워진 나노피펫에 배치된 125μm 백금 와이어(Goodfellow Corporation)는 작업 전극으로 사용되는 반면, 벌크 용액(PBS 또는 세포 매질)에 배치된 의사(pseudo) Ag/AgCl 전극은 기준 전극으로 사용되었다. 0.1V/초의 스캔 속도로 모든 시험관내 측정을 위해 선형 주사 전압전류법(linear sweep voltammetry)이 이용되었다.
퍼텐시오스태트와 주사 이온 전도도 현미경(SICM)을 저소음 기계 스위치와 결합하여 세포내 측정을 수행했다. SICM 장비(setup)는 전류 피드백 측정을 위한 Axopatch 200B 증폭기(Molecular Devices), 나노-pH 프로브의 거친 포지셔닝을 위한 MP-285 모터구동 마이크로조작기(Sutter Instrument), 정밀 포지셔닝 및 나노-pH 프로브 센서의 삽입을 위한 피에조 스테이지(NanoCube, Physik Instrumente), 및 장비의 하드웨어 제어를 위한 프로그래머블 인터페이스로 구성된다. 이 시스템은 LabVIEW(National Instruments)로 작성된 맞춤형 소프트웨어에 의해 실행된다. 세포에 대한 모든 실험은 접안경 카메라(Dino-Eye, Big C)가 장착된 역 형광 현미경(Olympus IX 70)에서 수행되었다.
세포 배양. HeLa, MCF-7, MDA-MB-231 및 인간 섬유아세포를 37℃에서 5% CO2 및 90% 습도의 조건 환경에서 배양하였다. HeLa, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포를 1X MEM에서 배양하고, 인간 섬유아세포는 1X DMEM에서 배양하였다. 모든 배지에 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하였다.
형광 현미경. MDA-MB-231 세포 배양물은 pH-민감성 형광 표시기인 BCECF-AM에 노출시켰다. Hank의 완충된 염 용액(HBSS)에서 1μM의 농도로 작업 용액을 제조하고, 형광 이미징 전에 37℃에서 15분동안 배양하였다. 1μM BCECF-AM 용액을 채우기 전에 둘베코(Dulbecco)'s 인산완충 식염수(DPBS)로 세포를 세척하였다. 배양 후, 과량의 형광 염료를 HBSS로 세포로부터 씻어 내고 이미징을 위해 배양물에 적재하였다.
세포내 pH 버퍼 보정을 위해, 세포 배양물을 세포내 pH 보정 버퍼 키트(Life Technologies, P35379)와 함께 제공된 프로토콜에 따라 제조된 완전한 pH 보정 버퍼에 노출시키고, 이미징 전에 37℃에서 10분동안 배양하였다. 세포내 pH 보정은 3회 반복으로 수행되었다. 모든 형광 현미경 분석은 Leica Application Suite Advance Fluorescence(LAS AF 3) 소프트웨어를 사용하여 Leica SP5 공촛점 현미경에 의해 수행되었다. Fiji-ImageJ 소프트웨어를 사용하여 추가 이미지 분석을 수행했다.
실시예
실시예
1: pH-반응성 석영 나노피펫 센서의
특징화
나노피펫의 측정 원리는 팁의 이온 전류를 기반으로 한다. 이 이온 전류는 나노피펫의 구멍 크기와 표면 전하에 크게 의존한다34. 석영 나노피펫의 표면 전하는 유리-액체 계면에서 실란올기의 해리로 인하여 음전하이다. 석영은 극도로 산성 인 pH 값에서 양성자화를 겪는다41. 이러한 석영의 표면 특성은 pH 감지 능력을 감소시켜, 기본 나노피펫을 매우 작은 pH 변화를 측정하는데 부적절하게 만든다. 기본 석영 표면의 낮은 민감도와 관련된 한계는 나노피펫 표면상에 pH 반응성 고분자 요소들의 결합을 통해 극복될 수 있다. 여기서 본 발명자들은 pH 민감성 표면 코팅제로 키토산을 사용했다. 산성 pH에서 강한 양전하를 띄는 키토산은 정전기적 상호작용을 통해 음으로 하전된 석영 표면의 하이드록실 부분에 끌린다. 표면 전하의 변화 이외에, 키토산 층의 두께는 pH에 따라 변화하여, 나노피펫의 민감도를 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다42,43. 나노피펫 표면 상의 키토산 층의 존재와 영향을 평가하기 위해, 본 발명자들은 표면 변형의 결과로서 전류 반응의 변화를 모니터링했다. 도 1a는 -0.5 내지 0.5V(Ag/AgCl 기준 전극 대비)의 전위 범위에서 10mM PBS(pH 7.0)로 채워진 기본 및 키토산-변형된 석영 나노피펫의 전기화학적 흔적을 나타낸다. 기록된 전류 반응은 키토산 변형 후에 현저하게 감소한다. 나노피펫 팁의 일반적인 기하학적 형상은 원추형이며(도 2a), 석영 나노피펫의 구멍 크기는 SEM으로 측정하여, ~97nm인 것으로 나타났다(도 1b). 추가적인 SEM 현미경 사진을 촬영하여 키토산 층의 존재를 추가로 확인하였다(도 2b). 키토산 변형이 나노피펫의 내부에서 수행되었기 때문에, 나노피펫을 수직 방향으로 에칭하고 내부 표면을 노출시키는데 집중 이온 빔이 사용되었다. 횡단면 이미지는 기본 나노피펫의 표면과 비교할때 나노피펫 표면 내부의 키토산 잔여물을 나타낸다(도 1c 및 1d).
일단 키토산 층의 존재가 SEM 및 전기화학으로 확인되면, 관능화된 나노피펫의 분석 특성을 선형 주사 전압전류법을 사용하여 조사하였다. 전위 범위는 0.1V/초의 스캔 속도로 -0.5V에서 0.5V까지 걸쳐 있다. pH의 조절은 전통적인 산-염기 적정법에 의해 달성되었다. 키토산-변형된 나노피펫의 보정은 첫 번째 1M NaOH 20㎕와 두 번째 HCl을 0.1M PBS(pH 7.0)에 연속적으로 첨가하여 수행했다. +/-0.5V에서 변형된 나노피펫의 전류 정류는 키토산 층의 전하의 변화에 따라, 완충 용액의 pH 변화에 반응하여 변화되었다. 키토산은 그 다당류 백본(pK a ~6.5)에 글루코사민 잔기를 포함하고 있어 키토산 pH-반응성이 되게 한다38. pK a 이하의 pH 값은 키토산 층을 양성자화하여 나노피펫 표면을 양전하로 만드는 반면, 염기성 조건은 키토산의 아민 작용기를 탈 양성자화하여, 표면의 순 음전하를 증가시킨다(도 3a). pH의 정량화를 위해, 상대 정류비(RR)는 R RR = RR pH / RR 중성 로 정의되었으며, 여기서 RR pH 및 RR 중성 은 특정 pH 및 pH 7.0 각각에서 RR이다. 도 3b는 6.02 내지 8.04의 생리학적으로 관련이 있는 pH 범위 내에서 키토산-변형된 나노피펫을 사용하여 산-염기 적정으로 얻은 보정 곡선을 나타낸다. pH 보정 곡선에서 관찰된 추세는 등전점 결정 실험의 전형이다. 키토산의 등전점에서 약간의 변화는 나노피펫 팁의 나노규모 원추형 기하구조 때문일 수 있으며, 이는 이온의 균일한 확산을 방해할 수 있다. 키토산-기능화된 pH-나노프로브의 민감도는 0.09 pH 단위였다. pH에 대한 높은 민감도는 나노프로브가 세포내 pH 측정을 위한 강력한 도구가 되도록 한다. 더 넓은 범위의 pH 보정뿐만 아니라 개별 pH의 전류-전위 곡선이 도 4a-4c에 제공되어 있다. 기본 나노피펫을 pH 감지에 대해 시험하였으며; 예상대로, 이 나노피펫은 pH 변화에 대해 낮은 민감도를 보였다(도 5).
실시예
2: 세포 배양
배지내
pH 감지
고체 나노포어 pH 프로브를 개발하기 위한 본 발명자들의 동기는 단일 세포 수준에서 세포내 pH를 측정하고, 독특한 대사 특성을 가진 암 세포를 확인하는 것이다. 세포내 pH 측정을 수행하기 위해, 키토산 변형 나노피펫을 세포 배양 배지, MEM 및 DMEM에서 추가로 보정하였다. 세포 배양액에는 다양한 아미노산, 비타민 및 기타 성분이 함유되어 있으므로, 최적의 작업 매개 변수는 PBS에 대해 결정된 것과 상이했다. 주사된 전위 범위는 0.1V/초의 스캔 속도로 -0.2 내지 0.6V였다. pH 변화에 대한 키토산-변형된 나노피펫의 민감도는 0.6V에서 가장 높았다. 도 6a-6b는 1X MEM 및 DMEM 용액에서의 나노-pH 프로브의 보정을 보여준다. 배지내 나노-pH 프로브의 보정은 20㎕의 0.1M HCl을 연속적으로 첨가함으로써 수행되었다. 균질 용액을 얻기 위해 산 용액을 세포 배양 배지에 첨가한 후 15초에 측정을 수행하였다. MEM 및 DMEM 배지의 산 적정에 대한 대표적인 선형 주사 전위법이 도 7a-7b에 입증되어 있다. 이 배지의 성분이 다르므로, MEM에 비해 DMEM이 pH 변화에 내성이 강하기 때문에 그들의 완충 능력이 약간 다르다.
실시예
3:
암 세포
및 비-
암 세포의
세포내
pH의 측정
세포내 pH의 직접 측정은 세포의 작은 크기와 생리적 기질의 복잡성으로 인해 어려움을 겪고 있다. 생리적인 pH 수준은 약간 알칼리성이지만, 큰 집단과 세포아래 구획 내의 개별 세포의 세포내 pH 수준은 알려지지 않았다. 통상적으로, 형광 염료(예를 들면, BCECF-AM, 오레곤 그린)는 세포내 pH를 간접적으로 검출하기 위해 사용된다30. 이러한 pH 지표가 큰 세포 집단에 대한 pH 근사를 나타내지만, 형광 염료를 사용하는 데는 몇 가지 단점이 있다: i)짧은 pH 범위로 인한 낮은 민감성, ii)빠른 광 변색, iii)세포 독성. 또한, 특정 소기관내 상기 염료의 축적과 이들의 누출율은 잘못된 해석을 야기할 수 있다. MDA-MB-231 세포의 세포내 pH를 측정하기 위해 종래의 pH 지시약인 BCECF-AM을 사용한 연구에서 세포내 반응(event)을 정확하고 민감하게 평가하기 위해 형광을 사용하는 단점이 있음이 입증되었다. 형광계적 세포내 pH 측정이 이루어진 이 연구에서, 세포를 BCECF-AM에 노출시키고, 15분동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 세척하고, 세포의 pH 보정 버퍼(pH 7.5, 6.5, 5.5 및 4.5)를 함유한 니제리신에 10분동안 노출시켰다. BCECF-AM은 이중 여기 파장을 가지고 있으므로; 이미지는 458 및 488nm에서 촬영되었다. 밝은 필드와 형광 현미경 사진은 각 pH 값의 두 가지 여기 파장에 대해 얻어졌다. 비례측정(biometric) 보정 곡선은 16 내지 23개의 개별 세포들의 형광 강도를 사용하여 수득하였다(데이터는 나타내지 않음). 한 그룹의 세포는 세포내 자가형광의 존재를 평가하기 위해 (BCECF-AM 없이) 음성 대조군으로 사용되었다. pH 염료가 없을 때, MDA-MB-231에 대한 관찰가능한 형광은 없었다. BCECF-AM에 노출된 세포를 사용하여 개별 세포의 세포내 pH 값을 측정하였다. 10개의 개별 세포로부터 얻어진 평균 세포내 pH 값은 6.78(±0.83)으로 계산되었다. 그러나, BCECF-AM 노출 후에 촬영한 현미경 사진은 세포체에 대한 형광 강도가 다양하다는 것을 보여 주었다(데이터는 나타내지 않음). 세포가 두꺼운 곳일 수록 형광 강도가 더 높았다. 또한, 개별 세포에서 서로 근접한 임의의 2개의 영역은 pH 값에서 큰 변화를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 변화는 (i)형광 염료의 불균일한 분포 또는 축적; (ii)형광 염료와 다른 분자와의 교차 반응성에 기여될 수 있다. 형광 측정의 또 다른 단점은 매질의 빈번한 교체가 필요한 샘플 제조 단계이어서, 세포에 스트레스를 주고 기저 세포내 수준을 변경할 수 있다는 점이다. 또한, 형광 염료의 사용은 약물 테스트나 독성 측정과 같은 치료 과정에서 단일 세포의 지속적인 조사를 허용하지 않는데, 왜냐하면 관심있는 화합물과 함께 이들 염료가 존재하면, 세포의 생리학을 변화시키거나 시험될 화합물과 교차 반응함으로써 잘못된 실험 결론을 초래할 수 있기 때문이다. 즉, 치료제, 채널 활성화제 또는 독소의 세포 충격을 평가하기 위한 시간 경과에 따른 단일 세포의 지속적인 조사는 종래의 형광 프로브로 수행될 수 없다.
세포내 pH를 직접 정확하게 측정하기 위해, 키토산-변형된 나노피펫을 배양액내 세포의 세포질에 삽입하였다. 본 발명자들은 인간 섬유아세포, HeLa, MCF-7 및 MDA-MB-231을 포함하는 인간 암세포주 및 비-암세포주의 세포내 pH를 직접 모니터링하기 위해 이 감지 기술을 처음으로 사용했다. 인간 섬유아세포는 정상 세포질 조건에서 세포내 pH 수준을 조사하기 위해 비-암성 모델로 선택된다. HeLa 세포주는 세포 배양에서 신속하고 지속적인 성장으로 인하여 가장 일반적으로 사용되는 인간 암 유형이다. 또한, HeLa 세포의 오염과 이질성의 보고로 인해, 이들 세포들의 세포내 pH 수준을 측정하면 세포 이질성을 평가할 수 있다44. MCF-7과 MDA-MB-231은 별개의 유방암 세포주이다. MCF-7은 호르몬 반응성 세포주이며, 그의 성장은 에스트로겐에 의해 촉진되며; MDA-MB-231은 고도로 전이된 것으로 밝혀진 침윤성 유방암에서 파생된다45. 본 발명자들은 상기 2개의 유방암 세포주를 조사하기로 선택했는데, 그 이유는 그것들이 다른 약물 민감성을 나타내기 때문이며, 본 발명자들은 이것이 세포내 pH 수준의 차이와 관련이 있는지를 결정하고자 했기 때문이다.
키토산-변형된 나노피펫은 나노피펫의 위치 결정을 위한 전류 피드백을 검출하는 맞춤형 주사 이온 전도도 현미경을 사용하여 개개의 세포에 삽입되었다. 최근에 본 발명자들은 이 맞춤형 플랫폼이 게놈 조사를 위해 단일 세포 수준에서 나노 생체검사(nanobiopsy)를 수행할 수 있음을 입증했다46. 도 8a는 키토산-변형된 나노피펫의 접근-침투-철수 프로세스동안 기록된 대표 피드백 신호를 나타낸다. 나노-pH 프로브를 세포에 삽입한 후, 선형 주사 전위법을 기록하고, 바이어스 전위 0.6V에서의 전류-반응을 이용하여 단일 세포의 세포내 pH 수준을 계산하였다.
0.6V 대 Ag/AgCl에서의 전압 전류 반응으로부터, 개별 세포의 계산된 세포내 pH 수준 및 모든 세포주의 평균 pH 값을 도 9a-9d에 나타내었다. 7개의 인간 섬유아세포를 세포내 pH에 대해 조사하였으며, 평균 pH는 7.37±0.29이었다(도 9a). 이러한 인간 섬유아세포에서 관찰된 세포내 pH 수준은 이온 교환기(NHE 및 NBC) 및 산 운반체(AE)의 모니터링을 포함한, 간접적 및 파괴적 접근법들을 통해 pH 수준을 예측한 이전 보고서와 일치한다17.
본 발명자들은 또한 비-암세포와 암세포 사이의 대사 차이를 조사하기 위해 나노-pH 프로브를 사용했다. 암세포가 비-암세포에 비해 신진 대사 속도가 빠르기 때문에 암 세포에서 산성 종류와 CO2의 생성이 더 높다. 세포내 pH 측정을 위해 14개의 개별 HeLa 세포에서 키토산-변형된 나노-pH 프로브를 사용하여, HeLa 세포의 평균 pH가 6.75±0.27임을 확인했다(도 9b).
비슷한 산성 세포내 환경이 다른 암 세포주에 존재하는지 비교하기 위해 유방암 세포주에서 pH 측정을 수행했다. 나노-pH 프로브를 사용하여, 6.91±0.20의 14개의 개별 MCF-7 세포에 대한 평균 세포내 pH 수준이 관찰되었다(도 9c). 평균 세포내 pH는 11개의 개별 세포를 사용하여 MDA-MB-231에 대해 6.85±0.11이었다(도 9d). 개별 세포 측정의 대표적인 선형 주사 전압법은 도 10a-10d에 제공되어 있다. 본 발명자들의 데이터는 세포내 환경이 pH에 의해 감지되는 방식으로 세포마다 다를 수 있음을 입증한다. 이러한 차이는 개별 세포의 상이한 신진대사 속도에 기인할 수 있으며, 종양과 같은 많은 집단에서 이종 세포의 동정에 사용될 수 있다. 나노-pH 프로브의 작은 팁 크기는 삽입(도 11a-11c, 11a 및 11b의 현미경 사진 비교) 및 측정 중에 손상을 감소시킨다. 이 양태는 제약 조작 및 약물 요법의 과정에서 동일한 세포의 연속적 또는 간헐적인 조사를 가능하게한다(다음 섹션 참조). 도 11c는 연속적인 시험관내 측정을 위한 나노-pH 프로브의 재생 및 재사용을 도시한다. 0.1M PBS(pH 7.0)에서 세포 조사 후 pH 프로브를 시험하였다. 또한, 이 시험은 시험관내 측정에 사용된 후 프로브의 온전함을 제어하는데 중요하다.
여기에 설명된 pH 나노-프로브를 보다 완벽하게 배치하기 위해, 완전-자동화된 고효율 로봇 시스템을 구축하여 수백개의 세포를 수분 내에 조사할 수 있다. 일반적인 세포 집단과 비교하여 더 낮거나 높은 pH 값을 갖는 세포가 확인되고, DNA 및 RNA 시퀀싱을 위한 나노생체검사에 대한 분자 마커가 부착(tag)될 것이다.
실시예
4:
세포내
pH의 약학적 처리
현재의 나노-pH 프로브는 약물 치료 중 세포내 pH 변화를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 이를 위해, 기존의 염소 채널 차단제, 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)-벤조에이트(NPPB)를 첨가하는 동안 단일 세포에서의 연속 모니터링을 위해 본 나노-pH 프로브를 배치했다. NPPB는 이전에 신장 상피 세포 및 대식 세포에서 염화물 채널을 차단하여 세포내 환경의 산성도를 증가시키는 것으로 나타났다. 통상적으로, pH의 변화는 형광 염료(BCECF-AM)의 도입에 의해 간접적으로 측정되었다47,48. 따라서,이 약제 조작 테스트는 나노-pH 프로브의 실시간 측정 능력뿐만 아니라 pH 검출에 대한 특이성을 입증하는 역할을 한다. 기준선을 얻기 위해 MDA-MB-231 세포에 나노-pH프로브를 삽입하고, 7분 동안 21초마다 연속 pH 측정을 수행했다. MDA-MB-231 세포에서의 이러한 실시간 pH 모니터링은 측정 과정동안 최소 드리프트와 약 7 및 8의 값을 나타냈다(도 12, 다이아몬드). NPPB의 효과를 연구하기 위해 MDA-MB-231 세포에 나노-pH 프로브를 삽입하고, 100μM의 NPPB(무수 DMSO로 새로 제조)를 세포 배지에 첨가하기 직전에 세포내 pH 기록을 시작했다. 도 12의 사각형은 7분동안 NPPB 노출의 결과로 pH 변화를 표시한다. 세포내 pH 수준은 NPPB가 도입된 후 처음 2분 이내에 현저히 떨어졌으며, 2.5로 낮아졌다. 측정된 pH 수준은 NPPB 도입 4분 후에 안정화되었다. 이 pH의 증가는 세포체의 수축을 초래하는 세포 사멸로 인한 것일 수 있으며, 이것은 세포 배지에 나노-pH 프로브의 팁을 노출시킬 것이다. 나노-pH 프로브를 갖는 3개의 개별 MDA-MB-231 세포의 세포내 pH 측정은 NPPB 노출 후 실시간 pH 변화뿐만 아니라 약물 반응 측면에서 세포 간 변화를 나타낸다(도 13).
실시예
5:
세포내
산화환원 변화 검출
상기 기술된 장치는 세포내 성분들의 산화 또는 환원에 반응하는 나노피펫 상의 키토산 층에 부착된 층으로 추가로 변형될 수 있다.
상기 키토산-변형된 석영 나노피펫은 헴단백질 및 효소와 같은 부동화 단백질로 변형될 수 있다. 키토산에 대한 이러한 부동화는 키토산이 고분자 골격에 임의로 분포된 글루코사민 잔기 및 카르복실기를 갖는, 펩티드 결합 형성 메커니즘 또는 촉매 반응을 통해 실현될 수 있다. 산화환원 활성 소형 단백질을 키토산 층에 부동화함으로써 반응성 산소(ROS) 및 질소 종류(RNS)와 같은 반응성이 높은 라디칼, 및 과산화수소에 상기 기능화된 나노피펫을 민감하게 만든다. ROS에 대한 자세한 내용은 Salehi 등, "Hemeproteins including hemoglobin, myoglobin, neuroglobin, cytoglobin and leghemoglobin," J. Photochemistry and Photobiology B: Biology 133 11-178 (2014)을 참조한다.
이러한 라디칼(예를 들면, 활성 산소 종류)은 암, 노화, 뇌졸중, 파킨슨 병 및 알츠하이머 병과 같은 많은 질병 상태에 기여하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 ROS와 RNS의 생리적 수준의 측정은 매우 중요하다.
ROS 또는 RNS의 존재하에, 나노피펫 내부의 산화환원 민감성 표면 작용기들은 산화 상태에 따라 환원되거나 산화된다. 이러한 산화 상태의 변화는 표면 전하의 변화를 초래한다. 표면 전하의 변화는 수성 환경에 존재하는 ROS 또는 RNS의 양과 상관 관계가 있다. 반응 종류의 검출은 전위차가 석영 나노포어에 적용될 때 나노포어에서 이온 전류의 변동을 측정함으로써 수행된다.
실시예
6: 나노-pH
프로브들의
다중화 어레이
상기 기술된 장치는 나노-pH 프로브의 다중화 어레이로 추가로 구성될 수 있다. 또한, 어레이에 사용되는 다양한 나노피펫의 내부에 다수의 표면 인식 물질을 첨가할 수 있다. 수 나노피펫 구조는 다양할 수 있으며, 모두가 키토산 pH 감지 코팅을 포함하지는 않는다.
이 어레이에 사용하기 위한 원추형 나노피펫 구조체를 제조하기 위한 가능한 한가지 방법은 Meyyappan의, 미국특허 제9,182,394호에 기술되어 있다. 이 특허는 양극 산화를 지지하는 금속-유사 물질로 형성되고 조절되는 나노피펫 채널의 어레이를 기술한다. 기술된 바와 같이, Al, Mg, Zn, Ti, Ta 및/또는 Nb와 같은 양극산화가능한 금속의 얇은 기재는 pH=4-6 및 전위 1-300Volt의 화학적 배쓰에서 온도 T=20-200℃에서 양극산화 처리되어, 두께 5~20nm의 산화된 채널 표면을 갖는 직경 10~50nm의 양극산화 처리된 나노피펫 채널 어레이를 생성한다. 길이 1-5μm의 인접한 나노피펫 채널 사이에 노출된 비산화성 양극산화가능한 금속의 일부가 에칭되어 나노피펫 채널의 내부 및 외부 표면을 노출시킨다.
도 16은 나노프로브 어레이의 2차원 단면도를 개략적으로 도시한다. 도 16은 설명을 위해 6개의 나노피펫 프로브를 도시한다. 훨씬 더 큰 어레이를 사용할 수 있다. 개개의 나노-pH 프로브는 전도성 물질을 함유하는 나노피펫을 포함하고, 나노피펫의 내부로 연장되는 작업(감지) 전극(161)에 연결된다. 절연층(166)은 상기 기술한 바와 같이, 예를 들어 결정질 SiO2로서 구성된 나노피펫(164)의 어레이의 후방부에 도포된다. 비활성지지 구조체(163)가 절연층(166)에 부착되고, 절연 및 전극 어레이를 지지하는 역할을 한다. 어레이 내의 각각의 나노피펫(164)은 도시된 바와 같이, 절연층으로부터 Δh의 높이까지 연장되고, 직경 d의 팁 개구를 갖는다. 나노포어의 직경(d)은 5~200nm일 수 있으며, 나노피펫 치수의 길이 Δh는 10~400μm일 수 있다. 각각의 작업 전극(161)은 개별 증폭기(170)의 입력에 접속되며, 개별 증폭기(170)는 어레이의 개별 프로브(164)로부터의 차동 입력을 가지며, 나노피펫 내에 전도성 물질을 함유한다. 개별적인 신호 증폭기(170)가 각각의 나노피펫에 대해 제공되고, 도 15에 도시된 바와 같이 세포내 민감한 pH 변화의 판독값을 갖는 측정 장치에 출력(연결은 도시되지 않음)된다. 어레이 내의 나노피펫(164)은 예를 들어, 산화 알루미늄으로 제조된, 천공된 절연층(166) 상에 제조된다. 천공은 5~125μm 범위의 감지 전극을 삽입하기 위한 것이다.
또한, 지지 구조체(163)와 절연층(166) 사이에 제거가능한 부착을 제공하도록 자석 구조물(168a, 168b)이 제공된다. 이는 어레이 내의 나노피펫에 대한 접근을 제공하고, 피펫의 변형을 허용할 뿐만 아니라 이들을 지지 전해질로 채운다.
고분자 또는 인식 분자로 피펫 구조의 내부 표면을 주조함으로써 전극(161)을 삽입하기 전에 변형이 수행된다. 표면 코팅 공정은 내부 표면 전체에 대해 수행될 수 있지만, 이온 전류 변화가 나노포어의 처음 0.1 내지 5㎛에 의해 지배되기 때문에 필수적이지는 않다.
이러한 표면 인식 재료는 Nafion®, 페닐렌디아민, 폴리-l-리신, 폴리-아크릴산 및 폴리피롤을 포함하는 고분자; 산화환원효소 및 탈수소효소 군을 포함하는 효소; 아비딘 및 프리온을 포함하는 단백질; 및 항원, RNA 단편 및 앱타머일 수 있다. 이들 물질은 목표로 하는 감지 목적을 위해 나노 튜브의 개별 또는 어레이의 기능화를 위해 단독으로 또는 조합하여 이용될 수 있다. 표면 변형 프로토콜은 부동화, 농도, 배양 시간 및 온도에 대한 표면 화학을 포함하여, 각 인식 물질에 대해 최적화되어야한다. 각 감지 어레이의 pH, 전해질 유형 및 농도와 같은 나노피펫 충진 용액의 성질은 가장 높은 검출 감도에 대하여 평가되어야 한다.
필요한 표면 변형이 완료되고, 충진 전해액이 도입된 후, 감지 전극이 내장된, 맞춤형 인쇄회로기판(PCB)이 천공에 전극을 정렬함으로써 나노피펫 어레이의 상부에 배치된다. 감지 전극은 은, 백금, 금을 포함하는 금속; 또는 산화환원계(은-염화은(I)) 또는 유리질 탄소, 그래파이트 및 붕소-도핑된 다이아몬드를 포함하는 비금속일 수 있다. 전자 장치가 나노피펫 어레이에 삽입되면, 나노피펫 어레이의 내부 구성요소가 완전히 봉인된다. 네오디뮴으로 제조된 자석 구조물(168)은 전자 장치와 나노피펫 어레이가 서로 고정되도록 보장한다. 본 발명의 전자 구조물은 개별 채널에 대한 모든 필요한 회로를 포함하고, 동기식 또는 맞춤형 감지를 수행할 수 있다.
결론
상기 특정 설명은 본 발명을 예시하고 설명하기 위한 것이지, 첨부된 청구 범위의 문자 및 균등 범위에 의해 정의된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허 또는 공보들은 명시적으로 규정되지는 않지만, 현장의 작업자가 이해할 수 있는 본 발명의 특정 양태를 수행하는데 유용한 방법 및 재료의 세부 사항을 전달하기 위한 것이다. 그러한 특허 또는 공보는 언급된 방법 또는 재료를 설명하고 가능하게 하기 위해 필요에 따라 각각이 구체적으로 및 개별적으로 참고 문헌으로 인용된 것과 동일한 정도로 참고 문헌으로 본원에 포함된다.
참고문헌들
Claims (28)
- (a) 다양한 전위에서 이온 전류 대 전위를 측정하는 회로에 전기적으로 연결되고, 단일 세포에 나노피펫을 삽입하기 위한 삽입 장치에 부착된 나노피펫이며, 상기 나노피펫은 수소 이온을 선택적으로 흡수하는 키토산 코팅으로 이루어진 내부 층을 포함하고, 여기서 키토산 코팅은 나노피펫의 내부 표면에 직접 결합되는 것인 나노피펫;
(b) 정류 값을 기준 pH 값과 상관시키기 위한 논리 수단으로서, 세포에서 얻어진 정류 값을 기준 정류 값과 상관시켜, 측정된 pH 값을 식별하는 출력을 제공할 수 있는 논리 수단; 및
(c) 보조 전극으로서 또한 기능하고 퍼텐시오스태트에 연결되는 기준 전극을 포함하는 회로
를 포함하는, 단일 세포 내부의 pH를 측정하기 위한 장치. - 제1항에 있어서, 논리 수단이, 보조 전극에서 전류를 측정함으로써 기준 전극에 대해 주어진 전위 범위에서 작업 전극의 전위를 스캐닝하도록 프로그램되는, 장치.
- 제1항에 있어서, 필터 선택 및 감도 선택 회로에 의해 브릿지된 i/V 증폭기를 포함하며, 상기 i/V 증폭기, 필터 선택 및 감도 선택 회로는 전해질 용액을 통과하는 전류에 기초하여 검출 가능한 전류 범위를 조정하도록 조정되는, 장치.
- 제1항에 있어서, 키토산이 30,000 내지 60,000 단위의 단량체 수를 갖는, 장치.
- (a) 나노피펫 구조를 제조하는 단계로서, (i) 지지체 상에 세포를 관통시키기 위한 마이크로조작기 및 감지 장치에 작동가능하게 연결가능하고, (ii) pH 이온에 반응하는 내부 층을 갖고, 상기 나노피펫 구조 및 기준 전극을 함유하는 전기화학 셀 내에서 다양한 전위에서 상기 나노피펫 구조를 통과하는 이온 전류 대 전위를 측정하기 위해 구성된 퍼텐시오스태트를 포함하는 회로에 작업 전극에 의해 전기적으로 연결되는, 나노피펫 구조를 제조하는 단계이며, 여기서 내부 층은 수소 이온을 선택적으로 흡수하는 키토산 코팅으로 이루어지고, 키토산 코팅은 나노피펫의 내부 표면에 직접 결합되는 것인 단계;
(b) 용액 내의 작업 전극과 기준 전극 사이에 상이한 전압을 인가하도록 구성되고, 상이한 전압 하에서 작업 전극과 기준 전극 사이의 이온 전류를 측정하도록 추가로 구성된 증폭기 회로에 상기 나노피펫 구조를 연결하는 단계;
(c) 상기 증폭기 회로에 의해 측정된 상이한 이온 전류를 나노피펫 구조 외부의 세포내 pH 값과 상관시키기 위한 논리 수단에 상기 나노피펫 구조를 연결하는 단계
를 포함하는, 단일 세포 내부의 pH를 측정하는 장치의 제조방법. - 제5항에 있어서, 상기 키토산 코팅은 키토산 물질 층을 나노피펫에 직접 결합시킴으로써 도포되는 것이며; 나노피펫을 통한 이온 전류에 대한 I-V 곡선을 전도 및 측정하는 증폭기에 상기 작업 전극을 연결하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- (a) 나노피펫 구조를 제공하는 단계로서, pH 이온에 반응하는 내부 층을 갖고, 상기 나노피펫 구조 및 기준 전극을 함유하는 전기화학 셀 내에서 다양한 전위에서 상기 나노피펫 구조를 통과하는 이온 전류 대 전위를 측정하기 위해 구성된 퍼텐시오스태트를 포함하는 회로에 작업 전극에 의해 전기적으로 연결되는, 나노피펫 구조를 제공하는 단계이며, 여기서 내부 층은 수소 이온을 선택적으로 흡수하는 키토산 코팅으로 이루어지고, 키토산 코팅은 나노피펫의 내부 표면에 직접 결합되는 것인 단계;
(b) 상기 전기화학 셀 내에서 상기 나노피펫 구조를 살아있는 세포에 삽입하는 단계; 및
(c) 상기 이온 전류를 측정하기 위해 상기 회로를 사용하는 단계로서, 상기 전류는 기준 pH와 상관 관계가 있는 단계
를 포함하는, 단일 세포내 pH를 측정하는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 나노피펫을 삽입하는 단계가 SICM 및 x-y-z 제어기를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 회로가, 이득 제어를 갖고, 이온 전류를 검출하기 위한 저역 통과 필터를 갖는, 검출 회로를 포함하는 증폭 회로를 추가로 포함하는, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 내부 층이 50nm 내지 150nm 직경의 평균 구멍 크기를 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 키토산이 30,000 내지 60,000 단위의 단량체 수를 갖는, 방법.
- 제7항에 있어서, 회로가, 기준 전극에 연결되고, 작업 전극으로부터의 입력을 갖는 증폭기로부터의 입력에 차례로 반응하는, 퍼텐시오스태트를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 퍼텐시오스태트가 기준 전극에 연결된 상대 전극에 연결되는, 방법.
- 제13항에 있어서, 작업 전극 및 상대 전극이 Ag/AgCl인, 방법.
- 제7항에 있어서, 전압이 0.5V 내지 0.7V인, 방법.
- 제7항에 있어서, 다양한 전압이 퍼텐시오스태트 상에 설정되는, 방법.
- 제7항에 있어서, pH 값이 암세포 상에서 취해지고 암세포가 아닌 세포에서의 pH와 비교되는, 방법.
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