CN100478436C - 实时电子细胞传感系统及其在基于细胞的测定中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明包括使用细胞-基底阻监控来测定细胞的装置、系统和方法。在一方面，本发明提供了在绝缘基底上包含电极阵列的细胞-基底阻抗监控装置，其中整个阵列的每一个阵列的电极电阻近似均匀。在另一方面，本发明提供的细胞-基底监控系统包括一个或多个细胞-基底监控装置(其包括多个各自有电极阵列的孔)、阻抗分析仪、连接单独孔的阵列和阻抗分析仪的装置操作台和控制装置操作台和阻抗分析仪的软件。在另一方面，本发明提供了使用阻抗监控来检测细胞行为或状态改变的细胞测定。

Description

实时电子细胞传感系统及其在基于细胞的测定中的应用

本申请要求如下专利申请的优先权：美国临时申请号60/519,567(于2003年11月12日提交)；美国临时申请号60/542,927(于2004年2月9日提交)；以及美国临时申请号60/548,713(于2004年2月27日提交)。在本段中所提及的所有申请都在此引入作为参考。

本申请也引入如下专利申请作为参考：美国专利申请号10/705,447(于2003年11月10日提交)，其名称为“Impedance BasedDevices and Methods For Use in Assays”(专利代理人编号为ACE-101.P.1.1-US)；美国专利申请No.10/705,615(于2003年11月10日提交)，其名称为“Impedance Based Apparatuses and Methods forAnalyzing Cells and Particles”(专利代理人编号为ACE-00101.P.1.2-US)；美国临时申请60/397,749(于2002年7月20日提交)；美国临时申请60/435,400(于2002年12月20日提交)；美国临时申请60/469,572(于2003年5月9日提交)；PCT申请PCT/US03/22557(于2003年7月18日提交)和PCT申请PCT/US03/22537(于2003年7月18日提交).在本段中所提及的所有申请都在此引入作为参考。

发明背景

技术领域

本发明涉及基于细胞的测定的领域。具体说，本发明提供了基于阻抗的装置、设备和系统以进行细胞分析和进行基于细胞的测定。

背景技术

A.细胞的电子分析

生物电子学是正在发展的涉及生物材料和电子装置的集成的跨学科的研究领域。生物电子学方法已经运用于分析细胞以及测定生物分子和细胞。在一种类型的应用中，将细胞培养在微电极上，并测量和确定细胞-电极阻抗以监控细胞的改变。

在PCT申请No.PCT/US03/22557(名称为“IMPEDANCE BASEDDEVICES AND METHODS FOR USE IN ASSAYS”，于2003年7月18日提交)中，公开了一种用于检测位于电极表面的细胞和/或分子的装置。此装置通过测量由细胞和/或分子与电极表面的附着或结合导致的阻抗变化来检测细胞和/或分子。此专利申请还公开了多种此装置的实施方案以及使用所述装置进行基于细胞的测定的设备、系统。

B.变应性疾病和IgE介导的细胞激活

变应性疾病，也常称为速发型超敏反应病症，是最常见的免疫系统功能障碍，其影响所有美国个体的20％。速发型超敏反应表现为从简单的疹或搔痒以及泪溢到最极端的过敏反应情况中的任一种，在所述极端情况中呼吸道被限制到窒息和死亡的点。由于超敏反应的严重性、缺乏适当的治疗方法以及患有各种形式的所述状况的人群的高百分比，制药企业已十分重视开发新药用来有效地治疗并抗击这些损害身体能力并潜在威胁生命的病症的症状。

免疫系统中参与变态反应的主要的细胞是肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞在骨髓中分化，循环于血液中，并在炎症反应的晚期募集于炎症组织部位。相反，肥大细胞正常分布于整个结缔组织中，并参与免疫球蛋白E(IgE)-介导的变态反应的速发期(immediate phase)(Sharma等人，Clin RevAllergy Immunol.2002 Apr；22(2)：119-48)。个体初次遭遇变应原导致产生IgE，该IgE将结合到位于肥大细胞表面的高亲和力的IgE受体(Fc(ε)RI)，从而引起肥大细胞的敏化。随后遭遇此变应原会引起位于肥大细胞表面上的Fc(ε)RI-IgE复合物的交联，以及刺激肥大细胞释放速发型超敏反应的介质。肥大细胞表面的受体结合的IgE的交联触发一系列细胞内事件，统称为肥大细胞激活，其以细胞外释放有力的炎症介质为终点，许多这样的介质储存于分泌颗粒中，包括组胺。肥大细胞激活可被分为相互依赖的早期和晚期。肥大细胞激活的早期包括磷酸化和蛋白酪氨酸激酶及其底物的激活、第二信使肌醇三磷酸和二酰甘油的产生、细胞内钙水平的升高和分泌颗粒与膜的融合(Stassen等人，Crit Rev Immunol.2002；22(2)：115-40)。肥大细胞激活的晚期包括由于肌动蛋白细胞骨架的重构而引起的明显形态改变，引起有力的炎症细胞因子的合成和分泌的基因表达，以及在血管、支气管平滑肌和白细胞中产生各种作用的脂质介质的合成。

基于速发型超敏反应起始和执行过程涉及的多个步骤，有多个用于药物干预的潜在靶。大多现有的对于诸如哮喘的速发型超敏反应的治疗方法寻求减轻所述状况的症状，而不是直接针对病因。然而，正在进行充满希望的努力，以通过施用人源化的单克隆抗IgE抗体来中和IgE抗体，并获得临床症状的长期缓和(D’Amato等人，MonaldiArch Chest Dis.2003 Jan-Mar；59(1)：25-9)。同样，对IgE介导的肥大细胞激活的内在信号传导通路的阐明以及组合化学的出现提供了应用小分子抑制剂来靶向参与肥大细胞激活的关键蛋白和酶的机会。这些化合物可潜在地提供新型的免疫调制剂以治疗速发型超敏反应病症。几种激酶(包括PKC和酪氨酸激酶Syk)的小分子抑制剂在阻断一些速发型超敏反应的啮齿类动物研究中提供了鼓舞人心的临床前结果(Seow等人，Eur J Pharmacol.2002May 17；443(1-3)：189-96)。

越来越多的公司利用大化学库来筛选可能参与多种疾病状态的信号传导系统的潜在抑制剂。因此急需一种高通量的分子和细胞测定，以筛选这些信号传导通路的潜在调制剂。关于IgE介导的信号传导，现用的测定是测量脱粒作用后释放到培养基中的介质。这通过测量这些介质的酶活性(Rac and phosphatidylinositol 3-kinaseregulate the protein kinase B in Fc epsilon RI signaling in RBL 2H3mast cells.J Immunol.2001 Feb 1；166(3)：1627-34)、使用放射性前体(Guillermot等人，J Cell Sci.1997 Sep；110(Pt 18)：2215-25)或者通过ELISA来实现的，从而对所释放的介质的量进行定量(Berger等人，Allergy.2002 Jul；57(7)：592-9)。这些测定是单点测定或终点测定，其测量这些介质的累积释放，且也涉及使用试剂和操作细胞，例如固定或裂解。存在单点测定的事实不能保证筛选大化学库所需的高通量分析的适应性，所述单点测定使用昂贵的试剂(比如抗体)和细胞操作。

C.抗癌药物筛选和发现

在抗癌药物开发中，对药物的细胞毒性及细胞增殖抑制作用的时间依赖性的研究是获得用于开发临床给药策略的信息的一个重要因素。具体地是，推导时间依赖性的IC50和观察IC50的不同的时间依赖性模式(例如，参见Hassan SB，Jonsson E，Larsson R和KarlssonMO in J.Pharmacology and Experimental Therapeutics，2001，Vol.299，No.3，pp 1140-1147；Levasseur LM，Slocum HK，Rustum YM和Greco WR，in Cancer Research，1998，vol.58，pp 5749-5761.)。一般来说，这些研究使用终点单测量测定。对于应用于培养的细胞的药物或化合物的剂量浓度而言，每一个时间点都需要不同的实验。这些都限制了在这种时间依赖性细胞毒性研究中的时间分辩率及时间点的数目。因此，需要新的技术或方法以提供高时间分辨率及允许在许多时间点测量。

本发明进一步扩展了以下专利申请的发明：PCT申请号PCT/US03/22557(于2003年7月18日提交)，其名称为“IMPEDANCEBASED DEVICES AND METHODS FOR USE IN ASSAYS”，及美国专利申请号10/705,447(于2003年11月10日提交)，其名称为“IMPEDANCE BASED DEVICES AND METHODS FOR USE INASSAYS”(专利代理人编号为ACE-00101.P.1.1-US)。本发明提供了基于测量细胞-基底阻抗来进行基于细胞的测定的实时细胞电子传感系统，并提供了使用此系统进行基于细胞的测定的方法。此外，本发明也旨在解决现有的测定IgE介导的信号传导及细胞激活的方法和技术的局限。

发明概述

一方面，本发明涉及用于监控细胞-基底阻抗的装置，所述装置包括：a)绝缘的基底；b)两个或更多个安装于基底上的电极阵列，其中两个或更多个电极阵列的每一个都包括两个电极结构；和c)至少两个连接垫(connection pad)，每个连接垫都位于基底的边缘。对于装置的两个或更多个电极阵列的每一个，两个电极结构的第一个电极结构连接于两个或更多个连接垫中的一个，而两个电极结构的第二个电极结构连接于两个或更多个连接垫中的另一个。两个或更多个电极阵列的两个电极结构的每一个包含多个电极元件，且装置的各个电极阵列在整个阵列上的电极电阻分布是近似均匀的。装置的基底有适于细胞附着或生长的表面，细胞在所述基底上的附着或生长可引起各个电极阵列中的电极结构之间的可被检测的阻抗变化。在一种优选实施方案中，在本发明装置的基底上的各个电极阵列连接有不透流体的容器。

再一方面，本发明涉及细胞-基底阻抗测量系统，其包括：a)至少一个多孔装置，其可监控细胞-基底阻抗，其中多孔中至少有两个孔各自在孔底包含电极阵列；b)阻抗分析仪；c)用于接合一个或多个多孔装置和能够选择和将任一个多孔中的电极阵列电连接于阻抗分析仪的装置操作台；和d)用于控制装置操作台和对阻抗分析仪测量的阻抗值进行数据获取和数据分析的软件程序。在本发明的优选实施方案中，多孔装置的每个电极阵列是单独寻址的(addressed)。

另一方面，本发明提供了一种利用本发明装置监控细胞-基底阻抗的方法。此方法包括：提供本发明的多阵列装置；将此多阵列装置连接于阻抗分析仪；将细胞沉积于装置的两个或更多个阵列上的至少一个阵列上；并监控装置的一个或多个电极阵列上的细胞-基底阻抗。

另一方面，本发明提供了细胞指数(Cell Index)的计算方法，以定量和比较细胞-基底阻抗。

另一方面，本发明提供了一种计算将细胞-基底监控装置的阵列与连接垫连接起来的电迹线(electrical trace)的电阻的方法。这个电迹线的电阻被用于计算细胞指数。

另一方面，本发明提供了使用本发明的细胞-基底阻抗测量系统来监控细胞-基底阻抗的方法。这个方法包括：提供本发明的细胞-基底阻抗测量系统，将细胞添加于包含电极阵列的多孔装置的至少一个孔中，并监控一个或多个包含细胞的孔的细胞-基底阻抗。阻抗可在规则或不规则的时间间隔被监控。在一种优选实施方案中，在多孔装置上的至少两个孔中进行细胞-基底阻抗监控。

另一方面，本发明提供了一种进行基于细胞的实时测定的方法，其可研究一种或多种化合物对细胞的作用，该方法包括：提供上述的细胞-基底阻抗测量系统；将细胞导入包含电极阵列的系统的至少一个孔中；在有细胞的一个或多个孔中加入一种或多种化合物；在加入一种或多种化合物之前和之后监控一个或多个孔的电极阵列上的细胞-基底阻抗。优选的是，在向一个或多个包含细胞的孔中加入一种或多种化合物后，在规则的或不规则的时间间隔上监控细胞-基底阻抗。时间依赖性的阻抗的变化可提供加入化合物前的时间依赖性的细胞状态的信息，以及与化合物反应时的时间依赖性的细胞状态的信息。这些信息可用以确定化合物对细胞的作用。

在另一方面，本发明提供一种对至少一种化合物进行实时细胞毒性测定的方法，其包括：提供上述的细胞-基底阻抗测量系统；将细胞导入包含电极阵列的系统的一个或多个孔中；在包含细胞的一个或多个孔中加入一种或多种化合物；在加入一种或多种化合物之前和之后监控一个或多个孔的细胞-基底阻抗，其中时间依赖性的阻抗变化提供了一种或多种化合物的时间依赖性的细胞毒性的信息。优选的是，在向一个或多个包含细胞的孔中加入一种或多种化合物后，在规则的或不规则的时间间隔监控细胞-基底阻抗。时间依赖性的阻抗的变化可提供化合物的任何可能存在的细胞毒性的信息。

在上述方法的一个实施方案中，使用具有相同细胞类型的多个孔，其中向包含细胞的不同孔中加入不同浓度的化合物。此方法可提供时间依赖性的和浓度依赖性的细胞毒性反应。

另一个方面，本发明提供了一种分析和比较第一种化合物和第二种化合物对某一种细胞类型产生的时间依赖性的细胞毒性作用的方法，其包括：a)用上述方法使用第一种化合物进行对细胞类型的实时细胞毒性测定；b)用上述方法使用第二种化合物进行对所述细胞类型的实时细胞毒性测定；和c)比较第一种化合物和第二种化合物的时间依赖性的细胞毒性反应。

在这种方法的一个实施方案中，第一种化合物的时间依赖性的细胞毒性反应是在多个给药浓度下测定的。在另一个实施方案中，第二种化合物的时间依赖性的细胞毒性反应是在多个给药浓度下测定的。在另一个实施方案中，第一种化合物和第二种化合物的时间依赖性的细胞毒性反应是在多个给药浓度下测定的。

另一方面，本发明提供一种概述化合物对多种细胞类型的细胞毒性的方法，其包括：a)用上述方法进行化合物对不同细胞类型的实时细胞毒性测定，和b)分析不同细胞类型对化合物的实时细胞毒性反应，以提供化合物的细胞毒性概况。

在另一个实施方案中，使用上述方法进行多种化合物对多种细胞类型的细胞毒性概述。

在另一个方面，本发明涉及使用电子学阻抗技术来估计和定量细胞中发生的形态学变化的方法，所述形态学变化由IgE刺激及IgE受体和抗原交联引起。此方法包括：提供本发明的细胞-基底阻抗测量系统；在系统的一个或多个孔中导入细胞，并向包含细胞的一个或多个孔内加入IgE；向包含细胞和IgE的一个或多个孔内加入抗原；和监控系统的一个或多个孔的细胞-基底阻抗。可以在加入IgE之前和之后监控阻抗，且优选在加入IgE之前、加入IgE之后以及加入抗原之前和加入抗原之后进行测量。细胞-基底阻抗可用作细胞对IgE刺激的反应一种指示，而这种指示是通过细胞形态学改变实现的。

在另一个方面，本发明涉及通过利用电子学测量和细胞传感来筛选由抗原结合到IgE-Fc(ε)RI复合物而启动的信号传导通路的抑制剂的方法。这种方法包括：提供本发明的细胞-基底阻抗测量系统；在系统的一个或多个孔中导入细胞，并向一个或多个包含细胞的孔内加入至少一种测试化合物；提供至少一个无测试化合物的包含细胞的对照孔；将IgE加到一个或多个包含细胞和测试化合物的孔中以及一个或多个对照孔中；向一个或多个包含细胞和测试化合物的孔中以及向一个或多个对照孔中加入抗原；并监控系统的一个或多个孔的细胞-基底阻抗。可以在加入IgE之前和之后检测阻抗，且优选在加入IgE之前、加入IgE之后以及加入抗原之前和加入抗原之后进行测量。此细胞-基底阻抗可用作细胞对IgE刺激的反应的一种指示，而这种指示是通过细胞形态学变化而实现的。比较一个或多个包含测试化合物的孔中的细胞-基底阻抗和一个或多个对照孔中的细胞-基底阻抗可提供测试化合物对细胞针对IgE刺激的反应的作用。具体地，IgE反应抑制剂可由其能降低用测试化合物处理的细胞相对于对照细胞的反应的细胞-阻抗反应的性质而被鉴定。

在该方面的一个实施方案中，本发明涉及使用电子学阻抗技术来筛选IgE结合到肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的高亲和性Fc(ε)RI受体的潜在抑制剂的方法。

在这方面的另一个实施方案中，本发明涉及使用电子学阻抗技术来筛选关键酶和蛋白的小分子抑制剂的方法，所述关键酶和蛋白参与由抗原与细胞高亲和性Fc(ε)RI受体在有或没有IgE交联时结合所引起的信号传导通路。

在另一方面，本发明涉及使用电子学阻抗技术来靶向关键酶和蛋白的确认目的的方法，所述关键酶和蛋白参与由抗原与细胞高亲和性FcεRI受体在有或没有IgE-交联时结合所引起的信号传导通路。这个方法包括：提供本发明的细胞-基底阻抗测量系统；在系统的一个或多个孔中导入基因改造的细胞；提供至少一个包含未经基因改造的细胞的对照孔；向包含基因改造的细胞的孔中和向一个或多个对照孔中加入IgE，并向包含基因改造的细胞的孔中和向一个或多个对照孔中加入抗原；向包含基因改造的细胞的孔中和向一个或多个对照孔中加入抗原；监控包含基因改造的细胞的孔和一个或多个对照孔的细胞-基底阻抗；并分析阻抗数据以确定基因改变对细胞针对IgE刺激的反应的作用。

在另一方面，本发明涉及使用电子学阻抗技术来比较IgE-介导的不同遗传背景细胞的反应的方法。这种方法可用于筛选和确认遗传标记，例如基因表达谱、基因剪接变体、蛋白表达谱、关键单核苷酸多态性(SNP)或突变和其他遗传变体，这些遗传标记可决定或影响IgE刺激、IgE受体相互作用、抗原介导的IgE受体交联、细胞内信号转导通路和脱粒。

另一方面，本发明涉及使用电子学阻抗技术来筛选、发现和确认特异性或非特异性地引起IgE交联的抗原(变应原)和半抗原的化学结构的方法。

附图简述

图1是本发明的细胞-基底阻抗测量装置的一种设计的示意图。A)描述了在基底上具有以2行x8列构型排列的16个电极阵列(或者16电极结构单元)的基底。B)描述了装置的单个电极阵列。C)显示了电极阵列的示意图，表明要求在整个阵列上的电极电阻分布是近似均匀的。

图2显示本发明的16x装置的图像。

图3显示本发明的96x装置的图像。

图4显示本发明16x装置操作台的一种设计，在操作台上连接有6个16x装置。

图5显示本发明96x装置操作台的一种设计，在操作台上放置有96孔板。

图6显示实时细胞电子传感软件的不同页面。A)实验笔记页(experimental note page)，允许实验人员记录实验的关键信息，例如实验目的和实验流程。B)实验设计页(experimental layout page)，允许记录加于各个孔中的细胞、细胞数目、化合物及化合物浓度。C)测试时间设置页(Test time setting page)，允许记录和控制进行细胞-基底阻抗测量所使用的时间间隔，且可设置多个实验步骤，每个步骤都具有不同的时间间隔值和不同长度的时间。D)细胞指数页(Cellindex page)是结果页，其中在由测试时间设置页设置的预定时间间隔完成每一个测量后，软件系统自动更新所有孔的测量的和推导的细胞指数值。E)实验数据绘图页(Experimental data plot page)允许对实验数据进行灵活的绘图及整理。

图7显示在本发明的细胞基底监控系统上以不同初始细胞接种数目接种的H460细胞增殖的实时监控。每隔15分钟连续记录细胞增殖，持续超过125小时。以对数比例绘制的细胞生长曲线显示了指数细胞生长和稳定期的细胞。

图8显示使用本发明的细胞基底阻抗监控系统实时监控NIH3T3细胞的细胞附着和扩散。在包被有聚-L-赖氨酸或纤连蛋白的装置上接种细胞。不同的包被表面上的细胞附着和细胞扩散过程被实时地每隔3分钟监控共测量3小时以上。

图9显示使用本发明的细胞-基底阻抗监控系统实时监控Cos-7细胞的形态学改变。使细胞血清饥饿8小时，并用50ng/mL EGF刺激。以3分钟时间间隔监控细胞的形态学变化，共监控2小时，然后以1小时时间间隔共监控14小时。经EGF处理的细胞的信号中出现的最初的跳变(jump)是由于响应于EGF产生的膜的变皱和肌动蛋白动态反应。箭标所指处为EGF刺激点。

图10显示用抗癌药物紫杉醇处理的H460细胞的时间依赖性细胞指数的绘图。不同孔的培养的H460细胞在其指数生长期用不同浓度的紫杉醇处理。在处理后，细胞对不同剂量的紫杉醇的动态反应被每隔15分钟使用本发明的细胞-基底阻抗监控系统进行实时监控，持续50小时。

图11显示用抗癌药物AC101103处理的H460细胞的时间依赖性细胞指数的绘图。不同孔的培养的H460细胞在其指数生长期用不同浓度的AC101103处理。在处理后，细胞对不同剂量的AC101103的动态反应被每隔30分钟使用本发明的细胞-基底阻抗监控系统进行实时监控，持续20小时。

图12显示用阿霉素处理的A549细胞的动态药物反应曲线。在16X细胞-基底阻抗监控装置的每个孔中接种10,000个A549细胞。在处理前用细胞-基底阻抗监控系统监控细胞附着和细胞生长。当细胞处于指数生长期时，在细胞中加入不同浓度的阿霉素。细胞对阿霉素的时间依赖性和药物剂量依赖性如图所示被实时记录下来。

图13是显示肥大细胞在有抗原或无抗原时对IgE的反应的细胞指数记录绘图。在16X装置的每个孔中接种20,000个RBL-2H3肥大细胞。使细胞贴壁和生长22小时，同时记录数据。在22小时时将细胞用1μg/mL非特异性小鼠IgG或者1μg/mL抗-DNP小鼠IgE处理。继续记录细胞的电子学阻抗反应另外20小时，随后吸出孔中的培养基，并换上新鲜无血清培养基。使细胞恢复30分钟，然后用1μg/mL的抗原，DNP-BSA处理。再测量细胞的电子学阻抗反应3小时。

图14显示另一个实验的结果，其中监控用抗-DNA IgE敏化的和通过应用DNP-BSA激活的RBL-2H3肥大细胞的细胞-电极阻抗反应。在16X装置上以20,000个细胞/孔的密度接种RBL-2H3肥大细胞，连续测量阻抗，并每隔30分钟使用本发明的细胞-基底阻抗监控系统记录细胞指数。接种后约14小时，将细胞与100ng/mL抗DNPIgE温育，24小时后继而应用100ng/mL DNP-BSA。在应用DNP-BSA后以5分钟的时间间隔进行阻抗测量(由细胞指数显示)。

图15显示RBL-2H3肥大细胞的细胞-电极阻抗反应和细胞形态学动力学和介质释放之间的相关性。(A)用100ng/mL IgE敏化RBL-2H3肥大细胞或用对照IgG抗体处理RBL-2H3肥大细胞，然后用DNP-BSA激活。细胞在所指示的时间点用多聚甲醛固定、透化并用罗丹明-鬼笔环肽染色。用安装有CCD照相机的Nikon E-400免疫荧光显微镜显现细胞并拍摄细胞照片。(B)被IgE敏化，通过应用DNP-BSA激活的RBL-2H3肥大细胞。

图16显示IgE单独介导的肥大细胞-电极阻抗反应升高及其对抗原介导的激活步骤的作用。(A)接种于微电子传感阵列上的RBL-2H3细胞不经处理或用所示浓度的抗-DNP IgE处理。使用细胞-基底阻抗监控系统连续监控和记录由细胞指数显示的阻抗值。(B)用15ng/mL或1μg/mL抗-DNP-IgE敏化的RBL-2H3细胞被用100ng/mLDNP-BSA激活。使用系统连续监控由细胞指数显示的阻抗值。

图17显示用细胞-电极阻抗测量系统监控蛋白激酶C抑制剂双吲哚基马来酰亚胺(Bisindolymaleimide)对IgE-介导的RBL-2H3肥大细胞的激活的抑制作用。将RBL-2H3肥大细胞用100ng/mL抗-DNP-IgE敏化，然后与所示浓度的双吲哚基马来酰亚胺温育1小时，之后再加入100ng/mL DNP-BSA。使用本发明的细胞-基底阻抗监控系统监控由细胞指数显示的阻抗值。

图18显示在有药理学抑制剂时测量的IgE-介导的RBL-2H3肥大细胞的β-氨基己糖苷酶活性。RBL-2H3肥大细胞被敏化，并分别与DMSO、16.6微摩尔SU6656、5微摩尔U73122、16.6微摩尔双吲哚基马来酰亚胺、16.6微摩尔Piceatannol和16.6微摩尔PD 98059温育1小时。通过加入100ng/mL DNP-BSA来激活细胞。

发明详述

A.定义

为了公开内容的清楚，而不是为了做作某种限制，本发明以下的详述将分为多个章节。

除非有另外的定义，在此使用的所有技术和科学术语都与本发明所属技术领域内技术人员所通常理解的术语具有相同的意义。在此所提及的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物都以参考文献的形式被完整地结合到本申请中。如果在本章内提出的定义与专利、申请、公开的申请和其他出版物中提出的定义相反或不一致，则本章中提出的定义优于那些引入作为参考的文献中提出的定义。

在此使用的“一个(a)”或“一个(an)”指“至少一个”或“一个或多个”。

在此使用的“膜”，是指材料片。

在此使用的“生物相容性膜”指对细胞，包括生存力、附着、扩散、游动性、生长或细胞分裂无有害作用的膜。

当存活的、未受损害的上皮细胞或内皮细胞的悬浮液被加入容器中时，当在12小时内有相当大百分比的细胞粘附于容器表面时，称为容器的表面“适于细胞附着”。优选的是，在12小时内至少50％的细胞粘附于容器表面。更优选的是，适于细胞附着的表面具有的表面性质使得铺平板12小时内(即，在细胞加入容器后)，至少70％的细胞粘附于表面。甚至更加优选的是，适于细胞附着的表面的表面性质使得铺平板12小时内至少90％细胞粘附于表面。最优选的是，表面的表面性质使得铺平板8、6、4、2小时内至少90％细胞粘附于表面。为了具有所需的用于细胞附着的表面性质，表面需要经化学处理(如：用酸和/或碱处理)，和/或物理处理(如：用血浆处理)，和/或生物化学处理(如：用一种或多种促进细胞附着的分子或生物分子包被。在本发明中，生物相容的表面(例如膜)优选地适于在测定中所使用的类型的细胞附着，所述测定使用生物相容的表面(例如，膜)，且最优选使得在测定中接触生物相容的膜的至少90％的细胞的附着。

“生物分子包被”是指在表面的包被，其包含作为天然存在的生物分子或生化试剂的分子，或衍生自或基于一种或多种天然存在的生物分子或生化试剂的生化试剂。例如，生物分子包被可包括细胞外基质成分(如纤连蛋白、胶原)，或其衍生物，或可包括生化试剂，如聚赖氨酸或聚鸟氨酸，它们是基于天然存在的生化试剂赖氨酸和鸟氨酸的聚合分子。基于天然存在的生化试剂如氨基酸的聚合分子，可利用天然存在的生化试剂的异构体或对映异构体。

“细胞外基质成分”是指存在于动物中的细胞外基质中的分子。它可以是来源于任意物种和任意组织类型的细胞外基质的成分。细胞外基质的成分的非限制性的实例包括层粘连蛋白、胶原纤连蛋白、其他糖蛋白、肽、糖胺聚糖、蛋白聚糖等。细胞外基质成分还包括生长因子。

“电极”是指一种具有高电导率的结构，即，电导率远远高于周围材料的电导率。

在此使用的“电极结构”是指单个电极，特别是一个具有复杂结构的电极(如一个螺旋型的电极结构)，或者是至少两个电连接在一起的电极元件的结合体。所有在“电极结构”中的电极元件都是电连通的。

在此使用的“电极元件”是指电极结构中的单个结构特征，例如，交指型电极结构中的指状突起结构。

在此使用的“电极阵列”或“电极结构单元”是指两个或更多个电极结构，其构造为具有一定尺寸和间隔，从而当连接于信号源时，可作为一个单元运行，以在电极结构周围空间区域产生电场。本发明中优选的电极结构单元可测量由于细胞附着在电极表面而产生的阻抗变化。电极结构单元的非限制性实例包括交指型电极结构单元和同心的电极结构单元。

“电极总线(electrode bus)”是电极的一个部分，其连接单个电极元件或亚结构。电极总线提供了从单个电极元件或单个电极亚结构通到另一个电连接点的共同导电线路。在本发明的装置中，电极总线都接触电极结构的各个电极元件，并提供连接到电迹线的电连接线路，所述电迹线会连结至连接垫。

“电极迹线”或“导电迹线”或“电迹线”是指从电极或电极元件或电极结构通向装置或设备末端或周边的导电线路，以将电极或电极元件或电极结构与阻抗分析仪连接起来。装置的末端或周边可对应于装置或设备上的连接垫。

“连接垫”是本发明的设备或装置上的一个区域，它电连接到所述设备或装置上的至少一个电极或至少一个电极结构内的所有电极元件上，并且可操作地被连接到外部的电路上(例如，阻抗测量电路或信号源)。连接垫和阻抗测量电路或信号源之间的电连接可以是直接或间接的，可通过任何适当的导电工具，例如导线或金属线来实现。这种导电工具也可以经过位于设备或装置上其他区域的电极或电传导线路来实现。

“交指型的”是指来自于一个方向的突起结构与来自另一个方向的突起结构以合上的双手的手指的方式相互交错(应指出交指型电极元件优选不会相互接触)。

在此使用的“接触电极元件的高概率”是指如果细胞随机地位于本发明的装置或设备的传感器区域内，那么细胞(或颗粒)接触电极元件的概率由在本发明的装置或设备之上或其中使用的细胞的平均直径、电极元件的大小、电极元件之间的间隙大小计算而来，大于约50％，更优选大于约60％，更优选大于约70％，甚至更优选大于约80％，大于约90％，或大于约95％。

在此使用的“在所述的基底上加工的至少两个电极”指至少两个电极被加工或制作或生产在基底上。该至少两个电极可以处于基底的同一面或基底的不同面。基底可以有多层，该至少两个电极可以处于基底的同一层或基底的不同层上。

在此使用的“在所述的基底上的同一面上加工的至少两个电极”是指至少两个电极被加工在基底的同一个面上。

在此使用的“在所述的基底上的同一平面上加工的至少两个电极”是指，如果绝缘基底是多层的，那么至少有两个电极被加工于基底的同一层上。

在此使用的“所述...电极(或电极结构)具有基本相同的表面积”是指所提及的电极的表面积相互没有很大的差别，从而，由细胞在所提及的任意一个电极(或电极结构)上附着或生长引起的阻抗变化将以与细胞在所提及的任意其他电极(或电极结构)上附着或生长引起的阻抗变化相同或相似的程度对阻抗的总的可检测的变化做出贡献。换句话说，当电极(或电极结构)具有基本相同的表面积时，在细胞在任一电极上附着或生长后，任意一个电极都会对总的阻抗变化做出贡献。大多数情况中，具有“基本相同的表面积”的最大的电极和最小的电极间的表面积比率小于10。优选的是，电极阵列的最大的电极和最小的电极间的表面积比率小于5、4、3、2、1.5、1.2或1.1。更优选的是，所述的电极结构的至少两个电极都有近于相同或相同的表面积。

在此使用的“所述的装置具有适合于细胞附着或生长的表面”是指设备上的电极和/或非电极区域具有合适的物理、化学或生物特性，从而目标细胞可以可存活地附着于该表面上，并且在细胞培养生长时，新生成的细胞可以继续附着在设备的表面上。然而，在装置或其表面包含细胞生存或生长所必要的物质不是必需的。这些必须的物质，例如营养物或生长因子，可以由培养基提供。更优选地，当将存活的、未受损伤的上皮细胞或内皮细胞的悬浮液加入到“适合于细胞附着的表面”上时，12小时内至少有50％的细胞粘附到表面上了。更加优选地，适合于细胞附着的表面具有这样的表面性质，从而铺平板12小时内至少有70％的细胞粘附到表面上了(即，添加细胞到构成所述装置的室或孔)。甚至更优选地，适合于细胞附着的表面的表面性质将导致铺平板12小时内至少有90％的细胞粘附到表面上。最优选地，适合于细胞附着的表面的表面性质将会使至少有90％的细胞在铺平板8、6、4、2小时内粘附到表面上。

在此使用的“所述的电极间的可检测的阻抗变化”(或“所述的电极结构间的可检测的阻抗变化”)是指当分子结合反应在电极表面发生时，将导致所述电极(或电极结构)间的阻抗产生相当大的变化，该变化可被阻抗分析仪或阻抗测量电路测得。阻抗变化指在设备的电极表面上发生分子结合反应时和当在电极表面上没有发生分子结合反应时阻抗值之间的差别。或者，阻抗变化指当有细胞在电极表面附着时和细胞没有在电极表面附着时的阻抗值之间的差别，或者是当附着到设备上含有电极的表面的细胞数目、种类、活性、粘着性或形态学发生变化时阻抗值的变化。在大多数情况中，阻抗改变超过0.1％即是可检测的。优选的是，可检测的阻抗变化超过1％、2％、5％或8％。更优选的是，可检测的阻抗变化超过10％。电极间的阻抗通常是所施加的用于测量的电场频率的函数。“在电极之间可检测的阻抗变化”并不要求在所有频率都有可测得的阻抗变化。“在电极之间可检测的阻抗变化”只要求阻抗的变化在任意单个频率(或多个频率)可被测得。此外，阻抗有两个成分，分别称为电阻和电抗(电抗可分成两类，容抗和感抗)。“在所述电极之间可检测的阻抗变化”仅要求电阻和电抗在任意一个或多个频率上，有一个可检测的变化。在本申请中，阻抗是电阻抗或电子阻抗。测量这种阻抗的方法是，(1)在所述电极之间应用给定频率的电压(或多个频率，或具有具体的电压波形)，并且监控在所述频率(或多个频率，或具有具体的波形)下通过所述电极的电流，将电压振幅值除以电流振幅值来推导阻抗值；(2)应用单频率成分(或多个频率，或具有具体的电流波形)的电流来通过所述的电极，并监控在所述频率(或多个频率，或具有具体的波形)下所述电极之间的电压，将电压振幅值除以电流振幅值来推导阻抗值；(3)可以测量或测定电阻抗的其它方法。注意，在上述的“将电压振幅值除以电流振幅值来推导阻抗值”中，“除以”是在相同的频率下对电流振幅和电压振幅的值进行的。测量这种电阻抗是一种电子过程或电过程，它不涉及使用任何试剂。

在此使用的“所述的至少两个电极具有明显不同的表面积”是指任何电极的表面积彼此之间都是不相同的，从而在较大电极上细胞附着或生长造成的阻抗变化将不会以与在较小电极上细胞附着或生长造成的阻抗变化相同或相似的程度对总的可检测的阻抗做出贡献。优选的是，在较大电极上细胞附着或生长造成的任何阻抗变化会明显的小于在较小电极上细胞附着或生长造成的阻抗变化。一般说，最大电极和最小电极的表面积的比率大于10。优选的是，最大电极和最小电极的表面积的比率超过20、30、40、50或100。

在此使用的“根据多孔微量培养板上的孔进行空间排列的多对电极或电极结构”是指装置或设备上的多对电极或电极结构是空间排列的，以与多孔微量培养板上的孔的空间构型匹配，从而，当需要时，所述装置可以被插入到、结合到或附着到多孔板(例如，无底的多孔板)，从而多孔微量培养板中的多孔将包括电极或电极结构。

在此使用的“按行-列构型排列”是指，就电连接来说，电极、电极阵列或开关电路的位置是由行位置号和列位置号所鉴定的。

在此使用的“每个孔都包含基本相同的数目...的细胞”是指孔中细胞数目的最少值至少为孔中细胞数目最高值的50％。优选的是，孔中细胞数目的最少值为孔中细胞数目的最高值的至少60％、70％、80％、90％、95％或99％。更为优选的是，每孔都包含相同的细胞数目。

在此使用的“每个孔都包含...同样种类的细胞”是指，就预期的目的来说，每孔包含同样种类的细胞，但不必要每孔包含完全相同种类细胞。例如，如果预期的目的是每孔包含哺乳动物细胞，那么，如果每个孔包含相同种类的哺乳动物细胞，如人类细胞，或不同种类的哺乳动物细胞，如人类细胞及其它非人类的哺乳动物细胞，例如小鼠、山羊或猴细胞等，那么是允许的。

在此使用的“每孔包含...一系列不同浓度的测试化合物”是指每孔包含系列稀释浓度的测试化合物，如以十分之一系列稀释的浓度为1M、0.1M、0.01M等。

在此使用的“剂量反应曲线”是指细胞反应对测试化合物剂量浓度的依赖关系。细胞的反应可以通过许多不同的参数进行测量。例如，测试化合物被怀疑具有细胞毒性，且会导致细胞死亡。那么，在用测试化合物处理细胞后的细胞反应可以通过不存活(或存活)的细胞的百分数来测得。

在此使用的“电极沿着微通道的长度具有要比要分析的颗粒的最大一维尺寸小得多的长度”是指电极在沿着微通道的长度具有至少小于要分析的颗粒的最大一维尺寸的90％的长度。优选的是，电极在沿着微通道的长度具有至少小于要分析的颗粒的最大一维尺寸的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％的长度。

在此使用的“微电极跨过微通道的整个高度”是指微电极跨过微通道的整个高度的至少70％。优选地，微电极跨过微通道的整个高度的至少80％、90％、95％。更优选地，微电极跨过微通道的整个高度的至少100％。

在此使用的“具有等于或稍大于所述颗粒大小的孔径的孔”是指这个孔的孔径应至少等于颗粒的大小，但是小于颗粒大小的300％。这里孔径和颗粒的大小是根据一维值测量的。

在此使用的“微电极条或电极条”是指一种绝缘基底条，在它上面加工有或整合有电极或电极结构单元。绝缘基底条的非限制性实例包括聚合物膜、玻璃、塑料片、陶瓷、半导体上生长的绝缘体外延片(insulator-on-semiconductor)、玻璃纤维(象那种用于制造印刷电路板的材料)。具有不同几何形状的电极结构单元可以通过任意合适的微制造(microfabricated)、微加工(micromaching)或其他方法制造或加工在基底条上。电极几何形状的非限制性实例包括交指型的电极、“圆在线上(circle-on-line)”电极、“菱形在线上(diamond-on-line)”电极、城堡式电极或正弦形电极。这些电极的几何形状的特征尺寸可以小到少于5微米，或少于10微米，到大到大于200微米，大于500微米，大于1毫米。电极几何形状的特征尺寸是指电极元件的最小宽度，或邻近电极元件间的最小间隙，或电极几何形状上反复出现的部件尺寸。在本发明中，微电极条可以是任何几何形状的。微电极条的一个示例性几何形状是矩形，其中条的宽度在小于50微米到大于10毫米之间，条的长度在小于60微米到大于15毫米之间。示例性的微电极条的几何形状可以具有200微米宽和20毫米长的几何形状。单个微电极条可以具有两个电极作为测量单元，或具有多个这种双电极作为多个测量单元，或具有单个电极结构单元作为测量单元，或具有多个电极结构单元作为多个电极结构单元。在一种示例性实施方案中，当多个电极结构单元被加工在单个微电极条上时，这些电极结构单元是沿着条的长度方向定位的。电极结构单元可以是正方形或矩形或圆形的。每个电极结构单元可能具有的尺寸从小于50μm×50μm，到大于2mm×2mm。

在此使用的“样品”是指包含可用本申请的设备、微量培养板或方法进行分离、操作、测量、定量、检测或分析的部分的任何物质。样品可为生物学样品，如生物学流体或生物学组织。生物学流体的实例包括细胞在培养基如细胞培养基中的悬浮液、尿、血、血浆、血清、唾液、精液、大便、痰、脑脊液、泪液、黏液、羊膜液等。生物学组织是通常为具体类型的细胞和它们的细胞间物质的聚集体，其形成人、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构中的一类结构材料，包括结缔组织、上皮组织、肌肉组织和神经组织。生物学组织的实例也包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单个细胞。生物学样品也可进一步包括细胞悬浮液，包含生物分子(如蛋白、酶、核酸、碳水化合物、结合到和生物分子的化学分子)的溶液。

在此使用的“液体(流体)样品”为天然以液体或流体形态存在的样品，如生物学流体。“液体样品”也可指天然以非液体状态，例如固体或气体存在的样品，但被制成含固体或气体样品材料的液体、流体、溶液或悬浮液。如，液体样品可包含含有生物学组织的液体、流体、溶液或悬浮液。

102.监控细胞-基底阻抗的装置和系统

测量细胞-基底阻抗的装置

本发明包括用于测量细胞-基底阻抗的装置，其包括一个绝缘的基底；安装于基底上的两个或更多个电极阵列，其中所述两个或更多个电极阵列的每一个包括两个电极结构；以及至少两个连接垫，每个连接垫位于基底的边缘。装置的各个电极阵列在整个阵列上有近似均匀的电极电阻。装置的基底有适合于细胞附着或生长的表面；细胞在所述基底上的附着或生长可引起各个电极阵列中的电极结构间的可检测的阻抗改变。

电极阵列是两个或更多个电极结构，其构造为具有一定尺寸和间隔，从而当连接于信号源时，可作为一个单元运行，以在电极结构周围空间区域产生电场。电极结构指单个电极，具体是具有复杂结构的单个电极。(例如，电极结构可包括两个或更多个电连接在一起的电极元件。)在本发明的装置中，电极阵列包含两个电极结构，每个电极结构包括多个电极元件，或亚结构。在本发明的优选实施方案中，装置的两个或更多个电极阵列的每一个的电极结构具有基本相同的表面积。在本发明装置的优选实施方案中，装置的两个或更多个电极阵列的每一个都包括两个电极结构，且每个电极结构包括多个电极元件。电极阵列的两个电极结构的每一个都连接于位于基底边缘的单独的连接垫。

这样，在本发明的装置中，对于装置的两个或更多个电极阵列中的每一个，两个电极结构的第一个连接于两个或更多个连接垫中的一个，而两个电极结构中的第二个连接于两个或更多个连接垫中的另一个。优选地，装置的各个阵列是可单独寻址的，意指阵列的电迹线和连接垫的布置可使阵列以这样的方式与阻抗分析仪连接，即，可以通过使用开关(如电子开关)将测量电压在一个给定时间施加到单个电极阵列。

装置的各个电极阵列在整个电极阵列上具有近似均匀的电极电阻分布。“整个阵列中均匀的电阻分布”是指当测量电压被加到阵列的电极结构上时，位于阵列的任一给定位置的电极电阻与阵列上任意其他位置的电极电阻是近似相同的。优选的，在装置的阵列的第一个位置的电极电阻和在相同阵列的第二个位置的电极电阻相差不超过30％。更优选的，在装置的阵列的第一个位置的电极电阻和在相同阵列的第二个位置的电极电阻相差不超过15％。甚至更优选的，在装置的阵列的第一个位置的电极电阻和在相同阵列的第二个位置的电极电阻相差不超过5％。更优选的，在装置的阵列的第一个位置的电极电阻和在相同阵列的第二个位置的电极电阻相差不超过2％。

对于本发明的装置，将给定电极阵列中的电极元件、电极间的间隙和电极总线的优选排列用于使所有细胞对电极阵列所测得的总阻抗改变发挥相似的贡献，而无论细胞位于何处和附着在电极表面的哪个位置。这样，需要当将测量电压加于电极阵列时，装置上的任一个给定阵列中的任意两个位置的电场强度是相似的。在阵列的任意给定位置，电场强度与阵列的第一个电极结构上的最近点和阵列的第二电极结构上的最近点之间的电势差有关。因此需要对一个给定的阵列来说，跨过电极元件和电极总线的电势降是相似的。基于这个要求，优选的是跨过整个阵列上电极电阻分布是近似均匀的，其中在一个目标位置的电极电阻等于在第一个电极结构上的最近点(指位于第一个电极结构上的一点，它与目标位置最近)和连接到第一个电极结构的连接垫之间的电极电阻加上在第二个电极结构上的最近点(指位于第一个电极结构上的一点，它与目标位置最近)和连接到第二个电极结构的连接垫之间的电极电阻的和。

本发明的装置被设计为装置的阵列跨过整个阵列具有近似均匀分布。这可以通过如下方法实现，例如，使电极结构和电极总线有特定的间隔和尺寸(长度、宽度、厚度和几何形状)，从而在阵列的任一单个位置的电阻和阵列上任意单个其他位置的电阻近似相同。在大多数实施方案中，给定阵列中的电极元件(或电极结构)有同等的间隔和相似的厚度和宽度，给定阵列中的电极总线有相似的厚度和宽度，且由给定阵列导出至连接垫的电迹线有非常相似的厚度和宽度。因而，在这些优选实施方案中，阵列的设计使得电极元件或结构的长度和几何形状、电极迹线的长度和几何形状和总线的长度和几何形状允许跨过阵列中的电极电阻分布是近似均匀的。

在一些细胞-基底阻抗测量装置的优选实施方案中，电极结构包括多个电极元件，且每个电极元件直接连接于电极总线。第一个电极结构的电极元件连接于第一个电极总线，且第二个电极结构的电极元件连接于第二个电极总线。在这些实施方案中，两个电极总线的每一个经电迹线连接于分开的连接垫。尽管迹线的电阻对阵列上一个位置的电阻有贡献，但是对于阵列的任何两个位置，从第一个总线到第一个连接垫和从第二个总线到第二个连接垫的迹线连接是相同的。因而，在这些优选实施方案中，在设计阵列的几何性状以提供跨过阵列的均匀电阻时无需考虑迹线的电阻。

以图1C所示电极阵列为例，希望附着于B位置的细胞和附着于A位置的细胞对总阻抗改变的贡献是相似的。因而，就需要在电极阵列上加有测量电压时，位置A和位置B有相似的电场强度。因而需要跨过电极元件和电极总线有相似的电势降。基于这些要求，优选的是跨过整个阵列有近似均匀的电极电阻分布，其中目标位置的电极电阻等于该位置的电极点与连于电极阵列的两个连接垫之间的电极电阻的和。图1C中位置A和位置B的电极电阻为

R_{位置_A}＝R_迹线1+R_1-到-A1+R_A1-到-A+R_A-到-A2+R_A2-到-2+R_迹线2   (1)

R_{位置_B}＝R_迹线1+R_1-到-B1+R_B1-到-B+R_B-到-B2+R_B2-到-2+R_迹线2   (2)

其中，R_迹线1为由连接垫到位于顶部电极总线的位置1的电连接迹线的阻抗(即电阻，因为电抗成分非常非常小)；R_迹线2为由连接垫到位于底部电极总线的位置2的电连接迹线的阻抗(即电阻，因为电抗成分非常非常小)；R_1-到-A1是从位置1沿顶部电极总线到位置A1的阻抗(即电阻，因为电抗成分非常非常小)；R_2-到-A2是从位置2沿底部电极总线到位置A2的阻抗(即电阻，因为电抗成分非常非常小)；R_{A1- 到-A}是从顶部电极总线的位置A1沿相连的电极元件到位置A的阻抗(即电阻，因为电抗成分非常非常小)；R_A2-到-A是从底部电极总线的位置A2沿另一个相连的电极元件到位置A的阻抗(即电阻，因为电抗成分非常非常小)。对近似均匀的电极电阻的要求指R_{位置_A}近似于R_{位置_B}。

如图1C所示电极结构的设计可满足近似均匀电极电阻的要求。图1C中，电极或电极元件为圆在线上构型，其圆的直径约90微米，线宽度约30微米，线间的间隙为约80微米。电极总线的内径约为5.75mm，且电极总线的外径约为6.070mm。

在本发明的一个优选实施方案中，对于细胞-基底阻抗的测量，阻抗分析仪经电子开关间接地连接到基底上的连接垫。阻抗分析仪测得的阻抗Z_总计为：

Z_总计＝Z_开关+Z_迹线+Z_{电极_阵列}            (3)

其中Z_开关是电子开关在“开”阶段的阻抗，Z_迹线是连接垫和电极总线之间基底上的电连接迹线的阻抗，Z_{电极_阵列}是有细胞或没有细胞时的电极阵列的阻抗。Z_开关和Z_迹线的主要成分是电阻。如果Z_开关和Z_迹线的值为可被确定，那么它们对总阻抗Z_总计的贡献就可以被从测得的阻抗中去掉。通过选择质量优良的电子开关，不同开关的Z_{开 关}值可接近恒定。这样Z_开关值对总的测得的阻抗Z_总计的贡献可以被从测得的阻抗中去掉。Z_迹线较难被去掉，因为不同的电极阵列的阻抗值是不同的，且不同装置之间用于制成电极结构的导电薄膜的厚度也可能不同。为精确测量细胞-基底阻抗，优选使用小的电连接迹线(或电迹线)阻抗Z_迹线。为此，需要较大宽度的电迹线，这样会导致电极阵列面积的减少。为此，在本发明装置的一个实施方案中，为了有合适的电迹线宽，使电极阵列面积的直径，在图1B所示的例子中，即弧形电极总线的内径小于标准微量滴定板的底孔直径。为确使电极总线在测定中不暴露于溶液中，可将带孔的板附着于基底，所述板底部的直径足够的小，以使电极总线不会处在孔的里面。

在本发明的一个优选实施方案中，用于监控细胞-基底阻抗的装置有两个或更多个电极阵列，其共用连接垫。优选的是，装置的至少一个电极阵列上的一个电极结构连接于连接垫，所述连接垫同时连接于装置的至少另一个电极阵列上的电极结构。优选的是，对于装置的至少两个阵列，两个或更多个阵列的每一个都有第一个电极结构连接于连接垫，所述连接垫连接于至少一个其他电极阵列的电极结构，而两个或更多个电极阵列的每一个都有第二个电极结构连接于连接垫，所述连接垫不连接于装置的任意其他电极结构或阵列。因而，在装置的优选设计中，存在至少两个电极阵列，其中的每个电极阵列有第一个电极结构连接于共用连接垫，而第二个电极结构连接于独立的连接垫。

在本发明的一些优选实施方案中，电极阵列的每个电极结构都与电极总线相连，而电极总线经导电迹线连接于装置上的两个或更多个连接垫中的一个。在优选实施方案中，两个电极结构中的每个都连于单个总线，从而，每个阵列连于两个总线，每个连于一个电极结构。在这样的排列中，两个总线的每一个都连接于基底上分开的连接垫。

连接于总线的导电迹线可由任何导电材料制成。迹线可处于基底的表面，且可任选地被绝缘层覆盖。可选择地，迹线也可放置于基底上的第二个平面。阻抗测量装置上导电迹线的排列和设计的描述可见于美国专利申请10/705,447，在此将该专利申请中说明基底上导电迹线的制造和设计的公开内容以参考文献的方式整合到本专利申请中。

图1A显示本发明装置的一个例子。该装置包括玻璃基底(101)，在基底上加工有16个电极阵列。每个电极阵列(102)包括两个电极结构(详见图1B)。每个电极阵列连接于两个电迹线(103)，其中两个迹线的每一个连接两个电极结构中的一个。从电极阵列(102)开始的这些电连接迹线(103)都连接于基底(101)边缘的连接垫(104)。如图1A所示，基底(101)上的四个四等分的每一个的四个电极阵列的每一个都有它们各自的一个电连接迹线连于共用连接垫(104)。因而，整个装置有四个共用连接垫(104)，每四分之一装置共用一个连接垫。而且，每个电极阵列有一个单独的电连接迹线(103)，其连接于一个独立的连接垫(104)。因此，基底(101)的边缘共有20个连接垫(104)。

一个可用于本发明的装置的电极阵列(如图1A)的例子见图1B。在此显示一个电极阵列。此电极阵列有两个电极结构，其中每个电极结构包括多个在此显示的具有圆在线上几何形状的电极元件(105)。在这个电极阵列结构中，一个电极结构中的电极元件(105)与阵列中另一个电极结构的电极元件(105)交替出现。通过电极元件(105)直接连接于电极总线(106)的方式，每个电极结构都独立连接于它的电极总线(106)。电极总线(106)形成环绕阵列周边的弧，其中阵列的两个总线不邻接或交迭。导电连接迹线(图1A的103)将每个总线连接到处于基底(图1A的101)边缘的连接垫(图1A的104)。

合适的电子连接工具，如接合在基底上和连接的印刷电路板上的连接垫上的金属夹，可用于形成装置上的连接垫和外部电子电路(例如阻抗分析仪)之间的电子连接。细胞-基底阻抗装置的设计和其制造方法的描述见美国专利申请No.10/705,447，在此将其中关于包含电极阵列的阻抗装置的设计、特性和制造的描述和公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。

优选的绝缘基底是平面的，且是平坦或近似平坦的。示例性的基底可包括许多材料，包括但不限于硅上生长的二氧化硅外延片(silicon dioxide on silicon)、绝缘体上生长的硅外延片(SOI)晶片、玻璃(如石英玻璃、铅玻璃或硼硅酸盐玻璃)、蓝宝石、陶瓷、聚合物、玻璃纤维、塑料、如聚酰亚胺(如Kapton，DuPont提供的聚酰亚胺薄膜)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯和尿素树脂。优选的是，基底和基底的表面将不干扰发生在基底表面的分子结合反应。对于细胞-基底阻抗监控，在本发明装置的使用中绝缘基底的任何暴露于细胞的表面优选是生物相容的。生物不相容的基底材料可以通过覆盖其他材料，例如聚合物或生物分子涂层而变成生物相容的。

基底的全部表面或部分表面可被化学处理，包括但不限制于，例如通过添加官能团或添加带电荷的或疏水基团而修饰表面。

可用在本发明装置的阻抗测量中的电极阵列的描述已描述于美国专利申请No.10/705,447中，在此将其中所有有关电极阵列(或结构单元)、电极结构、电极材料、电极尺寸和电极在基底上的制作方法的公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。

优选的本发明装置中的电极阵列包括包含两个电极结构的阵列，例如，螺旋型的电极阵列和交指型的电极阵列。在本发明的一些优选装置中，电极阵列加工在基底上，其中阵列包括两个电极结构，每个电极结构包括多个圆在线上电极元件，其中一个结构的电极元件与相对的电极结构的电极元件交替。例如，图1B显示了这样的一个阵列。

优选的是，本发明装置中的阵列的电极元件(或电极结构)有大致相同的宽度。优选的是，本发明装置的阵列的电极元件(或电极结构)的宽度大于30微米，更优选的宽度在约50到约300微米之间，且更优选的宽度约为90微米。

优选的是，本发明装置中的阵列的电极元件(或电极结构)是大致均匀地间隔开的。优选的是，本发明装置的阵列的电极元件(或电极结构)之间的间隙宽度小于50微米，更优选的是宽度在约5到约30微米之间，且更优选的是宽度为约20微米。

本发明装置可包括一个或多个不透流体的容器，其可用作流体容器。这种容器可以可逆地或不可逆地附着到，或构成在，基底或基底的部分上(例如，在微量滴定板中形成的孔)。在另一例中，本发明装置包括的微电极条可逆地或不可逆地附着到塑料壳上，该塑料壳具有对应于位于微电极条上的电极结构单元的开口。合适的流体容器材料包括塑料、玻璃或塑料涂覆的材料(例如陶瓷、玻璃、金属等)。包含流体容器的装置的描述和公开内容见母案美国专利申请No.10/705,447，在此将其中关于可接合包含电极用于阻抗测量的基底的流体容器和流体容器结构，包括其尺寸、设计、组成和制作方法的所有公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。

在一个优选实施方案中，位于本发明装置基底上的每个电极阵列都与一个不透流体的容器相连。优选的，本发明的装置被组装到一个无底的、多孔的具有流体密封的塑料板或条，如图2和图3所示。组装所述装置以使得基底上单个阵列位于容器或孔的底部。优选地，装置的每个阵列连接于多孔板的孔上。在一些优选实施方案中，用于细胞-基底阻抗测量的多孔装置带有“非阵列”孔，它们附着于基底但不与阵列连接。这样的孔可任选地用于进行非基于阻抗的测定，或用于显微镜下细胞的观察。

关于多孔阻抗测量装置的设计和组装的描述见美国专利申请No.10/705,447，在此将其中关于多孔阻抗测量装置，包括其设计、组成和制造的公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。本发明的装置优选具有2孔至1,536孔，更优选4孔到384孔，甚至更优选16孔到96孔，所有的孔或少于所有的孔上有电极阵列。

在一些优选实施方案中，市场出售的组织培养板可适用于本发明的装置。亦可定制优选尺寸的无底板。优选的是，孔底部(处于基底的端部)的孔径为约1毫米到约20毫米，更优选为约2毫米到约8毫米。孔可有均一的直径，或可为朝向底部逐渐变细，从而容器与基底接触的一端的直径小于相反一端的直径。

优选的装置

下列关于装置的描述不是用来对本发明作任何限制的。

图2是具有玻璃基底(201)的16x装置的一种设计的图像，其有16个微制造的电极阵列经金属夹(209)安装到印刷电路板(208)上。金属夹(209)接合于基底上的连接垫(204)并焊接在印刷电路板(208)上的连接线(210)上。印刷电路板(208)上的连接线(210)依次连接位于装置边缘的连接针(211)。无底塑料16孔条(207)经双面压敏胶结合到基底(201)上，构成16个单独的流体容器。在此装置中，流体容器的底部的直径约为5mm。

图3中显示了一种具有6块玻璃基底的96x装置的一种设计的图像，每块玻璃基底有15或16个微制造形成的电极阵列。图3A显示装置的底面，其开放的孔面朝下放置，而图3B显示带有塑料盖的装置，其开放的孔面朝上放置。6个基底(301)安装并密封于无底的96孔板(307)，从而96孔中的95孔在孔底面包含电极阵列(当开放的孔面朝上时)。96孔中有一孔不带电极(如图3A中(312)所示)。孔底部直径约为5mm。金属夹接合在基底的连接垫上，并焊接在位于基底(301)的末端的小印刷电路板(308)的顶侧面的连接线上(如图3B所述，当96孔板以开放的孔面朝上放置时)。印刷电路板(308)为双面的，且有相同编号的连接线分别处于电路板两侧面的相对位置。在电路板顶侧面的连接线通过导电通路连到底侧面的连接线，在此与装置操作台电连接。

使用方法

本发明也提供了使用本发明的包含位于电极阵列上的流体容器的装置进行细胞-基底阻抗测量的方法。这个方法包括：提供本发明的包含位于电极阵列上的流体容器的装置，将阻抗分析仪附着到本发明的装置上，向装置的一个或多个流体容器中加入细胞，以及测量在装置上的一个或多个阵列上的阻抗。使用阻抗测量装置进行细胞测定的方法见母案美国专利号申请置0/705,447，在此将其中关于使用阻抗测量装置的方法的公开内容引入作为参考，在本申请的D和E章节也引入所述内容作为参考。

细胞-基底阻抗测量系统

另一方面，本发明涉及细胞-基底阻抗测量系统，其包括A)至少一个多孔的细胞-基底阻抗测量装置，其中所述多孔的至少两个在孔底包含电极阵列；B)电连接到多孔细胞-基底阻抗测量装置的阻抗分析仪；C)装置操作台，其能与一个或多个多孔装置接合，并包括能够选择并连接多孔中任一孔的电极阵列到阻抗分析仪的电子电路；和D)连接装置操作台和阻抗分析仪的软件系统，用于控制装置操作台和进行从阻抗分析仪获取数据和分析数据。

在本发明的细胞-基底阻抗测量系统中，阻抗分析仪接合于一个或多个多孔装置的连接垫，以测量阻抗。细胞-基底测量系统可通过使用装置操作台的电路，通过数字开关，从记录测量一个孔的阵列的阻抗，转换到测量另一个孔的阵列的阻抗，以用于有效而同时地进行多孔测定。

本发明系统中的多孔细胞-基底阻抗测量装置可以是任一多孔细胞-基底阻抗测量装置，其中多孔中至少有两孔在孔底包含电极阵列，且其中多孔中至少两孔包含可单独寻址的电极阵列。本发明系统所用的装置当连接于阻抗分析仪时，可测量与细胞行为相关的阻抗值的差别。例如，用于本发明系统中的此细胞-基底阻抗测量装置可测量当细胞附着于电极阵列时和当细胞未附着于电极阵列时的阻抗值的差别，或可检测当附着于设备的包含电极的表面的细胞数目、类型、活性、粘着性或形态学改变时阻抗值的差别。

可成为细胞-基底阻抗监控系统的一个部分的优选的装置，可以是在母案美国专利申请No.10/705,447所描述的那些装置，在此将其中包括电极阵列的细胞-基底阻抗监控装置的公开内容，包括其设计、组成和制造的公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。可成为细胞-基底阻抗监控系统的一部分的优选装置也可以是本申请描述的那些装置。

优选的是，本发明系统的多孔装置包括4-1,536孔，其中部分或全部的孔可包含电极阵列。在本发明的一些实施方案中，装置操作台可包括一个或多个平台或一个或多个槽以便放置一个或多个多孔装置。这些一个或多个平台或一个或多个槽可包括插座、针或其它用于装置和装置操作台间电连接的装置。优选的是，在进行细胞阻抗测量测定期间，装置操作台被放置在组织培养箱里。它可电连接于优选置于组织培养箱外的阻抗分析仪和计算机。

装置操作台包括连接到阻抗监控装置和阻抗分析仪和电子开关的电子电路，所述电子开关可接通或断开与系统中所用的多孔装置上的两个或更多个电极阵列的每一个的连接。装置操作台的电子开关由软件程序控制。软件程序指导装置操作台将装置的阵列与阻抗分析仪连接，并监控一个或多个电极阵列的阻抗。在阻抗监控期间，阻抗分析仪可在一个频率或多于一个频率下监控阻抗。优选的是，在给定测定中监控多于一个时间点的阻抗，且更优选的是，监控至少3个时间点的阻抗。装置操作台可将装置的单个阵列连接到阻抗分析仪，以监控在一个测量时间点，装置上的一个、一些或所有阵列。对每一个所需的监控时间点，装置操作台的开关使得被选择的阵列能够得到快速连续监控。事实上每个监控时间点是测定中测量的狭窄时间范围(例如少于1秒至数分钟)，在此期间进行阻抗监控。在本发明的一些优选实施方案中，装置操作台软件是可编程的，以指导包含阵列的装置的任意一个孔在选择的时间间隔进行阻抗监控。

阻抗监控系统的软件也可储存和显示数据。数据可显示在屏幕上、作为打印的数据，或两者兼有。优选的是，软件可允许输入和显示试验参数，例如包括细胞种类、化合物浓度、监控的时间间隔等说明性信息。

优选的是，软件也可分析阻抗数据。在优选的实施方案中，软件可在一个或多个时间点计算多孔装置的一个或多个孔中的细胞指数。

图4显示一个16x装置操作台的一种设计，其有6个16孔装置连接于该操作台。装置操作台具有用于6个装置的6个独立的槽，其中每个槽包含具有连接指示灯(418)的零插入力插座(zero-insertionforce socket)(416)。当装置以正确方式接合到装置操作台时，由于指示灯(418)经装置的PCB上的电路线连到电源，所以该灯(418)会亮。操作台包括电子开关，其可以以数字方式开启(连通)或关闭(断开)，以连接单个孔里的电极阵列到阻抗分析仪。

图5显示可接合如图3所示的96孔装置的96孔装置操作台。操作台使用POGO针(520)连接到小印刷电路板上的连接线(装置有使用金属夹连接于装置边缘的连接垫的小PCB。POGO 针(520)连于装置操作台内部的电路。电路包括电子开关，它可以以数字方式开启(连通)或关闭(断开)，以将那些包含电极的孔中的电极阵列与阻抗分析仪连接。

图6显示了实时细胞电子传感软件的不同页面，阐明了可输入的实验参数的输入及数据分析结果的显示。A)实验笔记页，允许实验人员记录实验的关键信息，例如实验目的和实验流程。B)实验设计页，允许记录加于各个孔中的细胞、细胞数目、化合物及化合物浓度。C)测试时间设置页，允许记录和控制进行细胞-基底阻抗测量所使用的时间间隔，且可设置多个实验步骤，每个步骤都具有不同的时间间隔值和不同长度的时间。D)细胞指数页是结果页，其中在由测试时间设置页设置的预定时间间隔完成每一个测量后，软件系统自动更新所有孔的测量的和推导的细胞指数值。E)实验数据绘图页允许对实验数据进行灵活的绘图及整理。

C.计算细胞指数的方法

基于测得的阻抗、细胞数目(更确切的说，活细胞数目，或附着的细胞数目)和细胞附着状态之间的互相依赖关系，可能由测得的阻抗频率谱推导出所谓的“细胞数目指数”或“细胞指数”，其提供了定量和比较本发明的基于阻抗的测定中的细胞行为的有用指数。在本发明一些应用中，本申请中的“细胞指数”和以下专利申请中的“细胞数目指数”相同：PCT申请No.PCT/US03/22557(于2003年7月18日提交)，其名称为“IMPEDANCE BASED DEVICES ANDMETHODS FOR USE IN ASSAYS”，和美国专利申请No.10/705,447(于2003年11月10日提交)，其名称为“IMPEDANCE BASEDDEVICES AND METHODS FOR USE IN ASSAYS”(专利代理人编号为ACE-00101.P.1.1-US)。在此将美国专利申请10/705,447和PCT申请No.PCT/US03/22557中关于细胞指数和细胞数目指数的讨论和公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。

可以使用各种计算这种细胞数目指数的方法，在此公开一些新的方法。

本发明提供了几种计算细胞指数的方法，这些方法适于附着在细胞-基底阻抗装置的两个或更多个基本相同的阵列的细胞，其中监控细胞的阻抗变化。在本发明的优选实施方案中，这些方法可以比以往的计算细胞-基底监控装置的两个或更多个阵列上的细胞的细胞指数的方法更精确地计算细胞指数。在本发明一些优选的方法中，计算细胞指数的方法依赖于计算导向两个或更多个基本相同的阵列的电迹线的电阻的新方法。因此，本发明也包括了计算导向基底上的两个或更多个基本相同阵列的电迹线的电阻的方法。

“基本相同的电极阵列”或“基本相同的阵列”指的是：所指阵列上的电极尺寸及排列、电极结构和电极元件都是相同的。所以，两个基本相同的电极阵列将有相同尺寸(长、宽、厚度)的电极结构，其中电极结构将有相同数目的电极元件，且每个阵列上电极结构和电极元件的排列也是相同的。这里的排列是指结构或元件间的距离(间隔宽度)、它们相互间的物理位置和它们的几何形状(角度、弯曲度、圆在线上或城堡式的几何形状等)，包括连接于电极结构或电极元件的任何电极总线的相同特征。基本相同阵列的电极也包含相同的材料。就计算迹线电阻和细胞指数而言，基底可以有任意数目的基本相同的阵列。

以下的讨论提供了可计算附着在细胞-基底阻抗监控装置的阵列的细胞的细胞指数的新方法和用于计算导向细胞-基底阻抗监控装置的两个或更多个电极阵列的电连接迹线的电阻的新方法。

阻抗(Z)由两个成分组成，即电阻Rs和电抗Xs。在数学上，阻抗Z表示如下，

Z＝Rs+j Xs

其中， $j=\sqrt{-1},$ 指对于(串联)电抗成分Xs而言，加在其上的电压与通过它的电流有90度相差。对于(串联)电阻，加在其上的电压与通过它的电流具有相同的相位。由于其在电子学和电工程学中是众所周知的，阻抗也可如下所示由并联电阻Rp和并联电抗Xp来表示，

Z＝Rp＊(jXp)/(Rp+jXp)，

其中， $j=\sqrt{-1}.$ 然而，这些表达式(串联电阻和串联电抗，或并联电阻和并联电抗)是等价的。那些电学或电子工程学的技术人员可以容易地从一种表达式的参数值推导出另一种表达式。为了清楚与一致性，在本发明中的描述和讨论中使用串联电阻和串联电抗表达式。为了简单，将串联电阻和串联电抗简称为电阻和电抗。

如美国专利申请No.10/705,447(于2003年11月10日提交)，其名称为“Impedance based devices and methods for use inassays”和PCT申请号PCT/US03/22557，其名称为“Impedance based devicesand methods for use in assays”(于2003年7月18日提交)中所描述，监控细胞-基底阻抗以检测或测量阻抗的变化可通过在任意适合的频率范围测量阻抗来实现，在此将该两专利申请关于细胞-基底阻抗监控的公开内容以参考文献的方式整合到本专利申请中。例如，可在频率范围介于约1Hz至约100MHz之间测量阻抗。在另一例中，可在频率范围介于约100Hz至约2MHz之间测量阻抗。阻抗一般是频率的函数，即阻抗值随频率变化而变化。监控细胞-基底阻抗既可在单个频率也可在多个频率下进行。如果在多频率下进行阻抗测量，则可获得频率依赖性的阻抗谱，即在每个测量的频率获得一个阻抗值。如上所述，阻抗有两个成分，即电阻和电抗。电阻成分或电抗成分或两者的改变，都会引起阻抗的变化。

如美国专利申请No.10/705,447(于2003年11月10日提交)，其名称为“Impedance based devices and methods for use in assays”和PCT申请号PCT/US03/22557，其名称为“Impedance based devicesand methods for use in assays”(于2003年7月18日提交)所述，在此将该两个专利申请关于测量电阻抗的公开内容以参考文献的方式整合到本专利申请中，可通过下述实现测量电(或电子)阻抗的方法，(1)在所述电极之间应用给定频率的电压(或多个频率，或具有具体的电压波形)，并且监控在所述频率(或多个频率，或具有具体的波形)下通过所述电极的电流，将电压振幅值除以电流振幅值来推导阻抗值；(2)应用单频率成分(或多个频率，或具有具体的电流波形)的电流来通过所述的电极，并监控在所述频率(或多个频率，或具有具体的波形)下所述电极之间的电压，将电压振幅值除以电流振幅值来推导阻抗值；(3)可以测量或测定电阻抗的其它方法。注意，在上述的“将电压振幅值除以电流振幅值来推导阻抗值”中，“除以”是在相同的频率下对电流振幅和电压振幅的值进行的。如电学和电子工程学技术人员众所周知的，在这种计算(即上述的除以)中，电流振幅和电压振幅都表示为复数形式，其考虑了电流和电压的大小，以及电流和电压正弦波形间的相差。相似的，阻抗值也由复数形式表示，其具有如上述等式中所示的电阻和电抗成分。

如美国专利申请No.10/705,447(于2003年11月10日提交)，其名称为“Impedance based devices and methods for use in assays”和PCT申请号PCT/US03/22557(于2003年7月18日提交)，其名称为“Impedance based devices and methods for use in assays”所述，测量的细胞-基底阻抗可用于计算称为细胞指数或细胞数目指数的参数，在此将两专利申请中涉及细胞指数或细胞数目指数的公开内容以参考文献的方式整合到本专利申请中。可以使用多种计算所述细胞数目指数的方法，所述方法基于当细胞附着于电极结构时相对于无细胞附着于于电极结构时引起的电阻或电抗的变化。有时，将电极结构上无细胞附着但有相同的细胞培养基的电极结构上的阻抗(电阻和电抗)称为基线阻抗。基线阻抗可由下列一种或多种方法获得：(1)测量的电极结构的阻抗，其中向含有电极结构的孔里添加无细胞的培养基，其中该培养基与监控细胞附着的条件下阻抗测量时用的培养基相同；(2)在向在孔底部包含电极结构的孔应用含有细胞的培养基后短时间(例如10分钟)测量的阻抗(加入含有细胞的培养基后短时间段内，细胞没有足够时间附着到电极表面。这个短时间段的长度依赖于细胞种类和/或电极表面的表面处理或修饰)；(3)当孔中所有细胞都被某种处理(如高温处理)和/或试剂(如去污剂)杀死时，测量的电极结构的阻抗(对于要用的这种方法，处理和/或试剂不应该影响电极上的培养基的介电性质)。

在一个实例(A)中，细胞指数或细胞数目指数可如下计算：

(A1)在每个测量的频率，用当细胞存在和/或附着于电极时电极阵列的电阻除以基线电阻计算电阻比率；

(A2)在频率谱中找到或确定电阻比率的最大值，

(A3)从电阻比率的最大值减去1。

应用数学式，细胞指数推导为：

其中N是测量阻抗的频率点的数目。例如，如果用于测量的频率是10kHz、25kHz和50kHz，则N＝3，f₁＝10kHz，f₂＝25kHz，f₃＝50kHz。R_细胞(f_i)是在频率f_i时有当细胞存在在电极时电极阵列或电极结构的电阻(细胞-基底电阻)，且R_b(f_i)是在频率f_i时电极阵列或结构的基线电阻。

在这种情况下，零或接近零的“细胞指数或细胞数目指数”表示没有细胞或仅有很少数目的细胞存在或附着于电极表面。较高的“细胞数目指数”值表示对于相同类型的细胞和在相似的生理条件下的细胞，有更多的细胞附着于电极表面。较高的“细胞指数”值也表示对于相同类型和相同数目的细胞，细胞在电极表面能更好地附着(比如，细胞更加扩散或细胞更强地粘着于电极表面)。

在另一个实例(B)中，细胞数目指数可用如下方法计算：

(B1)在每个测量的频率，用当细胞存在或附着于电极时电极阵列的电抗除以基线电抗计算电抗比率。

(B2)在频率谱中找到或确定电抗比率的最大值，

(B3)从电抗比率的最大值减去1。

在这种情况下，零或接近零的“细胞数目指数”表示没有细胞或仅有很少数目的细胞存在或附着于电极表面。较高的“细胞数目指数”值表示对于相同类型的细胞和在相似的生理条件下的细胞，有更多的细胞附着于电极表面。

在另一个实例(C)中，细胞指数可用如下方法计算：

(C1)在每个测量的频率，从当细胞存在或附着于电极上时电极阵列的电阻减去基线电阻，以确定有细胞存在时的电阻相对于基线电阻的电阻改变；

(C2)然后找到或确定电阻改变的最大值。

在这种情况下，“细胞数目指数”基于在细胞存在时在整个测量的频率范围内的电阻相对于基线电阻的电阻最大改变值来推导。细胞指数的量纲是欧。

在另一个实例(D)中，细胞指数可用如下方法计算：

(D1)在每个测量的频率，计算阻抗的大小(等于

其中R_s和X_s分别是串联电阻和电抗)。

(D2)从当细胞存在或附着于电极时电极阵列阻抗的大小减去基线阻抗的大小，以确定当有细胞时的阻抗相对于基线阻抗的大小的变化。

(D3)找到或确定阻抗的大小变化的最大值。

在这种情况下，“细胞数目指数”基于在细胞存在时在整个测量的频率范围内的阻抗相对于基线阻抗的大小的最大改变值来推导。此细胞指数的量纲是欧。

在另一个实例(E)中，指数可用如下方法计算：

(E1)在每个测量的频率，用当细胞存在或附着于电极时电极阵列的电阻除以基线电阻，计算电阻比率，

(E2)然后通过从电阻比率减去1得到每个测量的频率时电阻的相对改变。

(E3)然后将所有的相对改变值积分(即将不同频率时所有相对改变值相加)。

在这种情况下，“细胞数目指数”基于多个频率点，而不是如上述实例中单个峰频率中获得。同样，零或接近零的“细胞指数”表示没有细胞存在于电极。较高的“细胞数目指数”指对于相同类型的细胞和在相似的生理条件下的细胞，有更多的细胞附着于电极。

在另一个实例(F)中，细胞指数可如下计算：

(F1)在每个测量的频率，用当细胞附着于电极上时电极阵列的电阻减去基线电阻，以确定有细胞时的电阻相对于基线阻抗的电阻改变；(此处，在频率f_i时电阻的改变可用下式：ΔR(f_i)＝R_s-细胞(f_i)-R_s-基线(f_i)给出，R_s-细胞和R_s-基线分别为细胞在电极阵列上存在时的串联电阻和基线串联电阻。)；

(F3)分析电阻改变的频率依赖性以推导可定量所述依赖性的某些参数。在一个例子中，可由

计算所述参数。在另一个例子中，此参数可由∑|ΔR(f_i)|计算。此参数可用作为细胞指数或细胞数目指数。

在这种情况下，“细胞数目指数”基于电阻改变的频率谱的分析推导。依赖于所述参数是如何计算的，细胞指数的量纲为欧。

在另一例(G)中，细胞指数可如下计算：

(G1)在每个测量的频率，计算阻抗的大小(等于其中R_s和X_s分别为串联电阻和电抗)。

(G2)从当细胞附着于电极时电极阵列阻抗的大小减去基线阻抗的大小，以确定当有细胞时的阻抗相对于基线阻抗的大小的变化。(此处，在频率是f_i时，阻抗大小的改变由式ΔZ(f_i)＝|Z_细胞(f_i)|-|Z_基线(f_i)|获得。

R_s-细胞和X_s-细胞分别为细胞存在于电极阵列上时的串联电阻和电抗。|Z_细胞(f_i)|为细胞存在于电极阵列上时电极阵列的阻抗的大小。|Z_基线(f_i)|为电极阵列的基线阻抗的大小。

(G3)分析阻抗大小的改变的频率依赖性，以推导可定量此依赖性的某些参数。在一个例子中，此参数可由

计算。在另一个例子中，此参数可由

计算。此参数可用作为细胞指数或细胞数目指数。

在这种情况下，“细胞数目指数”基于阻抗大小改变的频率谱的分析推导。依赖于所述参数是如何计算的，细胞指数的量纲为欧。

如美国专利申请No.10/705,447(于2003年11月10日提交)，其名称为“Impedance based devices and methods for use in assays”和PCT申请号PCT/US03/22557(于2003年7月18日提交)，其名称为“Impedance based devices and methods for use in assays”中所描述的，可以用不同的方法，从测得的细胞-基底阻抗(电阻或电抗)来计算称为细胞指数或细胞数目指数的参数，该两专利申请的描述细胞指数或细胞数目指数及其计算的公开内容将以参考文献的形式整合到本文中。细胞指数或细胞数目指数是在细胞-基底阻抗测量时孔中细胞的定量测量。

值得指出的是在利用阻抗信息来监控电极上的细胞状态中推导这种“细胞数目指数”不是必需的。事实上，人们可直接用阻抗值(例如，在单个固定频率；或最大相对改变频率，或在多个频率上)作为在细胞状态的指示。

然而，推导“细胞指数”或“细胞数目指数”和使用这类指数来监控细胞状态具有优点。使用“细胞数目指数”来监控细胞生长和/或附着和/或生存力状况有几个优点。

首先，人们可以用这种细胞数目指数比较不同电极几何形状的性能。

第二，对于给定的电极几何形状，可能通过测量添加到电极的不同数目的细胞的阻抗，建立“校准曲线”，以显示细胞数目和细胞数目指数之间的相互关系(在这种实验中，重要的是要确保接种的细胞已很好地附着到电极表面)。用这样的校准曲线，当进行新的阻抗测量时，可能从新测得的细胞数目指数而估计细胞数目。

第三，细胞数目指数也可用于比较不同的表面状况。对于相同的电极几何形状和相同数目的细胞，有较大细胞数目指数的表面处理说明细胞在此电极表面有更好的附着和/或此电极表面更适于细胞附着。

如上所示，对于计算细胞指数或细胞数目指数的一些方法来说，重要的是要知道有或没有细胞存在于电极结构上时所述电极结构的阻抗(电阻和/或电抗)。基于等式(1)，电极阵列的阻抗(电极上有或没有细胞)由下式给出：

Z_{电极_阵列＝}Z_总计-Z_迹线-Z_开关              (5)

其中Z_开关是电子开关在其“开”阶段的阻抗，Z_迹线是连接垫和电极总线之间基底上电连接迹线(或导电迹线)的阻抗，Z_总计是在阻抗分析仪测得的总阻抗。通过选择质量优良的开关，所有的电子开关可能有一致的状态为“开”的阻抗(主要为电阻)。例如，电子开关的状态为“开”的电阻可约为3欧(+/-10％)，状态为“开”的电抗可忽略不计(例如，在目标频率范围内小于0.2欧)。因而，如果确定或计算得到了迹线阻抗，那么式(5)可用于计算有细胞或无细胞存在时电极阵列的阻抗。

本申请发明了一种方法，以基于细胞-基底阻抗监控装置上的两个或更多个基本相同的阵列的相互关系，来确定导电迹线(或电连接迹线)的阻抗(主要是迹线电阻，对于薄的导电膜迹线，电抗非常小)。在下面，图1A展示了四个电极阵列A、B、C和D来说明本方法。电子开关的电抗(串联电抗)和电连接迹线的电抗(串联电抗)小于相应的电阻(串联电阻)。因此，我们着重分析电连接迹线的电阻。由阻抗分析仪测得的阻抗包括电阻(串联电阻，R_总计)和电抗(串联电抗)。对于电极阵列A-D，测得的总电阻R_总计、导电(电连接)迹线电阻(R_迹线)、开关电阻(R_开关)和电极阵列的电阻(R_s-阵列)符合下式：

R_e-阵列-A＝R_总计-A-R_迹线-A-R_开关-A    (6A)

R_e-阵列-B＝R_总计-B-R_迹线-B-R_开关-B    (6B)

R_e-阵列-C＝R_总计-C-R_迹线-C-R_开关-C    (6C)

R_e-阵列-D＝R_总计-D-R_迹线-D-R_开关-D    (6D)

在选择的电子开关具有一致的状态为“开”的电阻时，R_开关-A、R_开关-B、R_开关-C和R_开关-D有非常相似的值且可假定为相同值R_开关。因而，在上述等式中，已知参数为R_总计-A、R_总计-B、R_总计-C和R_总计-D，以及R_开关-A、R_开关-B、R_开关-C和R_开关-D，且有8个未知参数R_e-阵列-A、R_e-阵列-B、R_e-阵列-C和R_e-阵列-D以及R_迹线-A、R_迹线-B、R_迹线-C和R_迹线-D。不可能从这四个等式直接解出这些等式的8个未知变量。需要这些变量之间的其他关系来求解等式。各个迹线电阻(R_迹线-A、R_迹线-B、R_迹线-C和R_迹线-D)依赖于所使用的金属膜的类型，和迹线的几何形状，如迹线有多少矩型片段、片段的膜厚度、片段的宽度、片段的长度等。例如

其中N是迹线-A的片段数，t_A-i，、d_A-i和L_A-i是电极阵列A的迹线的第i个片段的厚度、宽度和长度，ρ是薄膜的电阻系数。此处提供的等式适用于包含单金属类型的膜。等式可经修改后易于用于包含两种或更多种金属类型的膜(如覆盖于铬粘合层上的金膜)。

如果整个基底上膜的厚度是相当均匀的(例如，厚度变化小于10％)，那么迹线电阻之间的关系仅由预定的几何形状(例如片段的长度、宽度)决定。例如，可直接如下所述计算电极阵列A的导电迹线的电阻和电极阵列D的导电迹线的电阻的比率α_A-D，这里假设这些迹线各处膜的厚度相同，且这些迹线各处的电阻系数也都是相同的。

相似地，基于预定的电极阵列B、C和D的迹线几何关系，人们可确定α_B-D和α_C-D。值得注意的是，对于这些迹线中的薄膜包含多于一种金属类型的情况，可以类似地推导上面的等式。因而，基于等式

R_开关-A＝R_开关-B＝R_开关-C＝R_开关-D＝R_开关，(9A)

R_迹线-A＝α_A-D·R_迹线-D，    (9B)

R_迹线-B＝α_B-D·R_迹线-D，    (9C)

和R_迹线-C＝α_C-D·R_迹线-D    (9D)

等式(6A)-(6D)可变为下列形式：

R_e-阵列-A＝R_总计-A-α_A-D·R_迹线-D-R_开关   (10A)

R_e-阵列-B＝R_总计-B-α_B-D·R_迹线-D-R_开关   (10B)

R_e-阵列-C＝R_总计-C-α_C-D·R_迹线-D-R_开关   (10C)

R_e-阵列-D＝R_总计-D-R_迹线-D-R_开关-D        (10D)

对于等式(10A)到(10D)，其中有5个未知变量，R_e-阵列-A、R_{e-阵列- B}、R_e-阵列-C和R_e-阵列-D以及R_迹线-D。数学上这些未知变量不能由这些等式计算得出。需要额外信息来解出这些变量R_e-阵列-A、R_e-阵列-B、R_{e-阵列- C}和R_e-阵列-D以及R_迹线-D。

在本发明中发明并描述了一种方法。在此方法中，将相同的生物或化学溶液或悬浮液应用于电极阵列A-D上。因为电极阵列A到D有基本相同的电极结构，所以对于当所有的电极阵列都暴露于相同的生物或化学溶液或悬浮液时的条件，电极阵列电阻R_e-阵列-A、R_e-阵列-B、R_e-阵列-C和R_e-阵列-D应该是相同的，或有非常类似的值，即R_e-阵列-A≈R_{e- 阵列-B}≈R_e-阵列-C≈R_e-阵列-D。如果我们假设平均电极阵列电阻为R_e-阵列，则如下的近似关系成立：R_e-阵列-A≈R_e-阵列-B≈R_e-阵列-C≈R_e-阵列-D≈R_e-阵列。因此，等式(10A)-(10D)可变形为：

R_e-阵列≈R_总计-A-α_A-D·R_迹线-D-R_开关    (11A)

R_e-阵列≈R_总计-B-α_B-D·R_迹线-D-R_开关    (11B)

R_e-阵列≈R_总计-C-α_C-D·R_迹线-D-R_开关    (11C)

R_e-阵列≈R_总计-D-R_迹线-D-R_开关-D         (11D)

因而，我们需要找到尽可能满足上列等式的R_迹线-D和R_e-阵列。一种数学方法为找到R_迹线-D和R_e-阵列，所述R_迹线-D和R_e-阵列使下列表达式得到最小值，该表达式用来定量描述近似等式(11A、11B、11C和11D)两边的差：

F(R_迹线-D，R_e-阵列)＝[R_e-阵列-(R_总计-A-α_A-DR_迹线-D-R_开关)]²+

[R_e-阵列-(R_总计-B-α_B-DR_迹线-D-R_开关)]²+[R_e-阵列-(R_总计-C-α_C-DR_迹线-D-R_开关)]²+

[R_e-阵列-(R_总计-D-R_迹线-D-R_开关)]²                  (12)

表达式F(R_迹线-D，R_e-阵列)是近似等式(11A、11B、11C和11D)两边差的平方的和。F(R_迹线-D，R_e-阵列)越小，则近似等式(11A、11B、11C和11D)两边越接近。因此，可导致F(R_迹线-D，R_e-阵列)取得最小值的R_迹线-D和R_e-阵列的值应该被确定。数学上的方法涉及到计算F(R_迹线-D，R_e-阵列)对R_迹线-D和R_e-阵列的一阶导数，并使所述一阶导数为0。导致这些一阶导数为0的R_迹线-D和R_e-阵列的值是导致F(R_迹线-D，R_e-阵列)取得最小值的值。一阶导数如下：

$=0;---\left(13A\right)$

$=0.---\left(13B\right)$

等式(13A)和(13B)可变形为：

R_e-阵列·[α_A-D+α_B-D+α_C-D+1]+R_迹线-D·[α_A-D ²+α_B-D ²+α_C-D ²+1]＝

α_A-D·[R_总计-A-R_开关]+α_B-D·[R_总计-B-R_开关]+

α_C-D·[R_总计-C-R_开关]+[R_总计-D-R_开关]

                                        (14A)

4·R_e-阵列+R_迹线-D·[α_A-D+α_B-D+α_C-D+1]＝[R_总计-A-R_开关]+[R_总计-B-R_开关]+[R_总计-C-R_开关]+[R_总计-D-R_开关]

                                        (14B)

这样可解出R_迹线-D：

其中A₁₁＝[α_A-D+α_B-D+α_C-D+1]；

S₁＝α_A-D·[R_总计-A-R_开关]+α_B-D·[R_总计-B-R_开关]+

α_C-D·[R_总计-C-R_开关]+[R_总计-D-R_开关]；

B₁₂＝[α_A-D+α_B-D+α_C-D+1]；

S₂＝[R_总计-A-R_开关]+[R_总计-B-R_开关]+[R_总计-C-R_开关]+[R_总计-D-R_开关]。

因而，在确定了R_迹线-D时，迹线电阻R_迹线-A、R_迹线-B和R_迹线-C可由等式(9B)、(9C)和(9D)计算出。而且电极阵列电阻R_e-阵列-A、R_{e-阵列 -B}、R_e-阵列-C和R_e-阵列-D可分别用等式(10A)、(10B)、(10C)和(10D)由测得的电阻R_总计-A、R_总计-B、R_总计-C和R_总计-D计算出。

因而，本发明的一个方面涉及一种方法，所述方法用于从测得的总电阻中，计算两个或更多个基本相同电极阵列(例如，图1A中的阵列A-D)的电连接迹线的电阻，其包括下列步骤：

(1)将电极阵列暴露于具有相同或相似的溶液或悬浮液的溶液；

(2)用阻抗分析仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为有溶液或悬浮液存在时的电子开关电阻、连接垫和电极结构之间的电连接迹线的电阻(例如对于图1A所示电极结构，位于连接垫和电极总线之间)和电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)、(9C)和(9D)求出电连接迹线的电阻，注意在用等式(15)进行计算时，电极阵列之间的几何关系用以确定因子α_A-D、α_B-D和α_C-D。

本发明的另一个方面涉及一种方法，所述方法用于如果将相同或相似的溶液或悬浮液加入到电极测定或与所述电极测定接触，从测得的总电极电阻中计算两个或更多个基本相同电极阵列(例如，图1A中的阵列A-D)的电极阵列的电阻，其包括下列步骤：

(1)将电极阵列暴露于具有相同或相似的溶液或悬浮液的溶液；

(2)用阻抗分析仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为有溶液或悬浮液存在时的电子开关电阻、连接垫和电极结构之间电连接迹线的电阻(例如对于图1A所示电极结构，位于连接垫和电极总线之间)和电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)、(9C)和(9D)求出电连接迹线的电阻，注意在用等式(15)进行计算时，电极阵列之间的几何关系用以确定因子α_A-D、α_B-D和α_C-D；

(4)用等式(10A、10B、10C和10D)计算电极阵列的电阻。

在许多应用中，用于每种电极阵列的溶液或者悬浮液(例如细胞悬浮液)有不同的组成。例如，可使用不同细胞数目的细胞悬浮液，从而应用于每个电极阵列的悬浮液是非常不同的。在这种情况下，确定有细胞存在时的电极阵列的电阻就要求通过进行一次“参考测量”或“校准测量”来确定电连接迹线的电阻，在进行所述“参考测量”或“校准测量”时，电极阵列暴露于相同的参考溶液。通过“参考测量”可以确定电连接迹线的电阻。在另一个单独测试中，电极阵列暴露于目标溶液或细胞悬浮液，并使用阻抗分析仪或阻抗测量电路测量这种条件下电极阵列的总电阻。有细胞悬浮液存在时的电极阵列的电阻可由测得的电阻减去相应电极阵列的电子开关电阻和电连接迹线电阻之和而从测得的电阻确定(或连续不断地确定)。

因而，本发明的另一个方面涉及一种方法，所述方法用于如果将不同的目标溶液或悬浮液应用到电极测定，从阻抗分析仪测得的总电阻计算基本相同的电极阵列(例如，图1A中的阵列A-D)的电极阵列的电阻，其包括下列步骤：

(1)将电极阵列暴露于具有相同或相似的溶液或悬浮液(参考溶液)的溶液；

(2)用阻抗分析仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为有参考溶液存在时的电子开关电阻，连接垫和电极结构之间电连接迹线电阻(例如对于图1A所示电极结构，位于连接垫和电极总线之间)和电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)、(9C)和(9D)求出电连接迹线的电阻，注意在用等式(15)进行计算时，图1A的电极阵列之间的几何关系用以确定因子α_A-D、α_B-D和α_C-D；

(4)向每个电极阵列应用溶液或悬浮液；用阻抗分析仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为有溶液或悬浮液存在时的电子开关电阻，连接垫和电极结构之间电连接迹线的电阻和电极阵列的电阻之和；

(5)用等式(10A)、(10B)、(10C)和(10D)计算电极阵列的电阻，其通过从步骤(4)测得的电阻中减去电子开关的电阻和电连接迹线的电阻实现。

注意在上述方法中，将电极阵列暴露于参考溶液以确定导电迹线电阻的步骤(步骤(1)、(2)和(3))可在向电极阵列应用目标溶液或悬浮液和测量总电阻的步骤(步骤(4))之前或之后进行。例如，可先进行步骤(4)。然后，将目标溶液或悬浮液从电极阵列上移开。再向电极阵列加入参考溶液(步骤(1))。再进行步骤(2)和步骤(3)以确定电连接迹线的电阻。最后，进行步骤(5)。

在另一种方法中，步骤(1)和(2)可在步骤(4)前进行。

本发明的另一个方面涉及一种方法，所述方法基于阻抗分析仪测得的基本相同电极阵列的总电阻，用于确定在基于细胞的测定中细胞存在时电极阵列的电阻。在这种方法中，将电极阵列暴露于相同的参考溶液(例如，不含有任何细胞的相同的细胞培养基)，并进行电测量以确定电连接迹线的电阻。在确定了电连接迹线的电阻后，将细胞悬浮液添加到电极阵列时的电极阵列的电阻可由在阻抗分析仪上测得的总电阻计算出。这个总电阻包括有细胞存在时的电极阵列的电阻、电子开关的电阻和电连接迹线的电阻。此方法包括下列步骤：

(1)将电极阵列暴露于具有相同或相似的溶液或悬浮液的溶液(参考溶液)；

(2)用阻抗分析仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为有参考溶液存在时的电子开关电阻、连接垫和电极结构之间电连接迹线的电阻(例如对于图1A所示电极结构，位于连接垫和电极总线之间)和电极阵列的电阻之和；

(3)用等式(15)和等式(9B)、(9C)和(9D)求出电连接迹线的电阻，注意用等式(15)进行计算时，图1A中电极阵列之间的几何关系用以确定因子α_A-D、α_B-D和α_C-D；

(4)向每个电极阵列应用目标细胞悬浮液；并用阻抗分析仪或阻抗测量电路，测量每个电极阵列的电阻(串联电阻)，这个电阻为有目标细胞悬浮液存在时的电子开关电阻、连接垫和电极结构之间电连接迹线的电阻和电极阵列的电阻之和；

(5)用等式(10A)、(10B)、(10C)和(10D)计算电极阵列的电阻，其通过从步骤(4)测得的电阻中减去电子开关的电阻和电连接迹线的电阻来实现。

注意在上述方法中，将电极阵列暴露于参考溶液以确定导电迹线的电阻的步骤(步骤(1)、(2)和(3))可在向电极阵列应用目标溶液或目标细胞悬浮液和测量总电阻的步骤(步骤(4))之前或之后进行。例如，可先进行步骤(4)，然后进行步骤(1)和(2)。在一种方法中，在步骤(4)后，将目标细胞悬浮液从电极阵列上移走。然后向电极阵列加入参考溶液。在另一种方法中，在步骤(4)后，将细胞用一些细胞裂解液全部裂解，从而电极暴露于相同的参考溶液，以进行步骤(2)和(3)的测量和计算。然后，进行步骤(5)以确定有目标细胞悬浮液存在时的电极阵列的电阻。

确定基本上相同电极阵列的电极阵列的导电迹线的电阻可作为或不作为用于基于细胞的测定中的监控细胞-基底阻抗的一部分。这依赖于电极阵列的阻抗数据(在单个或多个频率测量，在多个时间点测量)的分析方法。

在一些测定中，人们可能对有细胞存在时的电极阵列的电阻或阻抗相对于基线电阻或阻抗的相对改变感兴趣。在这种情况下，优选确定电极阵列的电阻(或阻抗)，其通过从总的测得的电阻(或阻抗)减去导电迹线的电阻和电子开关的电阻来实现。这样就需要确定导电迹线的电阻或阻抗。

在另一些测定中，人们对有细胞存在时的电极阵列的电阻(或阻抗)相对于基线电阻(或阻抗)的绝对改变。在这种情况下，人们可以从电极阵列上有细胞存在时的条件下测得的电阻或阻抗中直接减去测得的基线条件下的电阻或阻抗。电子开关的电阻(或阻抗)和导电迹线的电阻(或阻抗)对总的测得的电阻(阻抗)值的贡献可在这样的减法运算中被取消了。这样就不需确定导电迹线的电阻。

在一些测定中，人们对基于监控的阻抗值计算细胞指数或细胞数目指数感兴趣。依赖于用哪些方法计算细胞指数，可需确定，也可不需确定导电迹线的电阻。例如，对上述细胞指数计算方法(A)而言，需要导电迹线电阻来去除导电迹线电阻对电阻或阻抗相对变化分析的影响。在另一例中，对于上述细胞指数计算方法(F)而言，不需确定导电迹线电阻，因为导电迹线电阻的影响在计算中被取消了。

细胞-基底阻抗的监控可基于或不基于相对于基线阻抗(或电阻)的改变。例如，用基于细胞的测定估计测试化合物对细胞的作用。一种方法是，通过监控细胞-基底阻抗并确定将测试化合物加入细胞前和加入细胞后的细胞-基底阻抗的变化来进行所述测定。细胞-基底阻抗的监控可在在加药后的单个频率点或多个频率点，单个时间点或多个时间点进行。例如，紧在加入测试化合物前测量单个频率或多个频率下有细胞存在时的电极阵列的阻抗。然后往细胞加入测试化合物。在加入测试化合物后再次测量相同的单个频率或多个频率下有细胞存在时的电极阵列的阻抗。这样的加入化合物后的测量可在规则的或不规则的时间间隔连续进行许多时间点。细胞-基底阻抗的改变可通过从加入测试化合物后测得的阻抗(电阻和/或电抗)减去加入测试化合物前测得的阻抗(电阻和/或电抗)来确定或定量。如果在多个频率点进行测量，那么对于加入化合物后的每个时间点，可基于细胞-基底阻抗的计算的改变来推导单个参数或多个参数。这些参数被用于定量加入化合物后的细胞变化。这个方法可进一步被用于分析细胞对多种浓度的测试化合物的反应以推导剂量依赖性反应曲线。

D.进行基于细胞的实时测定的方法

本发明提供基于细胞的测定，其可以实时进行以对细胞增殖、细胞生长、细胞死亡、细胞形态学、细胞膜特性(如大小、形态学或细胞膜的组成)细胞粘附和细胞游动性进行评估。因此本测定可以为细胞毒性测定、增殖测定、细胞凋亡测定、细胞粘附测定、细胞激活测定、抗癌化合物功效测定、受体配体结合以及信号转导测定、细胞骨架变化测定、细胞结构变化测定(包括但不仅限于细胞膜大小、形态学或组成的变化)、细胞分化或去分化测定、细胞粘着性测定、细胞-细胞相互作用测定、微生物和环境毒素分析，等等。实时测定意指测定的细胞行为或细胞状况能以有规则或无规则的时间间隔连续估计。依赖于应用，测定的细胞行为、细胞反应或细胞状况可在它们出现的数秒到数分钟内。测定期间的细胞反应可以在选定的时间段内基本连续地监控。比如，在加入试剂后，培养物可以每隔5到15分钟进行监控，持续几个小时到几天。无论是以有规则还是元规则的时间间隔监控阻抗，阻抗监控之间的时间间隔以及阻抗监控测定的持续时间都可以由实验者决定。

因而，本发明的基于细胞的阻抗测定避免了由于在对细胞进行取样或测定时选择的一个或多个时间点引起的无意中对细胞反应进行的偏倚或错误的估计。另外，测定不需要对细胞培养物进行取样或添加试剂，从而可以更方便、更快地得到结果，同时消除了许多测定中可能引入的错误。

对细胞-基底监控以及相关装置、系统和使用方法的描述已在如下文献中提供：美国临时申请号60/379,749，其于2002年7月20日提交；美国临时申请号60/435,400，其于2002年12月20日提交；美国临时申请60/469,572，其于2003年5月9日提交；PCT申请号PCT/US03/22557，其名称为“Impedance based devices and methodsfor use in assays”，于2003年7月18日提交；PCT申请号PCT/US03/22537，其名称为“Impedance based apparatuses andmethods for analyzing cells and particles”，于2003年7月18日提交；美国专利申请号10/705,447，其名称为“Impedance based devicesand methods for use in assays”，于2003年11月10日提交；美国专利申请号10/705,615，其名称为“Impedance based apparatuses andmethods foranalyzing cells and particles”，于2003年11月10日提交，在此将以上文献中的关于细胞-基底阻抗装置、系统和使用方法的公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。本发明会进一步公开细胞-基底阻抗监控技术的细节。

简言之，对于用本发明技术测量细胞-基底或者细胞-电极阻抗，使用了细胞-基底阻抗监控装置，其在孔(如微量滴定板的孔)的底面上安装有合适几何形状的微电极阵列，或者具有类似的设计，在多个流体容器(孔)的底面朝向孔内的一方安装有电极。将细胞导入到装置的孔，使细胞和电极表面接触并附着上去。细胞的存在、不存在或性质的改变都会影响电极传感器表面电子和离子的通过。

测量电极间的阻抗可提供关于存在于传感器上的细胞生物学状态的重要信息。当细胞生物学状态发生变化时，可以自动且实时测量模拟电子读出信号，并可以将其转换成数字信号以进行处理和分析。在本发明的一个系统中，基于测量到的电极阻抗值可自动推导和提供细胞指数。所得到的给定孔的细胞指数反映了：1)附着在此孔电极表面的细胞数，2)此孔电极表面的细胞附着状态(紧密的或松散的)。因此，附着在电极表面的生理状态相似的同一种类的细胞越多，细胞指数越大。同样的，细胞在电极表面附着得越好(例如细胞扩散得更大从而有更大的接触面积，或者细胞与电极表面附着得更加紧密)，细胞指数越大。

在本发明的一方面，提供了进行基于细胞的测定的方法，其包括：a)提供本发明的细胞-基底阻抗监控系统；b)将细胞导入系统的装置的一个或者多个孔中，其中一个或者多个孔的至少一个包含电极阵列；和d)监控至少一个包含电极阵列和细胞的孔的细胞-基底阻抗。

此方法可用来测定细胞状态，此处的细胞状态包括但不限于：在基底上(包括在电极上)的细胞附着或粘附状态(例如细胞扩散程度、细胞附着面积、细胞附着的紧密程度、细胞形态学)，细胞生长或增殖状态；孔中存活细胞和/或死亡细胞数；细胞骨架的变化和再组织以及进入细胞凋亡和/或坏死的细胞数。用上述方法进行的基于细胞的测定包括但不仅限于细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞存活、细胞毒性、细胞形态学探测、细胞定量、细胞质量控制、时间依赖性细胞毒性特征、IgE-介导的细胞激活或者刺激、受体-配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理变化和细胞死亡、检测和定量中和抗体、特定的T-细胞介导的细胞毒性作用、用于筛选和测量配体-受体结合的基于细胞的测定。

在本发明该方面的一个优选实施方案中，将细胞加入到装置的至少两个孔中，每一个孔都包含电极阵列，并监控至少两个包含细胞和电极阵列的孔的阻抗。

测定中所用细胞可以是从任何物种中分离出的原代细胞或细胞系的细胞。细胞也可以是通过工程改造后的细胞。在某些实施方案中，在不同的孔中加入不同类型的细胞，并对这些细胞的行为进行对比。

可以以有规则或元规则的时间间隔来监控阻抗。虽然本发明没有要求，但优选的是监控3个或更多的时间点的阻抗。在上述基于细胞的测定的一个实施方案中，以有规则的时间间隔监控细胞-基底阻抗。可以在一个频率或多于一个频率上监控阻抗。例如，在某些实施方案中，在监控阻抗的每个时间点上在一段频率范围内监控阻抗。优选地，在约1Hz到约100MHz中间的至少一个频率监控阻抗，更优选在约100Hz到约2MHz之间的至少一个频率监控阻抗。

图7描述了用本发明的方法监控细胞增殖的结果。在该实验中，将H460细胞导入本发明细胞-基底阻抗监控系统的16孔装置的孔中，不同的孔接种的初始细胞数是不同的。将装置与系统的装置操作台接合，所述装置操作台置于保持在37℃温度和5％CO₂气氛的组织培养箱中。以15分钟的时间间隔监控细胞-基底阻抗125小时。细胞指数由系统对每一个时间点计算得到并针对每个细胞接种数显示为时间的函数以给出细胞生长(增殖)曲线。细胞生长曲线以对数(log)比例作图，给出了指数生长期和稳定期。

图8描述了实时监控NIH3T3细胞的细胞附着及扩散的结果。将细胞接种到用聚-L-赖氨酸或者纤连蛋白包被的细胞-基底阻抗监控装置上。将装置与装置操作台接合，所述装置操作台置于保持在37℃温度和5％CO₂气氛的组织培养箱中。通过测量细胞-基底阻抗监控系统上的阻抗监控在不同包被的表面的细胞附着及细胞扩散。阻抗每3分钟实时监控一次，持续3小时。每一个时间点的细胞指数由阻抗监控系统计算得到并作为时间的函数作图。

图9显示监控Cos-7细胞受表皮生长因子(EGF)侧基后形态学改变的实验的结果。将细胞接种到本发明16孔监控装置的孔中，所述16孔监控装置与细胞-基底监控系统的装置操作台接合。所述装置操作台被置于保持在37℃和5％CO₂的培养箱中。将细胞血清饥饿8小时，然后再用50ng/ml EGF进行刺激。对照细胞没有接受EGF。阻抗以3分钟的时间间隔进行监控，持续2小时，然后以1小时的时间间隔持续14小时。细胞指数由系统计算得到并作为时间的函数作图。由于EGF引起的膜变皱以及肌动蛋白动态反应，所以在EGF-处理的细胞中观察到了细胞指数最初的跳变。箭标显示了加入EGF的点。

D.1.用基于细胞的测定来测试化合物对细胞的影响

另一方面，本发明提供了进行研究一种或多种测试化合物对细胞的影响的基于细胞的测定的方法，其包括：a)提供本发明的细胞-基底阻抗监控系统；b)将细胞导入装置的至少一个包含电极阵列的孔中；c)向一个或多个包含细胞和电极阵列的孔中加入至少一种测试化合物；和d)监控加化合物前和加化合物后的一个或者多个孔的细胞-基底阻抗，其中阻抗的改变可以提供细胞对一种或多种化合物的反应的信息。

关于细胞对一种或多种化合物的反应的信息包括，但不限于关于下述的信息：在基底上(包括在电极上)的细胞附着或粘附状态(例如细胞扩散程度、细胞附着面积、细胞附着的紧密程度、细胞形态学)，细胞生长或增殖状态；孔中存活细胞和/或死亡细胞数；细胞骨架的变化和再组织以及进入细胞凋亡或死亡的细胞数。关于细胞状态的信息还包括引起一个或多个上述细胞状态指示因子的任何变化的任何化合物-细胞相互作用。例如，如果化合物与细胞表面受体结合，并且所述结合引起细胞形态学变化，那么这种化合物和受体的结合就可以通过监控的细胞-基底阻抗来测定。用上述方法进行的基于细胞的测定包括但不仅限于细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞存活、细胞毒性、细胞形态学探测、细胞定量、细胞质量控制、时间依赖性细胞毒性特征、IgE-介导的细胞激活或者刺激、受体-配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理变化和细胞死亡、检测和定量中和抗体、特定的T-细胞介导的细胞毒性效应、用于筛选和测量配体-受体结合的基于细胞的测定。

测定中所用细胞可以是从任何物种中分离出的原代细胞或细胞系的细胞。细胞也可以是通过基因工程改造后的细胞(例如，细胞来源于有基因改造生物，如来源于“基因敲除”生物，或者细胞被工程改造以超表达某种内源基因或转基因，或者细胞正常的基因表达被反义分子或沉默RNA操纵。)在某些实施方案中，向不同孔内加入不同类型的细胞，并比较所述不同细胞类型对一种或多种化合物反应的行为。

测试化合物可以是任何化合物，包括小分子、大分子、分子复合物、有机分子、无机分子、生物分子，如，但不限于，脂质、类固醇、碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、肽、蛋白、核酸或它们的任何组合。测试化合物可以是合成的化合物、自然存在的化合物、自然存在的化合物的衍生物等等。

在本发明优选的方法中，将细胞加入到至少两个包含电极阵列的细胞-基底阻抗监控装置的孔中，并且至少一个包含电极阵列且包含细胞的孔不接受测试化合物。可监控不接受测试化合物的对照孔，并将其阻抗数据与接受化合物的孔的阻抗数据进行比较以确定一种或者多种测试化合物对细胞的影响。

可以以有规则或无规则的时间间隔来监控阻抗。优选的是监控3个或更多的时间点的阻抗，至少一个所述时间点是在加入一种或多种测试化合物之前的。在上述基于细胞的测定的一个实施方案中，在加入测试化合物前在至少一个时间点监控细胞-基底阻抗，此后以规则时间间隔进行监控。例如在加入化合物前以一个或多个时间间隔测量阻抗，且在加入化合物后以规则的2小时、1小时、30分钟或者15分钟时间间隔进行测量。优选的是阻抗以规则时间间隔在3个或更多个时间点进行测量的。在本申请中，实时测定意味着允许人们使用各种时间分辨率测量细胞-基底阻抗，例如以较长的时间间隔如每隔1小时或每隔2小时进行测量，或以较短的时间间隔，每隔1分钟或每隔几分钟进行测量。

可以在一个或多于一个频率监控阻抗。例如，在某些优选的实施方案中，在监控阻抗的每个时间点在一段频率范围监控阻抗。优选在约1Hz到约100MHz中间的至少一个频率监控阻抗，更优选在约100Hz到约2MHz之间的至少一个频率监控阻抗。

优选的是，将含有细胞和测试化合物的孔的阻抗监控数据与含有细胞而不含有化合物的孔的阻抗监控数据进行比较，但这并不是本发明所必需的。例如也可能比较加入化合物前一个或多个时间点的阻抗测量值与加入化合物后一个或多个时间点的阻抗测量值。此比较可直接用于评估细胞对化合物的反应。还可能用得到的阻抗值计算细胞指数(或细胞数目指数)。计算细胞指数(细胞数目指数)的方法在此处以及在母案申请美国专利申请10/705,447中公开了，在此将其中关于细胞数目指数及其计算的公开内容以参考文献的方式整合到本申请中。可以比较由接受化合物的孔的阻抗测量值计算的细胞指数与由对照孔的阻抗测量值计算的细胞指数，以评估化合物对细胞的影响。另外，也可以比较加入化合物后从一个或多个时间点的孔的阻抗测量值计算的细胞指数和加入化合物前从一个或多个时间点的孔的阻抗测量值计算的细胞指数，以评估化合物对细胞的影响。在某些优选实施方案中，细胞指数可用作为细胞毒性的指示。

本发明向装置的孔中添加不同浓度的化合物的测定。所述方法包括：a)提供本发明的细胞-基底阻抗监控系统；b)将细胞导入装置中至少两个各自包含电极阵列的孔中；c)向至少一个包含细胞和电极阵列的装置的孔中加入第一种浓度的测试化合物；d)向至少另一个包含细胞和电极阵列的装置的孔中加入第二种浓度的测试化合物；和e)监控加化合物之前和之后一个或者多个孔的细胞-基底阻抗，其中阻抗的改变可以提供关于细胞对化合物反应的信息。

关于细胞对化合物的反应的信息包括，但不限于：在基底上(包括在电极上)的细胞附着或粘附状态(例如细胞扩散程度、细胞附着面积、细胞附着的紧密程度、细胞形态学)，细胞生长或增殖状态；孔中存活细胞和/或死亡细胞数；细胞骨架的变化和再组织以及进入细胞凋亡或死亡的细胞数。关于细胞状态的信息还包括引起一种或多种上述细胞状态指示因子的任何变化的任何化合物-细胞相互作用。例如，如果化合物与细胞表面受体结合，并且所述结合引起细胞形态学变化，那么这种化合物和受体的结合就可以通过监控的细胞-基底阻抗来测定。用上述方法进行的基于细胞的测定包括但不仅限于细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞增殖、细胞存活、细胞毒性、细胞形态学探测、细胞定量、细胞质量控制、时间依赖性细胞毒性特征、IgE-介导的细胞激活或者刺激、受体-配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理变化和细胞死亡、检测和定量中和抗体、特定的T-细胞介导的细胞毒性效应、用于筛选和测量配体-受体结合的基于细胞的测定。

测定中用到的细胞和测试化合物可以是如上面检测测试化合物作用的测定中所述的细胞和化合物。在本发明优选的方法中，将细胞导入到装置的至少三个各自包含电极阵列的孔中，并且至少一个包含电极阵列且包含细胞的孔不接受测试化合物。对不接受测试化合物的对照孔进行监控，且可将其阻抗数据和接受化合物的孔的阻抗数据进行对比以确定一种或多种测试化合物对细胞的作用。

阻抗监控可以如紧在前文中对检测测试化合物作用的测定中所述那样进行。

优选地，将从含有细胞和不同浓度测试化合物的孔中阻抗监控得到的数据进行对比。此对比可直接用于评估细胞对化合物浓度升高的反应。还可能用得到的阻抗值计算细胞指数(或细胞数目指数)。计算细胞指数(细胞数目指数)的方法在此以及在母案申请美国申请No.10/705,447中公开了，在此将其中关于细胞指数及其计算的公开内容以参考文献的方式整合到本专利申请中。在某些优选实施方案中，细胞指数可用作为细胞毒性的指示。

将从接受不同浓度化合物的孔的阻抗测量值计算的细胞指数进行比较，以评价化合物对细胞的作用。另外，可以比较从包含不同浓度的化合物的孔的阻抗测量值计算的细胞指数。由此比较可推导剂量反应关系。在某些优选的实施方案中，由细胞指数值可计算得到展示细胞毒性或抑制具体细胞反应的化合物的时间依赖性的IC50值。

在本方法的一个实施方案中，对细胞毒性反应的分析包括推导在给定化合物浓度下时间依赖性的细胞毒性反应变化的斜率。在该方法的另一个实施方案中，对实时细胞毒性反应的分析包括推导给定化合物浓度时时间依赖性的细胞毒性反应对时间的高阶导数。

应用多于一种化合物的基于细胞的测定

另一方面，本发明提供了一种进行研究两种或更多种化合物对细胞影响的基于细胞的测定的方法。所述方法包括：a)提供本发明的细胞-基底阻抗监控系统；b)将细胞导入装置的至少两个各自包含电极阵列的孔中；c)向至少一个包含细胞和电极阵列的装置的孔中加入第一种测试化合物；d)向至少另一个包含细胞和电极阵列的装置的孔中加入第二种测试化合物；和e)监控至少一个包含细胞和第一种化合物的孔，和至少一个包含细胞和第二种化合物的孔的细胞-基底阻抗，其中阻抗的改变可以提供细胞对第一种和第二种化合物反应的信息。

优选的是，将细胞对第一种化合物和第二种化合物的时间依赖性的反应进行对比以观察来自两种化合物的反应的相似或不同程度。在本方法的一种优选的实施方案中，对时间依赖性的细胞毒性反应进行了比较。

测定中用到的细胞和测试化合物可以是如上面检测测试化合物作用的测定中所述的细胞和化合物。在本发明优选的方法中，将细胞导入到装置的至少三个各自包含电极阵列的孔中，并且其中至少一个包含电极阵列且包含细胞的孔不接受化合物。对没有接受测试化合物的对照孔进行监控，且其阻抗数据可以和接受化合物的孔的数据进行对比以测定测试化合物对细胞的作用。

阻抗监控可以如紧在前文中对检测测试化合物作用的测定中所述那样进行。

优选的是，将含有不同测试化合物的孔的阻抗监控数据进行对比。在一种优选的实施方案中，可以在多种剂量浓度下对第一种化合物进行阻抗监控。在另一实施方案中，可以在多种剂量浓度下测定第二种化合物的时间依赖性的细胞反应。在另一个实施方案中，可以在多种剂量浓度下测定第一种化合物和第二种化合物的时间依赖性的细胞反应。

在以上方法的另一实施方案中，第一种化合物是具有已知的细胞毒性作用机理的化合物，而第二种化合物是具有未知的细胞毒性作用机理的化合物。如果第二种化合物的时间依赖性的细胞毒性反应与第一种化合物相似，那么第二种化合物可能与第一种化合物有相似的细胞毒性作用机理。

可以将多种方法用于比较化合物的细胞毒性反应。可以任选由得到的阻抗值算出细胞指数(或细胞数目指数)。在以上描述的方法的一个实施方案中，基于细胞指数值，推导出化合物的时间依赖性的IC50，并通过比较它们的时间依赖性的IC50曲线比较它们的细胞毒性反应。如果两种化合物的IC50曲线有相似的时间依赖性趋势，则这两种化合物可能有相似的诱导细胞毒性作用的机理。在所述方法的另一实施方案中，直接比较两种化合物的时间依赖性的细胞毒性反应，其中两种化合物的浓度相同或不同。可以通过分析测到的反应的变化斜率(其等于反应对时间的一阶导数)以及比较两种化合物的对时间依赖性的斜率，来进行时间依赖性的细胞毒性反应的直接比较。在另一种方法中，分析时间依赖性的胞毒反应对时间的更高阶导数。这种高阶导数的比较可以提供更多的关于化合物诱导的细胞毒性的机理的信息。

应用多于一种细胞类型的基于细胞的测定

另一方面，本发明提供了一种用于描述化合物对多种细胞类型的细胞毒性特征的方法，其包括：a)提供本发明的细胞-基底阻抗监控系统；b)将第一种类型的细胞导入装置中至少一个包含电极阵列的孔中；c)将第二种类型的细胞导入装置中至少另一个包含电极阵列孔中；d)将测试化合物加入到至少一个包含第一种类型的细胞的孔中和至少一个包含第二种类型的细胞的孔中；和e)监控至少一个含有第一种类型的细胞和测试化合物的孔和至少一个含有第二种类型的细胞和测试化合物的孔的细胞-基底阻抗，其中阻抗的改变可以提供细胞对第一种和第二种化合物反应的信息。

优选的是，比较第一种和第二种类型的细胞的时间依赖性的反应以比较两种类型的细胞的反应相似和不同的程度。在本方法的一个优选实施方案中，比较了时间依赖性的细胞毒性反应。

测定中所用的细胞类型可以是从任何物种中分离出的原代细胞或细胞系的细胞。在某些优选的实施方案中，不同的细胞类型是来源于不同个体的相同细胞类型，并因此有不同的基因型。一种或多种细胞类型可以是通过基因工程修饰后的细胞类型(例如，细胞来源于有基因改造生物，如来自“基因敲除”生物，或者细胞被工程改造以超表达某种内源基因或转基因，或者细胞正常的基因表达被反义分子或沉默RNA操纵。)在这些情况下，基因改造细胞可以与对照细胞进行比较。在某些实施方案中，向不同孔内加入三种或更多种不同的细胞类型并比较所述三种或更多种不同的细胞类型对一种或多种化合物的反应。

测定中用到的一种或多种测试化合物可以是如上面检测测试化合物作用的测定中所述的化合物。在本发明优选的方法中，将细胞导入到装置的至少三个各自包含电极阵列的孔中，并且其中至少一个包含电极阵列且包含细胞的孔不接受测试化合物。对没有接受化合物的对照孔进行监控，且其阻抗数据可以和接受化合物的孔的数据进行比较，以确定测试化合物对细胞的作用。在本发明优选的实施方案中，针对每一种测试的细胞类型，都进行了一个对照，其中对照不接受测试化合物。

阻抗监控可以如紧在前文中对检测测试化合物作用的测定中所述那样进行。

优选的是，比较包含不同细胞类型的孔的阻抗监控的数据。在一种优选的实施方案中，对暴露于化合物的多种剂量浓度的不同细胞类型进行阻抗监控。在一些实施方案中，可以用多种细胞类型检测多种化合物。在一些实施方案中，可以用多种细胞类型检测多种浓度的多种化合物。

在方法的一个实施方案中，实时细胞毒性反应分析包括推导化合物对多种细胞类型的时间依赖性的IC50值。在方法的另一个实施方案中，实时细胞毒性反应分析包括推导在给定的化合物浓度下时间依赖性的细胞毒性反应变化的斜率。在方法的另一个实施方案中，实时细胞毒性反应分析可包括推导在给定化合物浓度时时间依赖性的细胞毒性反应对时间的高阶导数。

在方法的一个实施方案中，实时胞毒反应分析包括推导化合物对多种细胞类型的时间依赖性的IC50值。在另一实施方案中，以上方法可以用来描述多种化合物对多种细胞类型的细胞毒性特性。

在方法的另一个实施方案中，实时胞毒反应分析包括推导在给定的化合物浓度下时间依赖性的细胞毒性反应变化的斜率。在方法的另一个实施方案中，实时细胞毒性反应分析可包括推导在给定化合物浓度时时间依赖性的细胞毒性反应对时间的高阶导数。

参考附图以示例的方式给出了一些使用本发明的细胞-基底阻抗系统进行化合物测定的例子。在这些例子中，细胞指数的计算方法与本申请C部分中描述的细胞指数计算方法(A)一样。在本申请的某些附图中，对规格化的细胞指数进行绘图。在给定时间点的规格化细胞指数是通过将该时间点的细胞指数除以参考时间点的细胞指数计算的。所以，参考时间点的规格化细胞指数为1。

正如本申请所说明的，如果细胞的附着条件在使用阻抗监控的整个测定过程中不变或者变化很小，那么细胞指数越大，孔中的细胞数就越多。细胞指数下降表明一些细胞从基底表面脱离或者由于化合物作用而垂死。细胞指数增加表明有更多细胞附着到基底表面，也表明总细胞数的增加。

图10显示了表示用不同浓度抗癌药紫杉醇处理的H460细胞的时间-依赖性细胞指数的曲线。在该实验中，将H460细胞导入16x细胞-基底阻抗监控装置的孔中。将装置置于装置操作台上，所述装置操作台位于保持37℃和5％CO₂条件的培养箱中。培养细胞，并在其指数生长期用不同浓度的紫杉醇进行处理。在处理后，通过用细胞-基底阻抗监控系统每隔15分钟实时监控细胞-基底阻抗50小时，来监控细胞对不同剂量紫杉醇的动态反应。细胞-基底阻抗监控系统计算每一个时间点的细胞指数，并将所述细胞指数作为时间的函数作图。对于浓度在67nM到500nM之间的紫杉醇，在加入化合物后H460细胞的细胞指数逐渐下降。但加入化合物后约15小时到20小时时细胞指数都在依赖于化合物浓度的时间降到最低点。这一点过后，这些孔的细胞指数逐渐上升。用33nM化合物浓度的细胞指数在加入化合物后最多约15小时显示几乎恒定的值。加入化合物15小时后细胞指数逐渐上升。

图11显示了表示用抗癌药AC101103处理的H460细胞的时间-依赖性细胞指数的曲线。将H460细胞导入到16X细胞-基底阻抗监控装置的孔中。将装置置于装置操作台上，所述装置操作台位于保持37℃和5％CO₂条件的培养箱中。培养细胞，并在其指数生长期用不同浓度的AC101103进行处理。处理后在细胞-基底阻抗监控系统上通过每隔30分钟实时测量阻抗约20小时，来监控细胞对不同剂量的AC101103的动态反应。

很明显，图11中的时间依赖性细胞指数和图10中的有很大不同。对于浓度为3.125微克/毫升、6.25微克/毫升和12.5微克/毫升的化合物，细胞指数分别显示约5小时、约15小时和大于20小时的几乎恒定的值。对于浓度为3.125微克/毫升和6.25微克/毫升的化合物，细胞指数在加入化合物约5小时和约15小时后开始上升。对于浓度为25微克/毫升的化合物，加入化合物后，细胞指数发生逐步而缓慢的下降。对于浓度为50微克/毫升的化合物，存在细胞指数保持几乎恒定的约10小时的时间段，且之后细胞指数稳定下降。

图12显示用阿霉素处理的A549细胞的动态药物反应。在16X装置的每孔中接种10,000个A549细胞。将装置置于装置操作台上，所述装置操作台位于保持37℃和5％CO₂条件的培养箱中。在通过监控规则时间间隔的阻抗进行处理前，在细胞-基底阻抗系统上实时监控细胞附着和细胞生长。当细胞生长到指数生长期时，向孔中加入不同浓度的阿霉素。将相同体积的用于溶解药物的溶剂加入到某些孔中作为对照。如该图所示，在细胞-基底阻抗监控系统上实时记录时间和药物剂量依赖性的细胞反应(计算为细胞指数)。

E.用细胞-基底阻抗测定监控IgE-介导的细胞激活

本发明同样包括监控由IgE刺激的细胞的细胞-基底阻抗的方法。本方法是基于对由抗原与反应性细胞表面的IgE-Fc(ε)RI复合物结合引起的细胞骨架变化的实时定量的，其中反应性细胞的例子是，但不限于，肥大细胞。提供的电子测定依赖于细胞骨架动力学，它是肥大细胞对抗原的内在反应，同时也是肥大细胞活化程序的主要部分，同时本测定不需要建立报告细胞系或者使用其它测定试剂。另外，由于测定是实时的，所以无论是抗原依赖性还是抗原非依赖性的对IgE-介导的肥大细胞活化的反应都可以用相同测定监控。

此处描述的监控IgE刺激的细胞-基底阻抗的测定可以使用任何细胞-基底阻抗测量装置，包括但不限于母案美国专利申请10/705,447中和在此处所描述的。本发明方法中可用到的细胞-基底阻抗装置是指有适合于细胞的表面，同时有细胞可以定居和相互作用的电极的装置。电极阻抗的测量可以反映细胞的状态，如细胞数、细胞形态学或者细胞粘附。在优选实施方案中，本发明方法中可用的细胞-基底阻抗装置包含基底，所述基底在其表面上包含一个或多个电极阵列，其中一个或多个电极阵列的每一个都含有两个电极或电极结构，其中所述两个电极或电极结构具有基本相同的表面积。使用过程中，本发明方法中所用的细胞-基底阻抗装置可以检测一个或多个频率的阻抗变化，所述阻抗变化是由于细胞数、细胞大小、细胞形态学、附着于基底的细胞和附着于基底的细胞的质量的变化引起的。

本发明方法中用到的细胞-基底阻抗装置优选包含至少一个围绕装置的电极阵列并对监控的细胞提供不透流体的容器的流体容器。在优选的实施方案中，装置包含至少两个阵列和两个孔形式的容器，其中每一个装置的阵列都由一个孔围绕。更优选的是，用于本申请所述筛选方法中的装置包含至少8个孔(例如，包含16孔或96孔的装置)，其中大部分孔都包含电极阵列，从而所述测定可以以高通量方式进行。可以任选在多个多孔装置中同时测定细胞(例如，连接到相同的阻抗分析仪，与可以接合多于一个多孔装置的装置操作台接合，或者连接单独的阻抗分析仪)，以提高高通量能力。

用来监控细胞-基底阻抗的系统包含一个或多个多孔装置、阻抗分析仪和装置操作台在此处描述且是优选的，但不是本发明方法中必需的。

用于IgE刺激测定中的细胞可以是分离自一种或多种生物或来自细胞系的任何细胞。细胞可以是从一种或多种生物的血液或其它组织中分离出来的细胞。细胞优选是哺乳细胞。细胞优选是肥大细胞、嗜碱性粒细胞或嗜酸性粒细胞，但这不是本发明必需的。细胞可以是基因工程改造过的表达IgE反应通路成分的任何类型的细胞。细胞可以被工程改造以不适当地表达或超表达IgE反应通路成分。细胞也可以被工程改造以表达IgE反应通路成分的显性失活或其他改变的形式，或消除IgE反应通路成分的表达(例如使用同源重组敲除、反义或沉默RNA技术)。这里所说的“IgE反应通路成分”也包括怀疑是IgE反应通路成分的分子。

在本发明某些方面的一些实施方案中，RBL-2H3大鼠肥大细胞可用来进行IgE-介导的信号传导机理的研究，同时可以评价不同抑制剂对导致肥大细胞脱粒和介质释放的信号传导通路的影响。RBL-2H3有着很多在培养中维持和扩展方面的优势，且大量文献中使用这种细胞系作为模型系统来研究IgE-介导的肥大细胞活化。然而，本发明的方法和系统可易于修改为适用于其它学术上或制药上感兴趣的细胞。这些细胞包括，但不限于小鼠骨髓肥大细胞、人肺肥大细胞、人皮肤肥大细胞以及其它哺乳动物物种的肥大细胞和嗜碱性粒细胞。

以下章节将公开使用阻抗监控装置的测定，所述测定可测量导致肥大细胞形态学改变和脱粒的IgE结合和抗原介导的IgE-Fc(ε)RI交联。测定可以实时以高通量进行，同时不需要任何其它试剂或细胞处理。

E.1.监控由IgE刺激引起的细胞-基底阻抗变化的方法

已显示IgE-介导的细胞刺激可以引起细胞(如肥大细胞)剧烈的形态学变化。例如，RBL-2H3肥大细胞从纺锤形形态学变为扁平的和成纤维细胞形态学。本发明的细胞-基底阻抗监控装置可用来探测细胞形状变化和由IgE-介导的反应性细胞刺激引起的细胞-基底相互作用的变化。

方法包括：a)提供包含至少一个孔的用于细胞-基底阻抗监控的装置，所述孔含有至少一个电极阵列；b)连接所述装置和阻抗分析仪；c)向一个或多个包含电极阵列的装置的孔中导入细胞；d)向一个或多个包含细胞的孔中加入IgE；e)向一个或多个包含细胞的孔中加入至少一种抗原、至少一种变应原或至少一种IgE交联剂；和

e)监控一个或多个包含细胞的孔的细胞-基底阻抗。

在本发明的方法中，用于细胞-基底阻抗监控的装置是包含基底的装置，所述基底在其表面含有一个或多个电极阵列，每个电极阵列都由孔形式的流体容器包围。一个或多个电极阵列的每一个都含有两个电极或电极结构，其中所述两个电极或电极结构具有基本相同的表面积，其中，当连接于阻抗分析仪时，所述装置可以检测一个或多个频率的阻抗变化，所述阻抗变化是由于细胞数、细胞大小、细胞形态学、附着于基底的细胞或附着于基底的细胞的质量的变化引起的。

细胞可以是任何对IgE刺激的反应或可能的反应令人感兴趣的细胞。优选的细胞是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或基因改造细胞。在某些优选实施方案中，细胞是哺乳动物来源的。

IgE可以在加入抗原、变应原或IgE交联剂之前、之后或同时加入。加入到孔中的IgE的浓度可以从约10ng/ml到约1μg/ml。优选的是，一个包含电极阵列和细胞的装置的孔中不接受IgE以提供至少一个对照孔，但这不是本发明所必需的。

抗原、变应原或交联剂可以是已知的或怀疑的抗原、变应原或交联剂。加入到孔中的浓度可以从约1ng/ml到约1μg/ml。不同的孔中可以接受不同浓度的抗原、变应原或交联剂。或者为了重复的目的，多个孔可以接受相同浓度的抗原、变应原或交联剂。优选的是，一个包含电极阵列和细胞的装置的孔中不接受抗原、变应原或交联剂以提供至少一个对照孔，但这不是本发明所必需的。

本方法可通过使用细胞-基底阻抗技术来评价和定量肥大细胞由于IgE刺激IgE与抗原交联引起的形态学变化。优选在实验的两个或更多个阶段监控阻抗。例如，在一个实施方案中，在向孔中加入IgE之前和之后监控阻抗。在另一个实施方案中，在向孔中加入抗原、变应原或交联剂之前和之后监控阻抗。在另一个实施方案中，阻抗也可以在向孔中加入IgE以及抗原、变应原或交联剂的之前和之后进行监控。阻抗也可以在向孔中加入IgE后且在向孔中加入抗原、变应原或交联剂前进行监控，以及在向孔中加入抗原、变应原或交联剂后进行监控。在一些优选实施方案中，阻抗在向孔中加入IgE前进行监控，在向孔中加入IgE后且在向孔中加入抗原、变应原或交联剂前进行监控，以及在向孔中加入抗原、变应原或交联剂后进行监控。

可以监控两个或更多个时间点的阻抗。优选的是，监控至少三个时间点的阻抗。优选的是，监控测定的两个或更多阶段的至少三个时间点的阻抗。每一个时间点的阻抗可以在一个或多于一个频率进行监控。获得的阻抗监控数据可以用来评价由IgE刺激引起的细胞的形态学变化。例如可以比较每个孔中加入IgE之前和之后，和/或加入抗原、变应原或交联剂之前和之后的阻抗。可以比较接受IgE的孔和没有接受IgE的对照孔的阻抗数据。可以比较接受抗原、变应原或交联剂的孔和没有接受抗原、变应原或交联剂的对照孔的阻抗数据。阻抗数据可以用来计算细胞指数，其可以用于进行比较。

下面是一种示例性的规程：

(1)向附着于阻抗分析仪的16-孔或96-孔细胞-基底阻抗测量装置的孔中添加预定数目的肥大细胞。

(2)使细胞附着并生长16-20小时，同时记录10ng/ml到1μg/ml终浓度的IgE，且继续如上所述使用细胞-基底阻抗监控系统记录细胞反应。

(3)IgE刺激后16-20小时，将培养基换成无血清培养基。使细胞恢复30分钟后，然后用抗原进行刺激。继续在阻抗监控系统上监控细胞对抗原的反应。

E.2.筛选可以调节细胞对IgE刺激反应的化合物的方法

本发明也包括评价一种或多种化合物影响一种或多种细胞对IgE-介导的刺激反应的作用的方法。所述方法包括：a)提供包含至少一个孔的用于细胞-基底阻抗监控的装置，所述孔含有电极阵列；b)连接所述装置和阻抗分析仪；c)向一个或多个包含电极阵列的装置的孔中导入细胞；d)向一个或多个包含细胞的孔的一个或多个中加入至少一种测试化合物；e)向一个或多个包含细胞和至少一种测试化合物的孔中加入IgE；e)向一个或多个包含细胞和至少一种测试化合物的孔中加入至少一种抗原、至少一种变应原或至少一种IgE交联剂；和e)监控一个或多个包含细胞和至少一种测试化合物的孔的细胞-基底阻抗。

在本发明的方法中，用于细胞-基底阻抗监控的装置是包含基底的装置，所述基底在其表面含有一个或多个电极阵列，每一个电极阵列都由孔形式的流体容器包围。一个或多个电极阵列的每一个都含有两个电极或电极结构，所述两个电极或电极结构具有基本相同的表面积。当连接于阻抗分析仪时，所述装置可以检测一个或多个频率的阻抗变化，所述阻抗变化是由于细胞数、细胞大小、细胞形态学、附着于基底的细胞或附着于基底的细胞的质量的变化引起的。

优选地，用于本发明方法的装置是这里描述的细胞-基底阻抗监控系统的一部分。

细胞可以是任何对IgE刺激有可检测的反应的细胞。优选的细胞是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或基因改造细胞。在优选的实施方案中，细胞是哺乳动物来源的。

IgE可以在加入抗原、变应原或IgE交联剂之前、之后或同时加入。加入孔中的IgE的浓度可以从约10ng/ml到约1μg/ml。任选地，一个包含电极阵列和细胞的装置的孔中不接受IgE以提供对照孔。

抗原可以是已知的或怀疑的抗原、变应原或交联剂。加入到孔中的浓度可以从约1ng/ml到约1μg/ml。不同的孔中可以接受不同浓度的抗原、变应原或交联剂。或者为了重复的目的，多个孔可以接受相同浓度的抗原、变应原或交联剂。任选地，包含电极阵列和细胞的一个装置的孔中不接受抗原、变应原或交联剂以提供对照孔。

测试化合物可以是任何化合物，包括小分子、大分子、分子复合物、有机分子、无机分子、生物分子，如，但不限于，脂质、类固醇、碳水化合物、脂肪酸、氨基酸、肽、蛋白、核酸或它们的任何组合。测试化合物可以是合成的化合物、自然存在的化合物、自然存在的化合物的衍生物等等。测试化合物的结构可以是已知或未知的。在一个实验中可以测定一个或多个化合物。多种化合物可以组合进行检测。使用本发明的方法可以测定给定化合物的不同浓度。

组合化学的出现使得能够生成大的且多样的化合物库，其可以用于筛选潜在的IgE-介导的肥大细胞活化抑制剂。可以用高通量的方式在本发明的细胞-基底阻抗监控系统上进行测定，以筛选化合物库以找到这种潜在的抑制剂。

测试化合物可以是通过肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上表达的Fc(ε)RI受体以干扰IgE-介导的信号传导的化合物。例如，测试化合物可以是针对IgE的抗体，或是含有全部或部分Fc(ε)RI抗原结合结构域的重组蛋白，可以检测它特异结合IgE并阻止IgE与内源Fc(ε)RI相互作用的能力。测试化合物还可以是小分子抑制剂化合物的候选物，它可以结合到Fc(ε)RI的IgE-结合袋并阻断Fc(ε)RI与IgE分子相互作用。测试化合物也可以是siRNA，可以检测它们下调Fc(ε)RI在肥大细胞表面表达的能力。

也可以筛选测试化合物以鉴定可以在胞内抑制IgE刺激引起的细胞反应的化合物。例如，可以筛选测试化合物以鉴定在IgE刺激引起的细胞信号传导中起作用的激酶或脂酶的抑制剂。例如本发明的方法可用于筛选抑制蛋白激酶C、SRC、Syk或PLC(γ)的化合物。

优选的是，化合物在加入IgE之前加到孔中，但也可以在加入IgE之后并在加入抗原之前，或在加入IgE和抗原之后加入。在IgE和抗原同时加入的实施方案中，测试化合物可以在之后加入，但优选的是在加入IgE和抗原之后加入。

本方法可通过使用细胞-基底阻抗技术来评价和定量IgE引起的化合物对细胞的反应，例如，但不限于肥大细胞。阻抗优选在两个或更多个实验阶段进行监控。依赖于试验步骤，阻抗优选在向一个或孔中加入IgE后进行监控，且优选在向一个或孔中加入IgE之前和之后进行监控。优选在加入测试化合物后，加入IgE之前和之后监控阻抗。还可以在加入测试化合物和IgE后，加入抗原之前和之后监控阻抗。在一些优选的实施方案中，可以在向孔中加入测试化合物之后且在加入IgE之前监控阻抗；在向孔中加入IgE之后且在加入抗原、变应原或交联剂之前监控阻抗；和在向孔中加入抗原、变应原或交联剂之后监控阻抗。

优选监控两个或更多个时间点的阻抗。优选的是，监控至少三个时间点的阻抗。优选的是，监控测定中两个或更多阶段的至少三个时间点的阻抗。每一个时间点的阻抗可在一个或多于一个频率进行监控。获得的阻抗监控数据可以用来评价测试化合物对由IgE刺激引起的细胞形态学变化的影响。例如可以比较每一个孔中加入化合物之前和之后，和/或加入IgE之前和之后，和/或加入抗原、变应原或交联剂之前和之后的阻抗。可以比较接受测试化合物的孔和没有接受测试化合物的对照孔的阻抗数据。阻抗数据可以用来计算细胞指数，其可用于进行比较。这样的比较可以用来鉴定能抑制细胞(如肥大细胞)对IgE刺激反应的化合物。例如，从记录到的阻抗值可以计算一种或多种抑制细胞对IgE刺激的反应的化合物的IC50。

下面是一种用于化合物筛选的示例性规程：

(1)向16-孔或96-孔细胞-基底阻抗测量装置的孔中加入预定量的肥大细胞，所述装置是细胞阻抗监控系统的一部分。

103.用阻抗监控系统监控细胞的附着和生长。

104.使细胞与递增浓度的一种或多种潜在目标抑制剂(抗-IgE抗体、重组Fc(ε)RI抗原结合结构域片段或小分子化合物)预先温育一段固定的时间。

105.施用对所用细胞系特异性的IgE，并使用系统，电子监控由IgE刺激引起的瞬时细胞形态学变化。通过比较细胞在递增的抑制剂浓度条件下记录的峰反应来估计抑制程度和确定IC-50。

在本发明方法的另一个实例中，用液体处理台或多道移液器将肥大细胞或其它目标细胞分配入到96孔装置中。用如上方法监控细胞的附着和生长。为了评价抑制剂对仅仅IgE介导的信号传导的影响，在应用IgE前将细胞和单一浓度或多种浓度的抑制剂一起预温育。然后用如上方法监控存在药物情况下细胞对IgE的反应。可选择地，如果要评价药物对IgE-Fc(ε)RI复合物的抗原交联的影响，可以紧在如上所述加入抗原前将细胞和抑制剂预温育。

E.3.使用细胞-基底阻抗技术确认参与信号传导通路的酶和蛋白的方 法，所述信号传导通路由在IgE-交联存在或不存在时抗原结合高亲和 力Fc(ε)RI受体引起。

由IgE结合Fc(ε)RI刺激的胞内信号传导通路涉及关键酶的活化，例如但不限于，激酶、磷酸酶和磷脂酶。这些细胞对IgE反应的下游介质是药物发现中的潜在靶。然而在筛选这些靶蛋白和酶的潜在抑制剂前必须确认它们干扰IgE-介导的信号传导。这可以通过经由转染、电穿孔或病毒感染的方式将编码怀疑的靶蛋白显性失活形式的DNA或一种或多种可靶向并降低这些蛋白表达的siRNA引入反应性细胞来实现。另外，反义试剂也可以用来降低或除去怀疑的靶的表达。

所述方法包括：a)提供包含至少一个孔的用于细胞-基底阻抗监控的装置，所述孔含有电极阵列；b)连接所述装置和阻抗分析仪；c)向一个或多个包含电极阵列的装置的孔中导入细胞，其中所述细胞是基因改造过的，以改变怀疑的靶分子的功能，或降低或消除其表达；d)向一个或多个包含细胞的孔中加入IgE；e)向一个或多个包含细胞的孔中加入至少一种抗原、至少一种变应原或至少一种IgE交联剂；和e)监控一个或多个包含细胞的孔的细胞-基底阻抗。

在本发明的方法中，用于细胞-基底阻抗监控的装置是包含基底的装置，所述基底在其表面含有一个或多个电极阵列，每一个电极阵列都由孔形式的流体容器包围。一个或多个电极阵列的每一个都含有两个电极或电极结构，所述两个电极或电极结构具有基本相同的表面积。当连接于阻抗分析仪时，所述装置可以检测一个或多个频率的阻抗变化，所述阻抗变化是由于细胞数、细胞大小、细胞形态学、附着于基底的细胞或附着于基底的细胞的质量的变化引起的。

测量细胞-基底阻抗的装置在母案美国专利申请10/705,447中和本申请中描述。本发明方法中用到的细胞-基底阻抗装置优选包含至少一个围绕装置的电极阵列并对监控的细胞提供不透流体的容器的流体容器。在优选的实施方案中，装置包含至少两个阵列和两个孔形式的容器，其中每一个装置的阵列都由一个孔围绕。更优选的是，用于本申请所述筛选方法中的装置包含至少8个孔(例如，包含16孔或96孔的装置)，其中大部分孔都包含电极阵列，从而所述测定可以以高通量方式进行。可以任选在多个多孔装置中同时测定细胞(例如，连接到相同的阻抗分析仪，与可以接合多于一个多孔装置的装置操作台接合，或者连接单独的阻抗分析仪)，以提高高通量能力。

用来监控细胞-基底阻抗的系统包含一个或多个多孔装置、阻抗分析仪和装置操作台在此处描述且是优选的，但不是本发明方法中必需的。

基因改造细胞可以是对IgE刺激有反应的任何类型的细胞。优选的是，使用肥大细胞，如RBL-2H3大鼠肥大细胞。基因改造细胞的方法是本领域众所周知的，且包括导入指导怀疑的靶蛋白的改变的形式的(例如，蛋白的显性失活形式)表达的表达构建体、导入可以指导能减少或去除靶蛋白表达的反义RNA表达的表达载体和导入可以指导能减少或去除靶蛋白表达的沉默RNA表达的表达载体。也可以在将细胞加入本发明的装置之前或之后，将反义或基因沉默试剂加入到培养的细胞。

优选的是，与基因改造细胞一起也测定未进行基因改造的对照细胞。

IgE可以在加入抗原、变应原或IgE交联剂之前、之后或同时加入。加入孔中的IgE的浓度可以从约10ng/ml到约1μg/ml。任选地，一个包含电极阵列和细胞的装置的孔中不接受IgE以提供对照孔。

用于测定的抗原可以是抗原、变应原或交联剂。加入到孔中的浓度可以从约1ng/ml到约1μg/ml。

本方法可通过使用细胞-基底阻抗技术来评价和定量IgE引起的化合物对细胞的反应，例如，但不限于肥大细胞。阻抗优选在两个或更多个实验阶段进行监控。依赖于试验步骤，阻抗优选在向一个或孔中加入IgE后进行监控，且优选在向一个或孔中加入IgE之前和之后进行监控。优选在加入测试化合物后，加入IgE之前和之后监控阻抗。还可以在加入测试化合物和IgE后，加入抗原之前和之后监控阻抗。在一些优选的实施方案中，可以在向孔中加入测试化合物之后且在加入IgE之前监控阻抗；在向孔中加入IgE之后且在加入抗原、变应原或交联剂之前监控阻抗；和在向孔中加入抗原、变应原或交联剂之后监控阻抗。

优选监控两个或更多个时间点的阻抗。优选的是，监控至少三个时间点的阻抗。优选的是，监控测定中两个或更多阶段的至少三个时间点的阻抗。每一个时间点的阻抗可在一个或多于一个频率进行监控。例如可以比较每一个孔中加入IgE之前和之后，和/或加入抗原之前和之后的阻抗值。可以比较包含基因改造细胞的孔和包含没有基因改造的细胞的孔的阻抗数据。阻抗数据可以用来计算细胞指数，其可以用于进行比较。这种比较可以鉴定影响细胞对IgE刺激的反应的基因。

获得的阻抗监控数据可以用来评价基因操作(如表达击倒(knockdown)、表达敲除或者显性失活表达)对细胞受IgE刺激后形态学改变的影响。影响细胞受IgE刺激后形态学改变的基因操作的鉴定可以用来鉴定在IgE反应中起作用的基因，并从而鉴定基因产物。

以下是本发明确认靶的测定的一个实例：

(1)提供含有用于目标蛋白的显性失活表达的DNA或靶向该目标蛋白的siRNA的细胞。

(2)将细胞转移到阻抗监控系统的装置中，并如上所述监控细胞的附着和生长。另外，可以在装置的孔中直接向细胞加入基因干扰试剂。

(3)将细胞在存在抗原或不存在抗原的条件下用IgE进行刺激，并如前文所述用阻抗监控系统记录细胞反应。这种遗传构建体或试剂干扰存在抗原时细胞对IgE刺激的反应的能力使得能够将构建体或试剂所针对的分子鉴定为潜在的药物发现的靶。

E.4.筛选决定或影响高亲和力Fc(ε)RI交联以及随后肥大细胞活化 的遗传标记的方法

已知宿主的遗传背景决定了对相似抗原的变态反应的类型和强度。本发明同样包括比较不同基因型的细胞对抗原介导的IgE刺激的反应的方法。这种不同基因型的细胞对抗原介导的IgE刺激的反应与不同基因型细胞显示的许多遗传标记的任一种有关。

所述方法包括：a)提供包含至少一个孔的用于细胞-基底阻抗监控的装置，所述孔含有电极阵列；b)连接所述装置和阻抗分析仪；c)向至少一个装置的孔中导入第一种基因型的细胞；d)向至少另一个装置的孔中导入第二种基因型的细胞；e)向包含第一种基因型的细胞的至少一个孔和包含第二种基因型的细胞的至少一个孔中加入IgE；e)向包含第一种基因型的细胞的一个或多个孔和包含第二种基因型的细胞的一个或多个孔中加入至少一种抗原；e)监控包含第一种基因型的细胞的一个或多个孔和包含第二种基因型的细胞一个或多个孔的细胞-基底阻抗；和f)比较包含第一种基因型的细胞的一个或多个孔的细胞-基底阻抗值和包含第二种基因型的细胞的一个或多个孔的细胞-基底阻抗值。

优选的是，本方法进一步包括：使至少一种遗传标记和从监控所述第一种基因型的细胞和所述第二种基因型的细胞获得的细胞-基底阻抗值相关联。

在本发明的方法中，用于细胞-基底阻抗监控的装置是包含基底的装置，所述基底在其表面含有一个或多个电极阵列，每一个电极阵列都由孔形式的流体容器包围。一个或多个电极阵列的每一个都含有两个电极或电极结构，所述两个电极或电极结构具有基本相同的表面积。当连接于阻抗分析仪时，所述装置可以检测一个或多个频率的阻抗变化，所述阻抗变化是由于细胞数、细胞大小、细胞形态学、附着于基底的细胞或附着于基底的细胞的质量的变化引起的。

测量细胞-基底阻抗的装置在母案美国专利申请10/705,447中和本申请中描述。本发明方法中用到的细胞-基底阻抗装置优选包含至少一个围绕装置的电极阵列并对监控的细胞提供不透流体的容器的流体容器。在优选的实施方案中，装置包含至少两个阵列和两个孔形式的容器，其中每一个装置的阵列都由一个孔围绕。更优选的是，用于本申请所述筛选方法中的装置包含至少8个孔(例如，包含16孔或96孔的装置)，其中大部分孔都包含电极阵列，从而所述测定可以以高通量方式进行。可以任选在多个多孔装置中同时测定细胞(例如，连接到相同的阻抗分析仪，与可以接合多于一个多孔装置的装置操作台接合，或者连接单独的阻抗分析仪)，以提高高通量能力。

用来监控细胞-基底阻抗的系统包含一个或多个多孔装置、阻抗分析仪和装置操作台在此处描述且是优选的，但不是本发明方法中必需的。

本发明方法中用到的细胞可以是任何对IgE反应的细胞，但优选的是从不同个体分离出的肥大细胞。除了阻抗监控，还可以对从个体分离的肥大细胞进行遗传标记分析。遗传标记包括，但不限于，SNPs、突变、可变RNA剪接变体、基因表达谱和蛋白表达谱。用从个体分离的细胞进行遗传标记分析的方法是本领域众所周知的。

在测定过程中，IgE可以在加入抗原之前、之后或同时加入。加入孔中的IgE的浓度可以从约10ng/ml到约1μg/ml。任选地，一个包含电极阵列和细胞的装置的孔中不接受IgE以提供对照孔。

用于测定中的抗原可以是抗原、变应原或交联剂。加入到孔中的浓度可以从约1ng/ml到约1μg/ml。抗原可因为它们在群体成员中被鉴定变应原的特征性倾向而被选出。

本方法可通过使用细胞-基底阻抗技术来使遗传标记与细胞的抗原-IgE反应相关联，所述细胞例如，但不限于肥大细胞。阻抗优选在两个或更多个实验阶段进行监控。依赖于试验步骤，阻抗优选在向一个或孔中加入IgE后进行监控，且优选在向一个或孔中加入IgE之前和之后进行监控。优选在加入测试化合物后，加入IgE之前和之后监控阻抗。还可以在加入测试化合物和IgE后，加入抗原之前和之后监控阻抗。在一些优选的实施方案中，可以在向孔中加入测试化合物之后且在加入IgE之前监控阻抗；在向孔中加入IgE之后且在加入抗原、变应原或交联剂之前监控阻抗；和在向孔中加入抗原、变应原或交联剂之后监控阻抗。

优选监控两个或更多个时间点的阻抗。优选的是，监控至少三个时间点的阻抗。优选的是，监控测定中两个或更多阶段的至少三个时间点的阻抗。每一个时间点的阻抗可在一个或多于一个频率进行监控。例如可以比较每一个孔中加入IgE之前和之后，和/或加入抗原之前和之后的阻抗值。可以比较包含基因改造细胞的孔和包含没有基因改造的细胞的孔的阻抗数据。阻抗数据可以用来计算细胞指数，其可以用于进行比较。这种比较可以用于鉴定影响细胞对IgE刺激的反应的遗传标记。

从阻抗监控获得的数据可以用来使指派给细胞的遗传标记与细胞对IgE刺激的反应相关联。鉴定与细胞对IgE的反应性相关联的遗传标记可以用来开发调节IgE反应的治疗策略。

示例性的测定如下：

(1)从两个或更多个能发生变态反应的个体分离肥大细胞。

(2)确定个体的目标遗传标记。

(3)培养这些肥大细胞(或在特定的分化因子存在下让干细胞分化为肥大细胞)。

(4)将细胞转移到阻抗监控装置中并监控细胞生长。

(5)加入IgE(人的)，同时加入或不加变应原。

(6)定量肥大细胞的阻抗反应。

(7)使遗传标记和肥大细胞反应相关联。

可以用本领域公知的标准RFLP和SNP分析、RNA和蛋白表达谱和RNA剪接探测方法进行遗传分析。优选地，使用来自非常大数目的个体的细胞以高通量方式进行测定，以提供遗传标记和IgE反应的强的相关性。

E.4筛选、发现和确认结合IgE受体以引起受体交联的抗原(变应 原)或半抗原化学结构的方法

本发明还提供了鉴定引起变态反应的抗原或半抗原的方法。所述方法包括：a)提供包含至少一个孔的用于细胞-基底阻抗监控的装置，所述孔含有至少一个电极阵列；b)连接所述装置和阻抗分析仪；c)向一个或多个包含电极阵列的装置的孔中导入细胞；d)向一个或多个包含细胞的孔中加入IgE；e)向一个或多个包含细胞的孔中加入至少一种怀疑的抗原或至少一种怀疑的变应原或半变应原；和e)监控一个或多个包含细胞的孔的细胞-基底阻抗。

在本发明的方法中，用于细胞-基底阻抗监控的装置是包含基底的装置，所述基底在其表面含有一个或多个电极阵列，每个电极阵列都由孔形式的流体容器包围。一个或多个电极阵列的每一个都含有两个电极或电极结构，其中所述两个电极或电极结构具有基本相同的表面积，其中，当连接于阻抗分析仪时，所述装置可以检测一个或多个频率的阻抗变化，所述阻抗变化是由于细胞数、细胞大小、细胞形态学、附着于基底的细胞或附着于基底的细胞的质量的变化引起的。

细胞可以是任何对IgE刺激的反应或可能的反应令人感兴趣的细胞。优选的细胞是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或基因改造细胞。在某些优选实施方案中，细胞是哺乳动物来源的。在一些优选实施方案中，细胞是从个体分离的肥大细胞。

IgE可以在加入抗原、变应原或半变应原之前、之后或同时加入。加入到孔中的IgE的浓度可以从约10ng/ml到约1μg/ml。优选的是，一个包含电极阵列和细胞的装置的孔中不接受IgE以提供至少一个对照孔，但这不是本发明所必需的。

抗原、变应原或半变应原可以是已知的或怀疑的抗原、变应原或变应原。加入到孔中的浓度可以从约1ng/ml到约1μg/ml。不同的孔中可以接受不同浓度的抗原、变应原或半变应原。或者为了重复的目的，多个孔可以接受相同浓度的抗原、变应原或交联剂。优选的是，一个包含电极阵列和细胞的装置的孔中不接受抗原、变应原或半变应原以提供至少一个对照孔，但这不是本发明所必需的。

本方法可通过使用细胞-基底阻抗技术来评价和定量肥大细胞由于IgE刺激IgE与变应原交联引起的形态学变化。优选在实验的两个或更多个阶段监控阻抗。例如，在一个实施方案中，在向孔中加入抗原、变应原或半变应原之前和之后监控阻抗。在另一个实施方案中，在向孔中加入IgE之前和之后进一步监控阻抗。在另一个实施方案中，阻抗可以在向孔中加入IgE以及抗原、变应原或半变应原的之前和之后进行监控。阻抗也可以在向孔中加入IgE后且在向孔中加入抗原、变应原或半变应原前进行监控，以及在向孔中加入抗原、变应原或半变应原后进行监控。在一些优选实施方案中，阻抗在向孔中加入IgE前进行监控，在向孔中加入IgE后且在向孔中加入抗原、变应原或半变应原前进行监控，以及在向孔中加入抗原、变应原或半变应原后进行监控。

可以监控两个或更多个时间点的阻抗。优选的是，监控至少三个时间点的阻抗。优选的是，监控测定的两个或更多阶段的至少三个时间点的阻抗。每一个时间点的阻抗可以在一个或多于一个频率进行监控。获得的阻抗监控数据可以用来评价由IgE刺激引起的细胞的形态学变化。例如可以比较每个孔中加入IgE之前和之后，和/或加入抗原、变应原或半变应原之前和之后的阻抗。可以比较接受IgE的孔和没有接受IgE的对照孔的阻抗数据。可以比较接受抗原、变应原或半变应原的孔和没有接受抗原、变应原或交联剂的对照孔的阻抗数据。阻抗数据可以用来计算细胞指数，其可以用于进行比较。

示例性规程如下：

(1)将肥大细胞接种到阻抗监控装置的孔中。

(2)在一段给定量时间内用阻抗监控系统电子地监控细胞。

(3)向细胞加入对变应原或半变应原特异性的IgE。

(4)用本系统监控细胞的反应。

(5)经过预定的时间增加后，加入对步骤(3)中IgE特异的变应原或半变应原。

(6)继续用本系统监控细胞的反应。

实施例1

作为实例，我们在此描述使用本发明的细胞-基底阻抗监控系统测量和监控RBL-2H3细胞(ATCC)在存在或不存在抗原时由于IgE-介导的刺激引起的形态学变化。细胞-基底阻抗监控系统具有可接合6个16X装置的装置操作台，如图4所示。其还具有阻抗分析仪，及指导阻抗测量并记录和分析阻抗数据的软件。

以20,000个细胞/孔将RBL-2H3细胞接种到16X装置的室中(如图2所示)，并用细胞-基底监控系统实时监控细胞在37℃组织培养箱中的附着和生长。22小时后，加入小鼠单克隆抗二硝基苯基(DNP)抗体(Clone SPE-7，Sigma)，终浓度为1μg/ml。加入非特异的小鼠IgG作为对照，终浓度1μg/ml。将装置放回到培养箱并再继续进行记录。在IgE刺激24后小时将室内的培养基吸出，并向细胞加入150μl新鲜培养基。再继续记录1小时，然后加入DNP-清蛋白(Sigma)，终浓度1μg/ml。继续记录另外4小时。

作为模型系统，RBL-2H3肥大细胞被广泛用于研究由IgE-介导的结合并刺激膜上高亲和力Fc(ε)RI受体引发的信号传导通路。肥大细胞的脱粒伴随着形态学的明显变化，所述变化涉及到肌动蛋白细胞骨架(Pfeiffer等人，J Cell Biol.1985Dec；101(6)：2145-55.)。即使没有抗原的交联，IgE与Fc(ε)RI的结合也导致剂量依赖性的脱粒和形态学变化(Oka等人，Am J Physiol Cell Physiol.2003Sep 17)。如图13所示，这种IgE-介导的剂量依赖性的现象也可用阻抗系统进行观察。在22小时，紧在施用IgE后观察到细胞指数迹线有急剧的移动。引起改变的IgE浓度的信号持续约6小时。这种动力学变化和用显微镜观察到的形态学变化以及用酶测定检测到的脱粒一致。重要的是在具有IgG的孔中，没有发生这种迹线的移动，从而说明了这种反应是具有IgE特异性的。记录的峰的幅度依赖于用于刺激细胞的IgE的浓度。引起改变的IgE浓度的信号持续约6小时。

一旦RBL-2H3肥大细胞被IgE敏化，那么通过使用能够产生IgE的抗原就可以引起进一步的脱粒和肌动蛋白介导的形态学变化。这已经用免疫荧光显微镜在RBL-2H3细胞内观察到，表现为广泛的膜变皱和细胞顶表面层形足板的形成。抗原介导的IgE-依赖性的肥大细胞脱粒和形态学动态现象也可以用细胞-阻抗监控系统进行监控和测量。加入IgE后20小时，除去培养基并用新鲜培养基替代。培养基的改变同样会引起信号中瞬时的非特异性变化，30分钟后所述信号立即恢复到基线水平。此时加入DNP-清蛋白会引起记录值的急剧移动，其峰出现在约15-20分钟，且约1小时后恢复到基线。在这些条件下，这种信号中移动的持续时间比仅仅IgE刺激时要短很多(3小时比6小时)。

实施例2

以下的实施例是用来说明实时细胞电子传感系统和方法如何用于实时监控IgE-介导的肥大细胞活化。本发明的方法和装置并不限于实施例中描述的那些。实际上，在本发明的范围内，还有其它特殊的方法和设备可用来进行监控IgE-介导的肥大细胞信号传导和活化的测定。

导言

本工作描述了使用细胞-基底阻抗测量对IgE-介导的肥大细胞活化的测定。本方法是基于实时定量由于肥大细胞表面上的IgE-Fc(ε)RI复合物的多价抗原聚集引起的形态学、细胞骨架和细胞粘附的变化的。由于电子测定读出值依赖于形态学、细胞骨架和粘附动力学的变化，这些都是肥大细胞对抗原内在的反应，且是肥大细胞活化程序的基本部分，所以本测定不需要建立报告细胞系或者使用任何其它试剂或细胞操作。由于测定是实时进行的，所以抗原依赖性和非依赖性的对IgE-介导的肥大细胞活化的反应都可以在相同测定中进行监控。本测定易于修改适用于96孔形式，且如此处所述，可用于以高通量方式测定肥大细胞活化的药学抑制剂。

材料和方法

细胞和试剂

RBL-2H3细胞系从美国典型培养物保藏中心(ATCC)购买，并在37℃和5％CO₂维持在含有10％胎牛血清的DMEM中。小鼠单克隆抗二硝基苯基IgE抗体(Clone SPE-7)和DNP-HSA从SigmaAldrich(St.Louis，MO)购买。Src-特异性的抑制剂SU6656、MEK-特异性的抑制剂PD98059和PLC-特异性的抑制剂U73122从Calbiochem(La Jolla，CA)购买。PKC-特异性的抑制剂双吲哚基马来酰亚胺和Syk抑制剂Piceatannol从Sigma购买。罗丹明-鬼笔环肽从Molecular Probes(Eugene，OR)购买。Lab-Tek chamber slides从VWR Scientific购买。

细胞-基底阻抗监控系统

实时细胞-基底阻抗监控系统包括3个组成部分：阻抗分析仪、装置操作台以及一个或多个16X微量滴定板装置。微电极传感器阵列用石印微制造方法安装在玻璃载片上，且将含有电极的载片组装到塑料盘以形成16个含有电极的孔。系统的装置操作台容纳16X微量滴定板装置，且能够电子地开关任何一个孔到用于阻抗测量的传感器(阻抗)分析仪。实际操作中，将具有培养在孔中的细胞的装置置于装置操作台，所述装置操作台位于培养箱的内部。电缆连接装置操作台和传感器(阻抗)分析仪。在阻抗监控系统的软件控制下，阻抗分析仪可以自动选择要进行测量的孔并连续进行阻抗测量。分析仪的阻抗数据被传递到电脑上，并由整合的软件进行分析和处理。

单个孔中电极(电极元件)间测量的阻抗取决于电极的几何性状、孔中的离子浓度以及是否有细胞附着在电极上。在没有细胞的情况下，电极阻抗主要决定于在电极/溶液界面和大量溶液中的离子环境。在存在细胞的情况下，附着在电极传感器表面的细胞会改变电极/溶液界面的局部离子环境，导致阻抗增加。电极上的细胞越多，细胞-电极阻抗越大。另外，阻抗的改变还依赖于细胞的形态学以及细胞附着于电极的程度。

为了基于测量到的细胞-电极阻抗来定量细胞状态，根据下式推导了一个称为细胞指数的参数，

其中R_b(f)和R_细胞(f)分别为没有细胞或有细胞情况下频率依赖性的电极电阻(阻抗的一个成分)。N是测量阻抗所用的频率点的数目。因此，细胞指数是对包含电极的孔中细胞状态的定量测量。在相同的生理条件下，电极上附着更多的细胞导致更大的R_细胞(f)值，从而导致更大的细胞指数值。另外，在孔中存在相同数目的细胞的情况下，细胞状态如形态学的改变将导致细胞指数的改变。例如细胞粘附或细胞扩散的增加将加大细胞电极的接触面积，这将使R_细胞(f)增加，从而细胞指数值也就增加。

荧光显微镜术

将RBL-2H3细胞接种到16孔Lab-Tek chamber slide上，使其附着和扩散6小时。将细胞用终浓度为100ng/ml的抗-DNP IgE或100ng/ml的非特异性小鼠IgG刺激，16小时后，吸出培养基，并用新鲜培养基替代，用100ng/ml的DNP-BSA处理所示的时间，然后用4％多聚甲醛固定。将细胞用PBS洗涤3次，用含有0.2％TX-100的PBS透化并在含0.5％BSA的PBS封闭。接着用罗丹明-鬼笔环肽对细胞染色30分钟，用PBS洗涤3次，并用Nikon E400表面照明荧光显微镜上的tritc滤镜和Nikon ACT软件显现和成像。

2.5.β-氨基己糖苷酶测定

洗涤生长在96孔板上的RBL-2H3细胞并培养于Tyrode缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，130mM NaCl，5mM KCl，1.4mM CaCl2，1mM MgCl2，5.6mM葡萄糖，以及0.1％BSA)，且用100ng/ml的抗-DNP IgE进行刺激，2小时后取出上清液，在含有0.5％TX-100的Tyrode缓冲液裂解细胞单层。用底物4-硝基苯基-2乙酰氨基-2-脱氧-b-D-吡喃型葡糖苷(4-nitrphenyl-2acetamido-2-deoxy-b-D-glucopyranoside)(1mg/mL)测量上清液和细胞单层中的氨基己糖苷酶活性。37℃培养1小时后，通过添加两倍体积的甘氨酸(0.4M，PH 10.7)终止反应。用Molecular Devices ELISA读出器(reader)读取405nm的吸收。

阻抗测定

在16X微量滴定板装置的每孔中接种20,000个RBL-2H3细胞并用阻抗测量系统进行监控。在加入所示终浓度IgE前让细胞附着并扩散5-24小时。连续测量细胞-电极阻抗，推导并记录时间依赖性的细胞指数值。

RBL-2H3肥大细胞活化的阻抗监控

在存在抗原的情况下IgE-介导的RBL-2H3肥大细胞活化将导致信号传导级联的启动，从而导致包含变态反应介质如组胺的分泌小泡的脱粒。另外，通过Fc(ε)RI的IgE-介导的刺激同样引起肌动蛋白细胞骨架的急剧重构(Oliver等人，1997)。由于监控细胞-电极阻抗可以提供关于细胞形态学和粘附参数的信息，所以我们希望能确定在存在抗原时被IgE预先敏化的RBL-2H3肥大细胞的阻抗反应。

将RBL-2H3肥大细胞接种到在每个孔底部整合有微电子传感器阵列的16X微量滴定板装置的表面。让细胞附着于传感器的表面，18小时后用抗-DNP IgE敏化(图14)。大概24小时后向细胞应用终浓度100ng/ml的DNP-BSA，以诱导IgE-结合的Fc(ε)RI受体的寡聚化和诱导肥大细胞活化。使用阻抗监控系统连续监控细胞-电极阻抗测量。如图14所示，DNP-BSA的应用诱导了立即和瞬时的阻抗值的增加，所述阻抗值在应用DNP-BSA的5分钟内是可检测的，在30分钟达到最大值，且在约2.5小时恢复到基线。IgE-介导的肥大细胞活化不仅导致形态学的巨大变化(Pfeiffer等人，1985)，而且还增加整联蛋白介导的细胞粘附(Wyczolkowska等人，1994)，这两者都对使用阻抗监控系统对细胞-电极阻抗的测量有贡献。

肥大细胞活化的阻抗测量与细胞骨架动态和脱粒相关

为了确定IgE-介导的细胞-电极阻抗升高是否与RBL-2H3肥大细胞活化相关，对IgE-介导的形态学变化和介质的释放都进行了监控。

用以上方法且在所示的时间点敏化并激活RBL-2H3肥大细胞，用多聚甲醛固定并用罗丹明-鬼笔环肽染色以显现肌动蛋白细胞骨架(图15A)。如图15A以及前文所述(Pfeiffer等人，1985；O’Luanaigh等人，2002；Powner等人，2002)，DNP-BSA-介导的Fc(ε)RI受体的交联导致时间依赖性的肌动蛋白细胞骨架重构。IgE刺激后最早在2.5分钟细胞就发生广泛的明显变皱，接着形态学发生变化，其导致细胞扩散并生成层形足板。细胞骨架重构的峰出现在IgE刺激后30-45分钟，这与用阻抗监控系统测到的细胞-电极阻抗反应峰正相关。作为对照，RBL-2H3肥大细胞同时用无关的IgG敏化，随后用DNP-BSA进行交联。并没有观察到明显的细胞骨架和形态学变化。

作为RBL-2H3肥大细胞活化的额外标记，对存在抗原交联时IgE刺激引起的β-氨基己糖苷酶活性进行测量。β-氨基己糖苷酶储存于分泌小泡中，且是肥大细胞脱粒的标记。已知抗原介导的IgE-结合的Fc(ε)RI在肥大细胞表面的交联会引起β-氨基己糖苷酶释放到培养基中(Razin等人，1983)。按材料与方法部分所述，将RBL-2H3细胞用抗-DNP IgE敏化，通过加入DNP-BSA进行活化，并测量β-氨基己糖苷酶活性。抗原交联导致取决于实验的β-氨基己糖苷酶增加2.5至4倍(图15B)。综上所述，IgE-介导的肥大细胞-电极阻抗的增加与肥大细胞活化特征性的形态学变化和脱粒正相关。因此，细胞-电极阻抗测量可以用作肥大细胞活化的读出值。

RBL-2H3敏化步骤的细胞-基底监控

最近显示高浓度的单体IgE在没有抗原交联的情况下就可以诱导肥大细胞活化(Oka等人，2004)。由此我们希望确定是否只有高浓度的IgE就可以诱导细胞-电极阻抗反应的增加。用从15ng/ml逐渐增加到1μg/ml量的IgE刺激16X微量滴定板细胞-基底阻抗监控装置表面上生长的RBL-2H3肥大细胞，并连续监控其阻抗反应(图16A)。单独的IgE应用引起细胞-电极阻抗反应的剂量依赖性的升高，这与形态学动态和介质释放相关。为确定用于敏化细胞的起始IgE浓度是否影响后面抗原介导的反应，用所示浓度的抗-DNP IgE敏化RBL-2H3细胞，且16小时后与终浓度为100ng/ml的DNP-BSA温育。如图16B所示，DNP-BSA-介导的反应与用于敏化细胞的起始抗-DNPIgE浓度成反比。用1μg/ml抗-DNP IgE进行敏化导致与多价DNP-BSA交联时引起的细胞-电极阻抗反应的增加可以忽略不计，而用15ng/ml抗-DNP IgE进行的敏化导致存在DNP-BSA聚集时引起的细胞-电极(细胞-基底)阻抗明显增加。另外，如果将加入高IgE和DNP-BSA间的时间增量增加到24小时，那么细胞将发生抗原介导的活化。

因此这些实验说明IgE的浓度以及在进行IgE敏化和随后抗原刺激之间的时间选择都是很重要的，且必须考虑。另外这些实验进一步说明了在微电子细胞-基底阻抗传感器阵列上实时监控细胞状态和在任何给定时间点的反应方面的肥大细胞活化时的优越性。

用细胞-基底阻抗监控系统检测的药物对肥大细胞活化的抑制

抗原介导的IgE-结合的Fc(ε)RI的聚集引发信号传导级联，这其中包括了许多信号传导蛋白，如蛋白激酶、蛋白磷酸酶和磷脂酶以及其他活性和功能对于肥大细胞活化不可缺少的信号传导蛋白(Turner和Kinet，1999)。因此我们希望确定可否用肥大细胞-电极阻抗测量来监控药物对这些信号传导蛋白中的一些的抑制作用。

将RBL-2H3细胞接种到16X微量滴定板装置中并用抗-DNP IgE预刺激，与所示剂量的PKC-特异性抑制剂双吲哚基马来酰亚胺温育1小时，接着用100ng/ml DNP-BSA进行处理(图17)。双吲哚基马来酰亚胺对RBL-2H3肥大细胞活化的剂量依赖性抑制可以通过细胞-基底监控系统进行实时监控。也测试了许多其它以下药物试剂，如对Src家族激酶特异性的SU6656、对磷脂酶C特异性的U73122、对Syk酪氨酸激酶特异性的Piceatannol和对MEK特异性的PD98059。计算了这些药物抑制剂在峰反应时的IC-50值并如表I所示。除PD98059的所有抑制剂都剂量依赖性地抑制抗原介导的RBL-2H3肥大细胞的活化。PLC-特异性的抑制剂U73122显示出很强的抑制作用，IC-50值为约1μM。虽然Src和Syk特异性的抑制剂需要较高的浓度(表I)，但它们也能抑制抗原介导的反应。MEK-特异性的抑制剂PD98059对IgE-介导的RBL-2H3反应在测试浓度具有最小的作用。

为了确认抑制剂介导的细胞-电极阻抗反应的消除与肥大细胞活化的抑制相关，测量了存在药物试剂时IgE刺激的RBL-2H3细胞的β-氨基己糖苷酶活性。如图18所示，SU6656、U73122、双吲哚基马来酰亚胺和Piceatannol消除了存在抗原聚集时β-氨基己糖苷酶活性的由抗-DNP IgE介导的刺激，而MEK特异性的抑制剂具有最小作用。这些发现与已经公开的数据一致，从而表明了Src、PLC、PKC和Syk特异性的抑制剂完全阻断了IgE-介导的肥大细胞的脱粒和活化(Oliver等人，1994；Amoui等人，1997；Moriya等人，1997；Tedeschi等人，2000)。总的来说，此处的结果显示在微电极细胞传感器阵列上实时监控IgE-介导的肥大细胞活化提供了估计肥大细胞活化的方便的工具。本测定不需要任何细胞操作，如标记、固定或裂解。通过证明细胞-电极(细胞-基底)阻抗测量和通过肌动蛋白细胞骨架动态和介质释放测量IgE-介导的肥大细胞活化正相关，验证了本测定。另外，以前表征的肥大细胞活化途径的特异性抑制剂抑制肥大细胞活化，如通过细胞-基底阻抗监控系统测量的，这进一步验证了本测定。

化合物	靶	IC50±SD(μM)
			双吲哚基马来酰亚胺	蛋白激酶C	2.9±1.7(N＝3)
SU6656	SRC	5.8±3.5(N＝5)
			U73122	磷酸激酶	0.93±0.6(N＝5)
Piceatannol	Syk	1(N＝1)

表I.由细胞-基底阻抗监控得到的药物试剂抑制肥大细胞活化的IC-50的确定。

讨论

细胞-电极阻抗的读数主要受三个参数影响：接种在微电子阵列上的细胞数、细胞形状和细胞粘附在电极表面的强度。由于分泌颗粒的融合、肌动蛋白细胞骨架的急剧重排以及整联蛋白介导的粘附的增强，从而使IgE-介导的RBL-2H3肥大细胞活化伴随着有效表面积的增加(Pfeiffer等人，1985；Wyczolkowska等人，1994)。与细胞与电极阵列的粘附相互作用增强组合的形态学动态引起抗原依赖性的IgE-介导的肥大细胞电极阻抗值的增加。另外，参与IgE-介导的肥大细胞活化的信号传导蛋白的药物抑制剂以剂量依赖性的方式抑制IgE-介导的肥大细胞活化(图17和表I)。

依据现有对肥大细胞活化的认识，抗原介导的IgE-结合的Fc□RI交联引起基于免疫受体酪氨酸的活化基元(ITAM)中关键酪氨酸被Src家族激酶Lyn磷酸化(Turner和Kinet，1999)。ITAM的磷酸化为Syk蛋白酪氨酸激酶提供停靠位点，所述激酶随后导致其自身的活化及其下游底物如磷脂酶Cγ(PLCγ)的磷酸化。PLCγ催化膜磷脂水解成肌醇1，4，5-三磷酸(IP₃)和二酰甘油(DAG)。IP₃动员在内质网内部贮存的钙，且钙和DAG都引起蛋白激酶C(PKC)家族和其它激酶和信号传导蛋白的普遍活化。IgE-介导的激酶途径的活化最终导致肥大细胞的脱粒和炎症介质的释放。因此，针对Src、Syk、PLCγ和PKC的药物抑制剂会引起剂量依赖性的IgE-介导的肥大细胞活化的抑制，这可以通过细胞-电极阻抗测量进行监控。用这些药物抑制剂处理的肥大细胞的细胞-电极阻抗值与通过β-氨基己糖苷酶活性测量的肥大细胞脱粒相关(图18)。用这些药物抑制剂进一步验证了所述测定，并显示细胞-基底阻抗监控系统可以用来评价肥大细胞的活化。

最新的一系列证据表明IgE单独介导的与肥大细胞的相互作用有重要的生物学功能，这已经超越其仅仅作为肥大细胞敏化剂的作用(Kawakami和Galli，2002)。两个不同的小组已显示在没有抗原介导的聚集时单体IgE的应用会诱导促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和AKT的磷酸化和活化，从而增强肥大细胞的存活(Asai等人，2001；Kalesnikoff等人，2001；Kitaura等人，2003)。但相同的文章也指出单体IgE不会诱导肥大细胞脱粒。相反，另一篇最近公开的报道指出高浓度的单体IgE自身会诱导肥大细胞活化，而无需抗原介导的连接。按作者所说，通过介质释放和肌动蛋白细胞骨架重排测量到的由IgE单独介导的肥大细胞活化与抗原介导的交联引起的肥大细胞活化没有区别(Oka等人，2004)。根据我们的结果，单独应用高浓度的单体IgE也会引起肥大细胞-电极阻抗值的增加，从而表面肥大细胞活化(图16)。然而反应的持续时间比抗原介导的肥大细胞活化要长。虽然抗原非依赖性的和抗原依赖性的肥大细胞活化反应的分子机理还有待阐明，但已经清楚单体IgE单体会引起重要的生物反应。我们也已确定了用于敏化细胞的IgE的起始浓度决定了后面抗原介导的肥大细胞活化的幅度和持续时间。用高浓度的IgE(1μg/ml)进行敏化导致非常低的抗原依赖性的肥大细胞反应，而用低浓度的IgE(15ng/ml)进行敏化导致肥大细胞的反应持续时间更长，幅度更大(图16B)。高浓度IgE-敏化的肥大细胞缺乏明显的抗原介导的肥大细胞反应更可能是由于肥大细胞在受到IgE-介导的活化后没有机会完全再形成其分泌颗粒，且这种结果得到如下事实的支持：增加用1μg/ml IgE进行敏化和交联步骤之间的时间增量，可最终导致抗原介导的肥大细胞的活化。

综上所述，本文介绍的实时和无标记IgE介导的肥大细胞活化测定为制药企业和科研机构的研究人员评估和定量IgE-介导的肥大细胞活化提供了一种崭新而且方便的工具。所述测定对在孔的底部集成有微电子传感器的96X微量滴定板的适用性使其成为进行高通量分析以筛选大化合物库的理想选择。另外，微电子细胞传感器技术通常可用来评估其它受体配体的相互作用。

这里所有引用的文献，包括专利、专利申请和出版物，且包括参考书目中引用的文献都全文引入作为参考。

标题仅为方便读者阅读，并不限制本发明的范围。

参考书目

Abbaa，A.K.and Lichtman，A.H.(2000)Cellular and Molecular Immunology.In.Elseiver Science，p.432-452.

Amon，U.，von Stebut，E.，Subramanian，N.and Wolff，H.H.(1993)CGP 41251，a novelprotein kinese inhibitor with in vitro selectivity for protein kinase C，atronglyinhibits immunological activation of human skin mast cells and human basophils.Pharmacology 47，200-8.

Amoui，M.，Draber，P.and Draberova，L.(1997)Sro family-selective tyrosine kinaseinhibitor，PP1，inhibits both Fc epsilonRI-and Thy-1-mediated activation of ratbasophilic leukemia cells.Eur J Immunol 27，1881-6.

Asai，K.，Kitaura，J.，Kawakami，Y.，Yamagata，N.，Tsai，M.，Carbone，D.P.，Liu，F.T.，Galli，S.J.and Kswakami，T.(2001)Regulation of mast cell survival by IgE.Immunity 14，791-800.

Corry，D.B.and Kheradmand，F.(1999)Indoction and regulation of the IgE response.Nature 402，B18-23.

Demo，S.D.，Masuda，E.，Rossi，A.B.，Throndset B.T.，Gerard，A.L.，Chan，E.H.，Armstrong，R.J.，Fox，B.P.，Lorens，J.B.，Payan，D.G.，Scheller，R.H.and Fisher，J.M.(1999)Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novelflow cytometric annexin-V binding assay.Cytometry 36，340-8.

Dietze，S.C.，Auerswald，E.A.and Fritz，H.(1990)A new，highly sensitive enzymio assayfor human tryptase and its use for identification of tryptase inhibitors.Biol ChemHoppe Seyler 371 Suppl，65-73.

Giaever，L.and Keese，C.R.(1984)Monitoring fibroblast behavior in tissue culture withan applied electric field.Proo Natl A cad Sci U S A 81，3761-4.

Giaever，I.and Keese，C.R.(1986)Use of electric fields to monitor the dynamical aspectof cell behavior in tissue culture.IEEE Trans Biomed Eng 33，242-7.

Giaever，I.and Keese，C.R.(1991)Micromotion of mammalian cells measuredelectrically.Proc Natl Acad Sci U S A 88，7896-900.

Giaever，I.and Keese，C.R.(1993)A morphological biosensor for mammalian cells.Nature 366，591-2.

Gould，H.J.，Sutton，B.J.，Beavil，A.J.，Beavil，R.L.，McCloakey，N.，Coker，H.A.，Fear，D.and Smurthwaite，L.(2003)The biology of IGE and the basis of allergicdisease.Annu Rev Immunol 21，579-628.

Gurish，M.F.and Austen，K.F.(2001)The diverse roles of mast cells.J Exp Med 194，F1-5，

Hamid，Q.，Tulic，M.K.，Liu，M.C.and Moqbel，R.(2003)Inflammatory cells in asthma：mechanisms and implications for therapy.J Allergy Clin Immunol 111，S5-S12；discussion S12-7.

Holgate，S.T.and Broide，D.(2003)New targets for allergic rhinitis --a disease ofcivilization.Nat Rev Drug Discov 2，902-14.

Kalesnikoff，J.，Huber，M.，Lam，V.，Damen，J.E.，Zhang，J.，Siraganian，R.P.andKrystal，G.(2001)Monomeric IgE stimulates signaling pathways in mast cellsthat lead to cytokine production and cell survival.Immunity 14，801-11.

Kawakami，T.and Galli，S.J.(2002)Regulation of mast-cell and basophil function andsurvival by IgE.Nat Rev Immunol 2，773-86.

Kitaura，J.，Song，J.，Tsai，M.，Asai，K.，Maeda-Yamsmoto，M.，Mocsai，A.，Kawakami，Y.，Liu，F.T.，Lowell，C.A.，Barisas，B.G.，Galli，S.J.and Kawakami，T.(2003)Evidence that IgE molecules mediate a spectrum of effects on mast cell survivaland activation via aggregation of the FcepsilonRI.Proo Natl Acad Sci U S A 100，12911-6.

Lavens，S.E.，Proud，D.and Warner，J.A.(1993)A sensitive colorimetric assay for therelease of tryptase from human lung mast cells in vitro.J Immunol Methods 166，93-102.

Lo，C.M.，Keese，C.R.and Giaever，I.(1999)Cell-substrate contact：another factor mayinfluence transepithelial electrical resiatance of cell layers coltured on permeablefilters.Exp Cell Res 250，576-80.

Marone，G.，Genovese，A.，Granata，F.，Forte，V.，Detoraki，A.，de Paulis，A.andTriggiani，M.(2002)Pharmaoological modulation of human mast cells andbasophils.Clin Exp Allergy 32，1682-9.

Moriya，K，Rivera，J.，Odom，S.，Sakuma，Y.，Muramato，K.，Yoshiuchi，T.，Miyamoto，M.and Yamada，K.(1997)ER-27319，an acridone-related compound，inhibitsrelease of antigen-induced allergic mediators from  mast cells by selectiveinhibition of foepsiion receptor I-mediated activation of Syk.Proc Natl Acad SciUSA 94，12539-44.

Noll，T.，Dieckmann，D.，Gibbs，B.F.，Nitschke，M.，Albrecht，C.，Vollrath，I.，Tamaoki，T.，Wolff，H.H.and Amon，U.(1997)Heterogeneity of signal transductioonmechanisms in human basophils and human skin mast cells.II.Effects of 7-O-methyl-UCN-01，NPC 15437 and bryostation 1 and 2，four protein kinase C-modulatory agents，on mediator release.Eiol Signals 6，1-10.

Oka，T.，Hori，M.，Tanaka，A.，Matstuda，H.，Karaki，H.and Ozakd，H.(2004)IgE alone-induced actin assembly modifies calcium signaling and degranulation in RBL-2H3 mast cells.Am J Physiol Cell Physiol 286，C256-63.

Oliver，J.M.，Burg，D.L.，Wilson，B.S.，McLaughlin，J.L.and Geahlen，R.L.(1994)Inhibition of mast cell Fc epsilon R1-mediated signaling and effector function bythe Syk-selective inhibitor，piceatannol.J Biol Chem 269，29697-703.

Oliver，J.M.，Pfeiffer，J.R.and Wilson，B.S.(1997)Regulation and roles of themembrane，cytoskeletal and adbesive reaponses of RBL-2H3 rat tumor mast cellsto Fc epsilon RI crosslinldng.In：M.M.Hamawy(Ed)The High Affinity IgEReceptor FceRI Structure and Function.R.G.Landes，Austin，Texas，p.139-172.

O′Luanaigh，N.，Pardo，R.，Fensome，A.，Allen-Baume，V.，Jones，D.，Holt，M.R.andCockcroft，S.(2002)Continual production of phosphatidio acid by phospholipaseD is essential for antigen-stimulated membrane ruffling in cultured mast cells.Mol Biol Cell 13，3730-46.

Pfeiffer，J.R.，，Seagrave，J.C.，Davis，B.H.，Deanin，G.G.and Oliver，J.M.(1985)Membrane and cytoskeletal changes associated with IgE-mediated serotoninrelease fron rat basophilic leukemia cells.J Cell Biol 101，2145-55.

Powner，D.J.，Hodgkin，M.N.and Wakelam，M.J.(2002)Antigen-stimulated activation ofphospholipase D1b by Racl，ARF6，and PKCalpha in RBL-2H3 cells.Mol BiolCell 13，1252-62.

Razin，E.，Mencia-Huerta，J.M.，Stevens，R.L.，Lewis，R.A.，Liu，F.T.，Corey，E.andAusten，K.F.(1983)IgE-mediated release of leukotriene C4，chondroitin sulfate Eproteoglycan，beta-hexosaminidase，and histamine from cultured bone marrow-derived mouse mast cells.J Exp Med 157，189-201.

Rivera，J.(2002)Molecular adapters in Fo(epsilon)RI signaling and the allergic response.Curr Opin Immunol 14，688-93.

Satomura，K.，Shimizu，S.，Nagato，T.，Komeichi，H.，Osuga，M.，Katsuta，Y.，Aramaki，T.and Omoto，Y.(2002)Establishment of an assay method for human mast cellchymase.Hepatol Res 24，361-367.

Shichijo，M.，Yamamoto，N.，Tsujishita，H.，Kimata，M.，Nagai，H.and Kokubo，T.(2003)Inhibition of syk activity and degranulation of human mast cells byflavonoids.Biol Pharm Bull 26，1685-90.

Smith，T.J.，Wang，H.S.，Hogg，M.G.，Henrikson，R.C.，Keese，C.R.and Giaever，I.(1994)Prostaglandin E2 elicits a morphological change in cultured orbitalfibroblasta from patients with Graves ophthalmopathy.Proc Natl Acad Sci U S A91，5094-8.

Tedeschi，A.，Lorini，M.，Gibelli，S.and Miadoma，A.(2000)Effects of protein kinase Cand phospholipase C inhibitors on IgE-dependent and IgE-independent basophilhistamine relesse.Inflamm Res 49，480-5.

Turner，H.and Kinet，J.P.(1999)Signalling through the high-affinity IgE receptor FcepsilonRI.Nature 402，B24-30.

Wang，H.S.，Keese，C.R.，Giaever，I.and Smith，T.J.(1995)Prostaglandin E2 altershuman orbital fibroblast shape through a mechanism involving the generation ofcyclic adenosine monophosphate.J Clin Endocrinol Metab 80，3553-60.

Wyczolkowska，J.，Dastych，J.，Slusarczyk，A.and Kolago，B.(1994)Relations betweenFc epsilon RI crosslinking-induced mast cell activation and adhesion tofibronectin.J Physiol Pharmacol 45，501-16.

Yamamoto，N.，Takeshita，K.，Shichijo，M.，Kokubo，T.，Sato，M.，Nakashima，K.，Ishimori，M.，Nagai，H.，Li，Y.F.，Yura，T.and Bacon，K.B.(2003)The orallyavailable spleen tyrosine kinase inhibitor 2-[7(3，4-dimethoxyphenyl)-imidazo[1，2-c]pyrimidin-5-ylamino]micotinamide dihydrochloride(BAY 61-3606)blocks antigen-induced airway inflammation in rodents，J Pharmacol ExpTher 306，1174-81.

Claims (71)

1.一种监控细胞-基底阻抗的装置，其包括：

a)绝缘的基底；

b)两个或更多个安装于基底上的电极阵列，其中所述两个或更多个电极阵列的每一个都包括两个电极结构；和

c)至少两个连接垫，每个连接垫都位于所述基底的边缘，其中，对于所述两个或更多个电极阵列的每一个，所述两个电极结构的每一个都包含多个电极元件，且所述至少两个电极阵列的每一个的所述两个电极结构的第一个连接于所述至少两个连接垫中的一个，而所述至少两个电极阵列的每一个的所述两个电极结构的第二个连接于所述至少两个连接垫中的另一个；另外，其中，每一个电极阵列在整个阵列上的电极电阻分布是均匀的；另外，其中，所述两个或更多个电极阵列的至少两个是可单独寻址的；且另外，其中，所述基底有适于细胞附着或生长的表面；其中所述细胞在所述基底上的附着或生长可引起各个电极阵列中的所述电极结构之间的可被检测的阻抗变化。

2.权利要求1中所述的装置，其中所述两个或更多个电极阵列的任何一个阵列上的第一个位置上的电极电阻与所述任何一个阵列上的第二个位置上的电极电阻的差别不超过30％。

3.权利要求1中所述装置，其中对于所述两个或更多个电极阵列的每一个，所述第一个电极结构和第一条电极总线相连，该电极总线通过至少一个电迹线与所述的至少两个连接垫中的一个相连；且所述第二个电极结构和第二条电极总线相连，该电极总线通过至少一个电迹线与所述的至少两个连接垫中的另一个相连。

4.权利要求3中所述的装置，其中所述两个或更多个电极阵列的至少两个的每一个的一个电极结构和一个共用连接垫相连；另外，其中，对于所述两个或更多个电极阵列的每一个，所述两个电极结构的一个和连接垫相连，该连接垫同时和所述两个或更多个电极阵列中的至少另一个的电极结构相连；而所述两个电极结构的另一个和不与任何其它电极结构相连的连接垫相连。

5.权利要求1中所述的装置，其中所述基底包括玻璃、蓝宝石、硅上生长的二氧化硅外延片或聚合物，且所述基底制作成平坦表面。

6.权利要求5中所述的装置，其中所述两个或更多个电极阵列的每一个的电极元件有相同的宽度；另外，其中所述电极元件的宽度在50微米到300微米之间。

7.权利要求5中所述的装置，其中所述两个或更多个电极阵列的每一个的电极元件是均匀地间隔开的；另外，其中相邻电极元件之间的间距在5微米到30微米之间。

8.权利要求5中所述的装置，其中所述两个或更多个电极阵列包括圆在线上的电极元件。

9.权利要求8中所述的装置，其中对于所述两个或更多个电极阵列的每一个，所述第一条电极总线包含沿所述每一个阵列上至少一部分周边延伸的电极，所述第二条电极总线包含沿所述每一个阵列上至少一部分周边延伸的电极，其中所述第一条电极总线和所述第二条电极总线之间不重叠，另外，其中所述每一个阵列中的相同电极结构中的电极元件和相同电极总线相连。

10.权利要求5中所述的装置，其中所述两个或更多个电极阵列的每一个阵列组织为同心形、正弦形、交指型或城堡型。

11.权利要求3中所述的装置，其中所述至少一条电迹线被绝缘层所覆盖。

12.权利要求3中所述的装置，其中所述至少一条电迹线被放置在基底的第二个面中。

13.权利要求1中所述的装置，进一步包括多个容器，其中每个容器以垂直方向放置于绝缘基底上，另外，其中每个容器形成不透流体的容器，且位于基底上的所述两个或更多个电极阵列的每一个都与不透流体的容器相结合。

14.权利要求13中所述的装置，其中每个容器呈具有相反的开放末端的管状，其一端与基底不透流体的接触；另外，其中容器与基底接触的一端的直径要小于相反一端的直径。

15.权利要求14中所述的装置，其中在放置于基底上的容器末端，一个或多个容器的直径在1mm到20mm之间。

16.权利要求13中所述的装置，其中容器一起形成无底的多孔微量滴定板；另外，其中存在的孔的数目在2到1,536之间。

17.权利要求16中所述的装置，其中小于所有的孔和电极阵列相结合。

18.权利要求16中所述的装置，其中所述两个或更多个电极阵列包含圆在线上元件；另外，其中两条电极总线和所述电极阵列的每一个结合；另外，其中对于每一个电极阵列，第一个电极结构的多个电极元件和所述两条电极总线中的第一条相连，且第二个电极结构的多个电极元件和所述两条电极总线中的第二条相连。

19.权利要求18中所述的装置，其中所述两条电极总线位于所述电极阵列的每一个的周边上；另外，其中和所述电极阵列的每一个相连的所述两条电极总线的每一条通过至少一条电迹线与所述至少两个连接垫中的一个相连；另外，其中所述电极阵列的每一个包含和第一条电极总线相连的包含多个电极元件的第一个电极结构以及和第二条电极总线相连的包含多个电极元件的第二个电极结构，且所述第一条电极总线和所述第二条电极总线和不同的连接垫相连。

20.权利要求19中所述的装置，其中至少两个所述电极阵列中的每一个的第一个电极结构和共用连接垫相连；另外，其中对于所述至少两个电极阵列中的每一个，第一个电极结构和连接垫相连，这个连接垫同时与至少另一个所述电极阵列的电极结构相连，而第二个所述电极结构与不和任何其它的电极阵列的电极结构相连的连接垫相连。

21.权利要求19中的所述的装置，进一步包括至少一个附着在所述基底底面上的印刷电路板。

22.权利要求21中所述的装置，进一步包括与所述的至少两个连接垫和所述至少一个印刷电路板接触的金属夹；进一步包括与至少一个印刷电路板接触的金属连接针，这个连接针可以连接到阻抗分析仪上。

23.权利要求1中所述的装置，进一步包括和所述至少两个连接垫电连接的阻抗分析仪。

24.权利要求18中所述的装置，其中所述的阻抗分析仪可以在1Hz到1MHz之间的频率范围内测量阻抗。

25.一种监控细胞-基底阻抗的系统，其包括：

a)权利要求13中所述的用来监控细胞-基底阻抗的装置，其所述的每个不透流体的容器为与位于基底上的一个电极阵列相结合的一个孔；

b)阻抗分析仪；

c)包含电子电路的装置操作台，所述装置操作台可以接合所述装置，且将所述装置上的所述两个或更多个电极阵列选择性地与所述阻抗分析仪进行连接；和

d)软件程序，其可以用来控制所述装置操作台，且记录和分析从所述阻抗分析仪获得的数据。

26.权利要求25中所述的系统，其中所述装置操作台包含可以接通和断开所述两个或更多个电极阵列的每一个与所述阻抗分析仪之间的连接的电子开关；另外，其中所述软件程序可以指导所述装置操作台在规则或无规则的时间间隔里测量所述两个或更多个电极阵列的一个或多个的阻抗值；另外，其中所述软件程序可以存储所述数据；另外，其中所述阻抗分析仪可以在一个或多个频率下测量阻抗；另外，其中所述系统可以显示所述数据。

27.权利要求25中所述的系统，其中所述软件允许输入并显示实验参数；其中所述软件可以基于从位于所述一个或多个孔中的所述一个或多个电极阵列测量的阻抗值来计算所述多孔板的一个或多个孔里在一个或多个时间点的细胞指数；其中所述软件是可编程的，以指导在选择的时间间隔里所述两个或更多个电极阵列的任何一个的阻抗监控；其中所述系统可以显示所述一个或多个孔在所述一个或多个时间点的所述细胞指数。

28.权利要求25中所述的系统，进一步包含至少一个平台，在系统运行期间可以用来在所述平台上放置所述一个或多个装置。

29.一种监控细胞-基底阻抗的系统，其包括

a)一个或多个权利要求19中所述的装置；

b)阻抗分析仪；

c)包含电子电路的装置操作台，所述装置操作台可以接合所述装置且将所述装置上的所述两个或更多个电极阵列的任何一个选择性地与所述阻抗分析仪进行连接；和

d)软件程序，其可以用来控制所述装置操作台，且记录和分析从所述阻抗分析仪获得的数据。

30.权利要求29中所述的系统，其中所述装置操作台包含可以接通和断开所述两个或更多个电极阵列的每一个与所述阻抗分析仪之间的连接的电子开关；另外，其中所述软件可以指导所述装置在规则或无规则的时间间隔里测量所述两个或更多个电极阵列的一个或多个的阻抗值；另外，其中所述软件程序可以存储所述数据；另外，其中所述系统可以显示所述数据。

31.权利要求29中所述的系统，其中所述软件允许输入并显示实验参数；其中所述软件可以基于从位于所述一个或多个孔中的所述一个或多个电极阵列测量的阻抗值来计算所述多孔板的一个或多个孔里在一个或多个时间点的细胞指数；其中所述软件是可编程的，以指导在选择的时间间隔里所述两个或更多个电极阵列的任何一个的阻抗监控；其中所述系统可以显示所述一个或多个孔在所述一个或多个时间点的所述细胞指数。

32.进行监控细胞-基底阻抗的测定的方法，其包括

提供权利要求25的系统；

向所述系统的至少一个孔中引入细胞；

监控所述至少一个孔中的细胞-基底阻抗；

分析三个或更多个时间点的所述至少一个孔的所述细胞-基底阻抗的变化；

其中所述的三个或更多个时间点中至少有三个时间点的间隔是有规则的。

33.进行监控由一种或多种测试化合物引起的细胞-基底阻抗的测定的方法，其包括

提供权利要求25的系统；

向包含电极阵列的所述系统的一个或多个孔中引入细胞；

向所述一个或多个孔中加入至少一种测试化合物；和

监控三个或更多个时间点的所述一个或多个孔中加入所述至少一种测试化合物前和加入所述至少一种测试化合物后的细胞-基底阻抗。

34.权利要求33中所述的方法，进一步包括向至少一个孔中引入细胞，而不向这个孔加入测试化合物，以生成对照孔。

35.权利要求33中所述的方法，进一步包括分析加入所述至少一种测试化合物之前和之后的时间点的阻抗值，其中所述的分析包括计算细胞指数。

36.权利要求35中所述的方法，其中所述分析可以提供如下信息：细胞增殖、细胞死亡、细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞存活、细胞毒性、细胞形态学、细胞量、细胞质量、化合物的时间依赖性的细胞毒性、IgE-介导的细胞激活或刺激、受体-配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理性变化、中和抗体的存在和量、特异性T-细胞介导的细胞毒性作用、受体-配体结合的存在及亲和力。

37.权利要求36中所述的方法，其中所述的细胞指数可以用作为细胞毒性的指示。

38.进行监控由一种或多种测试化合物引起的细胞-基底阻抗的多个测定的方法，其包括

提供权利要求25的系统；

向所述系统的两个或更多个孔中引入细胞；

向所述系统的所述两个或更多个孔的至少一个孔中加入第一种浓度的测试化合物，向所述系统的所述两个或更多个孔的至少另一个孔中加入第二种浓度的测试化合物；和

监控三个或更多个时间点的所述两个或更多个孔中的细胞-基底阻抗。

39.权利要求38中所述的方法，其中所述三个或更多个时间点的至少一个是在向所述至少一个孔中加入所述第一种浓度的测试化合物之前和在向至少另一个孔中加入所述第二种浓度的测试化合物之前的。

40.权利要求38中所述的方法，其中向两个或更多个孔中引入细胞包括向三个或更多个孔中引入细胞，且所述三个或更多个孔中的一个是对照孔，这个孔中不接受测试化合物。

41.权利要求38中所述的方法，进一步包括分析相同的一种或多种化合物对所述细胞的影响，其中所述分析包括计算细胞指数。

42.权利要求41中所述的方法，其中所述分析可以提供如下信息：细胞增殖、细胞死亡、细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞存活、细胞毒性、细胞形态学、细胞量、细胞质量、化合物的时间依赖性的细胞毒性、IgE-介导的细胞激活或刺激、受体-配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理性变化、中和抗体的存在和量、特异性T-细胞介导的细胞毒性作用、受体-配体结合的存在及亲和力。

43.进行监控由两种或更多种测试化合物引起的细胞-基底阻抗的多个测定的方法，其包括

提供权利要求25的系统；

向所述系统的两个或更多个孔中引入细胞；

向所述系统的所述两个或更多个孔的至少一个孔中加入第一种化合物；

向所述系统的所述两个或更多个孔的至少另一个孔中加入第二种化合物；和

监控所述至少一个包含所述第一种测试化合物的孔和所述至少另一个包含所述第二种化合物的孔中的细胞-基底阻抗，

其中所述监控包括监控三个或更多个时间点的阻抗变化。

44.权利要求43中所述的方法，其中所述三个或更多个时间点的至少一个是在向所述至少一个孔中加入至少一种测试化合物前的。

45.权利要求43中所述的方法，进一步包括分析所述一种或多种化合物对所述细胞的影响。

46.权利要求45中所述的方法，其中所述分析可以提供如下信息：细胞增殖、细胞死亡、细胞粘附、细胞凋亡、细胞分化、细胞存活、细胞毒性、细胞形态学、细胞量、细胞质量、化合物的时间依赖性的细胞毒性、IgE-介导的细胞激活或刺激、受体-配体结合、病毒和细菌毒素介导的细胞病理性变化、中和抗体的存在和量、特异性T-细胞介导的细胞毒性作用、受体-配体结合的存在及亲和力。

47.权利要求45中所述的方法，其中所述分析包括计算细胞指数，其中所述细胞指数被绘成对时间的图。

48.一种监控IgE刺激引起的细胞-基底阻抗的变化的方法，其包括：

提供权利要求25的系统；

向所述系统的一个或多个孔中引入细胞，其中所述一个或多个孔的每一个都包含电极阵列；

向所述系统的一个或多个孔中加入IgE；

向所述系统的一个或多个孔中加入抗原；和

监控所述系统的所述一个或多个孔中至少一个孔的细胞-基底阻抗。

49.权利要求48中所述的方法，其中所述细胞是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或基因改造细胞。

50.权利要求48中所述的方法，其中所述的IgE添加的浓度在10ng/ml到1μg/ml之间。

51.权利要求48的方法，其中所述细胞-基底阻抗是在向所述一个或多个孔中加入所述的IgE后且在向所述一个或多个孔中加入抗原前监控的。

52.权利要求51的方法，其中所述的细胞-基底阻抗是在向所述一个或多个孔中加入所述的IgE之前，在向所述一个或多个孔中加入所述IgE之后且在向所述一个或多个孔中加入抗原之前，和在向所述一个或多个孔中加入所述抗原之后监控的。

53.筛选可以调节细胞对IgE刺激的反应的化合物的方法，其包括：

提供权利要求25的系统；

向所述系统的一个或多个孔中引入细胞；

向所述系统的所述一个或多个孔的至少一个中加入至少一种测试化合物，其中每一个孔都包含电极阵列；

向所述系统的所述一个或多个孔中加入IgE；

向所述系统的所述一个或多个孔中加入抗原；和

监控所述系统的所述一个或多个孔的细胞-基底阻抗；和

分析来自所述一个或多个孔的所述阻抗数据，以估计所述至少一种测试化合物是否可以调节细胞对IgE刺激的反应。

54.权利要求53的方法，其中所述的细胞是肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或基因改造细胞。

55.权利要求53的方法，其中在向所述的一个或多个孔中加入所述IgE之前，向所述一个或多个孔中加入所述的一种或多种测试化合物。

56.权利要求53的方法，其中所述的至少一种测试化合物是可以和IgE结合的化合物或可以与Fc(ε)RI结合的化合物。

57.权利要求53的方法，其中所述的至少一种测试化合物是可以在胞内作用的化合物。

58.权利要求57的方法，其中所述至少一种化合物可以抑制蛋白激酶C、SRC、Syk、磷脂酶或PLC(γ)。

59.权利要求53的方法，其中向所述一个或多个孔的至少两个中加入所述至少一种测试化合物，且其中所述一个或多个孔的至少两个中接受不同浓度的所述至少一种测试化合物。

60.权利要求53的方法，进一步包括记录细胞-基底阻抗值和基于所述细胞基底阻抗值计算所述的至少一种测试化合物的IC50。

61.鉴定调节细胞对IgE刺激反应的靶的方法，其包括：

提供权利要求25的系统；

向所述系统的一个或多个孔中引入细胞，其中所述的细胞是基因改造的，以改变怀疑的靶分子的功能，或降低或消除其表达。

向所述系统的所述一个或多个孔中加入IgE；

向所述系统的所述一个或多个孔中加入抗原；和

监控所述系统的所述一个或多个孔的细胞-基底阻抗，以从所述一个或多个孔获取阻抗数据，且分析所述阻抗数据以鉴定调节细胞对IgE刺激反应的靶。

62.权利要求61的方法，其中所述的细胞是肥大细胞、嗜酸性粒细胞或嗜碱性粒细胞。

63.权利要求61的方法，其中所述的细胞-基底阻抗是在向所述一个或多个孔中加入所述IgE之前，在向所述一个或多个孔中加入所述IgE后且在向所述一个或多个孔中加入抗原之前，和在向所述一个或多个孔中加入所述抗原之后都进行监控的。

64.比较不同基因型细胞对IgE刺激的反应的方法，其包括：

提供权利要求25的系统；

向所述系统的一个或多个孔中引入第一种基因型的细胞，以生成一个或多个第一基因型的细胞孔；

向所述系统的一个或多个孔中引入第二种基因型的细胞，以生成一个或多个第二基因型的细胞孔；

向所述一个或多个第一基因型的细胞孔和所述一个或多个第二基因型的细胞孔中加入IgE；

向所述一个或多个第一基因型的细胞孔和所述一个或多个第二基因型的细胞孔中加入抗原；

监控所述一个或多个第一基因型的细胞孔的至少一个和所述一个或多个第二基因型的细胞孔的至少一个中的细胞-基底阻抗；和

比较所述一个或多个第一基因型的细胞孔的至少一个和所述一个或多个第二基因型的细胞孔的至少一个中的细胞-基底阻抗值。

65.权利要求64的方法，进一步包括将所述细胞-基底阻抗值和从所述第一基因型的细胞和所述第二基因型的细胞获得的分子遗传数据相关联。

66.权利要求65的方法，其中所述的分子遗传数据包括RFLIP数据、SNP数据、DNA标记数据、RNA表达谱数据、蛋白表达谱数据或可变剪接数据。

67.权利要求64的方法，其中所述的抗原是已知的或怀疑的变应原。

68.鉴定可引起变态反应的抗原或半抗原的方法，其包括：

提供权利要求25的系统；

向所述系统的一个或多个孔中引入细胞；

向所述系统的所述一个或多个孔中加入IgE；

向所述系统的所述一个或多个孔的至少一个中加入怀疑是抗原或半抗原的至少一种化合物；

监控所述系统的所述一个或多个孔的至少一个的细胞-基底阻抗，以获取被抗原或半抗原处理的所述细胞的细胞-基底阻抗数据；和

分析所述数据以鉴定抗原或半抗原。

69.权利要求33的方法，其中所述的一个或多个多孔细胞-基底阻抗监控装置放置于培养箱中。

70.权利要求38的方法，其中所述的一个或多个多孔细胞-基底阻抗监控装置放置于培养箱中。

71.权利要求48的方法，其中所述的一个或多个多孔细胞-基底阻抗监控装置放置于培养箱中。

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