CN1464909A

CN1464909A - 细胞诊断方法及该方法所用装置和仪器

Info

Publication number: CN1464909A
Application number: CN02802624A
Authority: CN
Inventors: 冈弘章; 小川龙太
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2001-08-09
Filing date: 2002-08-05
Publication date: 2003-12-31
Also published as: JPWO2003016555A1; WO2003016555A1; US20040033483A1

Abstract

本发明涉及用于诊断细胞的状态和特征的方法，其步骤包含提供用于测定细胞的物理化学特性的反应系统，将包括细胞的细胞膜成分在内的样品置于该反应系统中，将刺激物施加于该样品，获取该样品物理化学特性的指标值，并参照该指标值对该细胞的状态做出诊断。其中参比电极的放置环境或特性不同于测量电极的放置环境或特性，基板包含用于放置样品的贯通孔，所述样品被置于该参比电极和测量电极之间并邻近所述贯通孔。

Description

细胞诊断方法及该方法所用装置和仪器

技术领域

本发明涉及一种用于测定目的细胞状态的细胞诊断方法，同时还涉及该诊断方法中所使用的装置和仪器。

背景技术

按照惯例，已常规使用各种不同的抗体对活检样品或者体液进行染色的方法，以便做出病理诊断。

但是，由于病理学家的经验差异或者由于抗体滴度造成诊断错误等的原故，这些方法会产生不同的诊断结论。而且，这些方法需要花费很长时间。

发明内容

本发明可供解决上述问题，它提供一种通过测量细胞的各物理化学特性的变化进行细胞诊断的方法，可以快而简便地处理大量样品，又不会出现诊断错误。这些物理化学特性是与细胞内的变化有关的。同时本发明还提供该方法中所需的装置和仪器。

本发明涉及一种对细胞状态和特征进行诊断的方法，其步骤包括为测量细胞物理化学特性提供一种反应系统，将混有细胞膜成分的样品放置在该反应系统中，用刺激物作用于样品，获得一个样品物理化学特性的指标值(index)，然后根据这个指标值对细胞状态进行诊断。

该诊断步骤可以包括将所述指标值与对照样本的指标值进行比较。

一般说来，所述刺激物可以选自化学物质、蛋白质、氨基酸、电压脉冲、电流脉冲、电磁波、和激光束等。

本发明涉及用于该反应系统的装置包括放置样品的基板、参比电极及测量电极。参比电极的放置环境或者其特性与测量电极的放置环境或者其特性不同。

一般说来，装置的基板中有一个贯通的孔，以便放置样品；样品被放置在参比电极和测量电极之间，并且与那个孔临近。

一般说来，参比电极的放置环境或者其特性以及测量电极的放置环境或者其特性，分别是放置参比电极和测量电极的区域的容积。而且，测量电极的放置区域的容积一般都比参比电极的小一些。

一般说来，在本方法中，提供的反应系统的步骤包括将足够量的电解液放置在装置中，使得参比电极和测量电极都完全浸在其中，放置步骤包括将样品定位在装置的那个贯通的孔上。浸没参比电极的电解液的量比浸没测量电极的要大些。

一般说来，本装置还包括一个安置在基板中的细胞培养部分，以及一个安置在基板下的抽吸细胞的部分。细胞培养部分由基板和一个分隔构件组成。

一般说来，参比电极位于这个分隔构件的内壁。

一般说来，获得指标值的步骤包括：(a)记录样品发出的一个物理化学信号，将之作为时间序列的信号值；(b)取样这个时间序列的信号值，以得到多组由多个数值组成的提取出来的数据，计算每组数据的标准差；(c)计算这些标准差的平均值；(d)将这个平均值作为指标值。

一般说来，获得指标值的步骤还包括：(a)记录样品发出的一个物理化学信号，将之作为时间序列的信号值；(b)取样这个时间序列的信号值，以得到多组由多个数值组成的提取出来的数据，计算每组数据的标准差；(c)将标准差分入多个类别中，这些类别均是预先以标准差的大小作为单位来确定的，这样我们就得到一个代表着样本物理化学特性的分布曲线；(d)将所得到的分布曲线向正态分布曲线逼近；(e)计算最终得到的正态分布曲线的平均值和半宽度，将此两者作为指标值。

在本方法中，步骤(b)到(e)将被重复数次，被取样的时间序列信号值的数目在每次为获取多个正态分布曲线而进行的重复中都是不同的。指标值从这些正态分布曲线的平均值和半宽度中选择。

在本方法中，可能存在多个用于测量细胞的物理化学特性的反应系统，且在步骤(b)之前，可能还包括将反应系统中的多个样品发出的各个时间序列信号值相加。

在本方法中，在步骤(a)之前，可能还包括同时激发反应系统中的所有样品。

获得指标值的步骤还可能包括：(a)记录样品发出的一个物理化学信号，将之作为时间序列的信号值；(b)取样这个时间序列的信号值，以得到多组由多个数值组成的提取出来的数据，计算每组数据的标准差；(c)将标准差分入多个类别中，这些类别均是预先以标准差的大小作为单位来确定的，这样我们就得到一个代表着样本物理化学特性的分布曲线；(d)将所得到的分布曲线进行曲线逼近拟和分析，分析方法选自指标值递减分析、指标值递增分析、高斯分布、劳伦斯分布、σ分析、多峰分析以及非线性分析；(e)根据经步骤(d)得到的拟和曲线峰值前后的斜率，获得样品的另一个物理化学特性的指标值。

可以从初始数据a中以时间序列的形式多次进行步骤(b)的取样，前者是时间序列信号值中的一个，并且可以在初始数据a之后于预先确定的时间记录的数据b中以时间序列的形式多次进行步骤(b)的取样。

获得指标值的步骤还可能包括：(a)记录样品发出的一个物理化学信号，将其作为时间序列的信号值；(b)取样这个时间序列的信号值，以得到多组由多个数值组成的提取出来的数据，计算每组数据的标准差；(c)对所得的标准差进行取样，以得到多组由多个数值组成的提取出来的标准差，计算每组标准差的平均值；(d)当时间序列信号值的平均值达到一个预先设定的阈值时，根据达到该阈值的时间得到另一个样品的物理化学特性的指标值。

一般说来，步骤(a)可以在标准化学物质和待测化学物质的存在下进行，这种标准化学物质有着对样品已知的作用；变化标准化学物质和待测化学物质的浓度，重复步骤(b)到(e)；诊断步骤还可以包括在标准化学物质存在下和在待测化学物质存在下得到的两个指标值的比较。

本发明还涉及细胞诊断仪器，其包括一个反应系统，这个反应系统包括细胞诊断装置以及为了测定样品物理化学特性的方法。

本发明还与细胞诊断分析芯片相关，它包括一个放置样品的基板，还有其上细胞的细胞膜成分，一个参比电极，一个测量电极。所述基板具有a.组织粉碎部分；b.细胞培养部分；c.传感器部分；d.刺激物作用部分；e.信号放大部分；f.信号处理部分；g.数据显示部分；h.控制面板部分，这样就可以显示样品的状态。

其中的a.组织粉碎部分包含一个直径1-100μm的微滤器。

其中的b.细胞培养部分需要有温控装置。

其中的b.细胞培养部分还需要有湿度控制装置。

温度控制的装置可以使用Peltier设备或者是IH加热器。

附图说明

图1是本发明的一个实施方案中的细胞诊断装置的示意图。图1中的数字分别代表以下构件：1：细胞诊断装置；2：SOI基板；3：装置壁；4：测量电极；5：培养溶液；6：下陷槽；7：贯通孔；8：参比电极。

图2是本发明的另一个实施方案中的细胞诊断装置的示意图。图2中的数字分别代表以下构件：10：细胞诊断装置；4：测量电极；5：培养溶液；6：下陷槽；7：贯通孔；12：硅层；13：SiO₂(二氧化硅)层；14：基板支持物；19：样品。

图3是本发明的另一个实施方案中的细胞诊断装置的示意图。图3中的数字分别代表以下构件：5：培养溶液；13：SiO₂(二氧化硅)层；31：间隔部分；35：抽吸管道附件；37：细胞抽吸系统管道。

图4是本发明的一个实施方案的细胞诊断仪器的结构示意图。图4中的数字分别代表以下构件：101：信号源；102：单位标准差计算部分；103：正态分布曲线拟和部分；104：刺激物产生部分；105：平均值计算部分；106：平均值和半宽度计算部分；107：信号加和部分；108：特征计算部分；109：特征分类部分；110：数据显示部分。

图5是本发明的另一个实施方案中的细胞诊断仪器的结构示意图。图5中的数字所代表的构件与图4中的一致。

图6是本发明的另一个实施方案中的细胞诊断仪器的结构示意图。图6中的数字分别代表以下构件：101：信号源；102：单位标准差计算部分；103：正态分布曲线拟和部分；106：平均值和半宽度计算部分；109：特征分类部分；111：样品编号分类部分。

图7是本发明的另一个实施方案中的细胞诊断仪器的结构示意图。图7中的数字分别代表以下构件：101：信号源；103：正态分布曲线拟和部分；104：信号产生部分；106：平均值和半宽度计算部分；109：特征分类部分；110：数据显示部分。

图8的组方图显示的是正常细胞和包括从大鼠胃底获得的癌症细胞在内的细胞的碳酰胆碱(carbachol)浓度依赖反应，测定使用了本发明的一个实施方案中的细胞诊断装置。

图9的组方图显示的是正常细胞和包括从大鼠胃底获得的癌症细胞在内的细胞在碳酰胆碱作用之前和之后的测定结果，测定使用了本发明的另一个实施方案中的细胞诊断装置。

图10的组方图显示的是大鼠正常胃底细胞及大鼠胃底癌症细胞对200赫兹电压脉冲的反应，测定使用了本发明的一个实施方案中的细胞诊断仪器。

图11的组方图显示的是大鼠正常胃底细胞来源的细胞膜成分及大鼠胃底癌症细胞来源的细胞膜成分对200赫兹电压脉冲的反应，测定使用了本发明的一个实施方案中的细胞诊断仪器。

图12是一个示意图，显示的是本发明的实施方案中的细胞诊断分析芯片。在这个细胞诊断分析芯片中，a.组织粉碎部分、b.细胞培养部分、c.传感器部分、d.刺激物作用部分、e.信号放大部分、f.数据处理部分、g.数据显示部分以及h.控制面板部分都在细胞诊断装置的基板中予以提供，这样就可以显示样品的状态。图12中的数字分别代表以下构件：201：样品入口；202：细胞裂解部分；203：细胞培养部分和传感器部分；204：刺激物作用部分；205：信号放大部分；206：信号处理部分；207：数据显示部分；208：控制面板部分。

具体实施方式

本发明的细胞诊断的方法，包括以下步骤：提供一个用于测定细胞物理化学特性的反应系统；在该反应系统中放入细胞或者细胞膜成分，即样品；对该样品进行刺激；获取该样品的物理化学特性的指标值，并根据该指标值诊断或者描述该细胞的状态。

放置在反应系统中的细胞可以是组织样品，也可以是分离的、游离的细胞或者是混合的细胞。

作为刺激物，可以是物理刺激(如电压脉冲、电流脉冲、电磁波或者激光)，也可以是化学刺激(如与药物的接触)，或者其他很多方式。

本发明的相关装置是用于细胞诊断方法的一个反应系统。这个装置包括放置样品的基板，样品可以是细胞或者细胞膜成分，以及参比电极和测量电极，其特征是参比电极的放置环境或者其特性与测量电极的放置环境或者其特性不同。

基板包括一个贯穿的孔，样品就放在那里，参比电极和测量电极就安置在这个孔的附近，贯穿的孔插在参比电极和测量电极之间。

至于基板所用的材料，可以使用任何一种半导体、绝缘体、无机材料、有机材料等，如：硅、硅氧化物、绝缘体衬底硅(silicon-on-insulator，以下称为SOI)、塑料、橡胶、聚合物膜。其中，优选使用SOI和聚合物膜，更优选是使用多孔聚合物膜。基板厚度一般在1到10000μm之间，优选在1到100μm之间，更优选在5到10μm之间。

上述放置环境或特性的一个例子是参比电极或者测量电极所在区域的容积。测量电极所在的区域容积优选小于参比电极的。在这个例子中，放置参比电极的区域容积至少是测量电极的5倍，优选是10倍。

典型地，装置应包括在基板之上的细胞培养部分，以及基板之下的细胞抽吸部分。细胞培养部分可以是由基板和一个分隔构件组成。在这个例子中，这个分隔构件的形状优选是圆柱形的，但不存在严格的限制。这个分隔构件的材料优选是硅、硅氧化物、塑料、橡胶、或者相类似的材料。这里的术语“传感器部分”是特指除细胞培养部分及细胞抽吸部分以外的装置。

我们将借助图1和图2具体描述本发明。图1是本装置的一个横断面示意图，其示范性地示出这个装置被用做本发明的方法中所使用的反应系统。

细胞诊断装置1包括一个SOI基板2。SOI基板2的上表面上有壁3(细胞培养部分)以容纳样品(细胞或者细胞膜成分)。由金或者其他材料制成的测量电极4位于SOI基板2的下表面，用于探测信号。壁3内盛有大约50μl的培养液5作为电解液。在SOI基板2的贯通孔7中，大约有1μl或者更少的培养液。

壁3由用于盛放培养液的分隔构件(未显示)和SOI基板2组成。壁3内的SOI基板中有下陷槽6，其形状是最适于盛放细胞或者细胞膜成分的。一般说来，下陷槽6的开口直径约为10μm为一个半椭圆形。参比电极8(一般是Ag-AgCl)放在壁3之内，浸在培养液5中。

壁3内有参比电极8，浸有参比电极8的培养液5，下陷槽6，这些共同组成参比电极的放置环境，贯通孔7和其中的培养液共同组成测量电极的放置环境。

下陷槽6的尺寸依样品的不同而变化，并无特别限定，只要下陷槽6可容纳样品。一般说来，下陷槽6的开口直径在10到500μm，其深度一般在1-500μm之间。典型地，下陷槽6的直径在10-100μm之间，其深度一般在2-100μm之间。举个例子，优选的下陷坑的开口直径是20μm，深度是10μm，另一种优选的下陷坑的开口直径是20μm，深度是20μm。同时，贯通孔的尺寸也不做特别限制，只要样品不会穿过这个贯通孔，并能被容纳在下陷坑里就可以。一般说来，贯通孔的直径在1-100μm之间，深度在10-100μm之间。举个例子，优选的贯通孔的直径是5μm，深度为1.5μm。

图1的下半部分显示的为下陷坑的放大的平面图示。

图2是本发明的方法所用的反应系统的另一个示范性装置的示意图。图2中的装置10与图1中的装置1不同，它有着多个下陷槽6及贯通孔7。如图2所示，几个样品19(在图中是椭圆形的)被分别放入不同的下陷槽6。基板12至14由SOI制成。SiO₂(二氧化硅)层13在硅层12之下，支持基板14在SiO₂(二氧化硅)层13之下。测量电极4在基板12-14的背侧表面，其中测量电极4沿SiO₂(二氧化硅)层13和支持基板14的部分表面走行，测量电极4与样品19相接触，或者就在样品19的附近，优选是与样品19的距离在10μm之内。

本发明方法的反应系统所使用的装置中，在测量电极4周围仅需要非常少量的电解液。需要特别指出的是，在基板与放置样品的一面相对的另一个表面(即背面)附近的电解液的量不应超过1-10μl，这其中还应包括充满贯通孔的电解液。

如图1和图2所示，每个测量电极都可以有自己的下陷槽6和贯通孔7，或者每个测量电极也可以有多个下陷槽6和贯通孔7。

图3是个显示细胞抽吸部分的示意图。这个部分可以在使用图2中的装置10进行样品(细胞或者细胞膜成分)物理化学特性测定时选择性使用。图3显示的是一个细胞抽吸系统，包括一个抽吸管道附件35和一个细胞抽吸系统管道37，该系统位于SiO₂(二氧化硅)层13的背面表面，并共同构成基板。抽吸管道附件35由诸如丙烯酸树脂、PMDS、硅橡胶等类似材料制成，构成间隔部分31，后者与细胞抽吸系统管道37相连接，并且与基板中的贯通孔7相呼应。抽吸管道附件35通过硅橡胶或其类似材料贴靠在基板的背侧表面。另外，抽吸管道附件35还可以附着整合在基板上。如图3所示，当测量细胞或者细胞膜成分的物理化学特性时，由于受到从细胞抽吸系统管道37而来的抽吸压力，样品(细胞或者细胞膜成分)紧紧地附着在基板上。在本例中，只要样品(细胞或者细胞膜成分)的物理化学特性能够被测量电极准确地测量到，细胞抽吸部分就不需要完全充满电解液。请注意，在图3中样品(细胞或者细胞膜成分)并没有加以显示，下陷槽和贯穿孔的结构也被简化了。

图4是一个概念性示意图，显示的是本发明装置的一个细胞诊断仪器的结构。这个仪器是用来测定细胞状态的。该仪器包括测量部分(信号源101)(组成装置的一部分)；单位标准差计算部分102，对来自测量部分101的信号进行取样，计算标准差；平均值计算部分105，用于计算所得到的标准差的平均值；特征值计算部分108，用于通过对平均值计算部分105得到并输出的标准差平均值的计算，得到样品(细胞或者细胞膜成分)的物理化学特性值；数据显示部分110，用于显示所得到的物理化学特性值。各部分之间的连接在图4中用虚线或者实线表示。一般而言，单位标准差计算部分102、平均值计算部分105及特征值计算部分108都是为实现上述计算而设计的程序，贮存于与系统相连的计算机硬盘中。而显示数据部分110则就是CRT。

另外，在图4中，标记数字103、104、106、107及109分别代表着正态分布曲线拟和部分，刺激物产生部分，平均值和半宽度计算部分，信号加和部分和活性值分类部分。下面我们将予以详述。

图12是一个示意图，显示的是本发明的实施方案中的细胞诊断分析芯片。这个芯片包括可将样品(诸如细胞或者细胞碎片)放置其上的基板，参比电极和测量电极。在这个基板上，所提供的有样品入口201，细胞裂解部分202，细胞培养部分和传感器部分(此两项在图12中被整合在一起，用203代表)，刺激物作用部分204，信号放大部分205，信号处理部分206，数据显示部分207和控制面板部分208。有了这些组成，就可以实现细胞诊断的一系列步骤并可以显示出结果。

样品从样品入口被注入，经过一个引流连接管，进入到细胞裂解部分202。一般说来细胞裂解部分202是由一个微过滤器组成，其直径为20μm(Millipore公司有售)，将之覆盖在细胞培养部分中的待测样品(如细胞或者细胞膜成分)上。然后，将被覆盖的样品通过引流连接管引入细胞培养部分。细胞培养部分位于传感器(如前所述的)之上，后者包括参比电极和测量电极。利用控制面板208的控制，使用激发部分204在传感器中激发被引入的样品，这样，就能产生一个信号，也就是这个样品的物理化学特性的指标值。

典型地，细胞培养部分包括温度控制器，以保证样品处在激活状态。另外，还需要一个湿度控制器。温度控制的装置可以使用Peltier装置、IH加热器或者其他类似仪器。所产生的信号，被信号放大部分205放大，然后再由信号处理部分206进行处理，最后传入数据显示部分207，这里我们就能够看到处理后的结果了。注意，用于构成上述各构件以及构成各构件之间的连接物的元件，可以使用本领域技术人员已知的元件，在此我们就不再加以详述。另外，根据图12中所示的例子，细胞诊断分析芯片包括四个流水线，每个都有上述各构件组成，可以实现上述一系列的操作步骤。而且流水线的数目是不限的。

本发明方法、装置以及细胞诊断用仪器，提供了一种新的进行细胞诊断的方法。这种方法所用仪器及装置简单，可以提取到普通细胞外方法无法得到的信号。

本发明的细胞诊断方法不需要抗体，所以，也不需要使用抗体的方法中必需的染色步骤。因此，由于抗体滴度问题所造成的诊断错误也就不会发生。本发明的细胞诊断方法是通过测量细胞或者其膜碎片的物理化学特性来测知待诊断的目的细胞内的变化的。可以同时处理大量样品，且速度快，处理可以实现自动化。

本发明的细胞诊断方法一般说来是处理数字信号(时间序列信号值)的，这些信号都是在测定细胞或其膜碎片的物理化学特性的指标值的步骤中以预先确定的取样速度取样得到的，这样就可以在对细胞及其膜碎片的物理化学特性进行提取、测量、分类时明确地与噪音信号相区别。

本发明的细胞诊断装置及仪器不需要专门的控制仪器，仅需将样品放在基板上，不需要在样品和基板间制造一个高阻抗层(gigaseal)，这就可以用很短的时间对样品(细胞或者细胞膜成分)的细胞外电位进行测量。

使用本发明的装置，就可以通过改变测量电极或者参比电极的放置环境，来测量细胞或者细胞碎片的物理化学特性，而不需要在样品和基板间制造一个高阻抗层(gigaseal)。实施例

下面将就参照图示介绍几个本发明的特殊实施例。

实施例的目的在于用来描述本发明，而非对其进行限制。(实施例1)

本例中使用的细胞诊断仪器的结构组成示意图见图4，该仪器包括图3中所示的装置，后者在这里用于测量部分(信号源)101。来自大鼠胃底的正常细胞和肿瘤细胞作为样品。我们使用该仪器来测定化学物质碳酰胆碱对这些样品的作用。

化学物质碳酰胆碱是一种神经递质乙酰胆碱的类似物。将碳酰胆碱(Sigma生产)溶于林格氏液(Krebs Ringer)中，浓度分别是0、0.1、0.3、1、3、10、30以及100μM。将每个溶液都分别对来自大鼠胃底的正常细胞和肿瘤细胞进行处理，这些不同浓度的溶液可用于测量电信号。使用图3中所示的细胞诊断装置的测量部分(信号源)101，给每个不同浓度的碳酰胆碱溶液测定10秒的时间序列信号值，每隔100ms取样一次，以获得时间序列数据，接着计算取样数据的标准差。图8所示为用标准差的平均值所做的图。在图8中，黑色圆圈代表从肿瘤细胞得到的数据，白色圆圈代表从正常细胞得到的数据。

如图8所示，可以肯定，无论是正常细胞还是肿瘤细胞，碳酰胆碱的浓度越高，100ms间隔的标准差平均值就越高。这表明来自大鼠胃底细胞的离子通道的活化对碳酰胆碱的浓度有依赖性。

如图8所示，与正常细胞相比，从肿瘤细胞所得到的电信号的标准差较大，表明肿瘤细胞的碳酰胆碱依赖方式可能与正常细胞不同。这里碳酰胆碱的浓度是1到30μM。因此，本发明的方法和细胞诊断仪器可以用于测量细胞的物理化学特性，并可以用于探知是否存在有肿瘤细胞。(实施例2)

图5是一个示意图，显示的是本发明中用于测定目的细胞状态的细胞诊断仪器的构造。这里的仪器与图4中的相似，只是正态分布曲线拟和部分103、平均值和半宽度计算部分106及特征分类部分109在这里就相当于平均值计算部分105和特征计算部分108的位置。各个部分之间的连接在图5中用虚线或者实线表示。

通过单位标准差计算部分102，正态分布曲线拟和部分103将多个标准差的值分为多个组，单位是预先确定了的标准差宽度。在坐标轴上标注各标准差值，X轴表示组、y轴则表示该组的标准差值的数字。然后将所得的曲线与正态分布曲线拟和。接着，平均值和半宽度计算部分106计算所得的正态分布曲线的平均值和半宽度。特征分类部分109根据所得的平均值和半宽度对物理化学特性进行分类。注意，与图4所示仪器相似，单位标准差计算部分102，正态分布曲线拟和部分103、平均值和半宽度计算部分106及特征分类部分109一般都可以软件程序的形式保留在计算机的硬盘上。显示数据部分110可以是CRT。

仪器的结构示意图如图5所示，它包括图3中所示的装置，作为其测量部分(信号源)，用来测量碳酰胆碱在样品中的变化。这里的样品同例1一样，也是来自大鼠胃底的正常细胞和混有肿瘤细胞的细胞。

用浓度为50μM的碳酰胆碱对来自大鼠胃底的正常细胞及肿瘤细胞进行处理之前和之后，我们可以从测量部分(信号源)101获得相应的信号，接着就可以计算信号的标准差，这与实施例1中的方式相似。正态分布曲线拟和部分103将各标准差绘成图形，如图9所示。

图9(A)中所示，是一个根据时间序列的电信号数据计算得到的标准差值的柱状图，这个时间序列是在正常细胞及肿瘤细胞用碳酰胆碱处理之前的10秒内每隔5毫秒取样一次得到的。图9(B)所示的也是一个根据时间序列的电信号数据计算得到的标准差值的柱状图，但这个时间序列是在正常细胞用碳酰胆碱处理之后的10秒内每隔5毫秒取样一次得到的。图9(C)所示的则是根据肿瘤细胞用碳酰胆碱处理之后的所得数据的相应柱状图。如图9所示，这证实，用碳酰胆碱处理后，每隔5毫秒所得的正常细胞和肿瘤细胞的标准差平均值都有所增高。另外，这还证实，肿瘤细胞的平均值和半宽度值都比正常细胞的大些。因此，本发明的这种方法和细胞诊断仪器可以用来测定细胞的物理化学特性及判断肿瘤细胞的存在与否。(实施例3)

与实施例1相同，使用来自大鼠正常胃底的细胞及患有胃底癌的大鼠的胃底肿瘤细胞作为样品细胞。使用200Hz电脉冲激发样品，接着测量样品所发出的电压信号。结果见图10。然后，取分别来自正常细胞及肿瘤细胞的细胞膜成分作为样品，进行相同的实验。结果见图11。在每个图中，实线代表来自正常细胞样品的结果，虚线代表来自肿瘤细胞样品的结果。

如图10和11所示，无论是用细胞作为样品还是用细胞碎片作为样品，与正常细胞相比，肿瘤细胞中的电压信号的振幅较小。因此，本发明的这种方法和细胞诊断仪器可以用来测定细胞的物理化学特性及判断肿瘤细胞的存在与否。

在本实施例中，没有使用如图4所示的单位标准差值计算部分，而只是比较了电压信号的衰减。当然，如果进行更详细的分析，也可以对不同的频率、电阻抗变化或者电容进行比较。

如上所述，可以看出，使用本发明的方法和细胞诊断仪器来代替传统的免疫染色技术，可以简便的测定细胞或者细胞膜成分的物理化学特性，进而判断细胞的状态。在上面提及的几个实施例中都是在一个反应系统中对多个细胞或者由多个细胞制备而得的细胞膜成分同时进行测定，但对单个细胞进行测量也可以得到相似的结果。

注意，虽然上述实施例采用了图4和图5中所示意的仪器，但实际上具有图6或者图7中所示意的构造的仪器也同样可以使用。

与图5相比，图6所示的仪器还包括样品编号分类部分即标注为111的部分。

图7所示仪器与图5是一样的，只是图7中的仪器包括多个信号源101，信号产生部分104是用于激发信号源101的，信号加和部分107用于对来自信号源101的多个信号进行加和。

工业实用性

本发明提供了一种细胞诊断方法及其使用的装置和仪器，其通过测量由于细胞内的变化所引起的物理化学特性的改变，可轻易地在短时间内实现对大量样品的处理。

Claims

1.一种用于诊断细胞的状态和特征的方法，所述方法包含以下步骤：

为测量所述细胞的物理化学特性提供一个反应系统；

将包括所述细胞的细胞膜成分在内的样品放入所述反应系统内；

对所述样品施加一种刺激物；

获取所述样品的物理化学特性的指标值；并

参照所述指标值对所述细胞的状态作出诊断。

2.权利要求1的方法，其中所述诊断步骤包含将所述指标值与对照样品的物理化学特性的指标值进行比较。

3.权利要求1的方法，其中所述刺激物选自化学物质、蛋白质、氨基酸、电压脉冲、电流脉冲、电磁波、以及激光。

4.用于权利要求1的反应系统的装置，其包含：

放置所述样品的基板；参比电极；和测量电极，其中

所述参比电极的放置环境或特性与所述测量电极的放置环境或特性是不同的。

5.权利要求4的装置，其中所述基板包含用于放置样品的贯通孔；而所述样品被放置于该参比电极和测量电极之间，并置于所述贯通孔附近。

6.权利要求4的装置，其中所述参比电极的放置环境或特性以及所述测量电极的放置环境或特性分别是放置该参比电极和测量电极的区域的容积；而所述测量电极的放置区域的容积小于所述参比电极的放置区域的容积。

7.权利要求1的方法，其中提供所述反应系统的步骤包含将足够量的电解液放置于权利要求5的装置中，使得所述参比电极和测量电极浸没在所述电解液中，而

放置步骤包含将该样品定位于所述装置的贯通孔上，

其中浸没参比电极的电解液的量多于浸没测量电极的电解液的量。

8.权利要求5的装置，其进一步包含一放置于所述基板上方的细胞培养部分，以及一放置于所述基板下方的细胞抽吸部分，其中所述细胞培养部分由一个分隔构件和所述基板构成。

9.权利要求8的装置，其中所述参比电极被放置于该分隔构件的内壁。

10.权利要求1的方法，其中获取所述指标值的步骤包含：

(a)将样品发出的物理化学信号作为时间序列的信号值进行记录；

(b)对该时间序列的信号值进行取样，以得到多组由多个数值组成的提取的数据，并计算每组数据的标准差；

(c)计算所述标准差的平均值；并

(d)将该平均值作为所述的指标值。

11.权利要求1的方法，其中获取所述指标值的步骤包含：

(c)将所述标准差分入多个以预先确定的标准差的大小作为单位的组中，并得到一个代表所述样品的物理化学特性的分布曲线；

(d)将该分布曲线向正态分布曲线逼近；并

(e)计算最终得到的正态分布曲线的平均值和半宽度，并将该平均值和半宽度作为所述的指标值。

12.权利要求11的方法，其中的步骤(b)到(e)被重复多次，在每次重复中被取样的所述时间序列信号值的数目被改变以获取多个正态分布曲线，而所述的指标值选自所述正态分布曲线的平均值和半宽度。

13.权利要求11的方法，其具有多个用于测量细胞的物理化学特性的反应系统，并且在步骤(b)之前，该方法进一步包含加和由置于反应系统中的多个样品所发出的时间序列信号值。

14.权利要求13的方法，其中在步骤(a)之前，该方法进一步包含同时激发置于反应系统中的样品。

15.权利要求1的方法，其中获取所述指标值的步骤包含：

(b)对该时间序列的信号值进行取样，以得到多组由多个数值组成的提取的数据，并计算每组提取的数据的标准差；

(d)将所得到的分布曲线通过选自指标值递减分析、指标值递增分析、高斯分布、劳伦斯分布、σ分析、多峰分析、以及非线性分析的曲线逼近拟和分析进行拟和；以及

(e)根据经步骤(d)得到的拟和曲线峰值前后的斜率，获取所述样品的物理化学特性的指标值。

16.权利要求10的方法，其中的步骤(b)以时间序列的形式自初始数据a进行多次，所述初始数据a是时间序列信号值中的一个，并且该步骤(b)以时间序列的形式自记录于初始数据a之后的预先确定的时间的数据b进行多次。

17.权利要求1的方法，其中获取所述指标值的步骤包含：

(c)对所得的标准差进行取样，以得到多组由多个数值组成的提取的标准差，并计算每组提取的标准差的平均值；并

(d)根据当该时间序列的信号值的平均值达到一个预先确定的阈值的时间而获取该样品的物理化学特性的指标值。

18.权利要求11的方法，其中的步骤(a)在一种对所述样品具有已知作用的标准化学物质和一种待测化学物质存在的情况下进行，并通过改变标准化学物质和待测化学物质的浓度而重复步骤(b)到(e)，并且

其中的诊断步骤进一步包含将在该标准化学物质存在的情况下获取的指标值与在该待测化学物质存在的情况下获取的指标值进行比较。

19.一种细胞诊断仪器，其包含一个反应系统，所述反应系统包含权利要求8中的细胞诊断装置以及用于测定样品的物理化学特性的方法。

20.一种细胞诊断分析芯片，其包含用于放置包括细胞的细胞膜成分在内的样品的基板，一个参比电极，和一个测量电极，

其中所述基板具有a.组织粉碎部分、b.细胞培养部分、c.传感器部分、d.刺激物作用部分、e.信号放大部分、f.信号处理部分、g.数据显示部分、和h.控制面板部分，由此来显示该样品的状态。

21.权利要求20的细胞诊断芯片，其中的a.组织粉碎部分包含一个直径为1-100μm的微滤器。

22.权利要求20的细胞诊断芯片，其中的b.细胞培养部分具有温控措施。

23.权利要求22的细胞诊断芯片，其中的b.细胞培养部分进一步具有湿度控制措施。

24.权利要求22的细胞诊断芯片，其中所述温度控制措施具有Peltier设备或是IH加热器。