CN113804869B - 纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法 - Google Patents

纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法，属于电化学检测技术领域。本发明公开了纳米孔在电化学检测植物基因表达的多肽中的应用，通过在电化学检测分析装置中设置纳米孔，采集所述多肽通过纳米孔前后的电信号，对电信号的幅值，阻滞时间以及信号量等特征进行分析，从而检测多肽的含量、带电性质、二级结构、多肽的长度或分子量等信息。另外本发明还公开了一种电化学检测植物基因表达多肽的方法，充分发挥纳米孔电化学检测装置的低成本、快速、无标记的优点，精准记录不同多肽所引起的微小电流的变化，重复性好，可靠性高。

Description

纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测 方法
技术领域
本发明属于电化学检测技术领域，涉及纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法。
背景技术
植物蛋白是植物性状的体现者，在植物生长发育、组织、分化、抵御外界干扰等生命过程中发挥着极其重要的作用。对于蛋白质的研究，可以更好的了解植物在应对生长发育、环境变化等的调节机制；对形成蛋白的多肽功能段进行研究，则可以对多肽结构与蛋白功能的关系有更加深刻的认识，其中抗褐飞虱抗性基因通过蛋白质直接影响水稻的多个生理过程，从而实现对褐飞虱产生抗病和抗菌的作用。因此对于植物抗性基因与非抗性基因功能多肽进行研究从而实现更深刻的认识是有必要的。
目前对于多肽有大量的检测方法，最常见的方法是核磁共振(Nuclear MagneticResonance，NMR)、X射线晶体学(X-ray Crystallography)以及冷冻电子显微技术(Electron cryo-microscopy,cryo-EM)、质谱(Mass Spectrometry,MS)、红外光谱(Infrared Spectroscopy,IR)，紫外光谱(UV-visible Spectroscopy,UV)，圆二色谱(Circular Dichroism,CD)等，上述这些检测方法均能够对多肽进行检测与分析，但是以上方法在检测过程中对检测过程中的实验环境要求高、实验的周期较长且实验需要涉及到的操作复杂，鉴于上述方法的特点，影响到了对于植物抗性基因与非抗性基因功能多肽进行研究的推广。
由于纳米孔具有的低成本、快速、简单以及无需标记的检测优点，克服了以上检测方式的困难。因此可以尝试将纳米孔结合电化学检测方法用于对植物的抗性基因表达多肽进行检测和分析。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用；本发明的目的之二在于提供一种电化学检测植物抗性基因表达多肽的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1.纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用，所述应用为：将纳米孔设置在电化学检测装置中形成纳米孔电化学检测装置，将多肽置于所述装置中，采集所述多肽样品通过纳米孔前后的电信号，对包括电信号的幅值、阻滞时间或信号量的特征进行分析，从而检测得到多肽样品的含量、带电性质、二级结构、长度或分子量。
优选的，所述纳米孔电化学检测装置包括电极I(1)、电流表(2)、电源(3)、电极Ⅱ(4)、溶液腔室(5)、纳米孔(6)和支撑薄膜(7)，其中电极I(1)、电流表(2)与电源(3)的负极依次相连，电源(3)的正极与电极Ⅱ(4)相连，电极I(1)、电极Ⅱ(4)和支撑薄膜(7)位于溶液腔室(5)中，电极I(1)和电极Ⅱ(4)分别位于支撑薄膜(7)的两侧，纳米孔(6)位于支撑薄膜(7)上形成通道；
所述纳米孔(6)的孔径为1～10nm，所述纳米孔(6)为生物纳米孔、固态纳米孔或针尖纳米孔；
所述支撑薄膜(7)的材料为氮化硅、石墨烯、二硫化钼或特氟龙膜中的任意一种。
进一步优选的，所述纳米孔电化学检测装置中还包括电解液；
所述电解液为碱金属氯化物和三羟甲基氨基甲烷溶于水中形成的基础缓冲溶液或氯代丁基甲基咪唑(BMIM-Cl)和三羟甲基氨基甲烷溶于水中形成的基础缓冲溶液；
所述基础缓冲溶液中碱金属氯化物的浓度为0.1～2M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为1～50mM；
所述基础缓冲溶液中氯代丁基甲基咪唑(BMIM-Cl)的浓度为0.1～2M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为1～50mM。
进一步优选的，所述基础缓冲溶液的pH为3.3～10.0。
进一步优选的，所述碱金属氯化物为氯化钾、氯化锂或氯化钠中的任意一种。
优选的，所述多肽样品包括植物抗性基因表达的多肽和预测所述植物抗性基因表达多肽的三维结构模板蛋白3DEE_A对应的多肽；
所述植物抗性基因为水稻抗褐飞虱抗性基因，
所述水稻抗褐飞虱抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步优选的，所述多肽样品包括水稻抗褐飞虱抗性基因表达的多肽1～12和预测所述多肽1～12的三维结构模板蛋白3DEE_A对应多肽13～24，
。
2.一种电化学检测植物抗性基因表达多肽的方法，所述方法如下：
将待检测多肽样品溶液置于纳米孔电化学检测装置中，加入基础缓冲溶液作为电解液，施加外电场，加入β-环糊精(β-CD)使其在电解液中的浓度为0～50μM，采集待检测多肽样品通过所述纳米孔电化学检测装置中纳米孔前后电信号，对电信号的幅值和阻滞时间特征进行分析，从而检测待检测多肽样品的中多肽的含量、带电性质、二级结构、长度或分子量。
优选的，所述待检测多肽样品包括植物抗性基因表达的多肽和预测所述植物抗性基因表达多肽的三维结构模板蛋白对应的多肽；
所述待检测多肽样品还包括水稻抗褐飞虱抗性基因表达的多肽经过双缩脲反应形成的络合物和预测植物抗性基因表达多肽的三维结构模板蛋白对应的多肽经过双缩脲反应形成的络合物。
进一步优选的，所述双缩脲反应具体为：将所述多肽加入无酶水剂中形成浓度为10～1mM的多肽溶液，以KOH或NaOH的水溶液调节多肽溶液为碱性，加入CuSO4，搅拌反应生成紫红色络合物；
所述KOH或NaOH的水溶液中KOH或NaOH的浓度为0.1g/mL；
当所述多肽的分子量小于700g/mol时，所述多肽和CuSO4的摩尔比为5:2；
当所述多肽的分子量大于等于700g/mol时，所述多肽和CuSO4的摩尔比为1:4。
本发明的有益效果在于：本发明公开了纳米孔在电化学检测植物基因表达的多肽中的应用，通过在电化学检测分析装置中设置纳米孔，采集所述多肽通过纳米孔前后的电信号，对电信号的幅值，阻滞时间以及信号量等特征进行分析，从而检测多肽的含量、带电性质、二级结构、多肽的长度或分子量。本发明中的应用对由植物抗性基因所表达的多肽进行检测，电化学分析装置中采集电化学信号，对抗性基因所表达的多条多肽进行区分，从而实现纳米孔与生物遗传学的交叉应用。另外本发明还公开了一种电化学检测植物基因表达多肽的方法，充分发挥纳米孔电化学检测装置的低成本、快速、无标记的优点，精准记录不同多肽所引起的微小电流的变化，重复性好，可靠性高。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为实施例中采用的纳米孔电化学检测分析装置；
图2为多肽14(SKEWSRLKEGF)的样品在含有不同pH的电解液(不同pH的缓冲溶液，pH分别为3.3和7.5)的纳米孔电化学检测装置中的检测信号，其中a为多肽阻断信号幅值与时间散点图、b为多肽阻断电流时间柱状图、c为多肽阻断信号幅值柱状图；
图3为多肽08(WQPPNN)的样品分别在以基础缓冲液A、基础缓冲液C和基础缓冲液D为电解液的纳米孔电化学检测装置中的阻断信号幅值与时间散点图(a)以及多肽14(SKEWSRLKEGF)和多肽20(FIRQYRYD)的样品在以基础缓冲液D为电解液的纳米孔电化学检测装置中的阻断信号幅值与时间散点图(b)；
图4为24种多肽配制形成的样品溶液置于以基础缓冲液A作为电解液的纳米孔电化学检测分析装置中进行电化学检测，其中a为阻断电流幅值拟合柱状图、b为阻断电流幅值与时间散点图、c为阻断电流时间柱状图；
图5为水稻抗褐飞虱抗性基因表达的水稻抗褐飞虱抗性基因表达的蛋白(SCR)对应的12种不同多肽(1～12)的样品在含有β-环糊精的纳米孔电化学监测分析装置中产生的电流幅值和阻断时间散点图；
图6为预测水稻抗褐飞虱抗性基因表达的12种不同多肽(1～12)对应的三维结构模板蛋白(3DEE_A)对应的12种不同多肽(13～24)的样品在含有β-环糊精的纳米孔电化学监测分析装置中产生的电流幅值和阻断时间散点图；
图7为不同多肽的经过双缩脲反应后形成的样品在纳米孔电化学检测装置中产生的电流幅值散点图；
其中1为电极I、2为电流表、3为电源、4为电极Ⅱ、5为溶液腔室、6为纳米孔、7为支撑薄膜。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
将由水稻抗褐飞虱植物抗性基因Bph32(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：atggcagcgatgatcgggacgctggccctgctcgccgtgggctgctccgtgaccgtggtcctcagccccgcgcacctcgtcttcggcgcccgcgtgagggaggactactactccggcaggacgccggagcggcagatcaacgtcaccatcaccgccaacaacaccagcaagcacgccaaggtgcggtacctgtccatgaagaccgaggtgtggctggacgacaaggactgggttccggtggacctgggcaccgacaacaagacctcgaatcaattccgcacgtggtggcagccgccgaacaactccacgcagttcacggcgagggtcaacgtcctggagacgtatgggctgcctctatcatcatcggctccgcctccgcctccgccgcctccaggtagcagcaacgacaacaagtactacacggttgtgatcaaaacccaggtgcagttcaggtacggccctgctcacacaaggctctacagcatcatcgtcacctgcccctccaacaccaacttatcatcatggggcaacaatgttcctgatgaggaccactattactccatcaacgacgtctgtacctattag)表达，得到不同的多肽(如表1所示)，将表1中所示的不同多肽溶于无酶水中分别形成浓度为100mM(分子量小于700g/mol)和10mM(分子量大于等于700g/mol)的多肽样品溶液，置于-20℃的冰箱中保存备用。
表1由水稻抗褐飞虱植物抗性基因Bph32表达的多肽样品
序号 SCR 分子量 序号 3DEE_A 分子量
1 GTLAL ＜700g/mol 13 ETRG ＜700g/mol
2 GCSVTVVLSPAHL ＞700g/mol 14 SKEWSRLKEGF ＞700g/mol
3 FGA ＜700g/mol 15 ARA ＜700g/mol
4 GRTPERQINV ＞700g/mol 16 PGEFLQYCQS ＞700g/mol
5 NNTSKHAKV RYLSMKTEV ＞700g/mol 17 DGILALMDF EYTQLLAEV ＞700g/mol
6 APP ＜700g/mol 18 GFD ＜700g/mol
7 NKTSN ＜700g/mol 19 KYTPS ＜700g/mol
8 WQPPNN ＞700g/mol 20 FIRQYRYD ＞700g/mol
9 ARV ＜700g/mol 21 QEA ＜700g/mol
10 VLE ＜700g/mol 22 TAL ＜700g/mol
11 TY ＜700g/mol 23 LIWRN ＞700g/mol
12 GLPLS ＜700g/mol 24 YQTL ＜700g/mol
。
实施例1
常用溶液中研究植物抗性基因表达多肽以及其模板多肽的纳米孔检测，具体方案如下：
1、配置溶液：(1)配置基础缓冲溶液：(a)将氯化钾与三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于去离子水中，并调节溶液的pH＝3.3，形成含有氯化钾和三羟甲基氨基甲烷(Tris)的基础缓冲液A(其中氯化钾的浓度为1M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10mM)；(b)将氯化钾与三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于去离子水中，并调节溶液的pH＝7.5，形成含有氯化钾和三羟甲基氨基甲烷(Tris)的基础缓冲液B(其中氯化钾的浓度为1M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10mM)；(c)将氯化锂与三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于去离子水中，并调节pH＝3.3，形成含有氯化锂和三羟甲基氨基甲烷(Tris)的基础缓冲液C(其中氯化锂的浓度为1.0M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10mM)；(d)将氯代丁基甲基咪唑(BMIM-Cl)与三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于去离子水中，并调节pH＝3.3，形成含有氯代丁基甲基咪唑(BMIM-Cl)和三羟甲基氨基甲烷(Tris)的基础缓冲液D(其中氯代丁基甲基咪唑(BMIM-Cl)的浓度为1M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10mM)。以上溶液均使用0.22um过滤器过滤后再使用。
2、准备纳米孔电化学检测分析装置：将设置含有纳米孔6(纳米孔为α-溶血素生物纳米孔)的支撑薄膜7(以特氟龙膜为材料)置于溶液腔室5中，将电极I1、电流表2、电源3的负极依次连接，电源3的正极和电极Ⅱ4连接，其中电极I1和电极Ⅱ4置于溶液腔室5中且分别位于所述支撑薄膜7的两侧，形成纳米孔电化学检测分析装置，如图1所示。
3、检测多肽：(1)将制备的多肽样品溶液加入到上述准备的纳米孔电化学监测分析装置中，分别采用配置的不同基础缓冲液作为电解液，施加外加电压，在电场力的作用下，推动多肽样品溶液中的多肽样品穿过纳米孔，采集电流信号；(2)采用低噪声电流放大器(Axon Axopatch 200B)对步骤(1)中采集的电流信号进行放大，然后分别进行电流信号的幅值和电流阻滞时间特征分析(将采集到的电信号文件通过软件clamfit挑选特征电信号，并利用画图软件对电信号作图分析)，得到相应的多肽样品信号，对各多肽段信号分析比较，实现采用纳米孔对多肽的分析检测，如图2、图3和图4所示。
分别选择上述配制的基础缓冲液A和基础缓冲液B作为纳米孔电化学检测分析装置中的电解液，将多肽14(SKEWSRLKEGF)的样品配制的溶液分别加入，施加电场后记录检测电信号。图2为多肽14(SKEWSRLKEGF)的样品在含有不同pH的电解液(不同pH的缓冲溶液，pH分别为3.3和7.5)的纳米孔电化学检测装置中的检测信号，其中a为多肽阻断信号幅值与时间散点图、b为多肽阻塞电流时间柱状图、c为多肽阻断信号幅值柱状图。从图2可以看出，多肽14(SKEWSRLKEGF)的样品在pH为3.3和7.5的电解液中都可以通过纳米孔电化学检测装置中的纳米孔，但是通过的时间有较大的差异，pH为3.3的电解液中通过的时间较pH为7.5的缓冲液中长。由此说明纳米孔电化学检测装置中电解液的酸性条件可减缓待测多肽样品的通过纳米孔的速率，从而增加纳米孔对多肽样品检测的灵敏度。
分别选取上述配制的基础缓冲液A、基础缓冲液C和基础缓冲液D作为纳米孔电化学检测分析装置中的电解液，分别加入多肽样品08(WQPPNN)、多肽14(SKEWSRLKEGF)和多肽样品20(FIRQYRYD)的样品加入，施加电场后记录检测电信号。图3中a为多肽08(WQPPNN)的样品在含有不同电解液(基础缓冲液A、基础缓冲液C和基础缓冲液D)的纳米孔电化学检测装置中的阻断信号幅值与时间散点图，图3中b为多肽14(SKEWSRLKEGF)和多肽样品20(FIRQYRYD)的样品在基础缓冲液D作为电解液的纳米孔电化学检测分析装置中的阻断信号幅值与时间散点图。从图3可以看出，多肽08(WQPPNN)的样品在以基础缓冲液A、基础缓冲液C和基础缓冲液D为电解液的纳米孔电化学检测装置中通过纳米孔的时间没有特别明显的区别，由此说明pH值相同的不同缓冲液作为纳米孔电化学检测装置的电解液，多肽均能够在外加电场的作用下通过纳米孔，且通过纳米孔的时间并不受检测装置中电解液种类的影响，说明通过对纳米孔电化学检测装置的相关信号进行检测收集，可以达到分析多肽样品的目的；另外多肽14(SKEWSRLKEGF)和多肽20(FIRQYRYD)的样品在含有同样电解液(基础缓冲液D)的纳米孔电化学检测分析装置中的通过纳米孔的时间也没有明显的区别，表明以上检测过程中采用的基础缓冲液D无法得到比以基础缓冲液A作为电解液更好的检测效果，所以可以选择基础缓冲液A作为电解液对表1中24条多肽的样品进行检测。
将表1中的24种多肽配制形成的样品溶液置于以基础缓冲液A作为电解液的纳米孔电化学检测分析装置中进行电化学检测，其检测结果如图4所示，其中a为阻断电流幅值拟合柱状图、b为阻断电流幅值与时间散点图、c为阻断电流时间柱状图。从图4可以看出，在24种多肽样品中，并不是所有的多肽都能够通过纳米孔而产生相应的电流信号，只有6种多肽(GRTPERQINV(04)、NNTSKHAKVRYLSMKTEV(05)、WQPPNN(08)、SKEWSRLKEGF(14)、FIRQYRYD(20)和LIWRN(23))在同样体系的纳米孔电化学检测装置中通过纳米孔，并且具有不同分子量的多肽通过纳米孔的时间与产生的阻塞电流幅值也不相同。由此说明采用纳米孔电化学检测装置测试过程中通过纳米孔的时间从而鉴定多肽样品中多肽的种类以及分子量的范围。
实施例2
修饰纳米孔、改善纳米孔孔径，研究植物抗性基因表达多肽以及其模板多肽的纳米孔检测，具体方案如下，具体方案如下：
1、配置溶液：(a)配置基础缓冲溶液：将氯化钾与三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于去离子水中，并调节溶液的pH＝3.3，形成氯化钾和三羟甲基氨基甲烷(Tris)的基础缓冲液A(其中氯化钾的浓度为1M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10mM)；(b)制备β-环糊精样品溶液：将β-环糊精溶于无酶水中，用0.22um的过滤器过滤，得到浓度为10mM的β-环糊精样品溶液；以上溶液均使用0.22um过滤器过滤后再使用。
2、准备纳米孔电化学检测分析装置：将设置含有纳米孔6(纳米孔为α-溶血素生物纳米孔)的支撑薄膜7(以特氟龙膜为材料)置于溶液腔室5中，将电极I1、电流表2、电源3的负极依次连接，电源3的正极和电极Ⅱ4连接，其中电极I1和电极Ⅱ4置于溶液腔室5中且分别位于所述支撑薄膜7的两侧，形成纳米孔电化学检测分析装置，如图1所示。
3、检测多肽：(1)首先将制备的β-环糊精样品溶液加入上述的纳米孔电化学监测分析装置中，采用配置的基础缓冲液A作为电解液，施加外加电压，在电场力的作用下，推动β-环糊精样品嵌孔，采集电流信号，待电流信号出现概率均匀后加入待测多肽样品，采集电流信号；(2)采用低噪声电流放大器(Axon Axopatch 200B)对步骤(1)中采集的电流信号进行放大，然后分别进行电流信号的幅值和电流阻滞时间特征分析(将采集到的电信号文件通过软件clamfit挑选特征电信号，并利用画图软件对电信号作图分析)，得到相应的多肽样品信号，实现各功能肽段与蛋白功能的分析，如图5和图6所示。
图5为水稻抗褐飞虱抗性基因表达的蛋白(SCR)对应的12种不同多肽(1～12)的样品在含有β-环糊精的纳米孔电化学监测分析装置中产生的电流幅值和阻断时间散点图，图6为水稻抗褐飞虱抗性基因表达的蛋白三维建模模板蛋白(3DEE_A)对应的12种不同多肽(13～24)的样品在含有β-环糊精的纳米孔电化学监测分析装置中产生的电流幅值和阻断时间散点图(其中多肽16和多肽17并不溶于无酶水溶液中，因此在检测中不能产生相应的电流幅值和阻断时间散点图)。从图5和图6的检测结果可以看出，向纳米孔电化学检测装置中添加β-环糊精能够形成β-CD-α-HL纳米孔系统，同样可实现对由植物抗性基因表达的不同多肽进行检测区分，其信号相对于仅β-CD对照组而言，有特征电流信号的产生。
实施例3
络合多肽，增大待测物粒径，研究植物抗性表达多肽及其同源建模模板多肽的纳米孔检测，具体方案如下：
1、配置溶液：(a)配置基础缓冲溶液：将氯化钾与三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶于去离子水中，并调节溶液的pH＝10.0，形成氯化钾和三羟甲基氨基甲烷(Tris)的基础缓冲液E(其中氯化钾的浓度为1M、三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为10mM)；(b)制备双缩脲反应多肽样品：将10uL的0.1g/mL KOH溶液分别加入到上述制备的24种多肽样品溶液中，混匀营造碱性环境，而后加入10uL 0.01g/mL CuSO4溶液，发生双缩脲反应生成不同的紫红色络合物；以上溶液均使用0.22um过滤器过滤后再使用。
2、准备纳米孔电化学检测分析装置：将设置含有纳米孔6(纳米孔为α-溶血素生物纳米孔)的支撑薄膜7(以特氟龙膜为材料)置于溶液腔室5中，将电极I1、电流表2、电源3的负极依次连接，电源3的正极和电极Ⅱ4连接，其中电极I1和电极Ⅱ4置于溶液腔室5中且分别位于所述支撑薄膜7的两侧，形成纳米孔电化学检测分析装置，如图1所示。
3、检测多肽：(1)将发生双缩脲反应后生成的紫红色络合物加入上述的纳米孔电化学监测分析装置中，采用上述配置的基础缓冲液作为电解液，施加外加电压，在电场力的作用下，推动紫红色络合物通过纳米孔，采集电流信号；(2)采用低噪声电流放大器(AxonAxopatch200B)对步骤(1)中采集的电流信号进行放大，然后分别进行电流信号的幅值和电流阻滞时间特征分析(将采集到的电信号文件通过软件clamfit挑选特征电信号，并利用画图软件对电信号作图分析)，得到相应的电流信号，比较不同多肽产生的电流信号发现，多肽经过双缩脲反应形成的产物在纳米电化学检测装置中同样能够得到较好的区分，实现各功能肽段与蛋白功能的分析(如图7所示)。
图7为不同多肽经过双缩脲反应后形成的样品在纳米孔电化学检测装置中得到的电流幅值散点图。通过图7可以看出，将由植物抗性基因表达的多肽首先经过双缩脲反应后形成的样品，再用纳米孔电化学检测装置进行检测，依然能够对相应的多肽样品进行区分和检测。
同样在上述实施案例1～3中基础缓冲溶液中将采用的氯化钾、氯化锂、氯化钠或离子液(BMIM-Cl)中的任意一种，支撑薄膜替换为石墨烯、二氧化钼或氮化硅中的任意一种，纳米孔替换为玻璃纳米孔、固态纳米孔，缓冲溶液氯化物浓度替换为0.1～2M范围内的任意浓度，三羟甲基氨基甲烷(Tris)替换为其它缓冲液，三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度替换为1～50mM范围内的任意浓度，纳米孔采用固态纳米孔(氮化硅，石墨烯、氧化石墨烯或二氧化钼中)、生物纳米孔(α溶血素、Mspa)和针尖纳米孔(石英)，同样采用上述的纳米孔电化学检测装置进行电化学检测，依然能够通过外加电场下通过纳米孔产生的电信号来分析相应的多肽样品信号。
综上所述，本发明公开了纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达的多肽中的应用，通过在电化学检测分析装置中设置纳米孔，采集所述多肽通过纳米孔前后的电信号，对电信号的幅值，阻滞时间以及信号量等特征进行分析，从而检测多肽的含量、带电性质、二级结构、多肽的长度或分子量。本发明中的应用对由植物抗性基因表达的多肽进行检测，电化学分析装置中采集电化学信号，对抗性基因所表达的多条多肽进行区分，从而实现纳米孔与生物遗传学的交叉应用。另外本发明还公开了一种电化学检测植物基因表达多肽的方法，充分发挥纳米孔电化学检测装置的低成本、快速、无标记的优点，精准记录不同多肽所引起的微小电流的变化，重复性好，可靠性高。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 中国科学院重庆绿色智能技术研究院
<120> 纳米孔在电化学检测植物抗性基因表达多肽中的应用及检测方法
<160> 1
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> Natural sequence
<223> 水稻抗褐飞虱植物抗性基因Bph32
<400> 1
atggcagcgatgatcgggacgctggccctgctcgccgtgggctgctccgtgaccgtggtcctcagccccgcgcacctcgtcttcggcgcccgcgtgagggaggactactactccggcaggacgccggagcggcagatcaacgtcaccatcaccgccaacaacaccagcaagcacgccaaggtgcggtacctgtccatgaagaccgaggtgtggctggacgacaaggactgggttccggtggacctgggcaccgacaacaagacctcgaatcaattccgcacgtggtggcagccgccgaacaactccacgcagttcacggcgagggtcaacgtcctggagacgtatgggctgcctctatcatcatcggctccgcctccgcctccgccgcctccaggtagcagcaacgacaacaagtactacacggttgtgatcaaaacccaggtgcagttcaggtacggccctgctcacacaaggctctacagcatcatcgtcacctgcccctccaacaccaacttatcatcatggggcaacaatgttcctgatgaggaccactattactccatcaacgacgtctgtacctattag

Claims (2)

1.一种电化学检测植物抗性基因表达多肽的方法，其特征在于，所述方法如下：
将待检测多肽样品溶液置于纳米孔电化学检测装置中，加入基础缓冲溶液作为电解液，施加外电场，采集待检测多肽样品通过所述纳米孔电化学检测装置中纳米孔前后电信号，对电信号的幅值和阻滞时间特征进行分析，从而检测待检测多肽样品的中多肽的含量、带电性质、二级结构、长度或分子量；
所述纳米孔电化学检测装置中的纳米孔为α-溶血素生物纳米孔；
所述待检测多肽样品包括水稻抗褐飞虱抗性基因表达的多肽经过双缩脲反应形成的络合物和预测植物抗性基因表达多肽的三维结构模板蛋白对应的多肽经过双缩脲反应形成的络合物；
所述待检测多肽样品包括水稻抗褐飞虱抗性基因表达的多肽1～12和预测所述多肽1～12的三维结构模板蛋白3DEE_A对应多肽13～24，所述多肽1～12和所述多肽13～24的氨基酸序列表如下所示：
序号 SCR 序号 3DEE_A 1 GTLAL 13 ETRG 2 GCSVTVVLSPAHL 14 SKEWSRLKEGF 3 FGA 15 ARA 4 GRTPERQINV 16 PGEFLQYCQS 5 NNTSKHAKV RYLSMKTEV 17 DGILALMDF EYTQLLAEV 6 APP 18 GFD 7 NKTSN 19 KYTPS 8 WQPPNN 20 FIRQYRYD 9 ARV 21 QEA 10 VLE 22 TAL 11 TY 23 LIWRN 12 GLPLS 24 YQTL
。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双缩脲反应具体为：将所述多肽加入无酶水剂中形成浓度为10～100mM的多肽溶液，以KOH或NaOH的水溶液调节多肽溶液为碱性，加入CuSO4，搅拌反应生成紫红色络合物；
所述KOH或NaOH的水溶液中KOH或NaOH的浓度为0.1g/mL；
当所述多肽的分子量小于700g/mol时，所述多肽和CuSO4的摩尔比为5:2；
当所述多肽的分子量大于等于700g/mol时，所述多肽和CuSO4的摩尔比为1:4。
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