CN104020204A - 一种用于检测铅的电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种用于检测铅的电化学传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的检测端表面修饰有多壁碳纳米管，多壁碳纳米管上沉积有纳米金粒子，巯基修饰的捕获探针连接在纳米金粒子上，前述电化学传感器还包括适体探针，适体探针与巯基修饰的捕获探针通过互补配对形成双链结构。本发明采用适体探针，可包裹铅离子，从而使适体探针与捕获探针分离，在分离的过程中产生可供检测的电化学信号从而达到检测水体中铅离子含量的目的，具有灵敏度高、选择性好、稳定性好等优势。

Description

一种用于检测铅的电化学传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及电化学传感器技术领域，尤其涉及一种用于检测铅的电化学传感器及其制备方法和应用。

背景技术

目前，测定环境中的污染物的方法主要有色谱法、紫外分光法、同步荧光光谱法、分光光度法、导数光度法、流动注射分析法等。这些方法都存在前处理复杂、耗时长、样品基体效应大、分析周期长等缺陷，对仪器和工作人员的操作水平均具有较高的要求，很难在中小型企业中推广应用。例如：采用分光光度法检测污染物时，由于对底物浊度的要求和光干扰物质的影响，限制了其精确性和使用范围；而采用液相和气相色谱法检测，检测前需要对样品进行分离，分离过程通常需要预处理，操作步骤比较繁琐和耗时，检测仪器相对昂贵，且不便携带，不能进行实时检测。

电化学生物传感器是基于生物有机成分(如酶、抗体、核酸、细胞、微生物等)，对待检物质进行专一的识别，产生的信号经过信号传导器转变为电信号、光信号，进而定量检测出待测物质的一项新技术。运用电化学生物传感器来检测环境中的重金属、病原微生物、有害有机物具有特异性强、检测灵敏度高、检测效率高、成本低廉的特点，因此成为了环境保护工作中的一个研究热点。

目前，科研人员通过利用各种新型材料修饰电化学传感器以提高电化学生物传感器的稳定性、重复性以及结构的可靠性。制作电化学DNA传感器的关键是如何高效地在金上固定DNA探针，并保持其的活性是传感器能够检测的前提。通常DNA探针在金表面固定的方法有通过修饰DNA探针与不修饰DNA探针直接固定两种方法。这些方法均存在固定不牢固、固定中使用各种亲和物质影响DNA的活性、以及容易使用到对环境有害的物质等缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种制作简单、稳定性好、灵敏度高、检测精度高、抗干扰的能力强的电化学传感器，还相应提供一种电化学生物传感器的制备方法，以便通过一种工艺简单、制作迅速的制备方法使固定的DNA探针具有更好的稳定性和高活性的保持；在此基础上，还提供一种前述电化学传感器的应用，能够以简化操作、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性等特点实现对水体中铅的高效检测。

为解决上述技术问题，提供了一种用于检测铅的电化学传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的检测端表面修饰有多壁碳纳米管，多壁碳纳米管上沉积有纳米金粒子，纳米金粒子上连接有巯基修饰的捕获探针。

前述的电化学传感器还包括适体探针，适体探针可与巯基修饰的捕获探针通过互补配对形成双链结构。当电化学传感器用于检测水体中的铅离子时，将适体探针滴加到前述的玻碳电极上，使适体探针与捕获探针发生配对反应形成双螺旋结构，然后将具有适体探针的玻碳电极插入到含有铅离子的水体中，由于铅离子对适体探针的亲和力强于捕获探针，适体探针与捕获探针分离，DNA双螺旋结构发生裂解，从而产生可供检测的电化学信号。

进一步的，巯基修饰的捕获探针优选为具有SEQ ID NO.1前述的核苷酸序列；适体探针优选为具有SEQ ID NO.2前述的核苷酸序列。

进一步的，本发明的电化学传感器还包括信号指示剂，信号指示剂镶嵌在前述巯基修饰的捕获探针与适体探针形成的双链结构中，可以放大电化学信号。信号指示剂优选为亚甲基蓝；亚甲基蓝浓度为0.1～0.5mM时，效果更佳。

作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了上述的用于检测铅的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1、将多壁碳纳米管进行羧化处理得到羧化多壁碳纳米管；

S2、将前述羧化多壁碳纳米管配置成悬浮液，然后滴加到玻碳电极的检测端表面得到多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；

S3、将纳米金粒子沉积在前述多壁碳纳米管修饰的玻碳电极的检测端表面得到纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；

S4、将纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极插入巯基修饰的捕获探针中，前述巯基修饰的捕获探针通过静电吸附在纳米金上；然后插入巯基乙醇溶液中，使巯基乙醇封闭未被吸附的纳米金；

S5、按照捕获探针的氨基酸序列，配置与之互补的适体探针探针溶液，完成电化学传感器的制备。

进一步的，步骤S1中的前述羧化处理步骤为：将多壁碳纳米管浸入过氧化氢与浓硫酸的混合溶液中超声2.5小时以上，然后洗涤至中性、过滤、真空干燥得到前述羧化多壁碳纳米管。前述的过氧化氢与浓硫酸的混合溶液中过氧化氢和浓硫酸的体积比优选为1∶2～4，进一步的优选为1∶3。

进一步的，前述步骤S2中羧化多壁碳纳米管分散在N,N—二甲基甲酰胺中制成悬浮液。

作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种采用前述的电化学传感器或采用前述制备方法制得的电化学传感器在检测铅离子中的应用，包括以下步骤：

将适体探针滴加到电化学传感器的玻碳电极的反应端表面进行充分反应，待反应完成后将待测溶液滴加在玻碳电极表面，待充分反应后接入三电极系统的电解池中检测电流值，根据铅离子的浓度与电流值建立线性回归方程：

Y＝–(7.660±0.363)–(1.035±0.03118)χ

其中，Y为对铅离子检测时的电流平均值，单位为A；χ为待测溶液中铅离子的浓度值的自然对数，单位为M；检测下限为4.3×10^-15M。

进一步的，前述应用方法还包括亚甲基蓝的添加步骤，适体探针在玻碳电极反应端充分反应后，再将亚甲基蓝滴加在玻碳电极反应端表面进行充分反应，待反应完成后再进行待测溶液的检测，可提高电化学传感器的灵敏度。进一步的，电解池中的电解质溶液优选为pH5.0～9.0的Tris-HCl缓冲液。

本发明的创新点在于：

本发明采用多壁碳纳米管和纳米金颗粒修饰玻碳电极，多壁碳纳米管与纳米金颗粒在玻碳电极反应端表面形成复合材料，显著提高了电化学传感器的灵敏度和检测性能。其中多壁碳纳米管因为具有高电子传导性，提供大比表面积，保持生物活性等优点，是一种优秀的生物分子载体和信号传递媒介，可以改善电化学传感器的灵敏度；纳米金颗粒对生物分子有很好的亲和能力和生物相容性，并且沉积在多壁碳纳米管形成了更大的比表面积，为生物分子提供了更多吸附位点，能够显著提高生物传感器和待测溶液间电子的转移速度，快速获得稳定的响应电流。

其次，本发明利用适体探针可与铅离子形成化学结构稳定的G-四聚体巯基的特性，将捕获探针通过巯基吸附在纳米金粒子的位点上，待捕获探针完全吸附在纳米金的位点上后，如果纳米金上还存在为被吸附的位点，则加入巯基乙醇，封闭纳米金粒子上未被巯基吸附的位点。接着加入适体探针，使适体探针与捕获探针进行互补配对形成DNA双螺旋结构，亚甲基蓝镶嵌在DNA双螺旋结构的缝隙中。当被检测的水体中有铅离子存在时，由于铅离子与适体探针的结合力更强，使适体探针与捕获探针分离，DNA双螺旋结构裂解，适体探针便与铅离子形成化学结构稳定的G-四聚体，同时亚甲基蓝从DNA双螺旋结构中分离出来。适体探针和捕获探针在裂解的过程中产生了电流变化，同时亚甲基蓝的分离扩大了电流的变化。由于电流变化的大小与裂解的程度有关，而裂解的程度又与铅离子的浓度有关，本发明根据电流变化的原理制备电化学传感器，可有效检测水体中铅离子的浓度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供的用于检测铅的电化学传感器，综合了多壁碳纳米管、纳米金、亚甲基蓝以及DNA各自的性质，具有高灵敏、快速响应、高检测精度及较强抗干扰性等特性。

(2)本发明提供的一种电化学传感器在检测铅离子中的应用，操作简便，高效，检测成本低，为水体中铅的监测和控制过程提供一种有效的分子生物学检测方法。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例1的电化学传感器的结构及制备流程图。

图2为实施例1的多壁碳纳米管修饰的玻碳电极检测端表面的扫描电镜图。

图3为实施例1的纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极检测端表面的扫描电镜图。

图4为用差分脉冲伏安法检测不同浓度的铅得到的电流变化曲线图。

图5为铅含量与电流变化的线性回归图。

图6为电化学传感器的选择性对比图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售，其中CHI760B电化学系统购于上海辰华仪器公司。

实施例1

参见图1，一种用于检测铅离子的电化学传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极、适体探针和亚甲基蓝。玻碳电极的检测端表面修饰有多壁碳纳米管，多壁碳纳米管上沉积有纳米金粒子，纳米金粒子上连接有巯基修饰的捕获探针。当电化学传感器用于检测铅离子时，适体探针与巯基修饰的捕获探针通过互补配对形成双链结构，亚甲基蓝(浓度为0.1mM)镶嵌在巯基修饰的捕获探针与适体探针形成的双链结构中。

亚甲基蓝浓度还可以为0.1～0.5mM。

在本发明中捕获探针和适体探针可以是任一可形成互补配对的氨基酸序列，为了获得更强的电化学检测信号，实施例1的捕获探针为具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，具体为：

5’-CACCCACCCAC-SH-3’；

适体探针优选为具有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列，具体为：

5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’；

其中适体探针上的3’端的“GTGGGT”与捕获探针5’端的“CACCCA”进行互补配对。

实施例2

实施例1的电化学传感器的制备方法。

将玻碳电极表面抛光，然后用水冲洗玻碳电极表面，再依次用硝酸、丙酮、水进行超声清洗，最后再用浓度为10mM Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl缓冲液中含有1.0M的KCl)冲洗，自然晾干，然后用于电化学传感器的制备，具体的制备方法为：

S1、将多壁碳纳米管进行羧化处理得到羧化多壁碳纳米管；具体步骤为：

将多壁碳纳米管浸入过氧化氢与浓硫酸(浓硫酸的质量分数为98％)的体积比为1∶3的混合溶液中(过氧化氢和浓硫酸的体积比还可以为1∶2～4)，在温度为50℃下超声2.5h(超声时间可以是2.5h以上)，然后分别用超纯水与无水乙醇清洗至中性，抽滤，在温度为60℃中真空干燥24h。

S2、将羧化多壁碳纳米管悬浮液放入N,N-二甲基甲酰胺中制备成浓度为1.0mg/mL的悬浮液，然后将前述悬浮液滴加到玻碳电极的检测端表面，在常温下风干得到多壁碳纳米管修饰的玻碳电极。

S3、采用电化学沉积法将纳米金粒子沉积在前述多壁碳纳米管修饰的玻碳电极检测端表面得到纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极。

前述电化学沉积法中，电沉积法的初始电位为0V，采样间隔为0.1s，沉积时间为60s。

S4、将纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极插入浓度为1.0μM的巯基修饰的捕获探针中(捕获探针为具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列)，捕获探针通过化学反应和静电吸附在纳米金上；然后插入浓度为2.0mM的巯基乙醇溶液中，使巯基乙醇封闭未被吸附的纳米金。

S5、配制与捕获探针的氨基酸序列互补的浓度为1.0μM的适体探针溶液(适体探针为具有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列)和浓度为0.1mM的亚甲基蓝溶液，完成电化学传感器的制备。

分别将S2步骤中制备得到的多壁碳纳米管修饰的玻碳电极和S3步骤中制备得到的纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极进行电镜扫描，扫描结果参见图2、3。

从图2、3中可以看出：玻碳电极上的多壁碳纳米管分散均匀(图2)，金纳米粒子平铺在多壁碳纳米管上(图3)。

实施例3

实施例1的电化学传感器在检测铅离子中的应用，具体的检测方法为：

将适体探针滴加到电化学传感器的玻碳电极的反应端表面，37℃下反应60分钟，然后将浓度为0.1mM的亚甲基蓝(亚甲基蓝浓度可以为0.1～0.5mM)滴在玻碳电极的反应端表面，37℃下反应20分钟；接着分别将铅离子浓度分别为5.0×10^-11M～1.0×10^-14M的待测溶液滴加在玻碳电极表面，反应30分钟之后，接入三电极系统的电解池中，以pH为7.4的Tris-HCl作为电解质溶液，检测电流值。

图4是铅离子浓度分别为0M(a)、1.0×10^-14M(b)、5.0×10^-14M(c)、1.0×10^-13M(d)、5.0×10^-13M(e)、1.0×10^-12M(f)、5.0×10^-12M(g)、1×10^-11M(h)与5.0×10^-11M(i)的待测溶液的差分脉冲伏安曲线(DPV曲线)，图5是铅离子浓度与电流变化的线性回归方程图，从图4和图5中可知，铅离子的浓度与电流值的线性回归方程为：

Y＝–(7.660±0.363)–(1.035±0.03118)χ

其中，Y为对铅离子检测时的电流平均值，单位为A；χ为待测溶液中铅离子的浓度值的自然对数，单位为M；R²＝0.994；检测下限为4.3×10^-15M(检测下限按照按照3倍空白样的标准偏差计算)。

在实施例3中，电解池中的电解质溶液还可以为pH5.0～9.0的Tris-HCl缓冲液；亚甲基蓝溶液制备方法为：取0.007478g亚甲基蓝溶于100mL的超纯水中。

实验例1

为了进一步验证本实施例的电化学传感器及其检测方法的检测效果，现将三组铅离子浓度分别为1×10^-10mol·L^-1、5×10^-12mol·L^-1、1×10¹¹⁵mol·L^-1的待测溶液用实施例1的电化学传感器进行测定(测定方法参照实施例3)，进行回收率实验。

检测步骤：采用实施例1的电化学传感器对待测溶液进行检测。

将适体探针滴加到电化学传感器的玻碳电极的反应端表面，37℃下反应60分钟，然后将浓度为0.1mM的亚甲基蓝滴在玻碳电极的反应端表面，37℃下反应20分钟；接着将铅离子浓度分别为1×10^-10mol·L^-1、5×10^-12mol·L^-1、1×10^-15mol·L^-1的待测溶液滴加在玻碳电极表面，反应30分钟之后，接入20mL三电极系统的电解池中，以pH为7.4的Tris-HCl作为电解质溶液，检测电流值。根据所产生的电流信号的强弱对应待检测环境水样中铅离子的浓度及含量。检测结果如表1所示。

表1：三组环境样品的回收率验证结果

待测样品mol·L-1	a测定浓度mol·L-1	回收率％
			1×10-10	9.620×10-11	96.2
5×10-12	4.985×10-12	99.7
			1×10-15	1.001×10-15	100.1

注：a表示测量的平均浓度。

实验例2

为了验证本实施例的电化学传感器选择性，现将浓度均为1.0×10^-12mo/L^-1的Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、K⁺、Ag⁺与Hg²⁺金属离子待测溶液用实施例1的电化学传感器进行测定(测定方法参照实施例3)。

检测步骤：采用实验例1的电化学传感器对待测溶液进行检测。

将适体探针滴加到电化学传感器的玻碳电极的反应端表面，37℃下反应60分钟，然后将浓度为0.1mM的亚甲基蓝滴在玻碳电极的反应端表面，37℃下反应20分钟；接着分别将浓度均为1.0×10^-12mo/L^-1的Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Al³⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、K⁺、Ag⁺与Hg²⁺的待测溶液滴加在玻碳电极表面，反应30分钟之后，接入20mL三电极系统的电解池中，以pH为7.4的Tris-HCl作为电解质溶液，检测电流值。根据所产生的电流信号的强弱对应待检测溶液中铅离子的浓度及含量。检测结果如图6所示。

上述测定结果表明，本发明灵敏度高，选择性好，稳定性好，能够高效、低成本在线测量铅含量，为水体中铅的监测和控制过程提供了技术支持。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡是本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测铅的电化学传感器，包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，其特征在于，所述玻碳电极的检测端表面修饰有多壁碳纳米管，所述多壁碳纳米管上沉积有纳米金粒子，所述纳米金粒子上连接有巯基修饰的捕获探针，所述电化学传感器还包括适体探针，所述适体探针与所述巯基修饰的捕获探针通过互补配对形成双链结构。

2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述巯基修饰的捕获探针为具有SEQID NO.1所述的核苷酸序列，所述适体探针为具有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器还包括信号指示剂，所述信号指示剂镶嵌在所述捕获探针与适体探针形成的双链结构中。

4.根据权利要求3所述的电化学传感器，其特征在于，所述信号指示剂为亚甲基蓝，所述亚甲基蓝浓度为0.1～0.5mM。

5.一种如权利要求1至4中任意一项所述电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将多壁碳纳米管进行羧化处理得到羧化多壁碳纳米管；

S2、将所述羧化多壁碳纳米管配置成悬浮液，然后滴加到玻碳电极的检测端表面得到多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；

S3、将纳米金粒子沉积在所述多壁碳纳米管修饰的玻碳电极的检测端表面得到纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；

S4、将纳米金/多壁碳纳米管修饰的玻碳电极插入巯基修饰的捕获探针中，使所述巯基修饰的捕获探针吸附在纳米金上；然后插入巯基乙醇溶液中，使巯基乙醇封闭未被吸附的纳米金；

S5、配制适体探针溶液，完成电化学传感器的制备。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的所述羧化处理步骤为：将多壁碳纳米管浸入过氧化氢与浓硫酸的混合溶液中超声2.5小时以上，然后洗涤至中性、过滤、真空干燥得到所述羧化多壁碳纳米管。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述过氧化氢与浓硫酸的混合溶液中过氧化氢和浓硫酸的体积比为1∶2～4。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中羧化多壁碳纳米管分散在N,N—二甲基甲酰胺中制成悬浮液。

9.一种用权利要求1至4中任意一项所述的电化学传感器或采用权利要求5至8中任意一项所述制备方法制得的电化学传感器在检测铅离子中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

将适体探针滴加到电化学传感器的玻碳电极的反应端表面进行反应，反应完成后将待测溶液滴加在玻碳电极表面进行反应，待反应完成后接入三电极系统的电解池中检测电流值，根据铅离子的浓度与电流值建立线性回归方程：

Y＝–(7.660±0.363)–(1.035±0.03118)χ

其中，Y为对铅离子检测时的电流平均值，单位为A；χ为待测溶液中铅离子的浓度值的自然对数，单位为M；检测下限为4.3×10^-15M。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述适体探针在与玻碳电极反应端反应完成后，再将亚甲基蓝滴加在玻碳电极反应端表面进行反应，待反应完成后再进行待测溶液的检测；所述电解池中的电解质溶液为pH5.0～9.0的Tris-HCl缓冲液。