CN113552198B - 一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器,所述检测传感器包括电极,所述电极外附有葡萄糖检测核酸适配体和巯基己醇单分子层;所述葡萄糖检测核酸适配体包括能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列,以及修饰基团和亚甲基蓝基团,所述修饰基团为HO‑C6‑S‑S‑C6‑;所述能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列为序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的一种。本发明还保护上述传感器的制备方法。本发明采用核酸适配体作为识别基元,能在全血环境中高灵敏度地检测葡萄糖,不需要任何酶的参与,检测过程十分便捷。
Description
技术领域
本发明涉及电化学检测技术领域,特别涉及一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器及其制备方法。
背景技术
糖尿病是由不同发病机制和病因引起的体内胰岛素不足,而导致糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱,并以严重高血糖为主要临床表现的代谢性疾病。糖尿病分为两种主要形式:1型糖尿病(T1DM),它是一种自身免疫性疾病,其诱导产生胰岛素的胰腺β细胞的破坏,导致胰岛素的绝对缺乏;②2型糖尿病(T2DM),主要特征是胰岛素抵抗,其中外周组织不能对胰岛素刺激做出正常反应,机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症,以维持血糖的稳定。
葡萄糖的检测方法有多种,主要是光学分析法和电化学分析法两大类。光学分析法中有显色法、荧光分析法、紫外可见分光光度法、化学发光法等,电化学方法有各种电化学传感器法、电泳法、库仑滴定法等。近年来研究者们逐渐将目光转至无创血糖检测方法上来,如利用人体组织液进行红外光谱法测定葡萄糖。光学分析法具有高选择性、高灵敏度、稳定性好等优势,但大多需要配备大型仪器使用,便携性能较差。目前,电化学生物传感器因灵敏度高、检测限低、反应过程中生物识别具有高特异性、装置微型且易制备等特点,已经成为近年来研究热点之一。现阶段的产品常借助于葡萄糖氧化酶作为检测葡萄糖的关键基元,这类传感器在易变的体液环境中,容易发生酶降解等问题,具有稳定性差的特性。因此,亟需开发一类非酶的葡萄糖传感器。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的至少一种技术问题,提供一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器及其制备方法,采用核酸适配体作为识别基元,能在全血环境中高灵敏度地检测葡萄糖,不需要任何酶参与,检测过程十分便捷。本发明进一步考察了,电化学修饰位点差异性以及适配体序列的长度,对于葡萄糖信号的响应。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器,所述检测传感器包括电极,所述电极外附有葡萄糖检测核酸适配体和巯基己醇单分子层;所述葡萄糖检测核酸适配体包括能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列,以及修饰基团和亚甲基蓝基团,所述修饰基团为HO-C6-S-S-C6-;所述能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列为序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的一种。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
进一步,所述电极为金电极。
优选的,所述电极为2mm金圆盘电极。
本发明还要求保护上述一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
步骤1),制作电极;
步骤2),配置适配体溶液;
步骤3),制备传感器,将步骤1)的电极放入步骤2)配置的适配体溶液中反应,然后移到MCH溶液中反应,取出后制得检测传感器。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
进一步,所述步骤1)中,电极的制作包括以下步骤:选用2mm金圆盘电极,用Al2O3粉末打磨后,分别在浓度为0.5M的氢氧化钠溶液和0.5M的硫酸的溶液中清洗干净。
进一步,所述步骤2)中,适配体溶液的配置包括以下步骤:将100μM的葡萄糖检测核酸适配体溶液与20mM的TCEP溶液反应1h还原二硫键,然后用1×PBS缓冲溶液稀释为1μM。
进一步,所述步骤3)中,在适配体溶液中的反应条件为室温下反应2h。
进一步,所述步骤3)中,所述MCH溶液的浓度为20mM,在MCH溶液中的反应条件为4℃温度下反应12h。
进一步,所述步骤3)中,还包括取出电极后用1×PBS缓冲溶液清洗电极后用氮气吹干的清洗步骤。
本发明的有益效果是:本发明构建出了一种能与目标分子高亲和力、高特异性地结合的单链寡核苷酸序列,并制备出电化学生物传感器,能在全血环境中高灵敏度地检测葡萄糖;本发明传感器对靶标响应信号大,具有优异的灵敏度;本发明的传感器在全血环境中能保持很长时间的稳定性,反复多次测试信号依然平稳;本发明有望应用于实际生活中,给广大糖尿病患者的自检带来便利。
附图说明
图1为本发明传感器产生电信号变化的过程示意图;
图2为本发明传感器在全血中不同频率下测量信号随时间的变化及加入靶标前后的方波伏安曲线图。
图3为本发明传感器基于SEQ ID NO.1序列在全血中电信号随1mM浓度葡萄糖加入前后的方波伏安曲线图。
图4为本发明传感器基于SEQ ID NO.2序列在全血中电信号随1mM浓度葡萄糖加入前后的方波伏安曲线图。
图5为本发明传感器基于SEQ ID NO.3序列在全血中电信号随1mM浓度葡萄糖加入前后的方波伏安曲线图。
图6为本发明传感器基于SEQ ID NO.4序列在全血中电信号随1mM浓度葡萄糖加入前后的方波伏安曲线图。
实施例
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
本发明设计的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器,其特征在于,所述检测传感器包括电极,所述电极外附有葡萄糖检测核酸适配体和巯基己醇单分子层;所述葡萄糖检测核酸适配体包括能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列,以及修饰基团和亚甲基蓝基团,所述修饰基团为HO-C6-S-S-C6-;所述能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列为序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的一种。
本发明的修饰基团HO-C6-S-S-C6-中,C6为葡萄糖基团。
本发明的适配体序列具体如下:
基于SEQ ID NO.1:
5’-HO-C6-S-S-C6-ACGACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTCG T-MB-3’,这条序列为3’端修饰有电化学MB信号基团的适配体。
基于SEQ ID NO.2:
5’-MB-TGCTGTTACCTGTGACAATGTCTCGTTGTGTGTGCCAG-HO-C6-S-S-C6-3’,这条序列为5’端修饰有电化学MB信号基团的适配体。
基于SEQ ID NO.3:
5’-HO-C6-S-S-C6-CGACCGTGTGTGTAdT(MB)TTCTATACAGTGTCCATTGTCG-3’,第三条序列,MB基团在中间,修饰在T碱基上。
基于SEQ ID NO.4:
5’-HO-C6-S-S-C6-GACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTC-MB-3’,第四条本条序列的特点是3’端修饰有电化学MB信号基团的被截短的适配体。
目前现有技术中,对于血糖检测,一般采用有创检测的方式。目前的无创检测方式中,大多都借助于葡萄糖氧化酶作为检测葡萄糖的关键基元,稳定性较差,检测精度不足。
本发明的发明人基于此,设计了采用电化学方式实现对血糖无创检测的技术方案。本方案通过设计特定的检测传感器来实现对人血清中葡萄糖的快速、精确测定。
本发明设计了可以与葡萄糖进行特异性结合单链寡核苷酸,并以此为模板进行PCR扩增后得到大量可与胰岛素和葡萄糖特异性结合的ssDNA,以此制备核酸适配体。如图1所示,通过葡萄糖检测核酸适配体与葡萄糖特异性结合,产生电信号,以快速、精确的识别并测定血液中的葡萄糖。
本发明的核心是上述葡萄糖检测核酸适配体,采用人工设计的能够与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列,同时采用MB作为指示剂。
在本发明较为优选的实施方式中,所述电极为金电极。
优选的,所述电极为2mm金圆盘电极。
本发明优选采用金电极。能够配合本发明的适配体,形成充分的电信号,对葡萄糖能有稳定的高敏感性。采用2mm金圆盘电极后,能够进一步提高上述检测敏感性。
本发明的上述一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
步骤1),制作电极;
步骤2),配置适配体溶液;
步骤3),制备传感器,将步骤1)的电极放入步骤2)配置的适配体溶液中反应,然后移到MCH溶液中反应,取出后制得检测传感器。
本发明的核酸适配体,除了能够与葡萄糖进行特异性结合外,还能够通过浸润反应的方式,与电极材料结合,能够极大简化制备过程和制备难度,具有意想不到的技术效果。
在本发明较为优选的实施方式中,所述步骤1)中,电极的制作包括以下步骤:选用2mm金圆盘电极,用Al2O3粉末打磨后,分别在浓度为0.5M的氢氧化钠溶液和0.5M的硫酸的溶液中清洗干净。
上述处理能够使电极材料更易与适配体反应结合。
在本发明较为优选的实施方式中,所述步骤2)中,适配体溶液的配置包括以下步骤:将100μM的葡萄糖检测核酸适配体溶液与20mM的TCEP溶液反应1h还原二硫键,然后用1×PBS缓冲溶液稀释为1μM。
在本发明较为优选的实施方式中,所述步骤3)中,在适配体溶液中的反应条件为室温下反应2h。
在本发明较为优选的实施方式中,所述步骤3)中,所述MCH溶液的浓度为20mM,在MCH溶液中的反应条件为4℃温度下反应12h。
在本发明较为优选的实施方式中,所述步骤3)中,还包括取出电极后用1×PBS缓冲溶液清洗电极后用氮气吹干的清洗步骤。
实施例1
基于SEQ ID NO.1序列的传感器
本实施例的传感器采用以下方法制备,包括以下步骤:
步骤1),制作金圆盘电极。
步骤2),配置基于SEQ ID NO.1序列的适配体溶液,适配体序列为:
5’-HO-C6-S-S-C6-ACGACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTCG T-MB-3’;
将适配体溶液与TCEP溶液反应还原二硫键,然后用1×PBS缓冲溶液稀释,得到所需的适配体反应溶液。
步骤3),制备传感器,将步骤1)的金圆盘电极放入步骤2)配置的适配体反应溶液中反应,然后移到MCH溶液中反应,取出、清洗、吹干后制得本实施例的检测传感器。
实施例2
基于SEQ ID NO.2序列的传感器
本实施例的传感器采用以下方法制备,包括以下步骤:
步骤1),制作2mm金圆盘电极。
步骤2),配置基于SEQ ID NO.2序列的适配体溶液,适配体序列为:
5’-MB-TGCTGTTACCTGTGACAATGTCTCGTTGTGTGTGCCAG-HO-C6-S-S-C6-3’;
将适配体溶液与TCEP溶液反应还原二硫键,然后用1×PBS缓冲溶液稀释为1μM,得到所需的适配体反应溶液。
步骤3),制备传感器,将步骤1)的金圆盘电极放入步骤2)配置的适配体反应溶液中,室温下反应;然后移到MCH溶液中,4℃温度下反应;最后,取出、清洗、吹干后制得本实施例的检测传感器。
实施例3
基于SEQ ID NO.3序列的传感器
本实施例的传感器采用以下方法制备,包括以下步骤:
步骤1),制作2mm金圆盘电极,用Al2O3粉末打磨后,分别在浓度为0.5M的氢氧化钠溶液和0.5M的硫酸的溶液中清洗干净。
步骤2),配置基于SEQ ID NO.3序列的适配体溶液,适配体序列为:
5’-HO-C6-S-S-C6-CGACCGTGTGTGTAdT(MB)TTCTATACAGTGTCCATTGTCG-3’;
将100μM的适配体溶液与20mM的TCEP溶液反应1h还原二硫键,然后用1×PBS缓冲溶液稀释为1μM,得到所需的适配体反应溶液。
步骤3),制备传感器,将步骤1)的金圆盘电极放入步骤2)配置的适配体反应溶液中,室温下反应2h;然后移到20mM的MCH溶液中,4℃温度下反应过夜;最后,取出、清洗、吹干后制得本实施例的检测传感器。
实施例4
基于SEQ ID NO.4序列的传感器
本实施例的传感器采用以下方法制备,包括以下步骤:
步骤1),制作金圆盘电极,用Al2O3粉末打磨后,分别在浓度为0.5M的氢氧化钠溶液和0.5M的硫酸的溶液中清洗干净。
步骤2),配置基于SEQ ID NO.4序列的适配体溶液,适配体序列为:
5’-HO-C6-S-S-C6-GACCGTGTGTGTTGCTCTGTAACAGTGTCCATTGTC-MB-3’;
将100μM的适配体溶液与20mM的TCEP溶液反应1h还原二硫键,然后用1×PBS缓冲溶液稀释为1μM,得到所需的适配体反应溶液。
步骤3),制备传感器,将步骤1)的金圆盘电极放入步骤2)配置的适配体反应溶液中,室温下反应2h;然后移到20mM的MCH溶液中,4℃温度下反应过夜;最后取出,用1×PBS缓冲溶液清洗电极后用氮气吹干后制得本实施例的检测传感器。
使用本发明实施例1的电化学传感器,将传感器置于全血环境中进行稳定性和敏感性的测试,以确定本发明的技术效果。具体测试结果见图2。
从图2中A图可以看出,在加入靶标前,该传感器在全血中能保持优异的稳定性。
从图2中B图可以看出,当加入一定量的葡萄糖,致使测试体系中葡萄糖浓度为5mM(突变的拐点)时,传感器在各个频率下都产生了一个极大地信号变化,这表明,该适配体传感器对于葡萄糖的测定效果非常优异。
对本发明实施例1~4的传感器进行检测测试,以确定本发明传感器的检测效果,具体结果见图3~图6。
从图3可以看出,基于SEQ ID NO.1序列制备的传感器,在加入1mM浓度的葡萄糖靶标前后,该传感器在-0.22V处的电化学信号位移至-0.235V,电流产生0.3A的衰减,电信号变化率为20%。
从图4可以看出,基于SEQ ID NO.2序列制备的传感器,在加入1mM浓度的葡萄糖靶标前后,该传感器在-0.226V处的电化学信号位移至-0.236V,电流产生0.85A的衰减,电信号变化率为25%。
从图5可以看出,基于SEQ ID NO.3序列制备的传感器,在加入1mM浓度的葡萄糖靶标前后,该传感器在-0.228V处的电化学信号位移至-0.238V,电流产生0.9A的衰减,电信号变化率为20%。
从图6可以看出,基于SEQ ID NO.4序列制备的传感器,在加入1mM浓度的葡萄糖靶标前后,该传感器在-0.234V处的电化学信号位移至-0.244V,电流产生4A的衰减,电信号变化率为40%。
由图3~图6可以看出,本发明设计的适配体制备的电化学传感器,对于葡萄糖响应信号大,具有优异的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgaccgtgt gtgttgctct gtaacagtgt ccattgtcgt 40
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctgttacc tgtgacaatg tctcgttgtg tgtgccag 38
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaccgtgtg tgtadtttct atacagtgtc cattgtcg 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaccgtgtgt gttgctctgt aacagtgtcc attgtc 36
Claims (9)
1.一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器,其特征在于,所述电化学传感器包括电极,所述电极外附有葡萄糖检测核酸适配体和巯基己醇单分子层;所述葡萄糖检测核酸适配体包括能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列,以及修饰基团和亚甲基蓝基团,所述修饰基团为HO-C6-S-S-C6-;所述能与葡萄糖进行特异性结合的人工合成核苷酸序列为序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器,其特征在于,所述电极为金电极。
3.根据权利要求2所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器,其特征在于,所述电极为2mm金圆盘电极。
4.权利要求1~3任一项所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1),制作电极;步骤2),配置适配体溶液,将葡萄糖检测核酸适配体溶液与TCEP溶液反应;步骤3),制备传感器,将步骤1)的电极放入步骤2)配置的适配体溶液中反应,然后移到MCH溶液中反应,取出后制得检测传感器。
5.根据权利要求4所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中,电极的制作包括以下步骤:选用2mm金圆盘电极,用Al2O3粉末打磨后,分别在浓度为0.5M的氢氧化钠溶液和0.5M的硫酸的溶液中清洗干净。
6.根据权利要求4所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中,适配体溶液的配置包括以下步骤:将100μM的葡萄糖检测核酸适配体溶液与20mM的TCEP溶液反应1h还原二硫键,然后用1×PBS缓冲溶液稀释为1μM。
7.根据权利要求4所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中,在适配体溶液中的反应条件为室温下反应2h。
8.根据权利要求4所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中,所述MCH溶液的浓度为20mM,在MCH溶液中的反应条件为4℃温度下反应12h。
9.根据权利要求4所述的一种基于高响应葡萄糖适配体的电化学传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中,还包括取出电极后用1×PBS缓冲溶液清洗电极后用氮气吹干的清洗步骤。
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