CN111060574A - 一种基于双重信号放大策略检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器 - Google Patents
一种基于双重信号放大策略检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于双重信号放大策略检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器,属于新型功能纳米复合材料和生物传感器检测技术领域。本发明采用高导电性的金纳米叶修饰碳布为基底电极,进行了一次信号放大。进一步利用核酸适配体实现唾液酸的高特异性识别,提高了测定的选择性。通过硼酸‑二醇的反应结合硫堇/金纳米粒子/4‑巯基苯硼酸复合材料,从而引入硫堇的电化学信号并且实现了信号的二次信号放大。本方法制备的核酸适配体电化学传感器在唾液酸测定中表现出高的灵敏度、好的选择性和长期的稳定性。该传感器用于实际血清样品中唾液酸的测定,检测限可达60 nmol·L‑1。
Description
技术领域
本发明涉生物传感器检测和功能纳米复合材料技术领域,具体为一种基于金纳米叶修饰碳布和功能化金纳米粒子双重信号放大的核酸适配体电化学传感器及其制备方法和其在唾液酸检测方面的应用。
背景技术
唾液酸是神经氨酸的乙酰化衍生物,位于神经节苷脂的糖链的末端。它广泛存在于生物组织及体液中,参与细胞的识别、粘着和接触抑制等多种生理过程。对于患恶性肿瘤的患者,由于瘤细胞表面糖蛋白和糖脂的结构和含量都发生了显著变化,大量的唾液酸可能从癌细胞表面脱落进入血液,使得血清唾液酸水平升高,而且与病情的严重程度呈正相关。因此,唾液酸已成为一种广谱的肿瘤标志物。从而,建立一种血清中唾液酸的高灵敏和高准确度的测定方法对恶性肿瘤的辅助诊断、疗效观察和预后判断均有重要的临床价值。
传感器的设计中,特异性是非常重要的一个评价指标,而特异性取决于所选取的识别单元。目前,基于硼酸与唾液酸顺式二醇的识别反应用于唾液酸检测已有大量报道[H.X.Di,H.Q.Liu,M.M.Li,J.Li,D.B.Liu,Anal.Chem.,2017,89,5874-5881.]。这些传感器获得了较高的灵敏度,但是样品中其它含有顺式二醇分子的干扰影响了其实际应用。基于抗体的识别可以提高测定的特异性,然而抗体传感器的设计需要昂贵的酶标抗体试剂、易受环境影响变性且耗时很长,这也限制了其在常规临床测试中的应用[D.D.Fang,S.P.Zhang,H.Dai,Z.S.Hong,Y.Y.Lin,Electrochim.Acta,2019,326,134956/1-134956/9.]。核酸适配体作为一种识别单元不仅具有抗体所具备的高特异性、高亲和力和高稳定性,且还具有低成本、可重复性合成及便于化学修饰和功能化等传统免疫学与化学分子识别无可比拟的优势。唾液酸的核酸适配体能够在相关干扰分子共存下与其特异性结合[Y.H.Lao,H.Y.Chiang,D.K.Yang,K.Peck,L.C.Chen,Chem.Commun.2014,50,8719–8722.]。核酸适配体的成功筛选为特异性检测唾液酸提供了一种可能。
另一方面,利用纳米材料包括纳米粒子、纳米线及纳米管等的高比表面积和优异的催化活性可以提高传感器的灵敏性。基于此,本电化学传感器以高导电性的金纳米叶修饰碳布作为基底电极,进行了一次信号放大。进一步利用核酸适配体实现唾液酸的高特异性识别。通过硼酸-二醇的反应结合硫堇/金纳米粒子/4-巯基苯硼酸复合材料,从而引入硫堇的电化学信号并且实现了信号的二次放大。有望得到高灵敏和高选择性的唾液酸电化学传感器。目前未见相关报道。
发明内容
可以看出,本发明目的在于提供一种高灵敏、高选择性检测唾液酸的电化学传感器,分别以核酸适配体、金纳米叶修饰的碳布和金纳米粒子复合材料作为识别单元、基底电极及探针单元制备而得。
为实现本发明目的,将碳布电极表面通过电化学沉积获得金纳米叶,以金纳米叶修饰的碳布作为基底电极,以提高电极比表面积和导电性;接着在基底电极表面进行巯基修饰的核酸适配体固定,核酸适配体作为高特异性的识别单元提高测定的选择性;进一步进行唾液酸识别后,通过唾液酸中的二醇与硼酸的反应引入硫堇/金纳米粒子/4-巯基苯硼酸复合材料,通过硫堇的电化学实现唾液酸的定量测定,并放大了电化学信号,从而提高测定的灵敏性。
具体地,所述基于二重信号放大策略检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器通过如下方法制备而成:
(1)金纳米叶在碳布电极上的沉积:将碳布电极依次用超纯水、乙醇和超纯水在超声波清洗器中超声清洗,将清洗后的碳布电极浸入氯金酸溶液中进行恒电位电沉积获得金纳米叶结构的碳布表面。
(2)核酸适配体的固定及唾液酸的识别:将步骤(1)制得的金纳米叶修饰的碳布电极浸入到核酸适配体溶液中室温孵育,用1-己硫醇溶液浸泡电极进行封闭,消除非特异性结合位点。将制备好的修饰电极分别与不同浓度的唾液酸溶液在室温下孵育,进行唾液酸的识别。所选用的核酸适配体的DNA序列是TCCCT ACGGC GCTAA CCGAT AGGTG TAGCG TGGGGCACAT GTTCG CGCCA CCGTG CTACA AC。
(3)探针分子的制备及引入:取HAuCl4溶液放入装有超纯水的三颈瓶中,在搅拌条件下加热至沸腾,加入柠檬酸钠溶液生成金溶胶。然后将4-巯基苯硼酸和硫堇混合液在搅拌下逐滴加入至金纳米溶胶溶液中,持续搅拌后离心,然后分散至磷酸盐缓冲溶液中。将此金纳米粒子复合材料与步骤(2)结合唾液酸后的传感器共同孵育。
孵育后,进行微分脉冲伏安的测定,通过加入唾液酸前后硫堇的还原峰电流改变值与唾液酸浓度的关系实现唾液酸的定量测定。
作为一种优选方案,步骤(1)进行金纳米叶沉积时,选择碳布电极为基底电极且电化学沉积的时间和电位分别选择为400s和-0.08V,从而提高本发明方法进行检测的灵敏性。
作为一种优选方案,优化检测实验条件,步骤(2)进行核酸适配体固定时其浓度选择75μmol·L-1,从而提高本发明方法进行检测的选择性。
作为一种优选方案,步骤(3)中合成金纳米粒子复合物时4-巯基苯硼酸和硫堇摩尔比为1:1,测定唾液酸时选择在pH=4.5的0.1M磷酸盐缓冲溶液进行,从而进一步提高利用本发明方法进行唾液酸测定的灵敏度。
本发明具有如下积极有益的效果:
(1)采用电化学沉积获得金纳米叶修饰的碳布电极作为基底电极,提供了大的表面积和高的导电性,有利于提高测定的灵敏度。
(2)以金纳米粒子复合物上的硫堇作为探针分子,金纳米粒子表面含有大量的硫堇进一步提高了测定的灵敏度。
(3)本发明利用核酸适配体测定唾液酸,避免了使用昂贵的酶标抗体试剂,且具有与免疫传感器相当的特异性。
(4)本发明传感器制备简单、易行,且选用材料不受外界环境的影响,具有高的重复性和稳定性。
(5)本发明电化学传感器实现了唾液酸的高灵敏、高选择性测定,检测限为60nmol·L-1,可用于人体血清中唾液酸的测定,对于恶性肿瘤的辅助诊断和治疗具有重要意义。
所采用的核酸适配体的DNA序列见序列表。
附图说明
图1是本发明核酸适配体传感器的制备及用于唾液酸测定的原理图。
图2是金纳米叶修饰碳布电极的低放大倍数(A)和高放大倍数(B)的扫描电镜图。
图3(A)是(1)金纳米粒子、(2)硫堇修饰的金纳米粒子及(3)硫堇和4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子的X-射线光电子能谱图;图3(B)是电极修饰过程的交流阻抗图:(1)碳布电极、(2)金纳米叶修饰的电极、(3)核酸适配体固定后的电极、(4)识别唾液酸后的电极及(5)金纳米粒子复合物结合后的电极。
图4是本发明电化学传感器测定唾液酸的条件优化图:(A)核酸适配体浓度的影响和(B)缓冲体系pH值的影响。
图5是本发明电化学传感器对不同浓度唾液酸的响应曲线图,图中,A为测定唾液酸的微分脉冲伏安曲线图;B为电流改变值随浓度变化的标准曲线。
图6是本发明电化学传感器的选择性图,图中,(1)-(8)分别代表唾液酸、空白、葡萄糖、多巴胺、甘露糖、果糖、半乳糖和H2O2。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明:
实施例1基于双重信号放大策略检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器的制备方法
(1)金纳米叶在碳布电极上的沉积:在电极修饰前,将碳布电极(1.0×1.5cm)依次用超纯水、乙醇和超纯水在超声波清洗器中依次超声清洗7min,将处理好的碳布电极浸入10mL40mmol·L-1氯金酸溶液中,在-0.08V的恒电位下进行电沉积400s获得金纳米叶结构的碳布表面。
(2)核酸适配体的固定及唾液酸的识别:所选用的核酸适配体的序列是TCCCT ACGGCGCTAA CCGAT AGGTG TAGCG TGGGG CACAT GTTCG CGCCA CCGTG CTACA AC,将步骤(1)制得的金纳米叶修饰的碳布电极浸入到40μL的80μmol·L-1核酸适配体溶液中室温孵育12h,用4mmol·L-1 1-己硫醇溶液浸泡电极20min进行封闭,消除非特异性结合位点。将制备好的修饰电极分别与40μL不同浓度的唾液酸溶液在室温下孵育3h,进行唾液酸的识别。
(3)探针分子的制备及引入:取1.815mL HAuCl4溶液(10mg mL-1)放入装有150mL超纯水的三颈瓶中,在快速搅拌条件下加热至沸腾,迅速加入4.5mL质量百分含量1%的柠檬酸钠溶液生成酒红色的金溶胶。然后将250μL的1mM 4-巯基苯硼酸和25μL的10mM硫堇混合液在快速搅拌下逐滴加入至金纳米溶胶溶液中,随后溶液由酒红色变为蓝色,持续搅拌24小时,离心(8 000rpm,15min)后分散至12mL的0.1mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 4.5)中。10μL的金纳米粒子复合材料与步骤(3)结合唾液酸后的传感器共同孵育5小时,从而获得此电化学核酸适配体传感器。
应用例1本核酸适配体电化学传感器对唾液酸的测定
电位测试采用三电极体系,所制备的修饰电极为工作电极,铂丝为对电极,Ag/AgCl为参比电极。在电化学工作站上采用微分脉冲伏安的方式,在0.1mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH=4.5)条件下,通过测定不同浓度唾液酸标准溶液,计算加入唾液酸后探针分子硫堇的还原峰电流与空白溶液电流的改变值,以电流改变值-浓度绘制标准曲线。该电流改变值(ΔI)唾液酸的浓度(C)在0.1到440μmol·L-1的范围内成正比,其线性方程为ΔIp=0.135C+6.813,相关系数R2为0.996,检测限为60nmol·L-1。说明此电化学型传感器用于唾液酸的测定具有高的灵敏度。
实际血清样品测定时,根据电流改变值,基于上述线性方程,确定所述人体血清中唾液酸的浓度,从而实现定量检测。
应用例2本核酸适配体电化学传感器性能考察
为了研究本发明传感器的稳定性,重复测定相同浓度的唾液酸(0.2mmol·L-1),8次重复测定结果的相对标准偏差为2.41%。此外,使用相同的方法构筑6个核酸适配体传感器,其测定结果的相对标准偏差为5.34%。另外,将该核酸适配体传感器在4℃的冰箱中保存20天,其峰电流值可达到初始峰电流值的95.4%。说明了构筑的生物传感器具有好的稳定性。
在葡萄糖、果糖、半乳糖等干扰物质存在时,与唾液酸相比电流改变值变化较小,这主要是由于核酸适配体能够与唾液酸特异性结合,不结合其它分子,所以不会产生电流响应信号的变化。从而说明本发明核酸适配体电化学传感器有很好的选择性。
应用例3血清样品中唾液酸的测定
对3个血清样品稀释后的唾液酸进行了测定,测出的含量结果可以分别折合成2.66、1.80和2.37mmol·L-1。这个结果与血清中唾液酸的含量范围(1.8-2.66mmol·L-1)相吻合。同时采用加标回收的方法,加入不同浓度的标准样品,进行分析。得到加标回收率为91%-107%,此结果符合要求。由此说明该传感器具有潜在的应用价值,有望用于临床中血清样品唾液酸的测定。
表1血清样品中唾液酸的测定
序 列 表
< 110> 商丘师范学院
<120>一种基于双重信号放大策略检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器
<160> 1
<210>1
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>核酸适配体
<400> 1
tccctacggc gctaaccgat aggtgtagcg tggggcacat gttcgcgcca ccgtgctacaac 60
Claims (6)
1.一种检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,通过如下方法制备而成:
(1)金纳米叶在碳布电极上沉积:将清洗后的碳布电极浸入氯金酸溶液中进行恒电位电沉积获得金纳米叶结构的碳布表面;
(2)固定核酸适配体及识别唾液酸:将步骤(1)制得的金纳米叶修饰的碳布电极浸入到核酸适配体溶液中室温孵育,用1-己硫醇溶液浸泡电极进行封闭,消除非特异性结合位点;将制备好的修饰电极分别与不同浓度的唾液酸溶液在室温下孵育,进行唾液酸识别;
(3)引入探针分子:取HAuCl4溶液放入装有超纯水的三颈瓶中,搅拌条件下加热至沸腾,加入柠檬酸钠溶液生成金溶胶;然后将4-巯基苯硼酸和硫堇混合液在搅拌下逐滴加入至金纳米溶胶溶液中,得到4-巯基苯硼酸/金纳米粒子/硫堇复合材料溶液;将4-巯基苯硼酸/金纳米粒子/硫堇复合材料溶液与步骤(2)结合唾液酸后的传感器共同孵育,制得核酸适配体电化学传感器;
所选用的核酸适配体的DNA序列是TCCCT ACGGC GCTAA CCGAT AGGTG TAGCG TGGGGCACAT GTTCG CGCCA CCGTG CTACA AC。
2.根据权利要求1所述的检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,步骤(1)所述金纳米叶电化学沉积的时间和电位分别选择为400 s和-0.08 V。
3.根据权利要求1所述的检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,步骤(2)所述核酸适配体固定时其浓度选择75 μmol·L-1。
4.根据权利要求1所述的检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器,其特征在于,步骤(3)4-巯基苯硼酸和硫堇摩尔比为1:1。
5.如权利要求1-4其中之一所述的检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器的应用,其特征在于,通过如下方法实现:缓冲溶液中,进行微分脉冲伏安的测定,通过加入唾液酸前后硫堇的还原峰电流改变值与唾液酸浓度的关系实现唾液酸的定量测定。
6.根据权利要求5所述的检测唾液酸的核酸适配体电化学传感器的应用,其特征在于,所述的缓冲体系选择0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲体系,pH为4.5。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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