CN108872582A - 一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用,可用于对黄曲霉毒素B1的检测,蔗糖酶与基底DNA的复合物修饰金电极,然后,利用DNA序列的互补配对,基底DNA与适配体DNA互补配对,得到双链修饰的金电极,再加入AFB1与适配体DNA特异性结合,夺走适配体DNA,留下的基底DNA,被Walker DNA和铅离子特定位点剪切,剪切之后得到DNA片段修饰的金电极,而蔗糖酶游离在溶液中,能够分解加入的蔗糖为葡萄糖。葡萄糖的量与AFB1的浓度有关。随着AFB1浓度的增加,葡萄糖的含量会随之增加,血糖仪的数值就会相应增大。因此,此传感器可对不同浓度的AFB1进行定量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域,具体涉及一种基于DNAWalker的适配体传感器、制备方法及其应用,可用于对黄曲霉毒素B1的检测。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AFB1),其中一个最强的致癌物质、致畸因子,产生于曲霉和烟曲霉,已广泛存在于许多农作物(如玉米、花生、棉花、种子、黄豆)和发霉的食品(面包、糕点、饼)。此外,接触到AFB1可能导致严重的疾病,如肝硬化、肿瘤等。
因此,开发一种便携式、简便、快速、灵敏的传感器在线检测AFB1的方法是至关重要的。迄今为止,报道了各种对AFB1检测的分析方法,在这些方法中,由于层析、高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱具有高的的精确度和灵敏度,所以这些方法经常被用来检测AFB1。
然而,这些技术不仅需要昂贵的仪器和熟练的操作人员,还有复杂的样品预处理(如固相萃取柱),而且不适合多个样品的分析和现场检测,限制了它们的应用。
因此,开发一种简单的、选择性和灵敏度高的方法对AFB1现场检测仍然是非常令人期待的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于DNA Walker的适配体传感器及其制备方法,利用DNA序列的互补配对,适配体与目标物之间的特异性结合,DNA酶的特定位点剪切,制备适配体传感器。
本发明的目的还在于提供一种基于DNA Walker的适配体传感器的应用,实现对黄曲霉毒素B1的灵敏检测。
本发明提供的一种基于DNA Walker的适配体传感器的制备方法,包括以下步骤:
1)将抛光处理后的金电极浸入蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液中,培养,然后取出,清洗,得到修饰了基底DNA的金电极;
2)将步骤1)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入适配体DNA的缓冲溶液,培养,清洗,得到双链修饰的金电极;
3)将步骤2)得到的修饰双链的金电极浸入AFB1的缓冲溶液中,培养,清洗,得到修饰了基底DNA的金电极;
4)将步骤3)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液中,培养,得到含有蔗糖酶的溶液;
5)将步骤4)得到的含有蔗糖酶的溶液加入蔗糖溶液中,培养,得到含有葡萄糖的溶液;
6)将步骤5)得到的含有葡萄糖的溶液滴在血糖仪试纸上,得到代表葡萄糖含量的数值。
具体的,步骤1)为将购买的基底DNA溶解在磷酸盐PBS缓冲溶液得到浓度为100μM的DNA溶液,在4℃下保存备用;
进一步的,步骤1)中所述抛光处理后的金电极是指:金电极先依次用0.3mm和0.05mm的铝粉进行抛光处理,再依次放入体积比HNO3:H2O=1:1的溶液、乙醇溶液和超纯水中,分别进行超声波清洗,超声清洗的时间分别为3-5min;
进一步的,步骤1)中蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液是指:0.4mL20mg/mL蔗糖酶加入到含有20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mM N-N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中,4℃下培养1.5h-2h,再加入50μL 100μM氨基修饰的基底DNA缓冲溶液,在4℃下反应10h-12h,得到的蔗糖酶与基底DNA的复合物用Amicon-100K纯化,然后溶解在100μL PBS缓冲溶液,得到蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液,备用。
进一步的,步骤1)中基底DNA序列为:
5'-SH-GGGCCTAGCGArAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-NH2-3';
进一步的,步骤1)中的培养是指:室温下培养10h-12h;
进一步的,步骤1)中的清洗是指:用超纯水淋洗。
具体的,步骤2)为:将购买的适配体DNA溶解在磷酸盐PBS缓冲溶液中,得到浓度为1μM的配体DNA缓冲溶液,在4℃下保存备用;
进一步的,步骤2)中适配体DNA的序列为:
5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3';
进一步的,步骤2)中适配体DNA的缓冲溶液的用量为20μL;
进一步的,步骤2)中的培养是指:室温下培养1.5h-2h;
进一步的,步骤2)中的清洗是指:用超纯水淋洗。
具体的,步骤3)为:将购买的AFB1溶解在缓冲溶液中得到AFB1溶液,在4℃保存备用;
进一步的,步骤3)中AFB1的缓冲溶液的用量是20μL;
进一步的,步骤3)中的培养是指:室温下培养1.5h-2h;
进一步的,步骤3)中的清洗是指:用超纯水淋洗。
具体的,步骤4)所述Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液制备方法为:将购买的Walker DNA溶解在缓冲溶液中,得到浓度为1μM的缓冲溶液,在4℃下保存备用;将5μL浓度为5μM的铅离子溶液与20μL制备的1μM的Walker DNA缓冲溶液混合,即得。
进一步的,步骤4)中Walker DNA的序列为:
5'-TGTCTTGTGCTCCGAGCCGGTCGAAATCGCTAGGC-3';
进一步的,步骤4)中Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液的用量为20μL;
进一步的,步骤4)中的培养是指:室温下1.5h-2h;
具体的,步骤5)为:将购买的蔗糖溶解在水中得到1.0M的蔗糖溶液,保存备用;
进一步的,步骤5)中蔗糖溶液的用量为20μL;
进一步的,步骤5)中的培养是指:室温下20min。
具体的,步骤6)中用的血糖仪和血糖仪试纸购买于德国罗氏诊断有限公司。
上述制备过程中所用的缓冲溶液均为磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4,浓度为0.1M。
上述制备过程中所有的清洗都是用超纯水清洗。
本发明提供的种基于DNA Walker的适配体传感器,采用上述方法制备得到。
本发明还提供的一种基于DNA Walker的适配体传感器检测AFB1的应用,检测方法为:
在上述传感器制备过程中,通过改变AFB1的浓度,得到不同含量的蔗糖酶溶液,加入足量的蔗糖溶液中,得到不同浓度的葡萄糖溶液,取得到的葡萄糖溶液滴在血糖仪试纸上,用血糖仪检测葡萄糖含量,得到不同浓度的AFB1相应的血糖仪信号,构建线性关系。
进一步的,AFB1的浓度分别为0.02,0.03,0.04,0.05,0.1,0.5,1,5和10nM;
进一步的,所述足量的蔗糖溶液浓度为1.0M;
进一步的,血糖仪和血糖仪试纸购买于德国罗氏诊断有限公司。
本发明中,先标记蔗糖酶的特定基底DNA通过金硫键固定在金电极表面,然后AFB1的适配体DNA与基底DNA互补配对。加入AFB1,AFB1与适配体DNA特异性结合脱离电极表面。再加入Walker DNA和铅离子Pb2+,通过DNA酶的切割和DNAWalking机器过程后,使得蔗糖酶标记的DNA被切割,脱离电极表面,溶液中的蔗糖在蔗糖酶存在的情况下转化成葡萄糖,从而被血糖仪检测,以此达到检测AFB1的目的,并且具有高的灵敏度和选择性。由于葡萄糖是由蔗糖经过蔗糖酶催化转化而来,而蔗糖酶与AFB1的浓度相关,也就是葡萄糖的量与AFB1的浓度有关。随着AFB1浓度的增加,葡萄糖的含量会随之增加,血糖仪的数值就会相应增大。因此,此传感器可对不同浓度的AFB1进行定量检测。
与现有技术相比,本传感器的制备方法,利用DNA的互补配对和适配体与配子的特异性结合,选择性高;DNA酶的特定位点剪切,是传感器的灵敏度得到提高;重要的是,血糖仪的使用,不同浓度的AFB1都能够数字化显示,使此传感器能够现场检测。
由于便携式、易操作、成本低等优点,本发明提供的方法可以使用在家庭食品污染方面的检测,对此,做了实样检测,结果令人满意。甚至改变识别元件,此传感器可以检测其他的分析物,所以本方法提供了一个分析平台用于检测离子、生物分子、生物标记物等。
附图说明
图1为基于DNA Walker的适配体传感器检测AFB1的示意图;
图2A为电极组装过程的电化学阻抗表征;
a为裸金电极;
b为基底DNA修饰的金电极;
c为双链DNA修饰的金电极;
d为基底DNA修饰的金电极;
e为剪切之后DNA片段修饰的金电极;
图2B为电极组装过程的循环伏安表征;
a线为裸金电极;
b线为双链DNA修饰的金电极;
c线为基底DNA修饰的金电极;
d线为剪切之后DNA片段修饰的金电极;
图2C为剪切过程的阻抗表征;
图2D为在存在和不存在AFB1的情况下血糖仪的响应图;
a线为存在AFB1;
b线为不存在AFB1;
图3为不同情况下血糖仪的响应图;
a栏为没有AFB1;
b栏为没有蔗糖酶;
c栏为没有Walker DNA;
d栏没有铅离子;
e栏全都有;
图4A为DNA酶剪切时间的优化图;
图4B为铅离子浓度的优化图;
图4C为AFB1培养时间的优化图;
图4D为缓冲溶液pH的优化图;
图5A为不同浓度的AFB1相应的血糖仪信号图;
图5B为不同浓度AFB1的对数相应的的血糖仪信号图;
图5C为不同干扰物相应的血糖仪信号图;
图5D为随时间变化相应的血糖仪信号图;
图6为发霉的(a,b,c)与干净的(d,e,f)三种面包图和相应的提取液。
具体实施方式
实施例1
一种基于DNA Walker的适配体传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)、配置0.1M,pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液,用于溶解DNA,蔗糖和蔗糖酶等。
(2)、将购买的基底DNA序列(5'-SH-GGGCCTAGCGArAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-NH2-3')溶解在配制的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中得到浓度为100μM的基底DNA缓冲溶液,并在4℃下保存备用;将购买的适配体DNA(5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3’)溶解在0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)中得到浓度为1μM的适配体DNA缓冲溶液,在4℃下保存备用;将购买的Walker DNA(5’-TGTCTTGTGCTCCGAGCCGGTCGAAATCGCTAGGC-3’)溶解在0.1M pH=7.4磷酸盐缓冲溶液中得到浓度为1μM的Walker DNA缓冲溶液,并在4℃下保存备用。
(3)、金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理,再依次放入体积比HNO3:H2O=1:1溶液、乙醇溶液和超纯水中,分别进行超声波清洗,超声清洗的时间分别为3~5min,将抛光后的金电极浸泡在20μL蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液,室温下培养10h,通过金硫键使基底DNA结合到电极表面;
所述蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液制备方法为:0.4mL 20mg/mL蔗糖酶加入到含有20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mM N-N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中,4℃下培养1.5h-2h,再加入50μL 100μM氨基修饰的基底DNA缓冲溶液,在4℃下反应10h-12h,得到的蔗糖酶与基底DNA的复合物用Amicon-100K纯化,然后溶解在100μL PBS缓冲溶液,得到蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液,备用。
(4)、将修饰了基底DNA的金电极浸泡在20μL浓度为1μM的适配体DNA缓冲溶液中,在室温下培养2h,得到双链修饰的金电极;
(5)、将得到的修饰双链的金电极浸入含有20μL 1μM AFB1的缓冲溶液中,室温下培养2h,用超纯水清洗,得到修饰了基底DNA的金电极;
(6)、将得到的修饰了基底DNA的金电极浸入含有20μL Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液混合液中,室温下培养2h,得到含有蔗糖酶的溶液;
所述Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液制备方法为:将购买的WalkerDNA溶解在缓冲溶液中,得到浓度为1μM的缓冲溶液,在4℃下保存备用;将5μL浓度为5μM的铅离子溶液与20μL制备的1μM的Walker DNA缓冲溶液混合,即得。
(7)、将得到的含有蔗糖酶的溶液加入20μL蔗糖溶液中,培养20min,得到含有葡萄糖的溶液;
(8)、将得到的含有葡萄糖的溶液滴在血糖仪试纸上,得到代表葡萄糖含量的数值。
实施例2
制备的基于DNA Walker适配体传感器用于检测AFB1可行性研究:
将实施例1中AFB1缓冲溶液的浓度定为0和0.3nM后,用血糖仪检测结果液,得到代表葡萄糖含量的数值。
组装过程中,电极表面分别用电化学阻抗(图2A)和循环伏安法表征(图2B),证明组装过程是成功的。剪切过程的电化学阻抗值的变化(图2C)和血糖仪响应信号(图2D)说明该实验是可行的。
实施例3
制备的适配体传感器检测AFB1控制实验:
在实施例1制备的传感器方法中,分别不加以下物质:a.AFB1;b.蔗糖酶;c.WalkerDNA;d.铅离子;e.全都有。其他条件相同,检测葡萄糖含量。
如图3,只有所以因子都存在的情况下,传感器才能检测AFB1。
实施例4
制备的适配体传感器检测AFB1优化条件:
在实施例1制备的适配体传感器方法中,改变DNA酶剪切的时间分别为20、40、60、80、100、120、140、160min,其他条件相同,检测葡萄糖含量。
在实施例1制备的适配体传感器方法中,改变铅离子浓度分别为1,2,3,4,5,6,7,8μM,其他条件相同,检测葡萄糖含量。
在实施例1制备的适配体传感器方法中,改变AFB1反应的时间分别为20、40、60、80、100、120、140、160min,其他条件相同,检测葡萄糖含量。
在实施例1制备的适配体传感器方法中,改变溶液的pH分别为5.4、5.9、6.4、6.9、7.4、7.9、8.4、8.9,其他条件相同,检测葡萄糖含量。
结果如图4A、4B、4C、4D所示,所以最有条件为:DNA酶剪切的时间是120min,铅离子浓度是5μM,AFB1反应的时间是120min,溶液的pH是7.4。
实施例5
根据实施例4探索的最优实验条件,改变实施例1中AFB1的浓度分别为0.02,0.03,0.04,0.05,0.1,0.5,1,5,10nM,分别检测结果液中的葡萄糖含量。如图5A,图5B,构建线性关系,实现对AFB1的检测。
实施例6
根据实施例4探索的最优试验条件,将实施例1中的AFB1分别替换为AFB2,AFG1,AFG2,AFM,DON,ZON等干扰物和AFB1与干扰物的混合物,检测结果液中的葡萄糖含量。另外,将传感器放置1,2,3,4,5,6,7,8,9,10天后,检测结果液中的葡萄糖含量。如图5C,5D,说明传感器具有很好的选择性和稳定性。相比于其他的检测方法,如表1,此传感器表现出有意的性能。
表1为不同方法检测AFB1的对比表
方法 | 线性范围 | 检测限 | 参考文献 |
荧光法 | 16pM-6.4nM | 16pM | 40 |
均相免疫传感法 | 190pM-16.01nM | 130pM | 41 |
电化学传感法 | 22.4pM-1.6nM | 6.4pM | 42 |
光学传感法 | 1600pM-64nM | 512pM | 43 |
荧光免疫法 | 32pM-16nM | 25.6pM | 44 |
电化学免疫传感法 | 320pM-3.2nM | 192pM | 45 |
电化学免疫传感法 | 320pM-38.4nM | 160pM | 46 |
竞争免疫法 | 32pM-64nM | 10.6pM | 47 |
适配体传感 | 20pM-10nM | 10pM | 本发明 |
实施例7
根据实施例4探索的最优试验条件,将实施例1中的AFB1分别替换为发霉的三种面包和干净的三种面包的提取液,采用标准加入法检测结果液中的葡萄糖含量。如图6和表2,说明传感器能灵敏的检测食品样品中的AFB1。表2为检测结果(干净的三种面包的提取液不含AFB1,故表2展示了发霉的三种面包)。
发霉面包的提取液提取方法:2g的面包样品浸入2mL甲醇中,震荡30min后,以3000rpm离心5min,经三次重复上面的提取过程中,所有的萃取剂进行收集并转移到5mL的离心管中,随后,溶液用甲醇稀释。
表2
本发明制备的传感器的灵敏度高;而且,利用血糖仪,不同浓度的AFB1都能够数字化显示,能够现场检测,更方便。
Claims (11)
1.一种基于DNA Walker的适配体传感器的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
1)将抛光处理后的金电极浸入蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液中,培养,然后取出,清洗,得到修饰了基底DNA的金电极;
2)将步骤1)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入适配体DNA的缓冲溶液,培养,清洗,得到双链修饰的金电极;
3)将步骤2)得到的修饰双链的金电极浸入AFB1的缓冲溶液中,培养,清洗,得到修饰了基底DNA的金电极;
4)将步骤3)得到的修饰了基底DNA的金电极浸入Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液中,培养,得到含有蔗糖酶的溶液;
5)将步骤4)得到的含有蔗糖酶的溶液加入蔗糖溶液中,培养,得到含有葡萄糖的溶液;
6)将步骤5)得到的含有葡萄糖的溶液滴在血糖仪试纸上,得到代表葡萄糖含量的数值。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液是指:0.4mL 20mg/mL蔗糖酶加入到含有20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5mM N-N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲溶液中,4℃下培养1.5h-2h,再加入50μL 100μM氨基修饰的基底DNA缓冲溶液,在4℃下反应10h-12h,得到的蔗糖酶与基底DNA的复合物用Amicon-100K纯化,然后溶解在100μL PBS缓冲溶液,得到蔗糖酶与巯基标记的基底DNA复合物的缓冲溶液,备用。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于,步骤1)中基底DNA序列为:5'-SH-GGGCCTAGCGArAGGGCACGAGACACAGAGAGACAACACGTGCCCAAC-NH2-3'。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤2)中适配体DNA的序列为:
5'-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3'。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤4)所述Walker DNA缓冲溶液和铅离子溶液的混合液制备方法为:将购买的Walker DNA溶解在缓冲溶液中,得到浓度为1μM的缓冲溶液,在4℃下保存备用;将5μL浓度为5μM的铅离子溶液与20μL制备的1μM的Walker DNA缓冲溶液混合,即得。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤4)中Walker DNA的序列为:
5’-TGTCTTGTGCTCCGAGCCGGTCGAAATCGCTAGGC-3’。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤4)中的培养是指:室温下1.5h-2h。
8.一种权利要求1-7任一项所制备的基于DNA Walker的适配体传感器。
9.一种权利要求8所述的基于DNA Walker的适配体传感器检测AFB1的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,检测方法为:
在传感器制备过程中,通过改变AFB1的浓度,得到不同含量的蔗糖酶溶液,加入足量的蔗糖溶液中,得到不同浓度的葡萄糖溶液,取得到的葡萄糖溶液滴在血糖仪试纸上,用血糖仪检测葡萄糖含量,得到不同浓度的AFB1相应的血糖仪信号,构建线性关系。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,AFB1的浓度分别为0.02,0.03,0.04,0.05,0.1,0.5,1,5和10nM。
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