CN110082524A - 检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用，该传感器由第一试剂和第二试剂组成，所述的第一试剂是覆盖有脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的磁珠水溶液；所述的第二试剂是由覆盖有长链和短链的磁珠形成的DNA Walker体系。通过荧光分光光谱技术分析walker产物，实现了脂多糖的分析检测。本发明方法简单、稳定、特异性强、灵敏度高，可以在10‑4 ng/mL～107 ng/mL范围内线性检测脂多糖，且可以有效地区分脂多糖与其他对照物质。

Description

检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种脂多糖检测方法和应用，特别是一种检测脂多糖用荧光传感器、其制备方法和应用，应用于食品质量控制和保健管理分析技术领域。
背景技术
脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，脂多糖对宿主是有毒性的。只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后，脂多糖才被释放出来，所以又称为内毒素。脂多糖的毒性成分主要为类脂质A，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。其耐热而稳定，抗原性弱，但人体对脂多糖极为敏感。研究报道极微量(1-5纳克/公斤体重)的内毒素就会引起体温的上升，因而检测食品中的脂多糖是具有重要意义。
目前，检测脂多糖的方法有鲎试剂法、酶联免疫吸附法、快速银染法等。然而这些方法均具有不同程度的局限性，其中，鲎试剂法假阳性反应较多，酶联免疫法易于出现假阳性，快速银染法具有耗时长、操作繁琐等缺陷。由此可见，建立脂多糖的分析新方法成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于克服已有技术存在的不足，提供一种检测脂多糖用荧光传感器。
本发明的目的之二在于提供该荧光传感器的其制备方法。
本发明的目的之三在于提供该荧光传感器的应用。
为达到上述发明创造目的，本发明采用如下发明构思：
本发明利用点击化学介导的DNA walker和脂多糖适配体对脂多糖的特异性识别实现了对脂多糖的高特异性和高灵敏度的检测。本发明所采用的机理如下：选用脂多糖适配体作为脂多糖的识别元件，首先将脂多糖适配体(LPSA链)通过生物素与链酶亲和素结合的方式修饰到磁珠(MB)上，利用固液分离装置，得到磁珠表面覆盖脂多糖适配体的磁珠(MB-LPSA)，再加入可以与脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA(L’链)，通过固液分离装置得到覆盖双链DNA的磁珠(MB-LPSA/L’)溶液，形成脂多糖识别体系作为第一反应试剂，存储设置于第一试剂盒中；将DNA长链(L链)与DNA短链(S链)按照一定的比例进行混合，通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠(MB)上，得到覆盖长链和短链的磁珠，形成DNA Walker体系作为第二反应试剂，存储设置于第二试剂盒中。由于脂多糖(LPS)可以竞争结合脂多糖适配体(LPSA)。当有脂多糖存在的条件下，脂多糖与适配体结合使得识别链竞争游离下来，识别链末端修饰的叠氮(N3)可以通过点击化学结合DNA Walker体系的长链的二苯并环辛炔形成二苯并三氮唑，从而形成完整的Walker链(WL链)，在加入Nicking酶的条件下进行DNA walker得到产物，对产物进行荧光分光分析，进而检测脂多糖。
根据上述发明构思，本发明采用下述技术方案：
一种检测脂多糖用荧光传感器，由第一试剂和第二试剂组成，其特征在于：
所述的第一试剂是覆盖有脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的磁珠水溶液，浓度为0.5mg/ml-1mg/ml；所述的脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的的摩尔比为1:1-1:2；
所述的第二试剂是由覆盖有长链和短链的磁珠形成的DNA Walker体系，其浓度为0.5mg/ml-1mg/ml，其中长链和短链的摩尔比为1：10-1:20；所述的长链是与第一试剂中的产物进行点击化学识别的链，其碱基序列为：5’-biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-N3-3’；所述的短链为第一试剂互补配对的链，其碱基序列为：5’-biotin-TTTTTTTTTTAGCTGAGGAT-Fam-3’。
一种制备上述的检测脂多糖用荧光传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.所述的第一试剂的制备方法为：将脂多糖适配体LPSA链通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠MB上，得到磁珠表面覆盖脂多糖适配体的磁珠MB-LPSA，再加入可以与脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA，得到覆盖双链DNA的磁珠(MB-LPSA/L’)溶液，形成识别体系作为第一反应试剂；
b.所述的第二试剂的制备方法为：在pH7.4条件下，按照DNA长链(L)和DNA短链(S)混合摩尔浓度配比为1：10-1:20的混合比例，通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠(MB)形成DNA Walker体系作为第二反应试剂。
上述的步骤a的具体步骤为：
a-1.取磁珠浸没在摩尔浓度为4.8μM的脂多糖适配体链(LPSA)水溶液中，在30℃下反应1小时0.5h-1h；
a-2.将步骤a-1中得到的反应产物冲洗三次去除上清液，然后加入到摩尔浓度为4.8μM的识别链DNA(L’)的水溶液中，于37℃下反应2小时，洗涤去除上清液，加入去离子水，得到MB-LPSA/L’作为第一反应试剂，其浓度为0.5mg/ml-1mg/ml。
上述的步骤b的具体步骤为：
b-1.将经清洗处理过的磁珠，浸没到含有摩尔浓度为0.12μM的DNA长链和摩尔浓度为2.4μM的DNA短链的水溶液中，在30摄氏度下反应0.5h-1h；
b-2.将步骤b-1中得到的反应产物经清洗后去除上清液，加入去离子水，配置成浓度为0.5mg/ml-1mg/ml的Walker反应体系作为第二反应试剂。
一种脂多糖的检测方法，采用上述的检测脂多糖用荧光传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.建立标准工作曲线：将每50μL～100μL第一反应试剂磁分离后去除上清液1，分别浸没在等体积的浓度为0～107ng/mL的靶标物质脂多糖(LPS)的磷酸盐缓冲液中进行识别，得到磁分离后的上清液2，将该上清液2等体积转移到第二反应试剂中进行混合，并加入2～4μL Nicking酶、5～10μLcutsmart和43～86μL缓冲液进行反应0.5小时～1小时，得到产物，利用荧光分光光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并做出靶标物质脂多糖和荧光强度的线性图；所述的磷酸盐缓冲液是pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
b.样品检测：将每50μL～100μL第一反应试剂磁分离后去除上清液1，浸没在等体积的待测的脂多糖样品的磷酸盐缓冲液中，室温下培育0.5小时～1小时，得到磁分离后的上清液2，然后将该上清液2等体积与第二反应试剂混合，并加入2～4μL Nicking酶、5～10μLcutsmart和43～86μL缓冲液进行反应0.5小时～1小时，形成优化的目标检测样品的Walker产物，利用荧光分光光谱分析装置，检测试剂体系的光谱，建立待测脂多糖样品溶液的脂多糖浓度和特定波长处试剂体系的荧光强度值之间的直线关系的计算模块，通过分析系统与步骤a所得参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。
作为上述技术方案进一步优选的技术方案，适用于检测牛奶、果汁饮料或茶饮料样品中的脂多糖浓度。
能高效、灵敏、特异性检测脂多糖，应用前景优异，测得数据准确可靠。本发明将点击化学与DNA walker相结合，利用脂多糖适配体与脂多糖的特异性识别作用，采用荧光分光光谱作为检测手段，达到了对脂多糖的高灵敏、高特异性分析检测的目的。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明测定脂多糖的荧光传感器选择性好、灵敏度高、检测范围宽；
2.本发明通过链霉亲和素固定脂多糖适配体的方式，将适配体固定在界面，增强了目标物诱导的链解离，提高了传感器的灵敏度；
3.本发明通过脂多糖适配体来识别脂多糖，具有很高的特异性，消除了其它物质的干扰；
4.本发明采用DNA walker这种高度并行性的行走方式进行信号放大，增强了传感器的灵敏度；
5.本发明创新点在于将点击化学与DNA walker进行结合，通过点击化学引发DNAwalker的进行，拓宽了DNA walker的应用，也增强了DNA walker的抗干扰性；
6.本发明基于荧光光谱分析方法，具有高灵敏度、信号稳定、检测方式简便等优点，能广泛用于食品领域的化学检测，达到高效、灵敏、快速检测脂多糖的目的。
附图说明
图1为本发明实施例一检测脂多糖的荧光传感器的原理示意图。
图2为第一反应试剂中脂多糖适配体修饰磁珠的荧光光谱对比图。a代表修饰脂多糖适配体的磁珠，加入SYBR Green II荧光染料的荧光光谱；b代表未修饰脂多糖适配体的磁珠，加入SYBR Green II荧光染料的荧光光谱；c为修饰脂多糖适配体的磁珠，加入SYBRGreen II荧光染料的的荧光显微镜图片；d为未修饰脂多糖适配体的磁珠，加入SYBR GreenII荧光染料的荧光显微镜图片。
图3为第一反应试剂中加入脂多糖适配体与识别链互补形成的双链修饰磁珠的荧光光谱对比图。a代表修饰双链的磁珠，加入SYBR Green I荧光染料的荧光光谱；b代表未修饰双链的磁珠，加入SYBR Green I荧光染料的荧光光谱；c为修饰双链的磁珠，加入SYBRGreen I荧光染料的荧光显微镜图片；d为未修饰双链的磁珠，加入SYBR Green I荧光染料的的荧光显微镜图片。
图4为第一反应试剂中加入脂多糖后与识别链竞争性结合适配体的荧光光谱对比图。a代表未加入脂多糖，加入SYBR Green I荧光染料的荧光光谱图；b代表加入脂多糖，加入SYBR Green I荧光染料的荧光光谱图；c为未加入脂多糖，加入SYBR Green I荧光染料的荧光显微镜图片；d为加入脂多糖，加入SYBR Green I荧光染料的荧光显微镜图片。
图5和图6分别为脂多糖的浓度梯度检测荧光光谱图以及在520nm处的荧光强度值线性关系图。
图7为本发明实施例一的脂多糖(LPS)和对比例二的牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(Ova)、ATP、葡萄糖(Glu)、乳糖(Lac)、淀粉(Amylum)分别与MB-LPSA/L’结合后获得的在520nm波长处荧光强度值对比图。
具体实施方式
本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：在本实施例中，参见图1到图7，一种检测脂多糖的荧光传感器，主要由试剂盒、固液分离装置、荧光分光光谱分析装置、分析系统和控制系统组成，所述控制系统控制试剂盒中的试剂的供应和检测数据的输入和输出；将脂多糖适配体(LPSA链)通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠(MB)上，利用固液分离装置，得到磁珠表面覆盖脂多糖适配体的磁珠(MB-LPSA)，再加入可以与脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA(L’链)，通过固液分离装置得到覆盖双链DNA的磁珠(MB-LPSA/L’)溶液，形成识别体系作为第一反应试剂，在所述覆盖双链DNA的磁珠(MB-LPSA/L’)溶液中修饰的脂多糖适配体链(LPSA)以及识别链DNA(L’)均加入摩尔浓度为4.8μM，体积50μL；在pH7.4条件下，按照DNA长链(L)和DNA短链(S)摩尔浓度配比为1：20的混合比例，将DNA长链与DNA短链进行混合，通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠(MB)上，得到覆盖长链和短链的磁珠，形成DNAWalker体系作为第二反应试剂；按照设定混合比例另外取用所述第一反应试剂和所述第二反应试剂，首先将所述第一反应试剂首先与待测的脂多糖样品溶液混合，由于脂多糖(LPS)与适配体(LPSA)进行结合使得识别链DNA(L’)竞争脱落并游离，形成MB-LPSA/LPS与L’的混合溶液，进行固液分离取含有L’的上清液，然后将含有L’的上清液和所述第二反应试剂混合，经过至少30分钟的点击化学反应以及1小时的DNA walker反应后形成优化的目标检测样品的Walker产物试剂体系，使产物作为最终的目标检测样品试剂，利用荧光分光光谱分析装置，检测试剂体系的光谱，通过分析系统与所述参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。
在本实施例中，设置建立待测的脂多糖样品溶液的脂多糖浓度和特定波长处试剂体系的荧光强度值之间的直线关系的计算模块，对待测的脂多糖样品溶液的脂多糖浓度进行定量计算，并通过输出装置将脂多糖浓度检测结果进行输出。
在本实施例中，一种检测脂多糖的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、第一反应试剂的制备：
①取50μL质量分数为1mg/mL的磁珠(MB)，通过磁分离冲洗三次去除上清液，加入50μL摩尔浓度为4.8μM的脂多糖适配体链(LPSA)，在30摄氏度下反应1小时；
②将在所述步骤①中得到的反应产物通过磁分离冲洗三次去除上清液，然后加入50μL摩尔浓度为4.8μM的识别链DNA(L’)，于37摄氏度下反应2小时，磁分离冲洗三次去除上清液，加入去离子水，得到MB-LPSA/L’作为第一反应试剂。
步骤二、第二反应试剂的制备：
a取50μL质量分数为1mg/mL的磁珠，通过磁分离冲洗三次去除上清液，加入50μL摩尔浓度为0.12μM的DNA短链，50μL摩尔浓度为2.4μM的DNA短链，在30摄氏度下反应1小时；
b将在所述步骤a中得到的反应产物通过磁分离冲洗三次去除上清液，加入去离子水，得到Walker反应体系，作为第二反应试剂。
步骤三、脂多糖适配体与脂多糖特异性识别及DNA walker的反应流程：
ⅰ.将在所述步骤②中制备的MB-LPSA/L’与待测脂多糖样品溶液混合于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中，室温下培育至少30分钟，得到产物溶液MB-LPSA/LPS与L’；
ⅱ.对在所述步骤ⅰ中得到的产物溶液利用磁分离后取含有L’的上清液，然后加入到第二反应试剂中通过L’末端修饰的叠氮(N3)与L末端修饰的二苯并环辛炔(DBCO)进行点击化学反应，30分钟后形成二苯并三氮唑，磁吸分离三次后加入2μL Nicking酶、5μLCutSmartTM缓冲液和43μL pH 7.4的磷酸盐缓冲液进行DNA walker反应，1小时后磁吸分离保留上清液。
步骤四、荧光分光光谱分析检测脂多糖流程：
将在步骤三中获得的上清液放入荧光比色皿中，加入50μL pH 7.4的磷酸盐缓冲液，利用荧光光谱技术分析装置，检测产物的荧光光谱，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。
如图1所示，当脂多糖存在的条件下，MB-LPSA/L’表面脂多糖适配体(LPSA)与脂多糖(LPS)进行特异性识别并互补配对，竞争游离出识别链(L’)，识别链末端的叠氮(N3)通过点击化学反应结合第二反应试剂中DNA长链(L)的二苯并环辛炔，因识别链(L’)可以部分互补DNA短链(S)，在加入Nicking酶后可以实现DNA walker，进而对产物进行荧光检测分析。
本实施荧光传感器的制备方法及应用，通过点击化学介导的DNA walker检测脂多糖，能高效、灵敏、快速检测牛奶、茶饮料、果汁饮料中的脂多糖含量，应用于食品和保健品分析技术领域。
对比例一：
本对比例与上述实施例一步骤基本相同，特别之处在于：
在对比施例中，参见图7，进行生物传感器特异性研究：
为了验证本发明检测脂多糖的特异性，我们用了不同的蛋白如牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(Ova)、ATP、葡萄糖(Glu)、乳糖(Lac)、淀粉(Amylum)按照实施例一的操作过程处理来验证该生物传感器的特异性。如图7所示，即使BSA、Ova、ATP、Glu、Lac以及Amylum的浓度比脂多糖浓度高1000倍，仍然不能引起荧光强度值的明显变化。此对照反应说明了上述实施例的脂多糖适配体与脂多糖结合有高度的特异性，保证了生物传感器检测的高度选择性。
通过实施例一与上述对比例的对比分析可知，实施例一利用点击化学介导的DNAwalker以及脂多糖适配体对脂多糖的特异性识别进行对脂多糖特异性和灵敏性的检测。实施例一所采用的机理如下：选用脂多糖适配体(LPSA)作为脂多糖(LPS)的识别元件，通过脂多糖适配体末端修饰的生物素与磁珠表面的链霉亲和素反应将脂多糖适配体修饰到磁珠上，得到表面覆盖脂多糖适配体的磁珠(MB-LPSA)，然后加入与脂多糖适配体互补的识别链DNA，得到表明覆盖双链DNA的磁珠(MB-LPSA/L’)。在脂多糖存在的情况下，脂多糖会与脂多糖适配体结合，竞争游离出识别链DNA(L’)。识别链DNA进入第二反应试剂中，通过其末端的叠氮(N3)与长链的二苯并环辛炔进行点击化学反应结合，与短链的互补序列识别，在Nicking酶作用下进行DNA walker，对其产物进行荧光检测有强的荧光强度值，反之在没有脂多糖的情况下则不会游离识别链DNA，进而无法进行DNA walker，所以没有明显荧光强度值。在这个检测体系中，磁珠表面脂多糖适配体与脂多糖的特异性结合和点击化学介导的DNA walker信号放大作用，使高灵敏度、高特异性且稳定分析检测脂多糖成为可能。
实施例二：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，参见图5和图6，进行不同浓度的脂多糖的检测。
将双链修饰的磁珠(MB-LPSA/L’)与不同浓度的脂多糖(10-4ng/mL～107ng/mL)反应，经过特异性识别结合以及DNA walker反应之后，用荧光分光光谱法检测。
如图5所示，反应产物溶液在520nm波长处的荧光强度值随脂多糖的浓度升高而升高。图5为在各种浓度脂多糖存在的条件下，在510nm～600nm波长范围内光谱图。图6为520nm荧光强度值与脂多糖浓度之间的线性关系图，在10-4ng/mL～107ng/mL的脂多糖浓度范围内，荧光强度增加值与脂多糖浓度成线性关系。
上述实施例传感器通过荧光分光光谱技术进行检测，利用了脂多糖适配体修饰的磁珠对脂多糖的识别及点击化学介导的DNA walker后的荧光信号输出。上述实施例利用了脂多糖适配体与脂多糖的高特异性结合，保证了检测的高度特异性，借助点击化学介导的DNA wlaker技术提高了检测的灵敏性。通过荧光分光光谱技术捕捉walker产物的荧光强度变化，实现了脂多糖的分析检测。上述实施例方法简单、稳定性高、特异性强、灵敏度高，可以在10-4ng/mL～107ng/mL范围内线性检测脂多糖，且可以有效地区分脂多糖与其他对照物质。
实际样品检测研究：
采用加样回收法，运用本实施例荧光传感器测定了牛奶、果汁饮料、茶饮料(绿茶)中脂多糖的浓度，参见下表。可知，本实施例荧光传感器能够准确测定实际样品中脂多糖浓度。
上述实施例利用脂多糖适配体修饰的磁珠检测脂多糖的荧光传感，其特征是基于脂多糖适配体和脂多糖的特异性结合可以竞争识别链，使得识别链通过叠氮反应结合第二反应试剂中的长链，在加入Nicking酶的条件下进行DNA walker，其产物借助荧光分光光谱技术分析并检测脂多糖。
上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明检测脂多糖的荧光传感器、其制备方法和应用的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种检测脂多糖用荧光传感器，由第一试剂和第二试剂组成，其特征在于：
所述的第一试剂是覆盖有脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的磁珠水溶液，浓度为0.5mg/ml-1mg/ml；所述的脂多糖适配体LPSA链和脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA的的摩尔比为1:1-1:2；
所述的第二试剂是由覆盖有长链和短链的磁珠形成的DNA Walker体系，其浓度为0.5mg/ml-1mg/ml，其中长链和短链的摩尔比为1：10-1:20；所述的长链是与第一试剂中的产物进行点击化学识别的链，其碱基序列为：5’-biotin- TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-N3-3’；所述的短链为第一试剂互补配对的链，其碱基序列为：5’-biotin-TTTTTTTTTTAGCTGAGGAT-Fam-3’ 。
2.一种制备根据权利要求1所述的检测脂多糖用荧光传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.所述的第一试剂的制备方法为：将脂多糖适配体LPSA链通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠MB上，得到磁珠表面覆盖脂多糖适配体的磁珠MB-LPSA，再加入可以与脂多糖适配体碱基互补配对的识别链DNA，得到覆盖双链DNA的磁珠（MB-LPSA/L’）溶液，形成识别体系作为第一反应试剂；
b.所述的第二试剂的制备方法为：在pH7.4条件下，按照DNA长链（L）和DNA短链（S）混合摩尔浓度配比为1：10-1:20的混合比例，通过生物素与链霉亲和素结合的方式修饰到磁珠（MB）形成DNA Walker体系作为第二反应试剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其特征在于所述的步骤a的具体步骤为：
a-1. 取磁珠浸没在摩尔浓度为4.8 µM的脂多糖适配体链（LPSA）水溶液中，在30℃下反应1小时0.5h-1h；
a-2. 将步骤a-1中得到的反应产物冲洗三次去除上清液，然后加入到摩尔浓度为4.8µM的识别链DNA（L’）的水溶液中，于37℃下反应2小时，洗涤去除上清液，加入去离子水，得到MB-LPSA/L’作为第一反应试剂，其浓度为0.5mg/ml-1mg/ml。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其特征在于所述的步骤b的具体步骤为：
b-1. 将经清洗处理过的磁珠，浸没到含有摩尔浓度为0.12 µM的 DNA长链和摩尔浓度为2.4 µM的 DNA短链的水溶液中，在30摄氏度下反应0.5h-1h；
b-2. 将步骤b-1中得到的反应产物经清洗后去除上清液，加入去离子水，配置成浓度为0.5mg/ml-1mg/ml的Walker反应体系作为第二反应试剂。
5.一种脂多糖的检测方法，采用根据权利要求1所述的检测脂多糖用荧光传感器进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为：
a.建立标准工作曲线：将每50μL ～100μL第一反应试剂磁分离后去除上清液1，分别浸没在等体积的浓度为0～107ng/mL的靶标物质脂多糖（LPS）的磷酸盐缓冲液中进行识别，得到磁分离后的上清液2，将该上清液2等体积转移到第二反应试剂中进行混合，并加入2～4μL Nicking酶、5～10μLcutsmart和43～86μL缓冲液进行反应0.5小时～1小时，得到产物，利用荧光分光光谱分析装置，检测参照试剂的光谱，并做出靶标物质脂多糖和荧光强度的线性图；所述的磷酸盐缓冲液是 pH 值为7.4的磷酸盐缓冲液；
b.样品检测：将每50μL ～100μL第一反应试剂磁分离后去除上清液1，浸没在等体积的待测的脂多糖样品的磷酸盐缓冲液中，室温下培育0.5小时～1小时，得到磁分离后的上清液2，然后将该上清液2等体积与第二反应试剂混合，并加入2～4μL Nicking酶、5～10μLcutsmart和43～86μL缓冲液进行反应0.5小时～1小时，形成优化的目标检测样品的Walker产物，利用荧光分光光谱分析装置，检测试剂体系的光谱，建立待测脂多糖样品溶液的脂多糖浓度和特定波长处试剂体系的荧光强度值之间的直线关系的计算模块，通过分析系统与步骤a所得参照试剂的特征光谱进行对比，并通过光谱对比结果来确定所检测的脂多糖的含量水平。
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