CN111595830A - 一种手持式乳制品风险污染物检测仪及检测方法 - Google Patents

一种手持式乳制品风险污染物检测仪及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种手持式乳制品风险污染物检测仪及检测方法。本发明结合荧光检测和生物识别原理的优势，使得手持式乳制品风险污染物检测仪具有检测灵敏度高、检测速度快、操作简单、选择性好等特点；采用双锥形光纤维传感器可有效提高激发光的激发效率和荧光收集效率，提高仪器的灵敏度。该方法可以用于乳制品风险污染物的高灵敏快速检测。

Description

一种手持式乳制品风险污染物检测仪及检测方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，涉及一种手持式乳制品风险污染物检测仪及检测方法。
背景技术
民以食为本，食以安为先。随着经济全球化进程日益加速，食品安全不仅事关消费者健康，而且影响国际食品和农产品贸易，成为国际社会关注的焦点问题之一。由 于饲料霉变产生的生物毒素最终残存到乳制品中，导致人体面临着黄曲霉毒素、赭曲 霉毒素、呕吐毒素等生物安全风险，当前色谱和质谱技术不能满足企业自检的需求， 酶联免疫等快速方法尚存在一些“假阳性”、检测项目不全的问题，导致企业对生物毒 素的自检成为现实存在的瓶颈问题。因此针对食品安全问题发展高效、高灵敏检测仪 器十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够实现乳制品风险污染物现场快速检测的手持式乳制品风险污染物检测仪及检测方法。
本发明提供的手持式快速检测仪器，包括光学系统、微流控样品池和信号处理系统；
所述光学系统包括LED激发光源、凸透镜、双锥形光纤维传感器、光纤维连接 器、跳线、滤光片和光电二极管探测器；
所述微流控样品池包含一个样品入口和一个样品出口；其中，所述样品入口靠近所述凸透镜；所述样品出口靠近所述光纤维连接器；
所述双锥形光纤维传感器嵌入在所述微流控样品池中；
所述信号处理系统包括依次连接的荧光信号光电转换模块、弱信号前置放大器、数字信号处理模块和显示屏。
上述手持式快速检测仪器中，所述双锥形光纤维传感器由光纤和包覆在所述光纤外的外壳组成；
所述光纤和所述外壳采用相同的结构；
所述光纤的结构为双锥形结构；
所述双锥形结构具体为由两个粗段和细段组成；所述两个粗段通过细段连接，且所述粗段向所述细段渐缩；所述两个粗段的开口处直径相同，且均大于所述细段的直 径；
所述粗段的开口处直径为550-650μm；具体为600μm；
所述细段的直径为280-400μm；具体为300μm；
所述细段的长度为2.5～3.5cm；具体为3cm；
所述双锥形光纤维传感器的总长度为5cm；
锥角为0.2～0.5；
所述双锥形光纤维传感器的折射率为1.436；
构成所述光纤的材料为石英玻璃纤维；
构成所述外壳的材质为POM。
上述本发明提供的手持式快速检测仪器在检测中的应用，也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述检测为检测污染物；具体为检测乳制品风险污染物；更具体为检测黄曲霉毒素；再具体为检测黄曲霉毒素M1(也即AFM1)。
本发明还提供了一种利用前述本发明提供的手持式快速检测仪器检测污染物的方法，该方法包括：
1)将所述手持式快速检测仪器中所述双锥形光纤维传感器的光纤进行生物识别分子的修饰；
2)将待测污染物包被抗原固定到所述光纤表面，装回所述双锥形光纤维传感器中， 靠近所述样品入口的细段放置；
3)标准曲线的绘制：
将待测污染物荧光标记抗体与一系列不同浓度的待测污染物标准品溶液混合先进行预反应后，再置于所述微流控样品池中进行荧光反应，反应完毕后将反应混合物 冲洗出去后，启动所述LED激发光源，使激发光进入所述双锥形光纤维传感器，收集 所述信号处理系统接收到的荧光信号，以荧光信号响应强度为纵坐标，以所述待测污 染物标准品溶液的浓度为横坐标，进行拟合，得到标准曲线；
4)待测污染物浓度的测定：
将待测污染物荧光标记抗体与待测污染物溶液混合先进行预反应后，再置于所述微流控样品池中进行荧光反应，反应完毕后将反应混合物冲洗出去后，启动所述LED 激发光源，使激发光进入所述双锥形光纤维传感器，收集所述信号处理系统接收到的 荧光信号，将所得荧光信号响应强度与步骤3)所得标准曲线对比，即可得到所述待 测污染物的浓度；
所述步骤4)预反应和荧光反应步骤的反应条件与所述步骤3)相同。
上述方法中，所述生物识别分子为黄曲霉毒素；
所述修饰为各种常用方法，如可按照包括如下步骤的方法进行修饰：
将所述双锥形光纤维传感器于piraha溶液中浸泡(以实现羟基化)后，用超纯水清洗后硅烷化；
具体的，所述piraha溶液中，浓硫酸和双氧水的体积比为3：1；
所述浸泡步骤中，时间为20-40min；具体为30min；
所述硅烷化步骤中，所用硅烷化试剂为APTES水溶液；所述APTES水溶液的质 量百分浓度为4％-5％；具体为4.5％。
所述步骤2)固定步骤中，所用固定方法为各种常用方法；具体的，所述固定剂 可为戊二醛水溶液；所述固定剂的质量百分浓度具体为3％-5％；更具体为4％；
所述固定具体包括将步骤1)所得硅烷化光纤浸泡于固定剂中，震荡反应0.5-1.5h(具体可为1h)，得到表面修饰有双功能基团的锥形光纤；再将所得表面修饰有双功 能基团的锥形光纤浸泡在浓度为0.5μg/ml的AFM1包被抗原(购买于石家庄智唯生物 科技有限公司)中，在4℃下反应8h后取出用PBS缓冲液清洗3次而得。
所述步骤3)激发光进入所述双锥形光纤维传感器的角度为5～15°。
所述步骤3)预反应步骤中，时间为3-5min；具体为4min；
所述步骤3)荧光反应步骤中，时间为4-7min；具体为5min；
所述荧光标记抗体与待测污染物的体积比为1：1-10；具体为1:5；
所述荧光标记抗体的浓度为0.1-1.0μg/mL；具体为0.5μg/mL。
所述冲洗步骤中，所用冲洗剂为缓冲溶液；
具体的，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液；所述PBS缓冲溶液的pH值为7.4；浓 度为100mM。
所述荧光标记抗体具体为黄曲霉毒素荧光标记抗体。该荧光标记抗体可按照各种常规方法，通过对黄曲霉毒素抗体进行荧光标记而得。
所述待测污染物荧光标记抗体更具体为Cy5.5标记的AFM1荧光标记抗体；
本发明中，所述黄曲霉毒素具体可为黄曲霉毒素M1(也即AFM1)。
当检测样品时，将修饰有特定生物识别分子的双锥形光纤维传感器放入微流控样品池，然后将荧光标记的抗体分子和待测样品混合反应一段时间后，将混合物加入微 流控样品池，部分荧光标记的抗体分子结合到双锥形光纤维传感器中光纤表面上，经 过一定时间后，使用PBS缓冲溶液将未反应的样品冲洗出去，打开半导体激光器，其 发出的激发光经凸透镜后以一定角度进入双锥形光纤维传感器，激发光激发荧光分子 发出荧光，荧光经滤光片后被光电二极管探测器探测到，经光电转换、放大和数字化 后，在显示屏上显示检测结果。根据荧光信号强度与待测物浓度的定量关系，实现待 测风险污染物的定量检测。
本发明融合光学生物传感技术和微流控技术，发明了一种可以用于乳制品风险污染物高灵敏、快速检测的手持式快速检测仪器。其原理是，当一束激发光以一定角度 进入双锥形光纤维传感器时，其可以诱导激发结合到双锥形光纤维传感器荧光标记的 抗体分子发出荧光信号。由于结合到双锥形光纤维传感器的抗体分子数量与乳制品中 的待测物浓度成反比，因此，手持式乳制品快速检测仪器检测到的荧光信号与乳制品 中的待测风险污染物成反比关系，从而实现乳制品风险污染物的定量检测。依据此原 理的手持式乳制品风险污染物检测仪具有仪器体积小、检测灵敏度高、选择性强、操 作简单、检测速度快等优点，适合乳制品风险污染物的现场快速检测。
本发明由于采取以上技术方案，具有以下优点：
(1)结合荧光检测和生物识别原理的优势，使得手持式乳制品风险污染物检测仪具有检测灵敏度高、检测速度快、操作简单、选择性好等特点；
(2)仪器采用超微量微流控样品池，所需样品量少，节省试剂费用；
(3)采用双锥形光纤维传感器可有效提高激发光的激发效率和荧光收集效率，提高仪器的灵敏度；
(4)采用样品反应与检测分离模式，减少荧光分子漂泊几率，进一步提高检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明的手持式乳制品风险污染物检测仪的结构示意图；
图2为本发明的双锥形光纤维传感器结构示意图。
图3为黄曲霉毒素M1的免疫传感分析特征信号响应曲线。
图4为不同AFM1(也即黄曲霉毒素M1)抗体浓度下检测黄曲霉毒素M1的标准 曲线。
图5为HPLC与手持式仪器检测结果的线性相关性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获 得。
实施例1、
如图1所示，本发明提供的手持式乳制品风险污染物检测仪，包含光学系统、微 流控样品池3以及信号处理系统。
所述光学系统包括LED激发光源1、凸透镜2、双锥形光纤维传感器4、光纤维 连接器5、跳线6、滤光片7、光电二极管探测器8。
所述微流控样品池3，该微流控样品池3包括一个进样口和一个出样口。
所述信号处理系统包括荧光信号光电转换模块9、弱信号前置放大器10、数字信号处理模块11和显示屏12；
LED激发光源1发出的激发光经凸透镜2以一定角度进入双锥形光纤维传感器 4。激发光在双锥形光纤维传感器4以全内反射方式传播，部分能量可透过双锥形光纤 维传感器4的界面激发结合表面的抗体分子标记荧光分子发出荧光，部分荧光耦合回 双锥形光纤维传感器，经其第二个锥形结构，将高阶模的荧光转换成低阶模的光，提 高荧光的收集效率，该部分荧光经跳线6和滤光片7后，由光电二极管探测器8探测 到。再经过荧光信号光电转换模块9和弱信号前置放大器10将噪声中的荧光提出并 放大，最后利用数字信号处理模块11处理后，检测结果显示在显示屏12上。
如图2所示，双锥形光纤维传感器4是整个系统的核心部件，本发明中，所述双 锥形光纤维传感器由光纤和包覆在所述光纤外的外壳组成；所述光纤和所述外壳采用 相同的结构；所述光纤的结构为双锥形结构；所述双锥形结构为由两个粗段和细段组 成；所述两个粗段通过细段连接，且所述粗段向所述细段渐缩；所述两个粗段的开口 处直径相同，且均大于所述细段的直径；双锥形光纤维传感器4中光纤维石英玻璃纤 维，外壳的材质为POM，折射率为1.436，总长度为5cm，粗段开口处的直径为600μm， 细段长度为3cm，细段的直径为300μm；锥角为0.3。
上述双锥形光纤维传感器4中光纤的制作过程为：首先光纤维截断5cm长的光 纤维段，然后将其中间3cm部分放入40％HF溶液浸泡适当时间，使光纤维的直径腐 蚀至300μm，使得两端均形成锥形结构，即得。
实施例2
利用实施例1提供的手持式快速检测仪器检测污染物黄曲霉毒素的方法，包括：
1)将所述手持式快速检测仪器中所述双锥形光纤维传感器的光纤按照如下方法进行生物识别分子的修饰：
将所述光纤于piraha溶液中浸泡30min后，用超纯水清洗后用质量百分浓度为4.5％的APTES水溶液进行硅烷化；
所述piraha溶液中，浓硫酸和双氧水的体积比为3：1；
2)将步骤1)所得硅烷化光纤浸泡于4％的戊二醛水溶液中，在室温下震荡反应1h，得到表面修饰有双功能基团的锥形光纤；
再将所得表面修饰有双功能基团的锥形光纤浸泡在浓度为0.5μg/ml的AFM1包 被抗原(购买于石家庄智唯生物科技有限公司)中，在4℃下反应8h，后取出用PBS 缓冲液清洗3次，得到偶联AFM1包被抗原的光纤探针；
将所述AFM1包被抗原的光纤探针装回所述双锥形光纤维传感器中，靠近所述样品入口的细段放置；
4)基于浓度为1.0μg/ml的Cy5.5标记的AFM1荧光标记抗体母液(购买于石家 庄智唯生物科技有限公司)，用PBS缓冲液稀释，获得体积为200μL、不同浓度(0、 0.01、0.1、0.3、1、3、10、30、100μg/L)的AFM1荧光标记抗体水溶液。将这些溶液 与样品以体积比1:5混合，先进行预反应4min后，再将预反应后的混合物泵入所述微 流控样品池中，直至充满样品池内部，过程为20s，停止进样后进行荧光反应5min， 使Cy5.5标记的AFM1荧光标记抗体与光纤表面修饰的AFM1包被抗原进行特异性结 合，反应完毕后用pH值为7.4、浓度为100mM的PBS缓冲溶液将反应混合物冲洗出 去后，启动所述LED激发光源1，使激发光进入所述双锥形光纤维传感器4，根据所 述信号处理系统接收到的荧光信号，即可确定样品中黄曲霉毒素的浓度。
图3为AFM1的典型信号响应曲线。当将浓度为0.5μg/mL的抗AFM1荧光标记 抗体通入样品池后，系统信号值随着时间的推移逐渐增大，在反应时间达到10min时， 信号的上升幅度逐渐平缓，此时，信号值约能达到60左右。反应结束后，使用0.5％， pH＝1.9的SDS溶液对探头进行再生，发现信号值迅速下降，并最终回到基线位置。该 信号响应曲线表明本发明所构建双锥形光纤维传感器具有良好的反应活性及再生性。
图4为抗AFM1荧光标记抗体浓度为0.5μg/mL时，黄曲霉毒素M1的检测标准曲 线。利用Logistic四参数数学模型(式I)对该曲线进行拟合，可以得到AFM1的定量 检测方程。在该抗体浓度下，AFM1的检测区间为0.16～22.03μg/L，检测限为0.02μg/L。
Figure BDA0002514208290000061
式中，[X]是标准品(待测物)的浓度，为自变量；单位为μg/mL；
Y为信号响应强度，是因变量；
A1、A2均为拟合出的常数，分别对应的是上端渐近线(X＝0)和下端渐近线(X→∞)；X0是曲线的中点，也称作拐点，是常数；
P是拐点处曲线的斜率，为拟合出来的常数。
性能测试与验证
采用高效液相色谱法(HPLC)进行加标乳制品中AFM1的检测，结果如表1所 示，含有3种不同浓度AFM1的牛奶样品的添加-回收率均在100％～110％之间。HPLC 检测结果与本发明手持式仪器的检测结果间具有较好的线性相关性(图5)，R2可达 0.98998，这表明本发明手持式仪器在实际样品的检测中具有良好的准确性。
表1、HPLC检测加标乳制品中AFM1结果
Figure BDA0002514208290000071

Claims (10)

1.一种手持式快速检测仪器，其特征在于：包括光学系统、微流控样品池和信号处理系统；
所述光学系统包括LED激发光源、凸透镜、双锥形光纤维传感器、光纤维连接器、跳线、滤光片和光电二极管探测器；
所述微流控样品池包含一个样品入口和一个样品出口；其中，所述样品入口靠近所述凸透镜；所述样品出口靠近所述光纤维连接器；
所述双锥形光纤维传感器嵌入在所述微流控样品池中；
所述信号处理系统包括依次连接的荧光信号光电转换模块、弱信号前置放大器、数字信号处理模块和显示屏。
2.根据权利要求1所述的手持式快速检测仪器，其特征在于：所述双锥形光纤维传感器由光纤和包覆在所述光纤外的外壳组成；
所述光纤和所述外壳采用相同的结构；
所述光纤的结构为双锥形结构；
所述双锥形结构具体为由两个粗段和细段组成；所述两个粗段通过细段连接，且所述粗段向所述细段渐缩；所述两个粗段的开口处直径相同，且均大于所述细段的直径；
所述粗段的开口处直径为550-650μm；具体为600μm；
所述细段的直径为280-400μm；具体为300μm；
所述细段的长度为2.5～3.5cm；具体为3cm；
所述双锥形光纤维传感器的总长度为5cm；
锥角为0.2～0.5；
所述双锥形光纤维传感器的折射率为1.436；
构成所述光纤的材料为石英玻璃纤维；
构成所述外壳的材质为POM。
3.权利要求1或2所述手持式快速检测仪器在检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述检测为检测污染物；具体为检测乳制品风险污染物。
5.一种利用权利要求1或2所述手持式快速检测仪器检测污染物的方法，包括：
1)将所述手持式快速检测仪器中所述双锥形光纤维传感器的光纤进行生物识别分子的修饰；
2)将待测污染物包被抗原固定到所述光纤表面，装回所述双锥形光纤维传感器中，靠近所述样品入口的细段放置；
3)标准曲线的绘制：
将待测污染物荧光标记抗体与一系列不同浓度的待测污染物标准品溶液混合先进行预反应后，再置于所述微流控样品池中进行荧光反应，反应完毕后将反应混合物冲洗出去后，启动所述LED激发光源，使激发光进入所述双锥形光纤维传感器，收集所述信号处理系统接收到的荧光信号，以荧光信号响应强度为纵坐标，以所述待测污染物标准品溶液的浓度为横坐标，进行拟合，得到标准曲线；
4)待测污染物浓度的测定：
将待测污染物荧光标记抗体与待测污染物溶液混合先进行预反应后，再置于所述微流控样品池中进行荧光反应，反应完毕后将反应混合物冲洗出去后，启动所述LED激发光源，使激发光进入所述双锥形光纤维传感器，收集所述信号处理系统接收到的荧光信号，将所得荧光信号响应强度与步骤3)所得标准曲线对比，即可得到所述待测污染物的浓度；
所述步骤4)预反应和荧光反应步骤的反应条件与所述步骤3)相同。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述生物识别分子为黄曲霉毒素；
所述修饰包括：将所述光纤维于piraha溶液中浸泡后，用超纯水清洗后硅烷化；
具体的，所述piraha溶液中，浓硫酸和双氧水的体积比为3：1；
所述浸泡步骤中，时间为20-40min；具体为30min；
所述硅烷化步骤中，所用硅烷化试剂为APTES水溶液；所述APTES水溶液的质量百分浓度为4％-5％；具体为4.5％。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)固定步骤中，所述固定剂为戊二醛水溶液；所述固定剂的质量百分浓度具体为3％-5％；更具体为4％。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述激发光进入所述双锥形光纤维传感器的角度为5～15°。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)预反应步骤中，时间为3-5min；具体为4min；
所述荧光反应步骤中，时间为4-7min；具体为5min；
所述荧光标记抗体与待测污染物的体积比为1：1-10；具体为1:5；
所述荧光标记抗体的浓度为0.1-1.0μg/mL；具体为0.5μg/mL。
10.根据权利要求5-9任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)冲洗步骤中，所用冲洗剂为缓冲溶液；
具体的，所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液；所述PBS缓冲溶液的pH值为7.4；浓度为100mM。
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