CN109307773A

CN109307773A - 一种蛋白糖基化检测试剂盒、检测方法及应用

Info

Publication number: CN109307773A
Application number: CN201811285534.8A
Authority: CN
Inventors: 李娟�; 李婧影; 刘淑雅; 杨黄浩
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109307773B

Abstract

本发明公开了一种蛋白糖基化检测试剂盒、检测方法及应用，采用糖基标签核酸序列修饰蛋白表面的叠氮化糖基、引入蛋白探针核酸序列、引入杂交链式反应试剂等技术手段，实现特定蛋白的靶向、基于HCR的非酶放大策略、将其用于活细胞、活体中细胞膜表面特定蛋白糖基化检测、成像的蛋白质糖基化检测试剂盒、检测方法，及在体外、体内等各应用场合的检测应用。

Description

一种蛋白糖基化检测试剂盒、检测方法及应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种蛋白糖基化检测试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

蛋白糖基化是一类广泛存在于绝大多数真核细胞中的复杂的蛋白质翻译后修饰，生物体中超过70%的蛋白是糖蛋白，它们参与了许多重要的生理过程，包括调节蛋白质的折叠、细胞间的粘合、细胞内分子的转运和清除、受体的激活、信号的传递和生物大分子的内吞。在以前的研究中，较多的关注于蛋白整体的糖基化水平，而对于蛋白特异性的糖基化修饰关注的较少。目前，越来越多的研究显示，在生物学进程中，特定蛋白上的特异性糖基化比整体水平的糖基化更具有生物学意义。例如，细胞表面以及细胞内一些蛋白质上糖基化的变化，是肿瘤形成和发展的一种特征性表型。因而，细胞表面特定蛋白糖基化的可视化研究对于在细胞动态生理环境下阐明蛋白糖基化的功能是至关重要的。

迄今为止，能够直接在细胞水平标记特定蛋白的特异性糖基化修饰的技术手段还很有限。主要有两方面的原因：一是与其他蛋白翻译后修饰不同，糖基化修饰结构多变，二是多糖免疫原性相对较低，使其很难得到亲和力高的抗体，虽然一些报道基于凝集素的识别能力对细胞表面的N-糖基进行标记，但无法用于O-糖基标记，且凝集素的亲和力较低、高浓度时具有毒性。近年来，一系列基于糖代谢标记的技术被开发且用于细胞表面糖基改造，例如N-乙酰甘露糖胺（ManNAz）类似物被用于代替唾液酸合成过程中的天然代谢前体物质。在此基础上，结合糖基标记与蛋白标记即可实现蛋白特异性糖基化的成像。目前发展的一些联合化学手段的荧光标记技术，在细胞水平直接来标记特定蛋白上的特定糖基化修饰，使这种蛋白上的糖基化修饰在荧光显微镜下可视化，目前应用比较多的主要是FRET技术。然而，这些方法由于受限于FRET成像方式固有的缺陷，普遍存在着背景信号高、FRET效率低、选择合适供体/受体荧光分子对上存在困难等问题。因而，研究者们在致力于提高FRET效率的同时，也在寻求其他的解决策略，信号放大技术则提供了另一种思路。一些基于链式聚合反应（PCR）、滚环扩增（RCA）和核酸外切酶Ⅲ辅助循环杂交技术等信号放大策略也被应用于特定蛋白糖基化检测。但由于上述反应均需要酶的参与，它们在活体中的应用就受到了很大的限制。

杂交链式反应（HCR）是于2004年发展出来的一种简单有效的等温扩增反应，在该类反应中，一段引发序列（initiator）可触发两种作为“燃料”的DNA发夹结构之间发生杂交，形成具有几十到几百个重复单元的双螺旋结构，直到耗尽“燃料”。由于HCR无需酶的参与且具有等温放大效率高、灵敏度高、结构可变性高等优点，已被广泛用于各种生物分子的检测，包括核酸、蛋白、酶活性、小分子、金属离子以及肿瘤细胞。此外，HCR结合识别分子，如抗体和核酸适体，发展出原位或细胞内的成像技术，有助于更好地认识生理过程，并用于疾病诊断和治疗。但迄今为止，HCR放大策略在活细胞/活体的特定蛋白糖基化检测方面的应用还是空白。

综上所述，针对急需发展适用于活细胞/活体中特定蛋白糖基化的原位信号放大检测技术的重大需求，本发明拟设计一种基于HCR的非酶放大策略，将其用于活细胞、活体中细胞膜表面特定蛋白糖基化成像。通过设计DNA探针序列，仅在具有双靶标（蛋白和糖基）的共同响应时，DNA探针发生构象变化进而引发HCR，实现对特定蛋白糖基化检测的同时进行荧光信号的放大。本发明的实施方法不仅有望获得一种灵敏度高、特异性强的特定蛋白糖基化检测方法，而且还可为开发多靶标同时检测方法提供一定的参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白糖基化检测试剂盒、检测方法及应用，要解决的技术问题包括但不限于以下任一技术问题：第一方面，如何实现蛋白糖基化的检测，如何实现适用于体外、细胞、活体等各场合的蛋白糖基化的检测；第二方面，如何实现特定蛋白糖基化、蛋白特异性糖基化的检测；第三方面，如何实现蛋白糖基化检测信号的增强，检测精度的提高，动态实现精确检测以及如何实现可视化检测等。

本发明的主要发明构思在于：

第一方面，采用糖基标签核酸序列修饰蛋白表面的叠氮化糖基，直接或间接产生光学信号，从而实现蛋白糖基化的检测；

第二方面，进一步引入蛋白探针核酸序列，实现特定蛋白的靶向，并与糖基标签核酸序列邻近杂交后引发光学信号，从而实现特定蛋白糖基化的检测；

第三方面，进一步引入杂交链式反应试剂，蛋白探针核酸序列，实现特定蛋白的靶向，并使引发剂引发杂交链式反应试剂发生反应，反应产物包含分子信标产生光学信号，实现信号的进一步放大；更进一步的，本发明的主要目的在于设计一种基于HCR的非酶放大策略、将其用于活细胞、活体中细胞膜表面特定蛋白糖基化检测、成像的蛋白质糖基化检测试剂盒、检测方法，及在体外、体内等各应用场合的检测应用。

特定蛋白质的糖基化状态的可视化研究对于发现它们在疾病发展中的作用具有重要意义。然而，糖基化的普遍性使得特定蛋白上糖基的检测如同大海捞针。基于此，发明人还具体构建了一种基于临近诱导的杂交链式反应（HCR），实现在体外、活细胞、活体上特定蛋白糖基化的实时检测。

具体的，本发明第一方面提供如下技术方案：一种蛋白糖基化检测试剂盒，该试剂盒包括：

（1）糖代谢试剂，所述糖代谢试剂能够代谢至细胞膜蛋白，并表达叠氮化糖基；

（2）糖基标签核酸序列，所述糖基标签核酸序列能够修饰到所述叠氮化糖基上，直接或间接产生光学信号。

其中，“表达叠氮化糖基”在本领域中也表述为“使细胞膜表面的糖链末端修饰叠氮基团”、“使细胞表面带上叠氮基团”、“使细胞表面表达含叠氮基团的糖链”、“azidosugar labeling”、“azido sialic acid”、“metabolically incorporate azido sugarsinto their glycoproteins”等，其含义是通常的、清楚的，为本领域技术人员所熟知的，类似表达，可以列举的现有技术包括于学位论文《蛋白特异性糖基化修饰的标记影像以及利用糖链为肿瘤细胞提供免疫治疗》、学术论文Imaging the Glycosylation State of CellSurface Glycoproteins by Two-Photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy（Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52 (52): 14045-14049）

进一步的，所述糖基标签核酸序列通过生物正交反应修饰到所述叠氮化糖基上。

所述生物正交反应为点击化学反应。

具体的，本发明第二方面提供如下技术方案：在第一方面的基础上，所述试剂盒还包括：

蛋白探针核酸序列，所述蛋白探针核酸序列至少包括两段功能序列：核酸适配体、光学信号引发区，所述核酸适配体靶向所述细胞膜蛋白，所述光学信号引发区包括与所述糖基标签核酸序列完全互补的间隔区，所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后引发光学信号。

进一步的，所述光学信号引发区包括分子信标，所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后，所述分子信标转变为“开”状态。

进一步的，所述糖基标签核酸序列上带有荧光共振能量转移供体，所述蛋白探针核酸序列带有荧光共振能量转移受体；或者，所述糖基标签核酸序列上带有荧光共振能量转移受体，所述蛋白探针核酸序列带有荧光共振能量转移供体；所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后产生荧光共振能量转移。

具体的，本发明第三方面提供如下技术方案：在第一方面的基础上，，所述试剂盒还包括：

（1）杂交链式反应试剂，所述杂交链式反应试剂包括至少一种包含分子信标的单体；

（2）蛋白探针核酸序列，所述蛋白探针核酸序列为ASI功能核酸（Aptamer-Spacer-Initiator），所述ASI功能核酸包括三段功能序列：核酸适配体（Aptamer）、间隔区（Spacer）和引发剂（Initiator），其中，所述核酸适配体靶向所述细胞膜蛋白，所述间隔区与所述引发剂部分互补杂交形成发卡结构，所述间隔区与所述糖基标签核酸序列完全互补；

（3）所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后，所述引发剂引发所述杂交链式反应试剂发生反应，反应产物包含的分子信标产生光学信号。

进一步的，所述杂交链式反应试剂包括至少两种能够发生链式反应的核酸序列，其中，至少一种核酸序列包含分子信标。

进一步的，所述杂交链式反应试剂包括所述引发剂触发链式反应的DNA发夹结构H1和DNA发夹结构H2，其中，所述DNA发夹结构H1和/或所述DNA发夹结构H2包含分子信标。

具体的，本发明提供了一种与第一方面相对应的，采用上述的蛋白糖基化检测试剂盒进行蛋白糖基化检测方法，包括以下步骤：

（1）加入糖代谢试剂，代谢至细胞膜蛋白，使细胞膜蛋白表达叠氮化糖基；

（2）加入糖基标签核酸序列，修饰到所述叠氮化糖基上，直接或间接产生光学信号；

（3）检测所述光学信号，测定蛋白糖基化状态。

具体的，本发明提供了一种与第二方面相对应的，采用上述的蛋白糖基化检测试剂盒进行蛋白糖基化检测方法，包括以下步骤：

（2）加入糖基标签核酸序列，修饰到所述叠氮化糖基上；

（3）加入蛋白探针核酸序列，所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后引发光学信号；

（4）检测所述光学信号，测定蛋白糖基化状态。

具体的，本发明提供了一种与第三方面相对应的，采用上述的蛋白糖基化检测试剂盒进行蛋白糖基化检测方法，包括以下步骤：

（2）加入糖基标签核酸序列，修饰到所述叠氮化糖基上；

（3）加入蛋白探针核酸序列、杂交链式反应试剂，所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后，所述引发剂引发所述杂交链式反应试剂发生反应，反应产物包含分子信标产生光学信号；

（4）检测所述光学信号，测定蛋白糖基化状态。

此外，本发明还提供了上述蛋白糖基化检测试剂盒在体外检测、细胞检测或活体检测中的应用。

此外，本发明还提供了上述蛋白糖基化检测方法在体外检测、细胞检测或活体检测中的应用。

相比于现有技术，本发明的技术效果包括但不限于以下几点：

（1）采用了稳定的核酸序列作为糖基化的标签，提高了标签稳定性、生物相容性及后续修饰、识别的便利性。

（2）本发明以细胞表面特定蛋白糖基化的可视化和信号放大为目标：首先，结合糖代谢标记、生物正交、核酸适配体和DNA组装各自的优势，设计糖标记探针和蛋白识别探针，利用DNA探针间的临近杂交效应实现活细胞活体上特定蛋白糖基化的可视化检测；其次，结合非酶参与的DNA组装，在活细胞表面进行原位的HCR扩增，实现特定蛋白糖基化的放大可视化检测。

（3）能够实现活细胞表面目标蛋白及其糖基化的特异性双标记。利用糖代谢标记方法对细胞膜表面糖基化物质（包括糖蛋白、糖脂等）的糖链进行功能化基团的修饰的技术已经相当成熟，但以往的方法中直接在糖链上标记荧光分子，无法实现特异性蛋白糖基化的标记，必须引入针对目标蛋白的标记和信号响应体系。其他研究中通常采用基因工程技术使目标蛋白表达荧光蛋白或荧光分子，这种方法过程复杂，且改造后的蛋白其功能和结构可能会发生改变；另一些研究采用抗体标记的方法对目标蛋白进行标记，但这类方法不能在活细胞或者活体上进行标记。发明人通过核酸适配体对目标蛋白进行标记，并利用核酸探针具有结构可变的特性，使仅在目标蛋白上同时存在标记在糖链末端的GCP链时，与蛋白上标记的ASI发生杂交，使ASI产生构象变化，引发HCR反应产生荧光信号。该方法简单易行，核酸探针稳定性高，适用于活细胞和活体成像。

（4）能够实现活细胞活体环境中的核酸扩增反应。与现有方法采用酶参与的核酸扩增方法不同，由于本发明采用的是非酶参与的核酸扩增技术HCR，可以在常温下自发发生扩增反应，大量文献证明HCR适用于活细胞内的mRNA、蛋白、小分子等目标的检测和信号放大。

（5）构建了具有蛋白特异性的糖基化标记方法：与抗体标记相比，利用生物正交和DNA标记的方式具有良好的生物相容性，可在活细胞和活体中进行标记。DNA探针的序列和结构可设计性和可变性更高，能够进行精准的探针之间距离和相互作用的调控。DNA探针尺寸小，与抗体标记以及基因融合等方法相比，对目标蛋白的结构和功能影响小，不影响目标蛋白的生理状态下的功能，实现活细胞和活体中的原位检测。

（6）利用非酶参与的DNA组装进行蛋白特异性糖基化的放大检测：HCR反应无需酶的辅助，能够在生理条件下进行反应。

因此，相较于现有研究中常用的PCR、RCA等基于核酸的放大方法，HCR更适合在活细胞和活体上的应用。

附图说明

图1为特定蛋白糖基化标记探针在细胞膜表面作用的示意图。

图2为（a）PTK7靶向核酸探针在溶液中组装的琼脂糖凝胶电泳图；（b）GCP和ASI杂交发生FRET的荧光光谱图；（c）探针发生HCR反应的荧光光谱图。

图3为（a）CEM和Ramos细胞经过糖代谢后叠氮基团修饰验证的免疫印迹；（b）CEM和Ramos细胞经过糖代谢后PTK7蛋白表达的免疫印迹；（c）GCP和ASI探针在CEM和Ramos细胞表面标记的共聚焦图像。

图4为（a）CEM和Ramos细胞表面GCP和ASI探针间发生FRET的共聚焦图像；（b）CEM和Ramos细胞表面GCP和ASI之间FRET信号验证的共聚焦图像。

图5为（a）EpCAM靶向核酸探针在溶液中组装的琼脂糖凝胶电泳图；（b）GCP和ASI探针在HT29和MCF10A细胞表面标记的共聚焦图像。

图6为HT29和MCF10A细胞表面GCP和ASI之间FRET信号验证的共聚焦图像。

图7为CEM和Ramos细胞表面探针发生HCR反应的共聚焦图像。

图8为HT29和MCF10A细胞表面探针发生HCR反应的共聚焦图像。

图9为细胞表面HCR放大和未经HCR放大的荧光强度定量数据。

图10为CEM细胞经过不同浓度衣霉素处理后的影响，其中（a）CEM细胞经过不同浓度衣霉素处理后表面HCR和未经放大的共聚焦图像；（b）CEM细胞经过不同浓度衣霉素处理后表面HCR放大的荧光定量数据；（c）CEM细胞经过不同浓度衣霉素处理后表面HCR的流式数据。

具体实施方式

以下，使用实施例和对比例更加详细地说明本发明的具体实施示例，本发明的技术范围不限于以下实施例。

为直观的表现本发明实施例的技术内容，参见图1做如下解释：

如图1所示，本发明实施例中设计了两种核酸探针：糖基转换探针（GCP）和蛋白识别探针（ASI）。为实现特定蛋白的糖基化标记，首先，通过糖代谢和生物正交反应将GCP修饰到细胞表面糖基末端。ASI由三个功能片段组成，分别为适配体（Aptamer）、间隔区（Spacer）和引发剂（Initiator）。其中，适配体具有蛋白识别功能，间隔区与引发剂互补形成分子内发夹结构，引发剂在游离状态下能够触发HCR反应。重要的是，GCP与ASI的间隔区互补，二者的邻近能诱发ASI发生构象变化释放引发剂，当存在信号输出探针（H1和H2）时，能够在特定蛋白的糖基链上发生HCR反应。因此，利用简单的核酸标记和邻近诱导HCR反应，本发明实施例为活细胞中蛋白特异性的糖基化放大检测提供了有力的工具。

本具体实施方式中涉及的实验用品及相关验证方法如下：

（1）化学试剂：所有核酸（序列见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并经HPLC纯化。乙酰化N-叠氮乙酰甘露糖胺（Ac₄ManNAz）购自美国Click Chemistry Tools公司；炔丙基胆碱购自美国格利克斯实验室公司；BTTAA购自美国MedChemExpress公司。衣霉素和BCA蛋白定量试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司，杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）购自美国Gibco 公司。氯化镁、葡萄糖、牛血清白蛋白（BSA）、酵母转移核糖核酸（tRNA）、DBCO-Biotin、Stv-HRP、硫酸铜和抗坏血酸钠购自美国Sigma Aldrich公司。超纯水由Milli-Q水净化系统制备（18.2MΩ）。

（2）细胞系和细胞培养：人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM、人B淋巴细胞瘤细胞Ramos、人乳腺腺癌细胞SKBR3、大肠癌细胞HT29和正常人乳腺上皮细胞MCF-10A购于美国模式培养物保藏所（ATCC）。CEM、Ramos和SKBR3细胞培养于RMPI 1640培养基（HyClone）添加10%胎牛血清（HyClone）和100 IU/mL 青霉素-链霉素；HT29细胞培养于McCoy’s 5a改性培养基（ATCC）添加10%胎牛血清（HyClone）和100 IU/mL 青霉素-链霉素；MCF-10A细胞生长于含有霍乱毒素的乳腺上皮细胞培养基MEGM kit（Lonza）。所有细胞均在37℃含5% CO₂的气氛中进行培养。

实施例1

PTK7蛋白特异性糖基化探针制备和应用：利用靶向PTK7的核酸适配体sgc8设计ASI探针以及相应的GCP、H1和H2探针，相应探针序列参见表1。

对比例1

直接以PTK7阴性的Ramos细胞代替实施例1中的CEM细胞，其余实验条件均相同。

表1 实施例1和对比例1中采用的探针序列表

实施例2

采用EpCAM蛋白作为目标蛋白，高表达EpCAM的HT29细胞为研究对象，相应的探针制备和标记同实施例1，相应探针序列参见表2。

对比例2

直接以EpCAM阴性的MCF10A细胞代替实施例2中的HT29细胞，其余实验条件均相同。

表2 实施例2和对比例2中采用的探针序列表

（一）相关实验过程

将实施例1、对比例1、实施例2、对比例2中的探针进行以下相关实验：

A. 体外探针组装可行性验证：

分别将ASI、GCP、H1和H2探针95℃退火3min后，放入冰浴冷却3min，室温下放置1小时。按照GCP: ASI: H1: H2= 200 nM: 200 nM:1μM: 1μΜ的比例将探针混合于HCR反应缓冲液（DPBS含5 mMMgCl₂）室温孵育24小时。

B. 琼脂糖凝胶电泳分析：

将上述混合探针溶液用3%琼脂糖凝胶电泳进行分析，用溴化乙锭染色后进行凝胶成像，用于验证探针之间是否发生组装。

C. 溶液中的荧光实验：

Cy3标记的GCP和Cy5标记的ASI按1：1浓度混合后30min后用于进行荧光光谱分析实验，验证GCP和ASI探针间的相互作用，采用的激发光波长为530nm，采集波长位于540-750nm范围内的发射光谱。GCP、ASI、FAM和Dabcyl双标的H1、H2按200 nM: 200 nM:1μM: 1μΜ比例进行混合24小时后用于进行荧光光谱分析实验，验证HCR反应是否发生，采用的激发光波长为488nm，采集波长位于500-650nm范围内的发射光谱。

D. 激光共聚焦显微镜分析：

将细胞接种到35mm共聚焦皿里培养24h后，加入Ac₄ManNAz进行糖代谢标记，如需对糖基化程度进行调控，同时加入不同浓度的衣霉素。继续培养48小时后加入DBCO-GCP-Cy3反应30min后，再加入ASI-Cy5反应30min，最后加入FAM-H1和H2反应2小时，清洗后用激光共聚焦成像。

E. 流式细胞仪分析：

细胞加入Ac₄ManNAz以及不同浓度的衣霉素进行糖代谢标记，培养48小时后加入DBCO-GCP反应30min后，再加入ASI反应30min，最后加入FAM-H1和H2反应2小时，清洗后用流式细胞仪进行分析。

（二）相关实验结果

A. 体外探针组装可行性：

实施例1、对比例1、实施例2、对比例2中选择了2种蛋白作为糖基化检测的目标——PTK7和EpCAM，两种蛋白在多种肿瘤细胞中高表达，可作为肿瘤的生物标志分子。因此，核酸适配体sgc8和SYL3C分别用于构建靶向PTK7和EpCAM的ASI探针。首先，琼脂糖凝胶电泳和荧光光谱仪被用来验证探针之间的相互作用和组装行为的可行性（图2）。如图2a所示，GCP和ASI探针之间发生杂交并引发H1和H2的HCR反应。而当ASI或者GCP缺失时，HCR反应无法发生。这个过程也通过荧光光谱结果得到了验证。如图2b所示，GCP-Cy3和ASI-Cy5之间能够发生FRET现象，说明二者之间发生杂交。当GCP和ASI杂交后，H1和H2发生的HCR聚集产生了很强的荧光（图2c），而当缺失GCP或者ASI探针的情况下，只能产生很低的背景荧光信号。说明只有当GCP和ASI的杂交使ASI发生构象变化后引发H1与H2之间的HCR反应。

B. 细胞膜表面特定蛋白糖基化标记：

接着，为了进行细胞表面特定蛋白的糖基化检测，对探针在活细胞表面的组装行为进行了研究。为了标记细胞膜蛋白上的糖基，通过糖代谢方式使细胞的糖基修饰上叠氮基团，再与DBCO修饰的GCP探针通过无铜生物正交反应将GCP探针固定在细胞膜蛋白的糖基末端。首先，对了验证目标蛋白的糖基能够被标记上叠氮基团，经过Ac4ManNAz处理的CEM和Ramos细胞，同时以DMSO处理的细胞作为对照。在用DBCO-Biotin进行标记后将细胞裂解，细胞裂解液进行蛋白免疫印迹分析后，用链霉亲和素连接的辣根过氧化物酶（stv-HRP）进行标记验证目标蛋白糖基的叠氮化标记。同时，PTK7蛋白的抗体也被用于分析细胞裂解液的免疫印迹来验证细胞中PTK7目标蛋白的表达。数据表明Ac4ManNAz处理的细胞成功被标记上叠氮基团（图3a），且该过程不影响细胞中目标蛋白PTK7的表达（图3b）。

进一步，激光共聚焦显微镜被用于PTK7蛋白糖基的标记成像。在经过Ac4ManNAz糖代谢和DBCO-GCP-Cy3的标记后，CEM和Ramos细胞表明都能观察到明显的荧光，而对于没有经过糖代谢的细胞表明观察不到DBCO-GCP-Cy3的荧光（图3c）。同时，由于核酸适配体的特异性，ASI-Cy5探针能够选择性地标记在CEM细胞表面而无法标记在Ramos细胞表面（图3c）。此外，在Ac4ManNAz 处理的CEM细胞表面能够观察到FRET产生的Cy5荧光（图4a），这是由于细胞表面ASI和GCP探针的杂交所产生的，也代表了CEM细胞表面PTK7蛋白特异性的糖基化。为了进一步确认二者之间的确发生了FRET，受体分子Cy5在经过高强度激光漂白后，FRET产生的荧光消失了，同时供体分子Cy3的荧光强度增强了（图4b）。为了验证该方法的通用性，相同的过程在HT29和MCF10A细胞表面，以EpCAM蛋白为对象进行了验证。结果如图5和图6所示，都证明了该方法在HT29细胞表面标记EpCAM蛋白糖基化的可行性。上述结果均证明了，利用GCP和ASI探针标记能够实现活细胞表面特定蛋白糖基化的检测。

C. 细胞表面特定蛋白糖基化的信号放大：

由于细胞表面特定糖蛋白占膜蛋白总量的比例很低，在特定蛋白糖基检测中需要对信号进行放大。在本实施例中，我们采用邻近诱导HCR放大策略对蛋白特定糖基化进行荧光信号的放大。Ac4ManNAz处理的CEM细胞进行GCP和ASI探针标记后，加入FAM标记的H1和H2探针进行孵育。如图7所示，Ac4ManNAz处理的CEM细胞表面观察到很强的荧光。而在未经Ac4ManNAz处理的CEM细胞和Ramos细胞由于缺少糖基标记探针和目标蛋白，细胞表面都没有产生HCR反应和荧光信号。同样的现象在Ac4ManNAz处理的HT29细胞表面也能够观察到（图8）。通过对细胞表面荧光信号进行定量分析，邻近诱导的HCR反应在细胞表面能够对荧光信号放大5倍左右（图9）。上述结果表明本实施例中的邻近诱导HCR反应能够用于检测细胞表面特定蛋白糖基化并进行信号放大。

D. 细胞表面特定蛋白不同糖基化程度的检测：

除了对特定蛋白糖基化的检测之外，该邻近诱导HCR策略还能够对目标蛋白糖基化程度的变化进行原位监测。衣霉素是一种常用于抑制细胞糖基化水平的药物，本实验中，将CEM细胞与含有不同浓度衣霉素的Ac₄ManNAz进行共培养，以去除细胞表面的N-糖基化。随后，细胞按照上述方法进行特定蛋白糖基化的HCR放大或非放大检测。图10所示，相较于未经放大的荧光信号，邻近诱导HCR能够对PTK7蛋白的糖基化水平变化更加敏感。而未进行放大的荧光信号，在不同浓度衣霉素处理下，荧光信号没有明显变化。

上述实验结果分析表明，利用核酸探针的邻近杂交以及后续的邻近诱导HCR信号放大，能够实现在活细胞表明进行特定蛋白糖基化的检测。分别利用糖基标记探针和蛋白识别探针，对标记目标蛋白的糖基化的特异性标记以及后续的HCR反应都能够轻易实现。该方法适用于活细胞的PTK7特定唾液酸进行识别和放大检测。该非基因编辑的方法十分简便，能够通过更改蛋白识别探针拓展至其他目标蛋白的糖基化检测。因此，该方法为研究特定蛋白糖基化以及在疾病发展中蛋白糖基化的状态提供了一种有效的工具。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种蛋白糖基化检测试剂盒、检测方法及应用

<130> 11

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agtctaggat tcggcgtggg ttaaagccgg ccccgaatcc tagactaatc taactgctgc 60

gccgccggga aaatactgta cggttaga 88

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtctaggat tcycggcgtg ggttaaagcc ggccccgaat cctagactaa tctaactgct 60

gcgccgccgg gaaaatactg tacggttaga 90

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagtctagga ttcggggccg gct 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tagtctagga ttcggggccg gct 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagtctagga ttcggggccg gct 23

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg 48

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttaacccacg ccgaacctag actcaaagta gtctaggatc ggcgtg 46

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg 48

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttg 48

<210> 10

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agtctaggat tcggcgtggg ttaaagccgg ccccgaatcc tagactacac tacagaggtt 60

gcgtctgtcc cacgttgtca tggggggttg gcctg 95

<210> 11

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

agtctaggat tcycggcgtg ggttaaagcc ggccccgaat cctagactac actacagagg 60

ttgcgtctgt cccacgttgt catggggggt tggcctg 97

Claims

1.一种蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：

2.根据权利要求1所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述糖基标签核酸序列通过生物正交反应修饰到所述叠氮化糖基上。

3.根据权利要求1所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述生物正交反应为点击化学反应。

4.根据权利要求1所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

5.根据权利要求4所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述光学信号引发区包括分子信标，所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后，所述分子信标转变为“开”状态。

6.根据权利要求4所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述糖基标签核酸序列上带有荧光共振能量转移供体，所述蛋白探针核酸序列带有荧光共振能量转移受体；或者，所述糖基标签核酸序列上带有荧光共振能量转移受体，所述蛋白探针核酸序列带有荧光共振能量转移供体；所述间隔区与糖基标签核酸序列邻近杂交后产生荧光共振能量转移。

7.根据权利要求1至3任一项所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：

8.根据权利要求7所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述杂交链式反应试剂包括至少两种能够发生链式反应的核酸序列，其中，至少一种核酸序列包含分子信标。

9.根据权利要求8所述的蛋白糖基化检测试剂盒，其特征在于，所述杂交链式反应试剂包括所述引发剂触发链式反应的DNA发夹结构H1和DNA发夹结构H2，其中，所述DNA发夹结构H1和/或所述DNA发夹结构H2包含分子信标。

10.一种采用权利要求1至3任一项所述的蛋白糖基化检测试剂盒进行蛋白糖基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）检测所述光学信号，测定蛋白糖基化状态。

11.一种采用权利要求4至6任一项所述的蛋白糖基化检测试剂盒进行蛋白糖基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）加入糖基标签核酸序列，修饰到所述叠氮化糖基上；

（4）检测所述光学信号，测定蛋白糖基化状态。

12.一种采用权利要求7至9任一项所述的蛋白糖基化检测试剂盒进行蛋白糖基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（2）加入糖基标签核酸序列，修饰到所述叠氮化糖基上；

（4）检测所述光学信号，测定蛋白糖基化状态。

13.权利要求1至9任一项所述的蛋白糖基化检测试剂盒在体外检测、细胞检测或活体检测中的应用。

14.权利要求10至12任一项所述的蛋白糖基化检测方法在体外检测、细胞检测或活体检测中的应用。