CN113588938B

CN113588938B - 一种免疫磁珠及其制备方法和应用

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Publication number: CN113588938B
Application number: CN202110467277.5A
Authority: CN
Inventors: 李成林; 印晓星; 贡淑媛; 李�瑞; 于妍妍
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2021-09-09
Filing date: 2021-09-09
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2041-09-09
Also published as: CN113588938A

Abstract

本发明涉及一种免疫磁珠及其制备方法和应用，该免疫磁珠(IMNs)选择以EpCAM适体和PTK7适体共同作为识别CTCs的标志物，通过抗原适体亲和反应对CTCs进行富集与捕获，与单一适体作为识别CTCs的标志物相比，可以有效的获取不表达或低EpCAM的CTCs，对CTCs的富集效率很高，达到90％以上。本发明制备的免疫磁珠(IMNs)与待捕获的CTCs具有良好的生物相溶性，可以主动捕获目标细胞，并通过降解DNA适配体链而被清除，使得目标细胞易于释放，其制备方法简单，反应条件温和，成本低，适用范围广，可以富集、分离和检测循环胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞。

Description

一种免疫磁珠及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种免疫磁珠，以及该免疫磁珠的制备方法和应用。

背景技术

循环肿瘤细胞(CTCs)是从肿瘤中释放到血液中的罕见癌细胞，被认为是肿瘤侵袭的标志物，包含肿瘤发生和转移的所有实时分子信息，在肿瘤转移中起着关键作用。同时，作为一种液体活检技术，CTCs检测能够减少侵入组织取样需求的机会，在肿瘤治疗的基础研究和临床应用方面具有很大的潜力。因此，定量检测患者血液中的CTCs，将为恶性肿瘤的早期诊断、临床治疗、复发检测及预后提供及时有价值的信息。

由于外周血中循环肿瘤细胞的数量极其稀少，故捕获效率及纯度一直是限制循环肿瘤细胞研究的重要因素，目前大多数方法无法同时达到高效率及高纯度的捕获与检测。目前CellSearch系统是美国FDA批准的唯一用于转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌的临床CTCs检测技术，其主要原理是利用偶联了EpCAM抗体的磁颗粒与肿瘤细胞表面的抗原相结合，从而捕获细胞。然而，该系统的主要缺陷是只能单独识别捕获表达EpCAM的CTCs，对于一些不表达或低EpCAM的CTCs，则无法有效获取。此外，在该系统中，捕获的CTCs会失去了原有的活力，而且抗体成本昂贵，操作繁琐。

由于目前CTC捕获效率不能达到百分百，而且常见的CTC捕获方法在灵敏度、特异性、时间和成本等方面存在一定的缺陷，因此，制备既能够有效增强与CTCs的识别结合，同时又能操作简便、成本低的免疫磁珠是检测和表征CTCs的关键步骤。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种免疫磁珠(IMNs)，选择以EpCAM适体和PTK7适体共同作为识别CTCs的标志物，通过抗原适体亲和反应对CTCs进行富集与捕获，与单一适体作为识别CTCs的标志物相比，可以有效的获取不表达或低EpCAM的CTCs，对CTCs的富集效率很高，达到90％以上。

本发明的另一目的是提供一种上述免疫磁珠的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种上述免疫磁珠在富集和分离循环肿瘤细胞中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种免疫磁珠，它包括羧基化Fe₃O₄纳米球、链霉亲和素和链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的PTK7适体和EpCAM适体。

其中，PTK7适体，即酪氨酸蛋白激酶7，是PTK7/Otk的一个具有多功能的共同受体，最早是在结肠癌细胞中发现的，在结肠癌、食管癌、乳腺癌、血液等疾病中过表达。

EpCAM适体，即上皮细胞黏附分子，是一种在上皮源性肿瘤细胞表面广泛表达的糖蛋白，具有很强的抗原表位，在肝癌、结直肠癌、胃癌等中高表达。

偶联是指通过共价偶联、疏水作用或者分子间作用力连接在一起。

本发明提供的免疫磁珠(IMNs)，采用链霉亲和素对羧基化Fe₃O₄纳米球进行修饰，然后在修饰后的羧基化Fe₃O₄纳米球上偶联用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的PTK7适体和EpCAM适体，使得制成的免疫磁珠(IMNs)可以有效的获取不表达或低EpCAM的CTCs，对CTCs的富集效率很高，达到90％以上。

本发明提供的免疫磁珠(IMNs)，与待捕获的CTCs具有良好的生物相溶性，可以主动捕获目标细胞，并通过降解DNA适配体链而被清除，这使得目标细胞易于释放，得以体外培养和分析。

在一种优选方案中，本发明提供的免疫磁珠的粒径为140～180nm，优选为150nm。

本发明选择羧基化Fe₃O₄纳米球作为捕获CTCs的一个载体，在磁性分离过程中的响应速度更快，在外加磁场的定向控制下，通过清洗和解吸操作，可将目标物从多组分环境中快速分离出来。

本发明选择以EpCAM适体和PTK7适体共同作为识别CTCs的标志物，通过抗原适体亲和反应对CTCs进行富集与捕获。相对于单个标志物捕获的单一性，通过两种标志物联合检测，提高了对CTCs的特异性识别及捕获效率，富集效率达到90％以上，取得了出人意料的捕获效率。

本发明还提供了上述免疫磁珠的制备方法，它包括如下步骤：

(1)羧基化Fe₃O₄纳米球的制备：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠和醋酸钠溶于乙醇中，在180～220℃的条件下进行化学反应，获得羧基化Fe₃O₄纳米球；

(2)链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球的制备：将EDC分散于MEST溶液中制备EDC溶液，NHS分散于MEST溶液中制备NHS溶液；然后将配制好的EDC溶液、NHS溶液和步骤(1)中制备的羧基化Fe₃O₄纳米球在20～30℃的条件下进行活化反应，待活化反应完成后，再向其中加入链霉亲和素在20～30℃的条件下进行化学反应，获得链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球；

其中，MEST溶液为含MES和Tween 20的混合溶液，在混合溶液中MES的浓度为100mM，Tween 20的含量为0.05％，在配制的过程中调节其pH至5.0；

(3)免疫磁珠的制备：将步骤(2)中制备的链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与PTK7适体和EpCAM适体进行偶联反应，获得免疫磁珠。

在步骤(1)中，无水三氯化铁与柠檬酸三钠的质量比为1:0.15～0.25，可以但不局限于1:0.15、1:0.16、1:0.17、1:0.18、1:0.19、1:0.20、1:0.21、1:0.22、1:0.23、1:0.24或1:0.25，为了获取更好的效果，无水三氯化铁与柠檬酸三钠的质量比为1:0.19。

进一步地，在步骤(1)中，无水三氯化铁与醋酸钠的质量比为1:0.8～1.5，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获取更好的效果，无水三氯化铁与醋酸钠的质量比为1:1.1。

对于本发明而言，在步骤(1)中，反应温度为180～220℃，可以但不局限于180℃、190℃、200℃、205℃、210℃或220℃。

进一步地，反应时间为6～12小时，可以但不局限于6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时或12小时。

在步骤(1)中，可以采用不锈钢高压反应釜作为反应设备制备羧基化Fe₃O₄纳米球。待反应结束后，将得到的羧基化Fe₃O₄纳米球采用无水乙醇洗涤、干燥后，置于冰箱中备用。在使用之前，先进行超声分散处理，然后用PBS缓冲液制成含羧基化Fe₃O₄磁珠的溶液，其中，羧基化Fe₃O₄磁珠的浓度可以根据需要进行调整，其浓度可以为80～120mg/ml，例如，100mg/ml。

在步骤(2)中，对于步骤(1)中制成的羧基化Fe₃O₄纳米球，先进行活化处理，在活化反应的过程中，EDC与NHS的质量比为1:0.8～1.2，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1或1:1.2，为了获取更好的效果，EDC与NHS的质量比为1:1.1。

进一步地，EDC与羧基化Fe₃O₄纳米球的质量比为1:80～120，可以但不局限于1:80、1:90、1:100、1:105、1:110或1:120，为了获取更好的效果，EDC与羧基化Fe₃O₄纳米球的质量比为1:100。

进一步地，MEST溶液中EDC的浓度可以根据实际需要进行调整，例如，EDC的浓度为5～15mg/ml，优选为10mg/ml。

进一步地，NHS溶液中NHS的浓度可以根据实际需要进行调整，例如，NHS的浓度为5～15mg/ml，优选为10mg/ml。

对于本发明而言，在步骤(2)中，活化反应的温度为20～30℃，可以但不局限于20℃、25℃或30℃。反应时间为20～40min，可以但不局限于20min、30min或40min。

在一种优选方案中，在步骤(2)中，链霉亲和素与羧基化Fe₃O₄纳米球的质量比为1:900～1100，可以但不局限于1:900、1:950、1:1000、1:1050或1:1100。

在一种优选方案中，待步骤(2)中反应结束后，将得到的反应液通过磁性分离去除上清，再加入PBS缓冲液(pH 7.4)，以封闭链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球表面未反应的活化羧基基团。封闭处理后，将得到的封闭处理后的链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球，采用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤数次后，重新悬浮于PBS缓冲液(pH 7.4)中，得到链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球溶液，其中，链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球的浓度可以根据需要进行调整，其浓度可以为80～120mg/ml，例如，100mg/ml。

对于本发明而言，在步骤(3)中，将两种适体连接至链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球的表面，其中，链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与PTK7适体的质量比为1:0.08～0.12，可以但不局限于1:0.08、1:0.09、1:0.1、1:0.11或1:0.12，为了获取更好的效果，链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与PTK7适体的质量比为1:0.1。

进一步地，链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与EpCAM适体的质量比为1:0.08～0.12，可以但不局限于1:0.08、1:0.09、1:0.1、1:0.11或1:0.12，为了获取更好的效果，链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与EpCAM适体的质量比为1:0.1。

本发明提供的免疫磁珠(IMNs)可以有效的获取不表达或低EpCAM的CTCs，对CTCs的富集效率很高，达到90％以上，可以用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞，特别是用于富集、分离和检测循环胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供的免疫磁珠(IMNs)，选择以EpCAM适体和PTK7适体共同作为识别CTCs的标志物，通过抗原适体亲和反应对CTCs进行富集与捕获，与单一适体作为识别CTCs的标志物相比，可以有效的获取不表达或低EpCAM、PTK7的CTCs，对CTCs的富集效率很高，达到90％以上。

本发明提供的免疫磁珠(IMNs)，与待捕获的CTCs具有良好的生物相溶性，可以主动捕获目标细胞，并通过降解DNA适配体链而被清除，使得目标细胞易于释放，其制备方法简单，反应条件温和，成本低，适用范围广，可以富集、分离和检测循环胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞。

附图说明

图1是双适体免疫磁珠IMNs的制备过程示意图；

图2是羧基化Fe₃O₄纳米球的傅里叶红外吸收(FT-IR)图谱；

图3是免疫磁珠IMNs制备过程中的TEM图；其中，(A)羧基化Fe₃O₄纳米球；(B)Fe₃O₄/SA磁珠；(C)免疫磁珠；比例尺：100μm；

图4是羧基化Fe₃O₄纳米球、PTK7、EpCAM以及双适体免疫磁珠IMNs的UV-vis图；

图5是适体连接Fe₃O₄/SA磁珠的荧光图；其中，(A)Fe₃O₄/SA磁珠与AMCA标记的PTK7适体表征；(B)Fe₃O₄/SA磁珠与FAM标记的EpCAM适体表征；(C)组合图；比例尺：50μm；

图6是不同时间内免疫磁珠(IMNs)对肿瘤细胞富集效率的差异；其中细胞浓度：500个细胞/ml；

图7是MGC-803、BGC-823和THP-1细胞中PTK7、EpCAM的表达情况；

图8是免疫磁珠(IMNs)对不同肿瘤细胞的富集效率；其中，(A)单、双适体IMNs对MGC-803细胞的富集效率；(B)单、双适体IMNs对BGC-823细胞的富集效率；细胞浓度：500个细胞/ml；

图9是免疫磁珠(IMNs)和Fe₃O₄/SA磁珠(MNs)分别对MGC-803、BGC-823、THP-1细胞的富集效率；其中，(A)IMNs和MNs分别对MGC-803、BGC-823、THP-1细胞的富集效率免疫磁珠；(B)IMNs富集后的MGC-803细胞的DAPI荧光染色图；其中，a为明场图；b为荧光染色图；c为明场和荧光染色的叠加图；(C)IMNs富集后的BGC-823细胞的DAPI荧光染色图；其中，d为明场图；e为荧光染色图；f为明场和荧光染色的叠加图；(D)IMNs富集后的THP-1细胞的DAPI荧光染色图；其中，g为明场图；h为荧光染色图，i为明场和荧光染色的叠加图；比例尺：20μm；(E)IMNs对MCF-7、HepG2、A549细胞的富集效率；细胞浓度：500个细胞/ml；

图10是免疫磁珠(IMNs)对MGC-803细胞富集效率的影响，其中，(A)IMNs浓度对IMNs与MGC-803细胞富集效率的影响；(B)富集时间对IMNs与MGC-803细胞富集效率的影响；MGC-803细胞浓度：500个细胞/ml；

图11是不同浓度的肿瘤细胞在PBS介质、THP-1介质、血液介质中的富集效率，其中，(A)MGC-803细胞；(B)BGC-823细胞；

图12是免疫细胞化学法(ICC法)鉴定混合细胞的荧光染色图像，DAPI核染，CK19(Alexa FluorR594)，CD45(Alexa FluorR488)；比例尺：20μm；

图13是释放后的肿瘤细胞与不同浓度的免疫磁珠孵育2h后的存活率，(A)MGC-803细胞；(B)BGC-823细胞；

图14是释放的MGC-803、BGC-823细胞再培养的过程；(A)单个MGC-803细胞，比例尺：20μm；(B)单个BGC-823细胞，比例尺：20μm；(C)MGC-803细胞群，比例尺：50μm；(D)BGC-823细胞群，比例尺：50μm；

图15是不同胃癌分期的患者的CTCs数；

图16是某癌症患者的1ml血液中捕获到的7个CTCs的图像，其中(A)镜下左上视野中的CTC个数图像；(B)镜下右上视野中的CTC个数图像；(C)镜下左下视野中的CTC个数图像；(D)镜下右下视野中的CTC个数图像；比例尺：20μm；

图17是胃癌患者化疗前后CTCs数的差值比较。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明的免疫磁珠IMNs作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

1材料

1.1试剂

实验用水为双蒸水

1.2仪器

2 方法

2.1 溶液配制

2.1.1 0.01M PBS缓冲液(pH 7.4)的配制

将PBS干粉溶解于适量的蒸馏水中，再取5ml双蒸水溶解袋中残余粉末，重复三次，将得到的溶液和洗液于2000.00ml容量瓶定容，室温下保存。

2.1.2 0.1％Triton-X 100的配制

取1ml Triton-X 100，并溶解于900ml PBS缓冲液(pH 7.4)中，并稀释定容至1000.00ml，在4℃保存。

2.1.3 1％BSA的配制

取1g BSA溶解于100ml PBS缓冲液(pH 7.4)中，在4℃保存。

2.2细胞培养及处理

所使用的细胞包括：MGC-803(人胃癌细胞)、BGC-823(人胃癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、HepG-2(人肝癌细胞)和THP-1(人单核细胞)，其中MGC-803、BGC-823、MCF-7、A549和HepG-2细胞均为贴壁细胞，而THP-1为悬浮细胞。

2.2.1细胞培养

MGC-803、BGC-823、THP-1细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)及双抗(100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)的1640培养基中。

MCF-7、HepG-2细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)及双抗(100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)的DMEM培养基中。

A549细胞培养于添加了10％胎牛血清(FBS)及双抗(100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)的F12培养基中。

所有细胞均置于37℃、5％CO₂培养箱内进行培养。

贴壁细胞培养过程如下：首先去除细胞瓶内所有培养基，用0.01M PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰蛋白酶/EDTA消化液消化1min，再添加3ml新鲜培养基终止消化，在1000rpm的条件下离心3min后，将细胞沉淀以1:4的比例重悬浮于5ml新鲜培养基中。培养基每隔2～3天更换一次。

悬浮细胞培养过程如下：将细胞悬液在1000rpm的条件下离心5min，将细胞沉淀以1:4的比例重悬于5ml新鲜培养液即可。

2.2.2细胞固定及染色

细胞固定：弃去细胞/磁珠培养基或PBS缓冲液(pH 7.4)，加入4％多聚甲醛，在室温下静置10min，再用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤细胞两次；然后，用含0.1％Triton X-100的PBS溶液透化固定后的细胞5min(室温)，以PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤细胞3次。

DAPI染色：弃去细胞/磁珠培养基或者PBS缓冲液(pH 7.4)，用10mM PBS缓冲液(pH7.4)清洗一次，再滴加100μl DAPI染液，在室温下避光染色5～15min，弃去染色液，再以PBS缓冲液(pH 7.4)漂洗一次。滴加甘油或者Buffer A，荧光显微镜以340/380nm紫外激发，观测，拍照。

Anti-CK19抗体染色：将已固定细胞分散于100μl 5μg/ml的Anti-CK19抗体中，4℃过夜孵育。滴加甘油，荧光显微镜以590/617nm激发，观测，拍照。

Anti-CD45抗体染色：将已固定细胞分散于100μl 20μg/ml的Anti-CD45抗体中，4℃过夜孵育。滴加甘油或者Buffer A，荧光显微镜以488/519nm激发，观测，拍照。

2.3免疫磁珠(IMNs)的制备及表征

2.3.1羧基化Fe₃O₄纳米球的合成和表征

将1.08g无水三氯化铁与0.20g柠檬酸三钠溶于20ml乙二醇中，再加入1.20g醋酸钠，于室温25℃下搅拌30min使其混合均匀，得到均匀粘稠的褐色溶液。然后，将得到的褐色溶液密封在不锈钢高压釜中，在200℃的条件下反应8小时，获得羧基化Fe₃O₄纳米球。将得到的羧基化Fe₃O₄纳米球用无水乙醇洗涤数次后，于40-60℃的条件下真空干燥12h。干燥后的羧基化Fe₃O₄纳米球置于冰箱中，在4℃的条件下备用，在使用前先超声分散15-30min，用PBS缓冲液制成含羧基化Fe₃O₄磁珠的溶液(羧基化Fe₃O₄磁珠的浓度为100mg/ml)。羧基化Fe₃O₄纳米球采用TEM、FT-IR进行表征。

2.3.2链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球的合成和表征

为了实现链霉亲和素和羧基化Fe₃O₄纳米球的有效连接，采用链霉亲和素对羧基化Fe₃O₄纳米球进行改性，具体步骤如下：取100μl含羧基化Fe₃O₄纳米球(100mg/ml)的溶液于1ml离心管中，磁性分离去除上清，采用200μl MEST溶液(100mM MES，pH 5.0,0.05％Tween20)进行磁性分离洗涤2次，再移除上清。然后，向其中加入新鲜配置的100μl EDC溶液(10mg/ml，以上述MEST溶液作为分散剂)以及100μl NHS溶液(10mg/ml，以上述MEST溶液作为分散剂)，在25℃的条件下反应30min，在反应的过程中使用垂直混合仪，保持羧基化Fe₃O₄磁珠为悬浮状态，对羧基化Fe₃O₄磁珠表面的羧基进行活化。待活化处理后，向其中加入100μl链霉亲和素溶液(SA，1mg/ml)，在25℃的条件下，混匀均匀，进行偶联反应1h，在偶联反应的过程中，使用垂直混合仪，保持羧基化Fe₃O₄磁珠为悬浮状态，待反应结束后，将得到的反应液通过磁性分离去除上清后，再加入200μl PBST(pH 7.4)溶液，在25℃的条件下反应1h，以封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，在反应的过程中使用垂直混合仪，保持磁珠为悬浮状态。待封闭处理后，将得到的磁珠用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤数次后，重新悬浮于PBS缓冲液中，得到链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球溶液(链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球的浓度为100mg/ml)，置于冰箱中，在4℃的条件下备用，采用TEM、UV-vis对其进行表征。双适体免疫磁珠IMNs的制备过程如图1所示。

其中，MEST溶液为含MES和Tween 20的混合溶液，在混合溶液中MES的浓度为100mM，Tween 20的含量为0.05％，在配制的过程中调节其pH至5.0。

EDC溶液的配制如下：将EDC分散于MEST溶液中，制成EDC浓度为10mg/ml的溶液。

NHS溶液的配制如下：将NHS分散于MEST溶液中，制成NHS浓度为10mg/ml的溶液。

PBST(pH 7.4)溶液的配制如下：在PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入Tween20，制成含0.05％Tween20的溶液。

2.3.3免疫磁珠(IMNs)的合成和表征

采用生物素及荧光标记的PTK7、EpCAM适体对步骤2.3.2中得到的链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球表面进行修饰，其中，选择的PTK7适体为生物素修饰的AMCA标记的PTK7适体，EpCAM适体为生物素修饰的FAM标记的EpCAM适体，具体步骤如下：将100μl 100mg/ml链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球溶液分别与10μl 100mg/ml单PTK7适体溶液、10μl 100mg/ml单EpCAM适体溶液以及10μl含PTK7适体和EpCAM适体的双适体溶液(PTK7适体浓度为100mg/ml，EpCAM适体浓度为100mg/ml)进行反应，在25℃的条件下缓慢摇动孵育4h，经磁力架吸附除去多余的上清液，得到单PTK7适体与单EpCAM适体连接的免疫磁珠，以及双适体连接的免疫磁珠。将它们重悬于PBS缓冲液，置于冰箱中，在4℃的条件下备用，采用FT-IR、TEM、UV-vis、荧光成像对其进行表征。

2.4免疫磁珠(IMNs)对肿瘤细胞捕获实验

2.4.1IMNs生物稳定性的考察

将制备好的免疫磁珠在4℃的条件下，分别储存1、2、3、4周，通过比较免疫磁珠对细胞的捕获效率，考察其在4周内的稳定性。具体操作如下：分别向放置了1、2、3、4周的免疫磁珠中加入相同体积和浓度的CTCs，在室温下孵育30min后，用流式细胞仪检测其捕获效率。上述操作均重复测定3次。

2.4.2IMNs对人胃癌细胞MGC-803、BGC-823的特异性捕获

(1)细胞样本中的蛋白提取与浓度测定

收集MGC-803、BGC-823细胞样本后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(体积比为PMSF:RIPA裂解液＝1:100；Na₃VO₄：RIPA裂解液＝1:100；NaF:RIP裂解液＝1:50；亮素:RIPA裂解液＝1:1000；胃蛋白酶抑制剂:RIPA裂解液＝1:1000；抑肽酶:RIPA裂解液＝1:500)，充分吹打混匀，然后置于冰上裂解30min(10min涡旋一次)。随后12000g离心15min再吸取上清，用BCA蛋白测定试剂盒测定样本中的蛋白浓度(试剂A与试剂B按照50:1的比例配制蛋白测定工作液)。然后，将试剂盒中的标准蛋白按照说明书稀释成2000μg/ml、1500μg/ml、1000μg/ml、750μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、25μg/ml的梯度浓度，细胞样本按1:10稀释，每孔加入100μl蛋白测定工作液。将稀释后的细胞样本与各浓度的标准蛋白同时加入96孔板中，并以空白裂解液作为对照，于37℃孵育30min，然后在550nm的波长处测定吸光度值并绘制标准曲线求得样本的蛋白浓度并计算上样量。

(2)Western blot实验

1)SDS-PAGE电泳

样本前处理：根据蛋白样本体积加入5×上样缓冲液稀释，然后蛋白高温变性约10min。

配胶：根据目的蛋白分子量选取8％分离胶和5％浓缩胶制胶，配方如表1所示。

表1SDS-PAGE电泳分离胶及浓缩胶的配方

上样：加适量蛋白Marker，然后将变性过的蛋白样品按计算得到的上样量(4.45μl、4.85μl、3.82μl)缓慢加入上样孔中。电泳恒压60V，待溴酚蓝刚好跑出浓缩胶再将电压调100V，待能够分离出目的蛋白后停止电泳。

2)免疫印迹

先裁胶，根据蛋白Marker指示分子量，裁取目的蛋白分子量对应区域的分离胶，然后浸入转膜缓冲液中待用，之后进行转膜(湿转法)。提前用新配湿转液浸泡滤纸与硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜，再将海绵、滤纸、NC膜和胶按次序放入湿转系统，并注意赶气泡，恒流转膜：0.35A，2h，之后进行封闭与免疫反应。将转好的NC膜用洗膜液洗涤5min×3次，再放入封闭液(3％BSA)中封闭1h；将NC膜封入塑料薄膜中并加入相应的一抗，置于4℃摇床中过夜。之后取出NC膜，洗膜液洗涤5min×3次，将NC膜封入塑料薄膜中并加入对应的近红外荧光标记的二抗，室温避光孵育2h。洗膜液洗涤2次，每次5min；，再用PBS洗膜1次，5min。实验结果用Odyssey扫描仪扫描，并保存所得图像。

2.4.3单、双适体修饰的免疫磁珠对MGC-803、BGC-823细胞的识别比较

收集MGC-803、BGC-823细胞并重悬计数后，用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至每1ml含1000个细胞，然后将重悬液分别转移至1.5ml离心管中，分别加入0.5mg/ml的单、双适体修饰的免疫磁珠，混匀后在4℃的条件下，静置孵育20min，使用磁力架对悬液中的细胞进行分离和捕获(5min)。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS缓冲液(pH 7.4)进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数，计算捕获效率。细胞捕获率＝(A1-A2)/A1×100％(A1：捕获前细胞数量；A2：未捕获的细胞数量)。同时将捕获到的细胞固定，进行DAPI染色，荧光显微镜下观察。以此来验证双适体免疫磁珠(IMNs)捕获效率的优越性。

2.4.4IMNs对MGC-803、BGC-823和THP-1细胞的识别比较

分别收集MGC-803、BGC-823细胞和THP-1细胞，重悬计数，分别使用PBS缓冲液(pH7.4)稀释至每1ml含1000个细胞，然后将重悬液分别转移至1.5ml离心管中，分别加入100μl0.5mg/ml IMNs，混匀后在4℃的条件下，静置孵育20min，使用磁力架对悬液中的细胞进行分离和捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS缓冲液(pH 7.4)进行重悬洗涤两次，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被IMNs捕获的细胞进行计数，并计算捕获效率。细胞捕获率＝(A1-A2)/A1×100％(A1：捕获前细胞数量；A2：未捕获的细胞数量)。同时将IMNs捕获到的细胞固定，进行DAPI染色，荧光显微镜下观察。以此来验证IMNs对CTCs富集的特异性。

2.4.5IMNs对其他种类肿瘤细胞的捕获

将MCF-7、A549和HepG-2细胞收集并重悬计数后，使用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至每1ml含1000个细胞，然后将重悬液分别转移至1.5ml离心管中，分别加入相同浓度的IMNs，混匀后在4℃的条件下，静置孵育20min，使用磁铁对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS缓冲液(pH 7.4)进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。细胞捕获率＝(A1-A2)/A1×100％(A1：捕获前细胞数量；A2：未捕获的细胞数量)。以此来考察IMNs捕获的广泛性。

2.5富集条件的优化和CTCs检测的线性范围

2.5.1 IMNs孵育时所用IMNs浓度的优化

收集MGC-803细胞并重悬计数后，用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至每1ml含1000个细胞，然后将重悬液分别转移至1.5ml离心管中，分别加入0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的IMNs，混匀后在4℃的条件下，静置孵育20min，使用磁力架对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS缓冲液(pH 7.4)进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并。采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。细胞捕获率＝(A1-A2)/A1×100％(A1：捕获前细胞数量；A2：未捕获的细胞数量)。以此来确定IMNs的最佳孵育浓度。

2.5.2IMNs与细胞孵育时间的优化

收集MGC-803细胞并重悬计数后，用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至每1ml含1000个细胞，然后将重悬液分别转移至1.5ml离心管中，分别加入经上所确定的最佳孵育浓度的IMNs，混匀后在4℃的条件下，静置孵育2min、5min、10min、20min、30min，使用磁力架对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS缓冲液(pH 7.4)进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数。细胞捕获率＝(A1-A2)/A1×100％(A1：捕获前细胞数量；A2：未捕获的细胞数量)。以此来确定IMNs与细胞的最佳孵育时间。

2.5.3IMNs对MGC-803、BGC-823细胞特异性捕捉的线性范围考察

消化收集MGC-803、BGC-823细胞并计数，分别稀释至5个/ml、10个/ml、50个/ml、100个/ml、200个/ml、300个/ml、400个/ml、500个/ml的细胞浓度。利用流式细胞分析仪对上述几种浓度的细胞原液准确计数后，分别重悬于PBS缓冲液(pH 7.4)，THP-1细胞悬浮液(1×10⁶个/ml)和全血中，依次加入100μl 0.5mg/ml的IMNs，静置孵育20min，对悬液中的细胞进行捕获。捕获后，经磁力架吸附后，吸取上清液移至另一干净离心管中，并将捕获到的细胞用PBS缓冲液(pH 7.4)进行重悬洗涤两次，并与首次吸取的上清液合并。对于重悬于PBS缓冲液的细胞，采用流式细胞分析仪对该溶液中未被捕获的细胞进行计数，从而计算捕获效率。细胞捕获率＝(A1-A2)/A1×100％(A1：捕获前细胞数量；A2：未捕获的细胞数量)。对于重悬于THP-1细胞悬浮液以及全血中的细胞，通过免疫细胞化学(ICC)鉴定，镜下清点捕获到的细胞个数，来作线性回归方程，并计算捕获效率。细胞捕获率＝A3/A1×100％(A1：捕获前细胞数量；A3：捕获的细胞数量)。

2.6全血中CTCs的ICC鉴定

将从全血中捕获得到的MGC-803、BGC-823细胞重悬于PBS缓冲液(pH 7.4)中，分别用DAPI、anti-CK19、anti-CK45对其进行染色，并在荧光显微镜下观测。将DAPI核染色阳性、抗CD45染色阴性、抗CK19染色阳性的细胞鉴定为肿瘤细胞；而DAPI核染色阳性、抗CD45染色阳性、抗CK19染色阴性的细胞则被鉴定为白细胞(White Blood Cell，WBC)。

2.7细胞活力的评估

2.7.1MTT实验检测IMNs对细胞活性的影响

将生长状态良好的MGC-803、BGC-823细胞种植于96孔板中，密度为5×10³个/100μl/孔，在培养箱中孵育24h，然后弃去旧的培养基，用PBS缓冲液(pH 7.4)洗两次，然后分别加入0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的免疫磁珠，在培养箱中孵育2h。每孔加入10μl(5mg/ml)四甲基偶氮唑蓝(MTT)，置于细胞培养箱中孵育4h，之后去掉96孔板中的液体，在每孔中加入150μl二甲亚砜(DMSO)，于室温下在平板摇床上震荡15min。最后，将96孔板置于酶标仪中，在490nm波长处检测每个孔的吸光度值(OD)。细胞活力％＝([OD]测量-[OD]空白/[OD]对照-[OD]空白)×100％。以此来考察IMNs对细胞的活力影响。

2.7.2钙黄绿素(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)试剂检测捕获后再释放的细胞的活力

将IMNs与MGC-803、BGC-823细胞孵育20min后，置于磁力架上进行磁性吸附，去除上清后，加入DNase I降解适体链(3min)，释放已捕捉的细胞，再置于磁力架上吸附，此时释放的细胞在上清液中。将上清液中细胞在室温下用2μM Calcein-AM和8μM PI染色30min，在荧光显微镜下观察，其中绿色荧光指示为活细胞，红色荧光指示为死细胞。通过镜下计数活死细胞数，计算细胞存活率，以此来考察IMNs对细胞的活力影响。细胞存活率的表达如下：存活率％＝(B1-B2/B1)×100％，B1：细胞总数(个)；B2：死细胞数(个)。

2.8释放的细胞再培养

将IMNs与MGC-803、BGC-823细胞孵育20min后，置于磁力架上进行磁性吸附，去除上清后，加入DNase I降解适体链(3min)，释放出细胞，将得到的细胞加入96孔板中，加入l640培养基于37℃、5％CO₂的培养箱中培养1周，观察细胞增殖情况。培养基每隔2～3d更换一次，在一周内每隔24h于显微镜下观察一次细胞增殖情况，并拍照记录。以此来考察释放后的细胞的增殖存活情况。

2.9IMNs的临床应用

2.9.1比较CTCs数进行分期相关胃癌病理进展分析

从2020年9月起，本发明于徐州医科大学附属医院收集了13例胃癌不同分期的患者，记录患者的性别、年龄、病理分期等信息，病例的排纳标准如下：入选标准：①术前经胃镜活检病理及术后病理检查为胃癌患者；②具有详细完整的临床病理资料和手术记录的患者。排除标准：①术后病理诊断为非胃癌的患者；②接受化、放疗和免疫治疗的患者；③合并肝、肾、心功能不全的患者；④严重感染患者；⑤合并其他系统肿瘤患者。伦理审批文件批号：XYFY2020-KL141-01，并收集1ml的外周血置于EDTA-K2抗凝管中。随后，将100μl IMNs(0.5mg/ml)加入1ml血液中，孵育20min后，将收集得到的细胞用ICC法处理后，在荧光显微镜下鉴别并对其计数以统计患者CTCs数目，考察CTCs数是否与患者的胃癌分期相关。

2.9.2比较化疗前后CTCs数进行疗效分析

本发明收集了28例接受奥沙利铂联合替吉奥化疗的胃癌患者，记录患者的性别、年龄、病理分期等。病例的排纳标准如下：入选标准：①术前经胃镜活检病理及术后病理检查为胃癌患者；②接受奥沙利铂联合替吉奥化疗方案者；③具有详细完整的临床病理资料和手术记录的患者。排除标准：①术后病理诊断为非胃癌的患者；②接受化、放疗和免疫治疗的患者；③合并肝、肾、心功能不全的患者；④严重感染患者；⑤合并其他系统肿瘤患者。伦理审批文件批号：XYFY2020-KL141-01，同时追踪收集患者化疗前、化疗一个周期、化疗两个周期后外周血1ml，置于EDTA-K2抗凝管中，利用IMNs富集并检测CTCs数。通过比较患者化疗前后CTCs数目的变化，并结合临床指标，来辅助评估临床疗效。

2.9.3疾病检测

同时通过检测胃良性疾病患者以及健康人血液中的CTCs数，对胃癌进行早期诊断。各收集了14例胃良性疾病患者和10例健康者1ml的外周血，记录患者的性别、年龄等信息，血液样本置于EDTA-K2抗凝管中。病例的排纳标准如下：

(1)胃良性病变组：

入选标准：①经胃镜检查及病灶组织活检病理证实为胃癌前病变，包括胃粘膜的异型增生、肠上皮化生、良性息肉癌变或伴存有慢性萎缩性胃炎的患者；②具有详细完整的临床病理资料和手术记录的患者。

排除标准：①术后病理诊断为非胃癌的患者；②接受化、放疗和免疫治疗的患者；③合并肝、肾、心功能不全的患者；④严重感染患者；⑤合并其他系统肿瘤患者。

(2)健康对照组：

入选标准：体检查体为健康的人群；与胃癌组性别、年龄相匹配。伦理审批文件批号：XYFY2020-KL141-01。利用IMNs富集并检测CTCs数。

实验结果与分析

1羧基化Fe₃O₄纳米球、链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球(MNs)、免疫磁珠(IMNs)的表征

1.1羧基化Fe₃O₄纳米球的FT-IR表征

由于羧基是连接链霉亲和素(SA)的关键，为了确保链霉亲和素对羧基化Fe₃O₄纳米球的成功进行修饰，对羧基化的Fe₃O₄纳米球进行红外表征，在图2中可以看出575cm^-1处的强吸收峰是Fe₃O₄的特征峰，在1623cm^-1处是COOH基团中C＝O伸缩振动峰，1425cm^-1处是OH的面内弯曲振动峰，3395cm^-1处是-OH的伸缩振动峰。由此表明，Fe₃O₄纳米球的表面成功修饰上了羧基，确保了链霉亲和素的修饰成功性。

1.2羧基化Fe3O4纳米球、链霉亲和素-Fe3O4纳米球(MNs)、双适体免疫磁珠(IMNs)的TEM表征

为了验证羧基化Fe₃O₄纳米球、链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球(MNs)以及免疫磁珠(IMNs)是否成功制备，采用透射电镜(TEM)对上述三种材料进行了表征。如图3所示，从图中可看出，羧基化Fe₃O₄纳米球分散性较好，平均粒径为110nm。当链霉素亲和素包裹到羧基化Fe₃O₄纳米球外层后，可以观察到链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球的粒径变大，经计算，平均粒径达到130nm；而当EpCAM和PTK7适体进一步修饰到纳米球表面后，由于生物大分子膜的覆盖，所制得的免疫磁珠的粒径继续增大至150nm。上述三种材料平均粒径的逐渐增大，说明了链霉亲和素以及EpCAM和PTK7适体在羧基化Fe₃O₄纳米球表面的成功修饰，且并不会破坏原有的Fe₃O₄晶型结构。

1.3PTK7、EpCAM适体MNs表面共修饰的验证

本发明分别通过观测Zeta电势，紫外-可见吸收光谱(UV-vis)以及荧光成像等方法，验证PTK7、EpCAM适体在链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球表面的成功修饰。首先，由于链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球表面有大量羧基基团的存在，链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球的Zeta电势测定为(-5.32±0.61)mV(n＝3)，PTK7、EpCAM适体本身的电势值分别为(-12.19±0.40)mV、(-13.32±0.47)mV(n＝3)。PTK7、EpCAM适体与链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球孵育之后，Zeta电势测定值为(-21.32±1.02)mV(n＝3)，该电势值无论是相较于链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球还是两种适体，Zeta电势都变得更负，说明链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球与PTK7、EpCAM适体能够通过两者之间的化学键和作用力，成功地完成双适体免疫磁珠(IMNs)的制备。

继而，采用UV-vis检测链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球、PTK7适体、EpCAM适体以及IMNs的吸收光谱。如图4所示，链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球自身在本实验考察的波长范围内无特征性吸收峰(2号曲线)。PTK7适体、EpCAM适体分别在260nm处有一个明显的吸收峰(3号曲线、4号曲线)。而制备的IMNs同样在260nm处明显出现了相比于各单适体更强的紫外吸收峰(1号曲线)，该结果表明PTK7、EpCAM适体已经成功修饰在链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球表面。

进一步，利用生物素化的5-AMCA荧光染料标记的PTK7适体和荧光染料6-FAM标记的EpCAM适体对链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球表面进行修饰，采用荧光显微镜观察观察PTK7、EpCAM适体是否同时修饰在链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球的表面。如图5所示，在荧光场下，可以观察到明显的5-AMCA的蓝色荧光(图5A)和6-FAM的绿色荧光(图5B)，且两个不同荧光标记的适体表现出了明显的共定位(图5C)。该实验进一步表明，链霉亲和素-Fe₃O₄纳米球表面同时成功连接上了PTK7和EpCAM适体。结果也与上述Zeta电势以及UV-vis结果高度一致。

2IMNs在细胞上的验证

2.1IMNs生物稳定性的考察

本发明考察了制备好的免疫磁珠在4℃的条件下，分别储存1、2、3、4周后，对细胞的捕获效率差异的比较，考察其在4周内的稳定性。结果如图6所示，在1至4周内，捕获效率均无明显的差异(P>0.05)，表明磁珠在4周内能稳定存在，不会因为自身稳定性而影响检测分析结果。

2.2IMNs对CTCs富集的效率及特异性考察

本发明考察了胃癌MGC-803、BGC-823细胞和人单核粒细胞THP-1的PTK7和EpCAM的蛋白表达情况。如图7所示，MGC-803细胞为EpCAM高表达、PTK7低表达；BGC-823细胞是PTK7高表达、EpCAM低表达，而THP-1细胞则均不表达EpCAM、PTK7。

2.3单、双适体修饰的免疫磁珠对MGC-803、BGC-823细胞的识别比较

为明确EpCAM/PTK7双适体免疫磁珠对胃癌细胞富集能力的优越性，本发明进一步比较了单、双适体修饰的免疫磁珠对胃癌MGC-803和BGC-823细胞捕获能力的差异。如图8所示，对于EpCAM高表达、PTK7低表达的MGC-803细胞，单修饰PTK7适体的免疫磁珠对MGC-803细胞的捕获效率仅为(52.67±1.15)％、(54.00±1.00)％，低于单修饰EpCAM适体的免疫磁珠的捕获效率(81.67±1.53)％、(84.67±1.15)％，而双适体修饰的免疫磁珠的捕获效率显著高于单适体修饰的免疫磁珠，达到(96.00±0.58)％、(97.50±0.50)％。同样，对于EpCAM低表达、PTK7高表达的BGC-823细胞，单修饰EpCAM适体的免疫磁珠捕获效率仅为(49.67±0.58)％、(50.67±1.76)％，低于单修饰PTK7适体的免疫磁珠的捕获效率(75.33±1.53)％、(77.17±1.89)％，而双适体修饰的免疫磁珠的捕获效率可达到(95.00±1.00)％、(96.33±1.26)％，显著高于单适体修饰的免疫磁珠的捕获效率。因此，由于细胞蛋白表达的差异，单适体修饰的免疫磁珠会存在漏捕或少捕的现象，而双适体修饰可大大提高免疫磁珠对胃癌细胞的捕获效率。由此，EpCAM、PTK7双适体修饰的免疫磁珠对于胃癌细胞的富集效率显著优于单适体修饰的免疫磁珠。

2.4IMNs对MGC-803、BGC-823和THP-1细胞的识别比较

在此基础上，进一步考察双适体修饰的免疫磁珠(IMNs)对MGC-803、BGC-823细胞的富集效率以及特异性识别能力。将一定浓度的MGC-803、BGC-823细胞溶液与IMNs孵育20min，经磁性分离和洗涤后，采用流式细胞仪对上清液中未被IMNs捕获的MGC-803、BGC-823细胞进行计数，同时对免疫磁珠中被富集的MGC-803、BGC-823细胞进行DAPI染色，以方便细胞计数，从而计算富集效率。由图9A所示，IMNs对胃癌MGC-803、BGC-823细胞具有极高的富集效率，分别为(97.1±0.2)％、(97.5±0.2)％。然而，在相同条件下，IMNs对人单核粒细胞THP-1细胞的富集效率仅有(4.3±0.3)％，远远低于其对于MGC-803和BGC-823细胞的富集效率。上述结果证实IMNs可高度特性性的富集MGC-803和BGC-823细胞。此外，与IMNs对MGC-803和BGC-823细胞的高富集效率相比，未结合PTK7、EpCAM适体的MNs对MGC-803和BGC-823细胞几乎无富集能力，富集效率仅分别为(5.3±0.3)％、(5.7±0.3)％，表明IMNs依赖于PTK7、EpCAM特异性识别适体。

进一步采用免疫荧光技术验证上述结果。在MGC-803、BGC-823细胞富集后的明场图中，可以观察到，IMNs粒子可成功捕捉到细胞，且捕捉细胞后的IMNs粒子以细胞为中心，从分散态变为聚集状态(图9Ba、图9Cd)；同时呈现出DAPI染色的特有亮蓝色细胞核，且细胞形态较好的保存下来，说明IMNs已经成功捕捉了MGC-803、BGC-823细胞。然而在THP-1细胞富集后的明场中，尚未观察到被捕捉到的细胞，仅可观察到大部分IMNs粒子呈独立存在(图9Dg)；同时在荧光显微镜下的全视野中并未出现DAPI染色的亮蓝色细胞核(图9Dh)，表明IMNs无法识别和富集THP-1细胞。以上结果充分说明，IMNs可特异性、高效率的识别并富集胃癌细胞。

在上述基础上，本发明还进一步考察了IMNs对其他三种肿瘤细胞，即人乳腺癌MCF-7、人肺癌A549和肝癌HepG2细胞的富集效率。与MGC-803、BGC-823细胞结果相似，IMNs仍然能够对上述三种肿瘤细胞高效富集，富集效率分别为(93.0±1.0)％，(91.3±0.3)％和(90.8±0.6)％(n＝3)(图9E)，表明IMNs捕获细胞的广泛性。

2.5富集条件的优化和CTCs检测的线性范围

2.5.1IMNs与细胞孵育时所用IMNs浓度的优化

本发明对IMNs的富集浓度进行了优化。IMNs的浓度对CTCs富集的影响具有双重性。一方面，IMNs的浓度越高，无论是PTK7、EpCAM适体的量，还是磁性分离的速度和效率，都会显著升高，因而对CTCs的富集是有利的；然而，若IMNs的浓度过高，由于纳米球之间的碰撞，免疫磁珠容易发生自聚，因而会影响IMNs与细胞之间的吸附，不利于CTCs的富集。据此，本发明考察比较了5个浓度IMNs(0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml)对CTCs的富集效率。如图10A所示，随着IMNs浓度的增加(0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.5mg/ml)，对MGC-803细胞的富集效率也随之升高，但是当IMNs浓度超过0.5mg/ml时，富集效率不再升高，其可能的原因是过量的IMNs增加了纳米球的自聚程度，影响其表面的适体与CTCs接触的几率。因而，选择捕获CTCs的IMNs的最佳浓度为0.5mg/ml。

继而优化IMNs与细胞的孵育时间，结果如图10B所示，随着富集时间的延长，富集效率也逐渐增加，2min、5min、10min、20min、30min的富集时间下IMNs对MGC-803细胞的富集效率分别为(76.6±2.3)％、(88.8±1.6)％、(95.8±0.9)％、(97.5±0.3)％、(97.7±0.1)％(n＝3)。基于快速分析的考虑，确定IMNs与细胞的富集时间为20min。

2.5.2IMNs对MGC-803、BGC-823细胞特异性捕捉的线性范围考察

在最佳IMNs孵育浓度和最佳富集时间下，考察并比较了在三种不同介质中，IMNs对不同细胞浓度(5～500个细胞/ml)的MGC-803、BGC-823细胞的富集效果。由图11所示，在PBS缓冲液(pH 7.4)溶液中，随着细胞量的增加，被IMNs富集到的MGC-803、BGC-823细胞个数也呈线性增加，线性回归方程分别为Y＝0.973X-4.261(R²＝0.999)、Y＝0.977X-3.966(R²＝0.999)(PBS介质)。其中，当INMs分别与5个MGC-803、BGC-823细胞孵育时，均能够富集到4个细胞，并且这4个被捕获的细胞全部保持活性，富集效率为80％；除该细胞量之外，IMNs对较大细胞量的MGC-803、BGC-823细胞富集效率均在90％以上。同时，IMNs对THP-1细胞介质中以及全血介质中的MGC-803、BGC-823细胞的富集能力也较高，富集效率均在90％以上，线性回归方程分别为MGC-803细胞：Y＝0.957X-6.773(R²＝0.997)(THP-1介质)、Y＝0.946X-7.685(R²＝0.997)(血液介质)；BGC-823细胞：Y＝0.956X-6.401(R²＝0.998)(THP-1介质)、Y＝0.946X-7.243(R²＝0.997)(血液介质)。且统计学结果表明，IMNs对MGC-803、BGC-823细胞在三种介质中的富集效率没有显著性差异(P>0.05)，提示本实验设计的IMNs能有效用于CTCs的检测。

2.6CTCs的鉴别

本发明利用免疫细胞化学技术(ICC)对捕获后的CTCs进行进一步鉴定。首先，将进一步利用免疫细胞化学技术(ICC)对模拟全血样本捕获后的CTCs进行鉴定。首先，将MGC-803、BGC-823细胞与健康者全血混合，经IMNs捕获后，采用ICC法将CTCs与白细胞区分开来。抗CK19是鉴定血液中上皮细胞的标准标志物，抗CD45是鉴定白细胞的标志物。因此，本实验用DAPI染细胞核，用抗CD45和抗CK19区分白细胞和肿瘤细胞。如图12所示，将DAPI核染色阳性、抗CD45染色阴性、抗CK19染色阳性的细胞鉴定为肿瘤细胞，而DAPI核染色阳性、抗CD45染色阳性、抗CK19染色阴性的细胞则被鉴定为白细胞。而且从图中可以看出，肿瘤细胞体积大于白细胞体积(一般情况，但并非是必须)。本实验结果显示，利用ICC技术，通过DAPI、抗CD45、抗CK19染色可将肿瘤细胞与白细胞区分出来，可以用于临床CTCs鉴定。

2.7经IMNs捕获后的CTCs的活力评估

为了考察IMNs对细胞的活性影响，进行了MTT实验。如图13所示，随着免疫磁珠浓度的增加，孵育2小时内未发现明显的细胞活性下降。此结果表明本实验提供的免疫磁珠对细胞的毒性很低，具有良好的生物相容性。

2.8释放的CTCs再培养

由于血液中CTCs的数量极低，因此捕获后的CTCs能否继续增殖将是实现进一步细胞信号和功能分析的重要步骤。基于上述检测原理，将MGC-803、BGC-823细胞与100μl免疫磁珠(0.5mg/ml)孵育20min后，加入DNaseⅠ降解适体链(3min)，并离心收集释放的细胞。收集的细胞于1640培养基中，在5％CO₂，37℃培养箱中连续培养7天，观察捕获细胞的动态增殖情况。如图14所示，不仅是单个MGC-803、BGC-823细胞，MGC-803、BGC-823细胞群在一周内也保持了良好的增殖性能，表明免疫磁珠对细胞具有良好的生物相容性。

3IMNs的临床应用

上述研究结果均证实制备的双适体免疫磁珠有较好的胃癌CTCs分析潜能，因此，本发明进一步探究了该免疫磁珠在临床应用方面的潜力。将100μl免疫磁珠(0.5mg/ml)分别与1ml健康人和癌症患者的血样孵育20min，通过ICC法对癌症患者血液样品中的CTCs进行计数，其中DAPI⁺/CK19⁺/CD45^-鉴定为CTCs，DAPI⁺/CK19^-/CD45⁺为WBC。

3.1比较CTCs数进行胃癌病理进展分析

本实验收集了徐州医科大学附属医院13例不同胃癌分期的患者，患者信息如表2，并对其进行了统计，考察患者的CTCs是否与胃癌分期有关。如图15所示，随着胃癌分期的增加，CTCs也逐渐增加，经统计，线性回归方程为Y＝2.375X+1.337(R²＝0.848，P<0.05)，提示CTCs数可能与胃癌分期呈正相关。因此，利用本发明制备的IMNs可通过检测胃癌患者血中CTCs数，可以及时有效的评估患者的病情进展，尽早进行治疗，提高患者的生存期。

表2不同分期的癌症患者的基本信息及全血中CTCs数目的统计

3.2比较化疗前后CTCs数进行疗效评估

进一步利用本发明制备的IMNs富集奥沙利铂联合替吉奥化疗的胃癌患者CTCs，评价CTCs与患者疗效的关系。由于某些病人拖组及收样时间跨度大，故总共收集到徐州医科大学附属医院17例经过一周期奥沙利铂联合替吉奥化疗的胃癌患者，11例经过两周期化疗的患者，共28例患者。图16为表3中16号癌症患者化疗前1ml血液中捕获到的7个CTCs的图像，其中包括一个CTC簇和5个单CTC细胞，统计结果如表3。

表3癌症患者的基本信息及全血中CTCs数目的统计

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表3以及图17结果表明，对于接受奥沙利铂联合替吉奥化疗方案的患者，化疗一个周期、两个周期后，CTCs数较化疗前均有降低(除28号癌症患者外)，且结果具均有统计学意义(P<0.05)，说明该化疗方案确实有效，能控制患者的病情进展。其中，1号患者，化疗一周期、两周期后CTCs均较前下降，提示该治疗能有效控制病情。同时结合该患者的临床指标发现，其癌胚抗原(CEA)化疗前为3.8ng/ml，化疗一周期后为3.1ng/ml，化疗两周期后为2.8ng/ml，表明病情得到控制好转，与CTCs数检测结果显示的一致。

且值得注意的是，本实验在进行中，偶有化疗后CTCs数增加的个例(28号癌症患者)，结合该患者的临床指标发现，其CEA化疗前为7.4ng/ml，化疗一周期后为9.5ng/ml，同样的其胃癌抗原(CA724)稀释指标化疗前为128.30U/ml，化疗一周期后为156.30U/ml，肿瘤指标不降反升，提示该患者对奥沙利铂联合替吉奥化疗方案治疗一周期后即不敏感，产生耐药，与CTCs数检测结果显示的一致，临床医生也及时对该患者进行了用药调整，改换为白蛋白紫杉醇联合卡培他滨治疗。上述结果提示本发明的IMNs对CTCs的个数检测能有效提示化疗方案的疗效，为临床医生提供及时有价值的信息。

3.3疾病检测

本发明进一步考察是否可以用于胃癌辅助诊断。本部分实验收集了徐州医科大学附属医院14例胃良性疾病患者以及10例健康者的血样。相对于胃癌患者血液中检测出的不同数量的CTCs，健康者血样的检测，用以作为阴性对照，如表4，胃良性疾病(以胃息肉为主)患者血样中，均未检测出CTCs。如表5是对胃良性疾病中CTCs数的检测，结果均未检出，表明均未发生癌变(CTCs>1即为阳性)。

以上结果表明，本发明所构建的免疫磁珠能够可靠的应用于临床胃癌患者血液中CTCs的检测和鉴定，并为胃癌患者的临床疗效评估以及早期诊断提供重要的参考依据。

表4健康者的基本信息及全血中CTCs数目的统计

表5胃良性疾病患者的基本信息及全血中CTCs数目的统计

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种免疫磁珠，其特征在于，它包括羧基化Fe₃O₄纳米球、链霉亲和素和链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球上偶联有用于特异性识别与捕获循环肿瘤细胞的PTK7适体和EpCAM适体；所述免疫磁珠的粒径为140~180nm，其制备方法包括如下步骤：

（1）羧基化Fe₃O₄纳米球的制备：将无水三氯化铁、柠檬酸三钠和醋酸钠溶于乙醇中，在200℃的条件下进行化学反应，获得羧基化Fe₃O₄纳米球；其中，所述无水三氯化铁与柠檬酸三钠的质量比为1:0.19；无水三氯化铁与醋酸钠的质量比为1:1.1；反应时间为8小时；

（2）链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球的制备：将EDC分散于MEST溶液中制备EDC溶液，NHS分散于MEST溶液中制备NHS溶液；然后将配制好的EDC溶液、NHS溶液和步骤（1）中制备的羧基化Fe₃O₄纳米球在25℃的条件下进行活化反应，待活化反应完成后，再向其中加入链霉亲和素在20~30℃的条件下进行化学反应，获得链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球；

其中，MEST溶液为含MES和Tween 20的混合溶液，在混合溶液中MES的浓度为100mM，Tween 20的含量为0.05%，在配制的过程中调节其pH至 5.0；EDC与NHS的质量比为1:1.0；EDC与羧基化Fe₃O₄纳米球的质量比为1:100；链霉亲和素与羧基化Fe₃O₄纳米球的质量比为1:1000；MEST溶液中EDC的浓度为10mg/ml；NHS溶液中NHS的浓度为10mg/ml；反应时间为30min；

（3）免疫磁珠的制备：将步骤（2）中制备的链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与PTK7适体和EpCAM 适体进行偶联反应，获得免疫磁珠；其中，链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与PTK7适体的质量比为1:0.1；链霉亲和素修饰的羧基化Fe₃O₄纳米球与EpCAM 适体的质量比为1:0.1。

2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠的粒径为150nm。

3.一种权利要求1所述的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：

4.一种权利要求1所述的免疫磁珠在制备富集、分离和检测循环肿瘤细胞的试剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的免疫磁珠在制备富集、分离和检测循环胃癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或肝癌细胞的试剂中的应用。