CN112415184A - 用于细胞群体和单细胞的单分子分离系统及其方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于分离单细胞、捕获所述细胞内的所选猎物生物分子以及使用灵敏的测定方法检测所述猎物生物分子的系统和方法。本文还描述了能够以低的检测限度检测所选细胞的所选猎物生物分子的官能化衬底和组合物。

Description

用于细胞群体和单细胞的单分子分离系统及其方法和用途

相关申请

本专利申请要求2019年8月22日提交的美国临时申请号62/922,657的 权益，所述美国临时申请的全部公开内容以引用方式并入本文。

技术领域

本文所述的本发明大体上涉及蛋白质和/或细胞检测领域。具体地，本文 所述的实施方案涉及用于分离单细胞、捕获所述细胞内的所选猎物(prey)生物 分子以及使用灵敏的测定方法检测所述猎物生物分子的系统和方法。

以引用方式并入

本文所指出的所有美国专利、美国专利申请公开、外国专利、外国和PCT 公布的申请、文章和其他文献、参考文献和出版物，以及在由此颁布的任一个 或多个专利中引用的作为参考文献列出的所有文献，均在此以引用方式整体 并入本文。所并入的信息是本申请的一部分，就像在本申请中重复了所有文 本和其他内容一样，并且将被视为所提交的本申请的文本和内容的一部分。

背景技术

以下包括对理解本发明有用的信息。并不是承认本文明确或隐含引用的 任何信息、出版物或文献是本申请描述的发明或要求保护的发明的现有技术， 或者是本申请描述或要求保护的发明所必需的。

蛋白质从不单独起作用：它与作为其调节剂、辅助亚基或效应物发挥功 能的其他蛋白质一起起作用。蛋白质的功能性缔合通常需要与其他蛋白质的 物理相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)，尽管它们偶尔仅涉及可溶性因 子，诸如cAMP或Ca²⁺。因此，PPI在多种细胞过程的几乎所有方面都是不可 缺少的，并且蛋白质相互作用伴侣的鉴别对于阐明蛋白质的功能和调节是必 需的。

为了总体评估PPI，一种常用的强大技术是常规的共免疫沉淀(共IP/下拉 (pull-down))，之后进行蛋白质印迹法。然而，常规的共IP测定不能用于研究 稀有细胞如感觉毛细胞、循环肿瘤细胞和胚胎干细胞中的PPI：单一的蛋白质 印迹法测定通常需要约10⁴-10⁵个细胞，且单一的共IP测定需要约10⁵-10⁶个 细胞，并且稀有细胞不能如此大量地容易地获得(Schulte R.等，“用于蛋白质- 蛋白质相互作用分析的单珠粒亲和力检测(Single BeadAffinity Detection (SINBAD)for the Analysis of Protein-ProteinInteractions)”,PLoS ONE, 3(4):e2061(2008).https://doi.org/10.1371/journal.pone.0002061)。例如，毛细胞 是极其稀少的；耳蜗毛细胞数目为每个小鼠耳蜗约3,300个以及每个人耳蜗 约15,000个，而且，可从周围支持细胞中分离这些细胞的效率极低(Willott J.F. 等，“老年性耳聋的调节：当前状态和未来方向(Modulation ofPresbycusis: Current Status and Future Directions)”，Audiol Neurootol.,6:231-249(2001))。当 前，仅使用异源过表达系统来研究毛细胞中的PPI，但这些受人为因素影响并 且需要通过对内源蛋白质的研究来证实。常规共IP测定的这种技术限制大大 妨碍了对毛细胞和其他稀有细胞的研究，因此需要开发单细胞的下拉技术。 用于研究细胞间变化的其他方法包括诸如单细胞RNA测序和单细胞蛋白质 印迹法(Kang,C.C.等，“全细胞成像后单细胞蛋白质印迹法以评估癌症化疗反 应(Single-cell Western Blotting AfterWhole-Cell Imaging to Assess Cancer Chemotherapeutic Response)”，Anal.Chem.,86(20):10429-10436(2014))。

最近，Jain等开发了组合常规下拉和单分子荧光显微术的原理的单分子 下拉测定(SiMPull)(Jain,A.等，“用于研究蛋白质相互作用的单分子下拉 (Single-moleculepull-down for studying protein interactions)”，Nat.Protoc., 7(3):445-452(2012))。SiMPull使得不仅能够评价蛋白质复合物的化学计量， 而且还能够检查以微摩尔范围内的K_d为特征的微弱且短暂的PPI(Stelzl,U. 等，“人蛋白质相互作用网络：用于注释蛋白质组的资源(A Human Protein- Protein Interaction Network:A Resource forAnnotating the Proteome)”,Cell, 122(6):957-968(2005))。这些弱的PPI在常规的共IP测定中所用的多个洗涤 步骤中容易被破坏。然而，SiMPull自从其开发以来没有被广泛使用，也没有 被大规模商业化，因为该方法呈现出高的技术壁垒并且耗时。

现有的单细胞下拉方法可分离单细胞，但在扩大它们用于细胞组分分析 的用途方面涉及太多困难，如通过完全缺乏采用它们的用途的任何商业系统 或方法所证明(Wedeking,T.等，“单细胞GFP-Trap揭示胞质蛋白质复合物的化 学计量和动力学(SingleCell GFP-Trap Reveals Stoichiometry and Dynamics of Cytosolic ProteinComplexes)”,Nano Lett.,15(5):3610-3615(2015)；Wang,X.等， “关于单细胞单分子下拉(Toward Single-Cell Single-Molecule Pull-Down)”， Biophysical Journal,115(2):283-288(2018)；Ryu,J.Y.等，“利用原位裂解和共免 疫沉淀剖析单个癌细胞的蛋白质-蛋白质相互作用(Profiling Protein-Protein Interactions of Single Cancer Cellswith in situ Lysis and Co-Immunoprecipitation)”, Lab Chip.,19(11):1922-1928(2019))。这些方法的适用性是有问题的，因为(1) 所述方法可用于分析仅在细菌或粘附细胞培养物中而不在原代或悬浮培养细 胞(诸如血细胞和循环肿瘤细胞)中缓慢扩散的分子；2)所述方法仅可用于利用 针对细胞表面蛋白质的细胞外结构域的抗体分析细胞表面蛋白质；并且3)所 述方法的技术壁垒极高且因此所述方法不能用于普通生物实验室中。

因此，仍然存在相当大的未满足的对用于细胞成分分析的单细胞下拉的 需要。

发明内容

本文所描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于 在本发明内容中陈述或描述或提到的那些。但这并不旨在是包括一切的，并 且本文所描述和要求保护的本发明不限于在本前言中确定的特征或实施方案， 或不受其限制，包括本前言的目的仅在于说明而不是限制。

本公开提供了包含多个微米大小的特征的衬底用于分析分离的单细胞和 /或其所选组分的用途。在一些方面，本公开提供一种系统，其包括包含多个 微米大小的特征的玻璃衬底、多个经抗体包被的珠粒、针对诱饵(bait)生物分 子的多种一级抗体、多种诱饵分子、多种靶猎物生物分子和针对所述靶猎物 生物分子的多种一级抗体。多个经抗体包被的珠粒可包含针对针对靶诱饵生 物分子的一级抗体的多种二级抗体。多个经抗体包被的珠粒可包含针对靶诱 饵生物分子的多种一级抗体。在一些方面，多个经抗体包被的珠粒可包含结 合与诱饵生物分子结合的多种一级抗体的二级抗体。

在一些方面，所述系统可进一步包含一种或多种类型的细胞。细胞可包 含一种或多种类型的靶猎物生物分子。多个经抗体包被的珠粒可位于多个微 米大小的特征内。多个细胞可位于多个微米大小的特征中。多个细胞可包括 平均直径为约30微米的细胞。微米大小特征的平均直径可被配置为选择性地 分离直径小于微米大小特征的直径的细胞。

在一些方面，多种靶猎物生物分子可包括可在所述细胞的细胞膜中发现 的分子。在一些方面，多种靶猎物生物分子可包括可在所述细胞的细胞质中 发现的分子。在一些方面，诱饵生物分子和猎物生物分子可独立地选自：蛋白 质、DNA、RNA、mRNA、tRNA、cRNA、抗体、抗体片段、ScFv、肽和小分 子。DNA或RNA可进一步用生物素修饰。

在一些方面，所述系统可进一步包含细胞裂解缓冲剂，该细胞裂解缓冲 剂可包括非变性洗涤剂。

在一些方面，多个微米大小的特征可包括一系列孔，所述孔中的每一个 具有约15微米到约45微米的直径、各孔的中心之间的距离为约100微米到 约5000微米范围，和各孔的深度为约25微米到约150微米。在一些方面， 一系列孔的直径可以是约30微米。各孔的中心之间的距离可以是约150微 米。各孔的深度可以是约75微米。在一些方面，多个细胞可包括平均直径小 于孔的直径的细胞。在一些方面，可将多个微米大小的特征直接蚀刻到玻璃衬底中。在一些方面，多个微米大小的特征可由PDMS(聚二甲基硅氧烷)形 成。衬底可包括固化的PDMS。玻璃衬底可以是厚度为0.085mm到0.64mm 的玻璃盖片。在一些方面，玻璃衬底被配置为可用TIRF(全内反射显微镜术) 测量。孔可以是圆形、环形、球形或类似于圆的其他形状。一系列孔还可以是 卵形或方卵形(squoval)。所述孔可以是平底(F-孔)、圆底(U-孔)、C-底(其为平 底和圆底的组合，诸如在底部具有弯曲边缘的平底孔)(C-孔)；星形孔(其为具 有改进的C形几何形状的孔，具有一个或多个置于孔的底部和/或侧面的翅形 物(fin))；或V-底(其为锥形孔)(V孔)。

在一些方面，多个经抗体包被的珠粒进一步可包括磁性珠粒，其本身可 包含氧化铁芯和外层，所述外层包含使得能够结合生物分子(优选捕获剂，优 选抗体)的官能团。在一些方面，所述系统可进一步包含磁体。

在一些方面，本公开提供一种系统，其包括包含多个微米大小的特征的 玻璃衬底、结合诱饵生物分子的多种第一捕获剂、多种诱饵生物分子、多种猎 物生物分子、结合所述猎物生物分子的多种第二捕获剂，其中结合诱饵分子 的所述多种第一捕获剂进一步可包括磁性珠粒。诱饵生物分子、猎物生物分 子或两者可连接到荧光团。多个经抗体包被的珠粒可位于多个微米大小的特 征内。在一些方面，所述系统可进一步包含一种或多种类型的细胞，并且任选 地，所述细胞可包含一种或多种类型的猎物生物分子。在一些方面，所述系统 可进一步包含磁体。在一些方面，多个细胞可在多个微米大小的特征中。所述 多个微米大小的特征可包括一系列具有孔，所述孔中的每一个具有约15微米 到约45微米的直径、各孔的中心之间的距离为约100微米到约5000微米范 围，和各孔的深度为约25微米到约150微米。

本公开提供用于鉴别生物分子-生物分子相互作用的方法，其包括以下步 骤：(a)使一种或多种细胞类型与如本文所述的系统接触，(b)将裂解缓冲剂提 供给所述系统，以及(c)通过荧光显微术使所述系统成像。在一些方面，可对 系统部件中的至少一个进行荧光标记。荧光显微术可选自TIRF或共焦显微 术。

本公开提供用于鉴别生物分子-生物分子相互作用的方法，所述方法包括 以下步骤：(a)使包含多个微米大小的特征的衬底与一种或多种细胞类型接触， 其中所述一种或多种细胞类型的一部分或全部进入所述多个微米大小的特征 的一部分或全部中；(b)将多个经抗体包被的磁性珠粒提供给所述衬底，其中 所述经抗体包被的磁性珠粒包含结合诱饵生物分子的抗体；(c)任选地，向所 述经抗体包被的珠粒施加磁场；(d)使所述衬底与裂解缓冲剂接触；(e)形成复 合物，所述复合物选自所述经抗体包被的磁性珠粒的所述抗体和诱饵生物分 子、所述诱饵生物分子和猎物生物分子、或与所述经抗体包被的磁性珠粒的抗体结合的所述诱饵生物分子和所述猎物生物分子的全部；(f)提供结合所述 猎物生物分子的抗体或抗体复合物；(g)通过荧光显微术使结合到所述猎物生 物分子的所述抗体或抗体复合物成像。在一些方面，细胞可包含诱饵生物分 子和/或猎物生物分子。在一些方面，结合猎物生物分子的抗体或抗体复合物 带有荧光标记。在一些方面，结合到猎物生物分子的抗体复合物可包含结合 到猎物生物分子的一级抗体，以及结合到与猎物生物分子结合的所述一级抗 体的二级抗体，其中二级抗体带有荧光标记。在一些方面，猎物生物分子和诱 饵生物分子可独立地选自：蛋白质、DNA、RNA、mRNA、tRNA、cRNA、抗 体、抗体片段、ScFv、肽和小分子。

在一些方面，步骤(g)通过荧光显微术使结合到所述猎物生物分子的所述 抗体或抗体复合物成像可通过TIRF(全内反射显微镜术)或共焦显微术进行。

在一些方面，本文所述的方法可具有高于10、高于12、高于15或高于 20的分析物信噪比。

在一些方面，本文所述的方法可每纳米大小的官能化珠粒分离单个猎物 生物分子。

附图简单说明

并入本文并且构成本说明书的一部分的附图图解说明了本公开的多个方 面并且与说明书一起进一步用来解释所述方面的原理并使相关领域的技术人 员能够实践和使用所述方面。附图仅用于说明目的，显示了示例性非限制性 实施方案，并且不一定按比率绘制。

本专利或申请文件包含以彩色绘制的至少一个附图。具有(多个)彩图的本 专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要的费用后由专利局提供。

图1显示用于细胞群体的基于纳米珠粒的SiMPull的代表性示意图。经 链霉抗生物素蛋白包被的磁性纳米珠粒通过将一级抗体固定在其表面上而被 修饰，用于捕获靶蛋白质(诱饵蛋白质)(参见下文的详细方案)。将细胞裂解且 将磁性纳米珠粒添加到裂解物中并且培育30分钟，并且在通过珠粒捕获猎物 蛋白质后，使用特异性的一级抗体和荧光标记的二级抗体检测所述蛋白质。 将纳米珠粒洗涤三次以去除非特异性结合的蛋白质，转移到载玻片上并用盖 片覆盖，并且使用TIRF显微镜使其成像。在某些情况下，诱饵蛋白质或猎物 蛋白质带有荧光标记，并且可将其直接显现。

图2a-2c显示使用基于纳米珠粒的SiMPull的GFP下拉。图2a(标记为 “a”)显示通过链霉抗生物素蛋白包被的磁性纳米珠粒来下拉表达GFP的 HEK293T细胞的预制裂解物中的GFP，所述磁性纳米珠粒用生物素化的第2 抗体加抗GFP、抗FLAG或抗HA抗体进行表面改性。另外，将未经转染的 HEK293T细胞的细胞裂解物用作阴性对照。非常高的信噪(S/N)比表明GFP 被抗GFP抗体特异性地下拉。比例尺，10μm。图2b(标记为“b”)显示每个成 像面积的荧光分子的平均强度。误差棒表示标准偏差(s.d.)图2c(标记为“c”)显 示图2a中GFP分子的光漂白步骤的分布。大多数荧光斑点是单一分子。

图3a-3c显示通过使用基于纳米珠粒的方法应用于PKA复合物的下拉方 法。图3a(标记为“a”)显示PKA复合物和其被cAMP活化的示意图。R，调节 亚基；C，催化亚基。图3b(标记为“b”)显示上部图像：PKA-C-eGFP(绿色)的 下拉也下拉PKA-R-mCherry(红色)。图3b和图3c(标记为“c”)中的下部图像： 上部图像的相应表面标绘图。图3c显示上部图像：在加入了cAMP之后， PKA-C-eGFP(绿色)的下拉不下拉mCherry(红色)。使用共焦显微术进行所有分析。比例尺：3微米。

图4显示单细胞微孔阵列的代表性示意图。描绘了微孔芯片的示意性俯 视图(左)和横截面(右)。微孔为30微米宽和70微米深。

图5a和图5b显示微孔衬底的制作。图5a(标记为“a”)在左分图中显示， 通过标准软光刻方法在硅晶片上制作微柱(micropost)。特征被布置成正方形构 造，其含有9块10×10微柱(直径为30微米且高度70为微米)。右分图；框定 区域的放大。图5b(标记为“b”)在左分图中显示；分图a在PDMS凝胶中的相 应特征。右分图；框定区域的放大。比例尺：左分图中为1.5mm；右分图中 为400微米。

图6a和图6b显示每个微孔的细胞数目。将300μl于PBS中的悬浮细胞 (约10⁶个细胞/ml)施加到微孔芯片的表面(参见“方法”中的更多细节)。图6a (标记为“a”)显示视野中的微孔中捕集的细胞(用白色箭头指示)。比例尺，100 μm。图6b(标记为“b”)显示芯片中每个孔中细胞数目的总计数据(n＝3)。总微 孔的约40％被细胞占据；细胞占据的微孔中约85％是单细胞，并且推测该比 率将随着施加更多稀释的细胞而增加。

图7a和图7b显示将磁性珠粒施加到微孔。图7a(标记为“a”)显示仅具有 HEK293T细胞的微孔的俯视图。图7b(标记为“b”)显示在将磁性纳米珠粒施 加到芯片之后，具有HEK293T细胞的微孔的俯视图。

图8a和图8b显示单细胞下拉测定的一个代表性示意图。图8a(标记为 “a”)显示在通过微孔捕集单细胞后，将表面改性的磁性纳米珠粒(直径100±30 nm)施加到微孔芯片。纳米珠粒是经诱饵蛋白质的生物素化第2抗体和第1抗 体修饰的经链霉抗生物素蛋白包被的磁性纳米珠粒。图8b(标记为“b”)显示， 为了原位裂解细胞，将裂解缓冲剂添加到芯片的顶部。在细胞裂解和蛋白质 捕获后，磁性纳米珠粒被磁体拖到微孔底部，并通过TIRF或共焦显微术成像。

图9a-9f显示微孔中对单细胞的GFP下拉。图9a(标记为“a”)显示细胞裂 解后被GFP-抗体包被的磁性纳米珠粒下拉的GFP。大多数荧光斑点较小，但 有一些较大。图9b(标记为“b”)显示分图d中框定区域的放大。用箭头指示小 斑点，并且用箭形指示大斑点。图9c(标记为“c”)显示在阴性对照实验中，在 细胞裂解后，GFP未被无GFP-抗体包被的磁性纳米珠粒下拉。图9d(标记为 “d”)显示图9c中框定区域的放大。图9e(标记为“e”)显示在光漂白实验中展示 一步光漂白的小GFP斑点，表明在斑点中存在单个GFP分子。图9f(标记为 “f”)显示图9b和图9d中的点的总强度比例尺：分图图9a和图9c：20微米； 分图图9b和图9d：3微米。

图10a-10d显示单细胞中PKA复合物的下拉。图10a(标记为“a”)显示在 不存在cAMP的情况下，经抗GFP包被的磁性纳米珠粒下拉单细胞中的PKA- C-eGFP(绿色)和PKA-R-mCherry(红色)两者，但如图10b(标记为“b”)中所示， 在cAMP存在的情况下，仅下拉PKA-C-eGFP(绿色)。图10c(标记为“c”)显 示经抗GFP包被的磁性纳米珠粒下拉单细胞中的PKA-C-eGFP(绿色)和PKA- R-HA(红色)。通过用抗HA抗体和Alexa-561缀合的第2抗体进行免疫染色， 使PKA-R-HA显现。图10d(标记为“d”)显示当PKA-R-HA被PKA-R-GFP替 代时，见到很少的HA阳性斑点，表明图10c中的HA染色是HA特异性的。 在图10a-10d中，下部图像是上部覆盖图像中的小框定区域的放大，并且右侧 图像是它们相应的表面标绘图；比例尺：左上，20微米；左下，3微米；右 侧，3微米。

具体实施方式

对示例性实施方案的这一说明意在结合附图来解读，附图被认为是整个 书面说明书的一部分。另外，本文中所用的章节标题仅用于组织目的，并且不 应被解释为限制所描述的主题。

还已经发现，通过采用本文所述的系统，可使用为细胞群体，更重要的是 为单细胞设计的用于单细胞分离和分析的基于纳米珠粒的方法。本文所述的 方法比常规下拉方法简单得多且快得多，并且还可明显更广泛地应用于所有 细胞类型。这两个关键特征使得本文所述的方法能够在普通生物和临床实验 室中普遍应用。通过提供本文所述的单细胞捕获形式的单细胞分离和分析的 应用，本文所述的方法代表了单细胞研究领域的重大技术突破。

通常用于探究蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)的常规共免疫沉淀方法(共IP/ 下拉)需要大量细胞，因此不适合用于在稀有细胞如感觉毛细胞、循环肿瘤细 胞和胚胎干细胞中研究PPI；这大大妨碍了稀有细胞的研究，因此需要开发单 细胞下拉技术。同样重要的是，此类单细胞下拉技术可使得能够研究PPI中 细胞间变化。

本文描述了用于细胞群体且更重要地用于单细胞的SiMPull的基于磁性 纳米珠粒的方法，所述方法利用包含多个微米大小的特征的衬底。

本文所述的系统和方法尤其可用于：

1)评估复杂组织样品中的细胞异质性。例如，在一个实施方案中，可使用 本文所述方法和系统在不同细胞中测量EGFR和GRB2的相对表达。

2)测量复杂细胞蛋白质相互作用和信号传导途径的动态网络的存在和程 度。例如，在一个实施方案中，可使用本文所述的方法和系统来测量肿瘤微环 境中的HIF阻遏物途径和mTOR信号传导途径。

3)探索病毒感染的细胞间变化。例如，在一个实施方案中，本文所述的方 法和系统可以用来确定流感病毒或COVID-19病毒群体所促成的细胞感染率。

4)剖析复杂组织中的细胞类型百分比。例如，在一个实施方案中，可使用 本文所述的方法和系统来测量和定量肿瘤微环境中的免疫细胞群体。

5)可使用本文所述的方法和系统来验证单细胞RNA-seq数据的蛋白质信 息。

6)可使用本文所述的方法和系统来检测血液(例如，血红蛋白细胞)或淋巴 液中的小分子。

定义

如本文所用的术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，是包含性 的或开放式的，并且不排除来自药物(或在方法的情况下，步骤)的另外的未叙 述的要素或成分。短语“由……组成”不包括药物中未指定的任何要素、步骤或 成分(或在方法的情况下，步骤)。短语“基本上由……组成”是指指定的材料以 及不会显著影响药物的基本和新颖特征(或在方法的情况下，步骤)的那些材料。

如本文所用的术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论恶性或良 性)以及所有癌前期和癌性的细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性 病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文提到时并不相互排斥。

如本文所用的术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的特征通常在于 细胞生长和/或增殖失调的生理病状。一些癌症由快速分裂的细胞构成，而其 他癌症则由比正常细胞分裂更慢的细胞构成。癌症类型的示例可包括或不包 括例如癌、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和非霍奇金淋巴 瘤(non-Hodgkin's lymphoma))、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体 示例可包括或不包括例如鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、 肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵 巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或 子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、白血 病和其他淋巴增生性病症以及各种类型的头颈癌。

如本文所用的术语“接触”通常是指提供一种组分、试剂、分析物或样品与 另一种组分、试剂、分析物的接近。例如，接触可涉及将包含官能化纳米粒子 的溶液与包含细胞的样品混合。包含一种组分、试剂、分析物或样品的溶液还 可包含另一种组分或试剂，诸如二甲亚砜(DMSO)或洗涤剂，所述另一种组分 或试剂促进混合、相互作用、摄取或有利于组分、试剂、分析物和/或样品之 间的接触的其他物理或化学现象，在本发明的一些实施方案中，接触涉及利 用递送装置，诸如基于移液管的装置或基于注射器的装置，将包含官能化纳米粒子的溶液添加到包含细胞的样品中。

如本文所用，术语“受试者”等(包括“个体”和“患者”，其全部在本文中可 互换使用)是指任何哺乳动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动 物、野生动物园动物、运动动物或宠物动物，其可包括或不包括狗、马、猫、 绵羊、猪、牛等。优选的哺乳动物是人，包括成年人、儿童和老年人。优选的 运动动物是马和狗。优选的宠物动物是狗和猫。受试者可以是例如水生公园 动物，其可包括或不包括海豚、鲸、海豹或海象。在某些实施方案中，受试者、 个体或患者是人。

如本文所用，术语“样品”可以是指包含目标细胞的溶液、悬浮液、混合物 或未稀释量的水溶液。在一些实施方案中，目标细胞是稀有细胞。在一些实施 方案中，稀有细胞是皮肤细胞。在一些实施方案中，稀有细胞是循环癌细胞。 在一些实施方案中，水溶液进一步包含缓冲剂、稳定剂、细胞裂解剂、防腐 剂、EDTA等。在一些实施方案中，“样品”是体液。如本文所用，术语“体液” 可以是指可从受试者身体分离的任何流体，其可包括或不包括：全血、血浆、 血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液、脑脊液(CSF)、精液、擦拭样品(例如 脸颊拭子、鼻拭子、咽喉拭子等)、粘液、痰、月经血、月经液、阴道粘液、 羊水、滑液、母乳、恶露、稀粘液、淋巴、脓等。在一些实施方案中，体液可 更具体地是指全血、血清、尿液、唾液、擦拭的样品、粘液或精液。在某些实 施方案中，体液可更具体地是指全血、血清、尿液或唾液。在一些实施方案 中，体液可包含目标分析物(例如，靶猎物生物分子)。

如本文所用的术语“特异性地结合”和“特异性结合”意指在本发明的指定 条件下抗体或捕获剂以比其结合其他分子更大的亲和力结合靶标，诸如另一 种抗体、诱饵生物分子或猎物生物分子。在本发明的各种实施方案中，“特异 性地结合”可意指抗体或捕获剂以比其结合与靶分子无关的分子大至少约10⁶倍的亲和力、优选大至少约10⁷倍的亲和力、更优选在大至少约10⁸倍的亲和 力且最优选大至少约10⁹倍的亲和力结合靶分析物分子。通常，特异性结合是 指在比非特异性结合大约10⁶倍到约10⁹倍范围内的亲和力。在一些实施方案中，特异性结合的特征可在于相对于非特异性结合大10⁹倍的亲和力。无论何 时本文出现范围，如在“1-10或一到十”中，该范围是指但不限于给定范围中 的每个整数或测量单位。因此，1-10意指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10中 的每一个以及其间的任何子范围。

如本文所用，术语“猎物”或“猎物生物分子”或“靶猎物生物分子”是指存在 于待分析的所选细胞类型中的靶蛋白质、肽或多核酸(例如，DNA、mRNA、 tRNA、cDNA)。

如本文所用，术语“诱饵”或“诱饵生物分子”是指可特异性结合所述猎物 生物分子的经鉴别的蛋白质、肽或多核酸。诱饵生物分子和猎物生物分子的 结合形成检测事件的基础。在一些实施方案中，诱饵生物分子以高亲和力特 异性结合猎物生物分子。在一些实施方案中，可使用抑制动力学研究来测量 高结合亲和力。在一些实施方案中，高结合亲和力可小于10^-3M(即，0.001 M)、10^-4M、10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M或更小。在一 些实施方案中，诱饵生物分子是抗原，并且猎物生物分子是抗体。在一些实施 方案中，诱饵生物分子是第一蛋白质，并且猎物生物分子是第二蛋白质。在此 类实施方案中，本发明可用于测量蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)。在一些实施 方案中，第一蛋白质和第二蛋白质可独立地选自抗体、单链抗体、抗原结合抗 体片段、抗原、受体、配体、适体、适体受体、多核酸、细胞膜蛋白质、细胞 因子、转运体蛋白质、细胞信号传导分子、病毒粒子组分、细菌粒子组分或管 家蛋白质。在一些实施方案中，当猎物生物分子是多核酸时，诱饵生物分子是 包含一种序列的多核酸，所述序列的一部分具有与猎物生物分子的序列的一 部分的反向互补物，使得诱饵生物分子多核酸序列的一部分与猎物生物分子 的一部分杂交。在此类实施方案中，本发明可用于检测或分离来自样品中细 胞的所选多核酸。在此类实施方案中，猎物生物分子和诱饵生物分子可独立 地连接到生物素官能团，以便使得能够通过本文所述的方法实现链霉抗生物 素蛋白-抗体结合。

如本文所用，术语“磁性珠粒”是指至少具有一些磁性特征(例如铁磁性、 顺磁性和超顺磁性)的任何珠粒。在一些实施方案中，磁性珠粒包含铁、镍、 钴、氧化铁、氧化钡铁、氧化锰、氧化铬、氧化钴、氧化镍、磷化钴锰或其组 合。在一些实施方案中，磁性珠粒可包被有聚合物、水凝胶、聚乙二醇(PEG) 和/或官能化硅烷。在一些实施方案中，磁性珠粒可在磁性特征诱导元件周围 包被有一层二氧化硅。在一些实施方案中，可用羧酸、胺、生物素、链霉抗生 物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、NHS或马来酰亚胺将磁性珠 粒官能化。制备磁性珠粒的方法在本领域中是众所周知的，如在例如美国专 利号6,773,812和6,280,618中所述，所述专利的全部内容以引用方式并入本 文。可从商业供应商获得磁性珠粒(其可包括或不包括：Sera-Mag Streptavidin Speedbeads^TM、Sera-Mag NeutravidinSpeedbeads^TM、Streptavidin-Mag

或Streptavidin-Mag Agarose^TM(CytivaSciences(以前为GE Healthcare，以前为Amersham Biosciences))；AbraMagStreptavidin Magnetic Beads^TM或AbraMag Biotin Magnetic Beads^TM(Abraxis,ThomasScientific)； Dynabeads^TM(Thermo Fisher)、

珠粒(Miltenyi Biotec)或Turbobeads^TM (Turbobeads))。

如本文所用，术语“针对诱饵生物分子的一级抗体”是指特异性结合诱饵 生物分子的抗体、单链抗体(其可包括或不包括ScFv、纳米抗体、骆驼科动物 抗体(cameloid))、抗原结合抗体片段、抗原、受体、配体、适体、适体受体或 多核酸。在一些实施方案中，针对诱饵生物分子的一级抗体是单克隆抗体。在 一些实施方案中，针对诱饵生物分子的一级抗体是多克隆抗体。

如本文所用，术语“针对针对诱饵生物分子的一级抗体的二级抗体”是指 特异性结合针对诱饵生物分子的一级抗体的一部分的抗体、单链抗体(其可包 括或不包括ScFv、纳米抗体或骆驼科动物抗体)、抗原结合抗体片段、抗原、 受体、配体、适体、适体受体或多核酸。二级抗体所结合的针对诱饵生物分子 的一级抗体的表位位点不会破坏针对诱饵生物分子的一级抗体的结合。在一 些实施方案中，针对针对诱饵生物分子的一级抗体的二级抗体，或者直接通 过与二级抗体上的官能团(其可包括或不包括抗体的氨基酸的羧酸、胺或半胱 氨酸，或合成地添加到抗体上)的化学缀合，或者间接通过生物素-链霉抗生物 素蛋白(或中性抗生物素蛋白或抗生物素蛋白)相互作用连接到磁性珠粒上。在 一些实施方案中，针对针对诱饵生物分子的一级抗体的二级抗体是单克隆抗 体。在一些实施方案中，针对针对诱饵生物分子的一级抗体的二级抗体是多 克隆抗体。

如本文所用，术语“针对猎物生物分子的一级抗体”或“针对靶猎物生物分 子的一级抗体”是指特异性结合猎物生物分子的抗体、单链抗体(其可包括或 不包括ScFv、纳米抗体或骆驼科动物抗体)、抗原结合抗体片段、抗原、受体、 配体、适体、适体受体或多核酸。在一些实施方案中，在猎物生物分子与诱饵 生物分子相互作用的同时，针对猎物生物分子的一级抗体结合猎物生物分子 上的表位位点。在一些实施方案中，猎物生物分子与诱饵分子相互作用形成 复合物，针对猎物生物分子的一级抗体的一部分结合所述复合物。在一些实施方案中，用荧光团标记针对猎物生物分子的一级抗体。

如本文所用，术语“针对针对猎物生物分子的一级抗体的二级抗体”是指 特异性结合针对猎物生物分子的一级抗体的抗体、单链抗体(其可包括或不包 括ScFv、纳米抗体或骆驼科动物抗体)、抗原结合抗体片段、抗原、受体、配 体、适体、适体受体或多核酸。在一些实施方案中，将针对针对猎物生物分子 的一级抗体的二级抗体提供给针对猎物生物分子的一级抗体，而针对猎物生 物分子的一级抗体结合到猎物分子(猎物顺序添加)。在一些实施方案中，针对 针对猎物生物分子的一级抗体的二级抗体首先结合针对猎物生物分子的一级 抗体的表位位点，然后针对针对猎物生物分子的一级抗体结合所述猎物生物 分子(猎物复合添加)。针对猎物生物分子的一级抗体的表位不是猎物生物分子 -诱饵生物分子相互作用的一部分，针对针对猎物生物分子的一级抗体的二级 抗体结合所述表位。在一些实施方案中，针对针对猎物生物分子的一级抗体 的二级抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，针对针对猎物生物分子的一 级抗体的二级抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中，用荧光团标记针对针 对猎物生物分子的一级抗体的二级抗体。

如本文所用，术语“捕获剂”是指可选择性地结合靶生物分子的生物分子。 在一些实施方案中，捕获剂包括特异性结合猎物生物分子的抗体、单链抗体 (其可包括或不包括ScFv、纳米抗体或骆驼科动物抗体)、抗原结合抗体片段、 抗原、受体、配体、适体、适体受体或多核酸。

如本文所用，术语“荧光团”是指响应于光刺激事件而发射荧光信号的部 分。荧光团可以是小分子化合物或荧光蛋白质。在一些实施方案中，荧光团可 选自化学发光荧光团或荧光荧光团。在一些实施方案中，小分子荧光团可包 括或不包括：FAM、Cy染料、AlexaFluors、太平洋蓝(Pacific Blue)、香豆素、 BODIPY、丹磺酰、荧光黄、罗丹明(rhodamine)、德克萨斯红-X(Texas Red-X)、 太平洋绿(Pacific Green)、俄勒冈绿(Oregon Green)、德克萨斯红、四甲基罗丹 明、太平洋橙(Pacific Orange)、eFlours、PE-eFlours、PerCP-eFluors、Super Bright Fluors、DyLight Fluors、StarBright Fluors、DRAQ和CyTRAK探针、EverFluor fluors、Bella Fluors、Atto标签、Abberior染料、MegaSTOKES染料、DYfluors、 HiLyte Fluors、SeTau Dytes、Quasar和Cal Fluors、SureLight染料、APC(别 藻蓝蛋白)、APCXL、RPE、BPE、YOYO-1，以及以下文献中所述的其他荧光 团：分子探针手册，荧 光探针和标记技术指南(The Molecular Probes Handbook,A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)，第11版，Iain Johnson 和Michelle T.Z.Spence，由Life Technologies公司于2010年出版，以及 Invitrogen^TM分子探针手册：荧光探针和标 记技术指南(Invitrogen^TM Molecular Probes Handbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)，第 11版(出厂编号Invitrogen^TM H37126)，这两篇文献均在此以引用方式整体并 入本文。荧光荧光团可以是本领域所理解的任何荧光团，并且可通过本领域 所熟知的方法附着到抗体。在一些实施方案中，用荧光团对所述抗体的官能 化可通过NHS化学或马来酰亚胺化学进行，使得所述荧光团分别通过胺或半 胱氨酸残基共价缀合到所述抗体。在一些实施方案中，荧光蛋白质独立地与 诱饵生物分子、猎物生物分子或两者共表达。在一些实施方案中，荧光蛋白质 可包括或不包括：GFP(绿色荧光蛋白质)、YFP(黄色荧光蛋白质)、CFP(青色 荧光蛋白质)、RFP(红色荧光蛋白质)、mCherry、mNeon Green、Sirius、 Sandercyanin、shBFP-N158S、Azurite、EBFP2、mKalama1、mTagBFP2、TagBFP、 shBFP、ECFP、Cerulean、mCerulean3、SCFP3A、CyPet、mTurquise、mTFP1、 单体Midoriishi-Cyan、Aquamarine、TurboGFP、TagGFP2、mUKG、Superfolder GFP、Emerald、EGFP、单体Azami Green、mWasabi、Clover、NowGFP、mClover3、 TagYFP、EYFP、Topaz、Venus、SYFP2、Citrine、Ypet、IanRFP-deltaS83、 mPapaya1、mCyRFP1、单体Kusabira-Orange、mOrange、mOrange2、MOKk、 MKO2、TagRFP、TagRFP-T、RRvT、mRuby、mRuby2、mTangerine、mApple、 mStrawberry、FusionRed、mNectarine、mRuby3、mScarlet、mScarlet-I、mKate2、HcRed-Tandem、mPlum、mRaspberry、mNeptune、NirFP、TagRFP657、TagRFP675、 mCardinal、mStable、mMaroon1、mGarnet2、iFP1.4、iFP713、iFP670、iFP682、 iFP702、iFP720、iFP2.0、mIFP、TDsmURFP、miRFP670、Sapphire、T-Sapphire、 mAmetrine、mKeima、mBeRFP、LSS-mKate2、LSS-mKate1、LSSmOrange或 CyOFP1。

如本文所用，术语“裂解缓冲剂”或“细胞裂解缓冲剂”是指能够破坏细胞 膜的试剂。裂解缓冲剂可包括变性或非变性洗涤剂(本文还被称为表面活性剂)。 当靶生物分子是多核酸时，可使用变性洗涤剂。当靶生物分子是需要保留三 级结构以进行检测的蛋白质或多肽时，使用非变性洗涤剂。在一些实施方案 中，变性洗涤剂是SDS(十二烷基硫酸钠)。在一些实施方案中，非变性洗涤 剂选自：CHAPS、脱氧胆酸盐、Triton^TM X-100、NP40和吐温20。裂解缓冲 剂可进一步包括本领域所熟知的缓冲盐。

在一些实施方案中，猎物生物分子和诱饵生物分子独立地选自细胞表面 蛋白质或细胞溶质蛋白质。在一些实施方案中，猎物生物分子和诱饵生物分 子独立地选自人类蛋白质图谱(https://www.proteinatlas.org/，于2020年6月26 日访问)中的任何蛋白质。在一些实施方案中，猎物生物分子和诱饵生物分子 独立地选自：HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、ZAP-70、MPO、TdT、 FMC-7、HER2、NEU、前列腺干细胞抗原(PSCA)、上皮特异性抗原(ESA)、 上皮细胞粘附分子(EpCAM)、α2β1、VEGFR-1、VEGFR-2、CD133、AC133抗 原、CD1、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、 CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、 CD23、CD25、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、C43、CD45、CD56、 CD57、CD58、CD61、CD64、C71、CD79a、CD99、CD103、CD117、CD123、 CD138、CD138、CD163、CD235a、HLA-DR、κ、λ、Pax-5、BCL-2、Ki-67、 ZAP-70、MPO、TdT、FMC-7、Pro2PSA、ROMA(HE4+CA-125)、OVA1(多种蛋白质)、HE4、纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物(DR-70)、AFP-L3％、循环肿 瘤细胞(EpCAM、CD45、细胞角蛋白8、细胞角蛋白18+、细胞角蛋白19+)、 HER2、NEU、前列腺干细胞抗原(PSCA)、上皮特异性抗原(ESA)、上皮细胞 粘附分子(EpCAM)、α2β1、VEGFR-1、VEGFR-2、CD133、AC133抗原、p63 蛋白质、c-Kit、CA19-9、雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、Pro2PSA、HER- 2/neu、CA-125、CA15-3、CA27.29、游离PSA、甲状腺球蛋白、核有丝分裂 器蛋白质(NuMA、NMP22)、α-甲胎蛋白(AFP)b、ROMA(HE4+CA-125)、OVAL HE4、DR-70、p63蛋白质、c-Kit、CA19-9、总PSA、α-甲基酰基-CoA消旋酶 /AMACR、CA125/MUC16、ERα/NR3A1、ERβ/NR3A2、胸苷激酶1、AG-2、 BRCA1、BRCA2、CA15-3/MUC-1、陷窝蛋白-1、CD117/c-kit、CEACAM- 5/CD66e、细胞角蛋白14、EGF R/ErbB1、HIN-1/SCGB3A1、Ki-67/MKI67、 MKP-3、巢蛋白(Nestin)、NGF R/TNFRSF16、NM23-H1、PARP、PP4、丝氨 酸蛋白酶抑制蛋白E1/PAI-1、14-3-3β、14-3-3σ、14-3-3ζ、15-PGDH/HPGD、 5T4、A33、ABCBS、ABCB6、ABCG2、ACE/CD143、ACLP、ACP6、丝状 肌动蛋白结合蛋白(Afadin)/AF-6、阿法米(Afamin)、AG-2、AG-3、Akt、醛酮 还原酶1C3/AKR1C3、α1B-糖蛋白、α1-微球蛋白、αB晶体蛋白/CRYAB、α- 甲胎蛋白/AFP、α-甲基酰基-CoA消旋酶/AMACR、AMFR/gp78、膜联蛋白A3、 膜联蛋白A8/ANXA8、APC、载脂蛋白A-I/ApoA1、载脂蛋白A-II/ApoA2、 载脂蛋白E/ApoE、APRIL/TNFSF13、ASCL1/Mash1、ATBF1/ZFHX3、吸诱 素、极光激酶A(Aurora A)、BAP1、Bcl-2、Bcl-6、β2-微球蛋白、β-1,3-葡萄 糖醛酸基转移酶1/B3GAT1、β-连环蛋白、β-III微管蛋白、比库蛋白(Bikunin)、 BMI-1、B-Raf、BRCA1、BRCA2、Brk、C4.4A/LYPD3、CA15-3/MUC-1、c- Ab1、钙粘素-13、钙调蛋白结合蛋白/CALD1、钙调理蛋白1、钙视网膜蛋白、 碳酸酐酶IX/CA9、过氧化氢酶、组织蛋白酶D、陷窝蛋白-1、陷窝蛋白-2、 CBFB、CCR7、CCR9、CEACAM-19、CEACAM-20、CEACAM-4、CHD1L、 几丁质酶3样1、胆囊收缩素-B R/CCKBR、绒毛膜促性腺激素α链(αHCG)、 绒毛膜促性腺激素α/β(HCG)、CKAP4/p63、密封蛋白-18、簇集素、c-Maf、c- Myc、毛状蛋白(Coactosin)样蛋白质1/CotL1、COMMD1、Cornulin、皮层肌动 蛋白、COX-2、CRISP-3、CTCF、CTL1/SLC44A1、CXCL17/VCC-1、CXCL8/IL- 8、CXCL9/MIG、CXCR4、细胞周期蛋白A1、细胞周期蛋白A2、细胞周期 蛋白D2、细胞周期蛋白D3、CYLD、Cyr61/CCN1、细胞角蛋白14、细胞角 蛋白18、细胞角蛋白19、DAB2、DCBLD2/ESDN、DC-LAMP、Dkk-1、DLL3、 DMBT1、DNMT1、DPPA2、DPPA4、E6、E-钙粘素、ECM-1、EGF、EGF R/ErbB1、 ELF3、ELTD1、EMMPRIN/CD147、EMP2、内皮联蛋白/CD105、内皮唾液酸 蛋白/CD248、烯醇化酶2/神经元特异性烯醇化酶、EpCAM/TROP1、Eps15、 ERα/NR3A1、ERβ/NR3A2、ErbB3/Her3、ErbB4/Her4、ERCC1、ERK1、 ERK5/BMK1、Ets-1、外生骨疣蛋白1(Exostosin 1)、EZH2、埃兹蛋白(Ezrin)、 FABP5/E-FABP、肌成束蛋白、FATP3、FCRLA、胎球蛋白A/AHSG、酸性FGF、 碱性FGF、FGF R3、FGF R4、纤维蛋白原、成纤维细胞活化蛋白质α/FAP、 卵泡抑素样1/FSTL1、FOLR1、FOLR2、FOLR3、FOLR4、FosB/GOS3、FoxMl、 FoxO3、FRAT2、FXYD5/抗粘附素、GABA-A Rα1、GADD153、GADD45α、 半乳凝素-3、半乳凝素-3BP/MAC-2BP、γ-谷氨酰环化转移酶/CRF21、Gasl、 胃泌素-释放肽R/GRPR、胃动蛋白1、凝溶胶蛋白/GSN、GFAP、GLI-2、谷 胱甘肽过氧化物酶3/GPX3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、高尔基糖蛋白1/GLG1、gp96/HSP90B1、GPR10、GPR110、GPR18、GPR31、GPR87、GPRC5A、GPRC6A、 GRP78/HSPA5、HE4/WFDC2、类肝素酶/HPSE、丝氨酸蛋白酶(Hepsin)、Her2、 HGF R/c-MET、HIF-2α/EPAS1、HIN-1/SCGB3A1、HLA-DR、HOXB13、HOXB7、 HSP70/HSPA1A、HSP90、透明质酸酶1/HYAL1、ID1、IgE、IGFBP-2、IGFBP- 3、IGFBP-4、IGFBP-6、IGF-I、IGF-I R、IGF-II、IGFL-3、IGFLR1、IL-1β/IL-1F2、IL-17E/IL-25、IL-2、IL-6、IMP脱氢酶1/IMPDH1、输入蛋白α2/KPNA2、 ING1、整合素β1/CD29、整合素β3/CD61、IQGAP1、异柠檬酸脱氢酶1/IDH1、 ITIH4、ITM2C、Jagged 1、JNK、JunB、JunD、激肽释放酶2、激肽释放酶6/ 甘油磷酸钙(Neurosin)、KCC2/SLC12A5、Ki-67/MKI67、KiSS1R/GPR54、KLF10、 KLF17、L1CAM、乳酸盐脱氢酶A/LDHA、核纤层蛋白B1、LEF1、瘦素/OB、 LIN-28A、LIN-28B、脂质运载蛋白-2/NGAL、LKB1/STK11、LPAR3/LPA3/EDG- 7、LRMP、LRP-1B、LRRC3B、LRRC4、LRRN1/NLRR-1、LRRN3/NLRR-3、 Ly6K、LYPD1、LYPD8、MAP2、蛋白裂解酶(Matriptase)/ST14、MCAM/CD146、 M-CSF、MDM2/HDM2、Melan-A/MART-1、黑皮质素-1R/MC1R、黑素转铁 蛋白(Melanotransferrin)/CD228、褪黑激素、Mer、间皮素、异粘蛋白(Metadherin)、 转移抑素(Metastin)/KiSS1、甲硫氨酸氨肽酶、甲硫氨酸氨肽酶2/METAP2、MFAP3L、MGMT、MIA、MIF、MINA、Mind Bomb 2/MIB2、Mindin、MITF、 MKK4、MKP-1、MKP-3、MMP-1、MMP-10、MMP-13、MMP-2、MMP-3、 MMP-8、MMP-9、MRP1、MRP4/ABCC4、MS4A12、MSH2、MSP R/Ron、 MSX2、MUC-4、Musashi-1、NAC1、新天冬氨酸蛋白酶A(Napsin A)、NCAM- 1/CD56、NCOA3、NDRG1、NEK2、NELL1、NELL2、新饱食分子蛋白-1 (Nesfatin-1)/核连蛋白-2、巢蛋白、NFkB2、NF-L、NG2/MCSP、NGF R/TNFRSF16、烟酰胺N-甲基转移酶/NNMT、NKX2.2、NKX3.1、NM23-H1、 NM23-H2、Notch-3、NPDC-1、NTS1/NTSR1、NTS2/NTSR2、OGR1、Olig2、 骨桥蛋白/OPN、Ovastacin、OXGR1/GPR80/P2Y15、p130Cas、 p15INK4b/CDKN2B、p16INK4a/CDKN2A、p18INK4c/CDKN2C、 p21/CIP1/CDKN1A、p27/Kip1、P2X5/P2RX5、p53、PARP、PAUF/ZG16B、PBEF/ 内脂素(Visfatin)、PDCD4、PDCD5、PDGF Rα、PDGF Rβ、PDZD2、PEA-15、 胃蛋白酶原A5/PGA5、肽酶抑制剂16/PI16、过氧化物还原酶2(Peroxiredoxin 2)、PGCP、PI 3-激酶p85α、PIWIL2、PKM2、PLK1、PLRP1、PP4、P-Rex1、 PRMT1、抑制蛋白1、孕酮R B/NR3C3、孕酮R/NR3C3、颗粒蛋白前体 (Progranulin)/PGRN、催乳素、前列腺素E合酶2/PTGES2、PSAP、PSCA、PSMA/FOLH1/NAALADase 1、PSMA1、PSMA2、PSMB7、PSP94/MSMB、 PTEN、PTEN、PTH1R/PTHR1、PTK7/CCK4、PTPβ/ζ/PTPRZ、Rab25、RARRES1、 RARRES3、Ras、Reg4、Ret、RNF2、RNF43、S100A1、S100A10、S100A16、S100A2、S100A4、S100A6、S100A7、S100A9、S100B、S100P、SART1、SCUBE3、促胰液素R、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A9/Centerin、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白 E1/PAI-1、血清淀粉样A1、血清淀粉样A4、SEZ6L、SEZ6L2/BSRP-A、Skp2、 SLC16A3、SLC45A3/普罗斯汀(Prostein)、SLC5A5、SLC5A8/SMCT1、SLC7A7、 Smad4、SMAGP、SOCS-1、SOCS-2、SOCS-6、SOD2/Mn-SOD、Soggy-1/DkkL1、 SOX11、SOX17、SOX2、SPARC、SPARC样1/SPARCL1、SPINK1、Src、STEAP1、STEAP2、STEAP3/TSAP6、STRO-1、STYK1、存活蛋白、突触结 合蛋白-1、粘结蛋白聚糖-1/CD138、突触融合蛋白4、突触核蛋白-γ、端锚聚 合酶1、Τ、TCF-3/E2A、TCL1A、TCL1B、TEM7/PLXDC1、TEM8/ANTXR1、 腱糖蛋白C、TFF1、TGF-β1、TGF-β1、2、3、TGF-β1/1.2、TGF-β2/1.2、TGF- βRI/ALK-5、THRSP、胸苷激酶1、胸腺素β10、胸腺素β4、甲状腺球蛋白、 TIMP测定试剂盒、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、TLE1、TLE2、TLR2、 TM4SF1/L6、TMEFF2/脑肿瘤抑癌蛋白-2(Tomoregulin-2)、TMEM219、 TMEM87A、TNF-α、TOP2A、TopBP1、t-纤溶酶原活化物/tPA、TRA-1-60(R)、 TRA-1-85/CD147、TRAF-4、转凝蛋白/TAGLN、胰蛋白酶2/PRSS2、类胰蛋白酶α/TPS1、TSPAN1、UBE2S、uPAR、u-纤溶酶原活化物/尿激酶、尾紧张 肽-II R、VAP-1/AOC3、VCAM-1/CD106、VEGF、VEGF R1/Flt-1、VEGF R2/KDR/Flk-1、VEGF/P1GF异型二聚体、VSIG1、VSIG3、YAP1、ZAG、ZAP70、 ZMIZ1/Zimp10和癌胚抗原。

在一些实施方案中，猎物生物分子选自由肾细胞、感染原(infectious agent) 或寄生虫原(parasitic agent)、实体瘤细胞、循环肿瘤细胞或可用于诊断或预后 的任何其他细胞表达的生物分子。在一些实施方案中，猎物生物分子选自在 肾细胞、感染原(例如，细菌或病毒)、实体瘤细胞或循环肿瘤细胞的表面上或 这些细胞内表达的生物分子。在一些实施方案中，在肾细胞表面上或肾细胞 内表达的猎物生物分子可包括或不包括：KIM-1、白蛋白、β-2微球蛋白、半 胱氨酸蛋白酶抑制剂C、簇集素、载脂蛋白A-I/ApoA1、CXCL8/IL-8、ERCC1、 Ki-67/MKI67、MMP-9或三叶因子-3。

在一些实施方案中，猎物生物分子是用于特定类型的癌症的一种或多种 生物标志物。在一些实施方案中，用于乳腺癌的猎物生物分子可包括或不包 括her2-neu、ER、PR、Ki-67和p53。在一些实施方案中，用于肺癌的猎物生 物分子可包括或不包括TTF-1、新天冬氨酸蛋白酶A、CK 5/6、p40/63和突触 小泡蛋白(Synaptophosmin)。在一些实施方案中，用于前列腺癌的猎物生物分 子可包括或不包括AMACR、PSA、CEA和p63。在一些实施方案中，用于结 直肠癌的猎物生物分子可包括或不包括MLH1、MSH2、PMS2、MSH6、c-Kit、 p16和BRAFV600E。在一些实施方案中，用于肿瘤浸润性淋巴细胞的猎物生 物分子可包括或不包括CD4、CD8、CD14、CD20、CD45RO、FoxP3、PD-L 和PD-L1。在一些实施方案中，用于泌尿系统(膀胱、肾、尿道)癌的猎物生物 分子可包括或不包括CK7、p63、CK20、p53、Ki-67、PSA、波形蛋白和PAX8。

在一些实施方案中，猎物生物分子是细胞特异性的。细胞可处于健康状 态(正常)或患病状态(异常)。单核细胞和巨噬细胞可展现包括或不包括CD14 和CD16生物分子的猎物生物分子。淋巴细胞B细胞可展现包括或不包括 CD20生物分子的猎物生物分子。淋巴细胞NK细胞可展现包括或不包括CD56 生物分子的猎物生物分子。淋巴细胞T细胞可展现包括或不包括CD3生物分 子的猎物生物分子。T Reg细胞可展现包括或不包括CD4、CD25和FoxP3生 物分子的猎物生物分子。细胞毒性T细胞可展现包括或不包括CD8生物分子 的猎物生物分子。辅助T细胞可展现包括或不包括CD4生物分子的猎物生物 分子。初始T细胞可展现包括或不包括CD45RA生物分子的猎物生物分子。 记忆T细胞可展现包括或不包括CD45RO生物分子的猎物生物分子。Tth细 胞可展现包括或不包括CXR5生物分子的猎物生物分子。Th17细胞可展现包 括或不包括CCR6生物分子的猎物生物分子。Th2细胞可展现包括或不包括CCR4生物分子的猎物生物分子。Th1细胞可展现包括或不包括CXCR3生物 分子的猎物生物分子。肿瘤细胞可展现包括或不包括PanCK生物分子的猎物 生物分子。

如本文所用，术语“抗体”是指可特异性结合抗原的蛋白质。在一些实施方 案中，抗体可包括或不包括任何重组或天然存在的免疫球蛋白分子，其可包 括或不包括IgG类别(例如IgG1)、IgM类别、IgY类别、IgD类别、IgE类别 的成员；以及任何抗原结合免疫球蛋白片段，其可包括或不包括Fv、Fab和 F(ab′)2片段、抗体片段、ScFv(单链可变片段，即免疫球蛋白重链(V_H)和轻链(V_L)的可变区的融合蛋白质，所述重链(V_H)和轻链(V_L)与10到约25个氨基酸 的短接头肽连接)或单结构域抗体(纳米抗体)，以及它们的任何衍生物。在实 施方案中，抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

如本文所用的术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，其中该部分保留 在其存在于完整抗体中时通常与该部分相关的至少一种且多达大部分或所有 功能。在一些实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，因此保留 结合抗原的能力。在一些实施方案中，抗体片段(例如包含Fc区的抗体片段) 保留在其存在于完整抗体中时通常与Fc区相关的至少一种生物学功能，所述 功能可包括或不包括FcRn结合、抗体半衰期调节、ADCC功能和补体结合。 在一些实施方案中，抗体片段是具有与完整抗体基本上类似的体内半衰期的 单价抗体。例如，此类抗体片段可包含抗原结合臂，该抗原结合臂连接到能够 赋予片段体内稳定性的Fc序列。

“多克隆抗体”或“PAb”是来源于用抗原或其抗原功能衍生物免疫的动物 的血清的抗体分子的异质群体。为了生产多克隆抗体，可包括或不包括兔、小 鼠和山羊的宿主动物可通过注射任选地补充有佐剂的抗原或抗原缀合物进行 免疫。多克隆抗体可在抗血清中从其他物种中未经纯化、纯化或部分纯化。用 于制备和纯化多克隆抗体的技术描述于各种一般和更具体的参考文献中，包 括但不限于Kabat和Mayer,实验免疫化学(Experimental Immunochemistry),第 2版,(Thomas,Springfield,Ill.(1961))；Harlow和Lane,抗体：实验室手册 (Antibodies:A Laboratory Manual)(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988))；和Weir,实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology),第5版(Blackwell Science,Cambridge,Mass.(1996))。

“单克隆抗体”或“MAb”是结合特定抗原的同质抗体群体，并且可通过提 供抗体分子生产的任何技术获得，所述技术可包括或不包括通过细胞系的连 续培养。这些技术包括但不限于

和Milstein的杂交瘤技术，“分泌具有 预定特异性的抗体的融合细胞的连续培养物(Continuous cultures of fused cells secreting antibiody ofpredefined specificity)”,Nature,256:495-497(1975)；和美 国专利号4,376,110)、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，“从人淋巴细胞生产单 克隆抗体(The Production ofMonoclonal Antibodies From Human Lymphocytes)”, Immunology Today,4:72-79(1983)；Cote,R.J.等，“与细胞抗原反应的人单克隆 抗体的生成(Generation of humanmonoclonal antibodies reactive with cellular antigens)”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026-30(1983))以及EBV-杂交瘤技术 (Cole等，单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy), Alan R.Liss,Inc.,NewYork,第77-96页(1985))。此类抗体可属于任何免疫球 蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。产生本发明MAb 的杂交瘤可在体外或体内培养。体内产生高滴度的MAb使其成为目前优选的 产生方法。

或者，针对单链抗体的产生所述的技术(美国专利号4,946,778；Bird等， “单链抗原结合蛋白质(Single-chain Antigen-Binding Proteins)”,Science, 242:423-426(1988)；Huston等，“抗体结合位点的蛋白质工程：在大肠杆菌中 产生的抗地高辛单链Fv类似物的特异性活性的恢复(Protein Engineering of Antibody Binding Sites:Recoveryof Specific Activity in an Anti-Digoxin Single- Chain Fv Analogue Produced inEscherichia Coli)”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85:5879-83(1988)；和Ward.,“从大肠杆菌分泌的单一免疫球蛋白可变结构域 库的结合活性(Binding Activities of aRepertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted fromEscherichia Coli)”,334:544-546(1989))可被改 造以产生适用于本发明中的基因-单链抗体。单链抗体通常是通过以下方式形 成：经由氨基酸桥连接Fv区的重链片段和轻链片段，从而产生单链多肽。

可通过已知技术生成识别特异性表位的抗体片段。例如，此类片段包括 但不限于：可通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生的F(ab′)2片段，以及可通过 还原F(ab′)₂片段的二硫键桥而生成的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库 (Huse等，“在噬菌体λ中生成免疫球蛋白库的大组合文库(Generation of a large combinatorial library of theimmunoglobulin repertoire in phage lambda)”,Science, 246:1275-1281(1989))以允许快速且容易地鉴别具有期望特异性的单克隆Fab 片段。

如本文所用，术语“多肽”、“肽模拟物”和“模拟物”包括合成的或遗传工程 化的化学化合物，所述化学化合物可具有与它们所模拟的蛋白质区基本上相 同的结构和功能特征。

在一些实施方案中，多肽可以是经修饰的或未经修饰的。通常，肽模拟物 是与范例多肽(即，具有生物学或药理学功能或活性的多肽)(例如，相同或类 似)的结构或功能模拟物，但也可具有一个或多个任选地被选自由例如以下组 成的组的键替代的肽键：-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反 式)、-COCH₂-、-CH(OH)CH₂-和-CH₂SO-。模拟物可完全由天然氨基酸、合成 化学化合物、氨基酸的非天然类似物构成，或者是部分为天然肽氨基酸和部 分为氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可包含任何量的天然氨基 酸保守取代，只要此类取代也不显著改变模拟物活性即可。

如本文所用，术语“约”意在定量其所修饰的数值，表示在误差界限内可变 的此类值。当没有叙述特定的误差界限(诸如例如，相对于平均值的标准偏差) 时，术语“约”意指所使用数字的数值的加或减10％。例如，“约50％”意指在 45％到55％的范围内。

系统

在一些实施方案中，本公开提供了用于分离单细胞和分析所选细胞组分 的系统。在一些实施方案中，本文所述的系统可以高于10、高于12、高于15 或高于20的信噪比(SN)，定量地分析所选细胞组分。

单细胞分离、单细胞裂解、抗体/捕获剂包被的珠粒和TIRF或共焦显微 术的组合允许灵敏地检测所选细胞组分。此外，靶向诱饵生物分子、然后在诱 饵生物分子和猎物生物分子之间形成复合物、之后通过本文所述的方法成像 的设计允许捕获和分析原本在这样高的SN水平下不能检测到的诱饵-猎物生 物分子相互作用(蛋白质-蛋白质相互作用，PPI)。

衬底

本文所述的本发明包括包含多个微米大小的特征的衬底用于分析分离的 单细胞和/或其所选组分的用途。在一些实施方案中，盖片可由透明固体介质 制成。透明固体介质可选自玻璃(例如，派莱克斯耐高温玻璃(pyrex)、硼硅酸 盐、碱石灰、光学玻璃、石英)、环烯烃聚合物(例如，Zeonor、Zeonex)或聚丙 烯酸酯。在一些实施方案中，衬底可以是0号到4号类型(对应于约0.085mm 到约0.64mm的厚度)的盖片。在一些实施方案中，可涂覆衬底。涂层可包括 或不包括硅烷、聚硅烷或聚合物。在一些实施方案中，用聚二甲基二氯硅烷涂 覆衬底。可将微米大小的特征蚀刻到衬底中或通过硬化的聚合物提供在衬底 的顶部上。在一些实施方案中，硬化聚合物可包括或不包括PDMS或SU8。 SU-8包含双酚A酚醛环氧单体，该单体溶解于有机溶剂(γ-丁内酯GBL或环 戊酮，取决于配方)中，并且与可包括或不包括三芳基

/六氟锑酸盐的光酸生 成剂交联。在一些实施方案中，硬化的聚合物可由通过常规光刻方法生成的 固体负母片模板制成。使硬化的聚合物和交联剂的前体与负母片模板接触， 交联反应开始(例如，热和/或光)，并且移除母模以生成微米大小的特征。

特征的直径可被配置为允许一个细胞进入每个特征中。如图6a和6b所 示，特征的大小可被配置为选择性地每个特征分离单个细胞。这种单细胞分 离尤其允许分离经分离细胞的细胞组分。与和分离的细胞共定位的官能化珠 粒和用于实现高灵敏度荧光检测的平台(例如，TIRF或共焦显微术)组合，可 分析一种或多种分离的细胞的组分，包括蛋白质-蛋白质相互作用。单细胞的 分离还允许分析稀有细胞，其可包括或不包括毛细胞(例如，耳蜗细胞)、循环 肿瘤细胞或循环胚胎细胞。衬底中的多个微米大小的特征可具有呈圆形的特 征。衬底中的多个微米大小的特征可包括一系列特征，所述特征独立地具有 直径在8微米到15微米、15微米到45微米、45微米到80微米、80微米到 100微米、100微米到150微米或上述范围之间的任何范围的大小。在一些实 施方案中，特征直径可被配置为分离所选细胞(例如，大细胞/小细胞群体内的 小细胞)。在一些实施方案中，特征的直径可为15微米、16微米、17微米、 18微米、19微米、20微米、21微米、22微米、23微米、24微米、25微米、 26微米、27微米、28微米、29微米、30微米、31微米、32微米、33微米、 34微米、35微米、36微米、37微米、38微米、39微米、40微米、41微米、 42微米、43微米、44微米或45微米。多个特征可被足够远地间隔开，使得 来自任何一个特征中的荧光团的荧光光晕(bloom)将不会与来自另一特征中的 荧光团的荧光的荧光光晕重叠。在一些实施方案中，各特征的中心之间的距 离可在约10微米到约5000微米的范围。各特征的中心之间的距离可在10微 米到100微米、100微米到200微米、200微米到500微米、500微米到1000 微米、1000微米到2000微米、2000微米到5000微米的范围，或上述范围之 间的任何范围。特征的深度可足以分离和维持特征内的单细胞，同时防止两 个或更多个细胞占据同一个特征。在一些实施方案中，特征的深度可在约15 微米到约150微米的范围。在一些实施方案中，特征的深度可在约15微米到 约40微米、约40微米到约60微米、约60微米到约75微米、约75微米到 约90微米、约90微米到约120微米、约120微米到约150微米的范围，或 上述范围之间的任何范围。

珠粒

本文所述的发明涉及纳米大小官能化珠粒的用途。珠粒的大小使得多个 珠粒将进入衬底的特征(孔)中。纳米大小的珠粒的大小可以是5纳米到1000 纳米。在一些实施方案中，珠粒的直径可以是5纳米到20纳米、20纳米到 50纳米、50纳米到100纳米、100纳米到500纳米、500纳米到1000纳米， 或任何上述范围之间。可用聚合物、二氧化硅或水凝胶层涂覆珠粒。可将珠粒 官能化以使其结合抗体或捕获剂。可用羧酸、胺、生物素、链霉抗生物素蛋 白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、NHS或马来酰亚胺将珠粒官能化。 官能化珠粒可经由直接共价键包被有生物分子(例如，具有多肽或抗体上的赖 氨酸残基或5'氨基官能化的多核酸的NHS官能化珠粒)，或通过间接方式(例 如，结合到六组氨酸修饰的蛋白质的NTA-Ni官能化珠粒)而包被有生物分子。

在一些实施方案中，可通过使用链霉抗生物素蛋白-生物素结合将纳米大 小的官能化珠粒官能化。在一些实施方案中，可用EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二 甲基氨基丙基)碳化二亚胺/N-羟基-琥珀酰亚胺)活化用羧酸官能团包被的纳 米大小的粒子，之后洗涤，以产生EDC官能化的纳米粒子。其他酰胺偶合剂 可代替EDC使用，例如，DCC(二环己基碳化二亚胺)、EDAC.HCl、(N-(3-二 甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺.HCl)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HOOBt (HODhbt)(羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪)、HOAt(1-羟基-7-氮杂-1H-苯 并三唑)、DMAP(4-(N,N-二甲基氨基)吡啶)、BOP(苯并三唑-1-基氧基-三(二 甲基氨基)-

六氟磷酸盐)、PyBOP(苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基

六氟磷 酸盐)、PyOxim(氰基(羟基亚氨基)乙酸基-O2)-三-(1-吡咯烷基)-

六氟磷酸乙 基酯)、PyBrOP(7-氮杂-苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基

六氟磷酸盐)、DEPBT (3-(二乙氧基-磷酰氧基)-1,2,3-苯并[d]三嗪-4(3H)-酮)、TBTU/HBTU(2-(1H-苯 并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基胺

四氟硼酸盐/六氟磷酸盐)、HCTU((2-(6-氯 -1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基胺

六氟磷酸盐)、HDMC(N-[(5-氯-1H- 苯并三唑-1-基)-二甲基氨基-吗啉代]-脲

六氟磷酸盐N-氧化物)、HATU(2-(7- 氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基胺

六氟磷酸盐)、COMU(1-[1-(氰 基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)-二甲基氨基-吗啉代]-脲

六氟磷酸盐)、 TOTT((2-(1-氧基-吡啶-2-基)-1,1,3,3-四甲基异硫脲

四氟硼酸盐)、TFFH(四甲基氟甲脒

六氟磷酸盐)、EEDQ(N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉)、 T3P(2-丙烷膦酸酐)、DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉

盐)或CDI(1,1′-羰基二咪唑)。在一些替代实施方案中，可在存在碱的情况 下进行偶合。碱可以是有机或无机的。无机碱可包括或不包括例如碳酸盐缓 冲剂或磷酸盐缓冲剂。有机碱可以是三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)或N-甲 基吗啉(NMM)。

洗涤可以是pH温和的洗涤，以便不水解NHS部分。温和pH洗涤可用 PBS缓冲剂(磷酸盐缓冲盐水，pH约7.4)进行。接着，链霉抗生物素蛋白可与 EDC官能化的纳米粒子反应，以产生链霉抗生物素蛋白官能化的纳米粒子。 其他抗生物素蛋白样分子可代替链霉抗生物素蛋白使用，例如：已结合一个、 两个或三个生物素的抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、超抗生物素蛋白 (superavidin)和链霉抗生物素蛋白。在一些实施方案中，可用生物素将捕获剂 /抗体官能化。抗体可与交联剂如磺基-SMCC(Pierce)反应，之后与硫醇-缀合 的生物素反应，以产生生物素化的抗体。在替代实施方案中，抗体可与NHS- 缀合的生物素反应，其中NHS-缀合的生物素可与抗体上的任何游离胺(优选 来自赖氨酸残基的游离胺)反应，以产生生物素化的抗体。在替代实施方案中， 抗体可与DTT(二硫赤藓糖醇)反应以破坏二巯基半胱氨酸键，以产生游离的 巯基(sulfuryl hydryl)。巯基可与马来酰亚胺缀合的生物素反应以产生生物素化 的抗体。在一些实施方案中，可购买具有选自以下的官能团的纳米粒子：羧 酸、NHS、链霉抗生物素蛋白、胺、炔或醛。生物素化抗体可与链霉抗生物素 蛋白官能化纳米粒子反应以产生直接连接的抗体官能化纳米粒子。

用相同的生物分子均质地官能化每个纳米大小的官能化珠粒。然而，在 一些实施方案中，可将多种类型的均质官能化的纳米大小的珠粒添加到微米 大小的衬底特征中，以使得能够对相同细胞内的多种猎物生物分子进行捕获 和分析。在一些实施方案中，可将相对量的多种类型的均质官能化纳米大小 珠粒的每一种添加到微米大小的衬底特征中，以使得能够对同种分离的细胞 中的各种细胞组分进行相对定量。

在一些实施方案中，用单一捕获剂或抗体(结合诱饵蛋白质的一级抗体)将 纳米大小的官能化珠粒官能化。在一些实施方案中，用二级抗体将纳米大小 的官能化珠粒官能化，并且一级抗体结合二级抗体的一部分。在一些实施方 案中，二级抗体针对诱饵生物分子。此类配置通过将所鉴别的抗体添加到一 级抗体官能化珠粒上来允许官能化珠粒对诱饵生物分子的可编程性。

在一些实施方案中，在将纳米大小的官能化珠粒提供给包含多个微米大 小的特征的衬底之前，或在将纳米大小的官能化珠粒提供给微米大小的特征 之后，可将捕获剂/抗体添加到该珠粒上。在一些实施方案中，多个经抗体包 被的珠粒可包含针对针对靶诱饵生物分子的一级抗体的多种二级抗体。多个 经抗体包被的珠粒可包含针对靶诱饵生物分子的多种一级抗体。在一些方面， 多个经抗体包被的珠粒包含结合与诱饵生物分子结合的多种一级抗体的二级 抗体。在一些实施方案中，可在将细胞提供给包含多个微米大小的特征的衬 底之前，将捕获剂/抗体添加到包含细胞的溶液。在此类实施方案中，在抗体 连接到纳米大小的官能化珠粒之前，抗体可与游离溶液中的细胞表面细胞组 分缔合，这可增加反应动力学。

在将多个细胞提供给衬底之前或之后，可将纳米大小的官能化珠粒(进一 步用捕获剂/抗体官能化)添加到包含多个微米大小的特征的衬底。在一些实施 方案中，珠粒可具有磁性，使得磁场的引入将珠粒拉到衬底的表面，以便在使 用TIRF或共焦显微术时允许荧光检测的更有效的灵敏度。在一些实施方案 中，可利用重力(例如，允许沉降时间，或在配置为接受平面衬底的离心机中 使衬底经受高重力)将珠粒下拉到衬底表面。在一些实施方案中，在将细胞提 供给包含多个微米大小的特征的衬底之前或之后施加磁力。在一些实施方案 中，将捕获剂/抗体添加到纳米大小的官能化珠粒上，所述珠粒首先被添加到 包含多个微米大小的特征的衬底上。

在一些实施方案中，所述系统可进一步包含一种或多种类型的细胞。细 胞的类型可以是稀有细胞，其可包括或不包括毛细胞(例如，耳蜗细胞)、循环 肿瘤细胞或循环胚胎细胞。耳蜗细胞不能通过标准细胞取样方法来测量，因 为大多数细胞分析方法由于其缺乏灵敏度而不允许分析极少量的耳蜗细胞 (10⁴个，来自整个人耳蜗)。本公开的高SN(信噪比)单细胞组分分析系统和方 法还允许在癌症早期阶段检测循环肿瘤细胞，在所述阶段通常原本无法检测 到肿瘤细胞。在一些实施方案中，本公开的高SN单细胞组分分析系统和方法 还允许检测正在怀孕或已怀孕的雌性中的循环胚胎细胞。循环胚胎细胞可以 是微嵌合胎儿细胞。微嵌合细胞经常在出生后的雌性中发现并且可归因于增 强的免疫系统(Dawe等，“从婴儿到母亲的细胞迁移(Cell Migration from Baby to Mother)”,Cell AdhMigr.2007Jan-Mar；1(1):19–27)。]

在一些实施方案中，细胞可来自受试者。来自受试者的细胞可包含生物 分子，所述生物分子可用于帮助鉴别细胞状态、身份、生长速率、谱系、突变、 变体、表达水平、癌症阶段或缓解状态和/或潜伏性或活动性感染。此类细胞 可包括或不包括例如哺乳动物细胞、免疫调节细胞、淋巴细胞、单核细胞、多 形体、T细胞、肿瘤细胞、酵母细胞、细菌细胞、感染原、寄生虫、植物细胞、 转染细胞，诸如NSO细胞、CHO细胞、COS细胞、293细胞。

在一些实施方案中，细胞可以是活的、死的、固定的和/或基本上完整的。 在一些实施方案中，细胞可以是相同类型或不同类型。当细胞是不同类型时， 细胞可来自不同的组织或肿瘤来源，展现不同的病理学，表达不同的或突变 的生物分子，表达不同水平的生物分子，表达具有不同翻译后修饰的生物分 子，或展现不同的形态。在一些实施方案中，捕获剂/抗体能够区分突变生物 分子和野生型生物分子。当细胞来自不同的肿瘤来源时，细胞可来自肿瘤，所 述肿瘤可包括或不包括例如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、结直肠癌、肝癌、 胰腺癌、甲状腺癌、膀胱癌或其他类型的癌症。

在一些实施方案中，细胞可包含一种或多种类型的靶猎物生物分子。当 要检测多种类型的靶猎物生物分子时，可使用多种类型的纳米大小的官能化 珠粒，所述珠粒具有多种类型的抗体，所述抗体对应于与猎物生物分子对应 的诱饵。

在一些实施方案中，多种靶猎物生物分子可包括可在所述细胞的细胞膜 中发现的生物分子。在一些实施方案中，多种靶猎物生物分子可包括可在所 述细胞的细胞质中发现的生物分子。在一些实施方案中，诱饵生物分子和猎 物生物分子可独立地选自：蛋白质、DNA、RNA、mRNA、tRNA、cRNA、抗 体、抗体片段、ScFv、肽和小分子。DNA或RNA可进一步用生物素修饰。 本文所述的系统和方法可使得能够进行单细胞测序，其中所述猎物生物分子 是来自分离的细胞的DNA或RNA。在一些实施方案中，作为猎物生物分子 的捕获的DNA或RNA可使用加热或变性剂(例如，低盐、DMSO、脲、甲酰 胺等)从相应的诱饵多核苷酸序列去杂交，并且去杂交的DNA或RNA可通过 DNA分析方法进一步加以分析以确定所述DNA或RNA的部分或全部序列。 在一些实施方案中，DNA分析方法可包括或不包括：DNA测序、qPCR、SSCP、 STR或通过微阵列或质谱进行基因分型。DNA测序方法可包括或不包括使用 Illumina HiSeq、MiSeq、iSeq或NovaSeq；ThermoFisher IonTorrent系统；Qiagen GeneReader系统；或BGIDNBSEQ-T7、DNBSEQ-G400、DNBSEQ-50系统， 使用制造商提供的方案和说明。

在一些实施方案中，所述系统进一步包含细胞膜破裂剂以释放细胞组分。 细胞膜破裂剂可以是裂解缓冲剂。裂解缓冲剂可包括或不包括变性洗涤剂(当 分析多核苷酸时)或非变性洗涤剂(当分析蛋白质、抗体和多肽时)。在一些实 施方案中，变性洗涤剂是SDS(十二烷基硫酸钠)。在一些实施方案中，非变 性洗涤剂选自：CHAPS、脱氧胆酸盐、Triton^TMX-100、NP40和吐温20。裂 解缓冲剂可进一步包括本领域所熟知的缓冲盐。

在一些实施方案中，系统和其中使用的玻璃衬底可被配置为可用TIRF (全内反射显微镜术)进行测量。TIRF照明可消除或减少来自衬底表面上的其 他光散射元件的散射。TIRF照明提供了照明和荧光不会相互作用而受到表面 碎片影响的优点。本公开中的TIRF显微术减少了来自焦平面外部的背景荧 光，并且可显著改善从连接到猎物生物分子-诱饵生物分子/抗体复合物的荧光 团发射的荧光的信噪比。TIRF显微术利用了在紧邻具有不同折射率的两种介 质之间的界面的有限衬底区域中的感应倏逝波。在一些实施方案中，所利用 的TIRF界面可以是衬底和玻璃盖片之间的接触区域。在一些实施方案中，照 明系统可包括光纤以将光传递到载玻片的边缘。在一些实施方案中，照明系 统可包括Darklite垂直式照明器(Micro Video Instruments公司，Avon，Mass.)。

方法

本发明尤其提供用于鉴别生物分子-生物分子相互作用的方法，其包括以 下步骤：(a)使一种或多种细胞类型与如本文所述的系统接触，(b)将裂解缓冲 剂提供给所述系统，以及(c)通过荧光显微术使所述系统成像。在一些实施方 案中，生物分子是细胞中的低拷贝数蛋白质。在一些实施方案中，生物分子选 自诱饵生物分子和猎物生物分子。诱饵生物分子是已知或怀疑与所选细胞之 内或之上的另一生物分子(猎物生物分子)具有相互作用的生物分子。然后，使 猎物生物分子与一级抗体或一级-二级抗体复合物复合，其中用荧光团对猎物 生物分子、一级抗体或二级抗体中的一种或多种带有荧光标记。在一些实施方案中，可通过荧光显微术进行成像。荧光显微术可选自TIRF或共焦显微术。 一级抗体可单独地或作为与二级抗体的复合物添加到猎物生物分子-诱饵生 物分子复合物中。在一些实施方案中，首先将一级抗体添加到猎物生物分子- 诱饵生物分子复合物，之后添加二级抗体(针对一级猎物抗体)。

本发明尤其提供用于鉴别生物分子-生物分子相互作用的方法，所述方法 包括以下步骤：(a)使包含多个微米大小的特征的衬底与一种或多种细胞类型 接触，其中所述一种或多种细胞类型的一部分或全部进入所述多个微米大小 的特征的一部分或全部中；(b)将多个经抗体包被的磁性珠粒提供给所述衬底， 其中所述经抗体包被的磁性珠粒包含结合诱饵生物分子的抗体；(c)任选地， 向所述经抗体包被的珠粒施加磁场；(d)使所述衬底与裂解缓冲剂接触；(e)形 成复合物，所述复合物选自所述经抗体包被的磁性珠粒的所述抗体和诱饵生 物分子、所述诱饵生物分子和猎物生物分子、或与所述经抗体包被的磁性珠粒的抗体结合的所述诱饵生物分子和所述猎物生物分子的全部；(f)提供结合 到所述猎物生物分子的抗体或抗体复合物；(g)通过荧光显微术使结合到所述 猎物生物分子的所述抗体或抗体复合物成像。在一些实施方案中，细胞可包 含诱饵生物分子和/或猎物生物分子。在一些实施方案中，结合猎物生物分子 的抗体或抗体复合物带有荧光标记。在一些实施方案中，结合到猎物生物分 子的抗体复合物可包含结合到猎物生物分子的一级抗体，以及结合到与猎物 生物分子结合的所述一级抗体的二级抗体，其中二级抗体带有荧光标记。在一些实施方案中，猎物生物分子和诱饵生物分子可独立地选自：蛋白质、DNA、 RNA、mRNA、tRNA、cRNA、抗体、抗体片段、ScFv、肽和小分子。

在一些实施方案中，步骤(g)通过荧光显微术使结合到所述猎物生物分子 的所述抗体或抗体复合物成像可通过TIRF或共焦显微术进行。

在一些实施方案中，每个纳米大小的官能化珠粒分离单个猎物生物分子。

实施例

在这些实施例中所述的工作评价和证实了使用经抗体包被的磁性纳米珠 粒以及包含多个微米大小的特征的衬底用于单细胞分离和其组成分析的积极 效果。

实施例1

用于细胞群体的基于纳米珠粒的单细胞分离和分析的一般代表性方法

经链霉抗生物素蛋白包被的磁性纳米珠粒通过将一级抗体固定在其表面 上而被修饰，用于捕获靶蛋白质(诱饵蛋白质)(如本文实施例中所述)。将细胞 裂解且将磁性纳米珠粒添加到裂解物中并且培育30分钟，并且在通过珠粒捕 获猎物蛋白质后，使用特异性的一级抗体和荧光标记的二级抗体检测所述蛋 白质。将纳米珠粒洗涤三次以去除非特异性结合的蛋白质，转移到载玻片上 并用盖片覆盖，并且使用TIRF显微镜使其成像。在一些实施方案中，对诱饵 蛋白质或猎物蛋白质进行荧光标记以用于直接显现。(图1)

实施例2

用于细胞群体中绿色荧光蛋白质(GFP)下拉的基于纳米珠粒的SiMPull

基于纳米珠粒的SiMPull方法首先通过下拉GFP来验证蛋白质下拉，因 为GFP可直接显现而无需免疫染色，这简化了验证，并且更重要的是，因为 GFP可用于光漂白实验中以评估下拉的荧光斑点的单分子状态。

使用磁性纳米珠粒下拉HEK293T细胞中的异位GFP(图2a)。相比之下， 在阴性对照实验中，很少的GFP分子被下拉(图2a)，并且所计算的测定信噪 (SN)比为约10-20(图2b)。该SN比与Jain等的原始SiMPull方法相当或优于 后者。通过应用Jain等先前所用的算法，图2a中约95％的荧光斑点展示高斯 (Gaussian)分布。对这些荧光斑点进行光漂白实验，并且结果表明58％的斑点 是单一荧光团(即，GFP单体)，18％是两个荧光团，且22％>2个荧光团。含 有≥2个荧光团的斑点可能表示位于单个纳米珠粒上的在60nm(需要解释这 个数字，一个像素＝60nm)距离内的≥2个GFP分子。5％的不显示高斯分布的 荧光斑点可能是粘在一起的丝束纳米珠粒。这些结果证实我们的基于珠粒的 方法使得能够以非常高的SN比在单分子水平上捕集目标蛋白质。

实施例3

在细胞群体中下拉cAMP依赖性蛋白质激酶A(PKA)复合物

PKA(最广泛研究的蛋白质激酶之一)的全酶或复合物作为包含调节(R)亚 基二聚体和两个催化(C)亚基的异四聚体存在(图3a)；cAMP在生理水平下可 结合R亚基并且从PKA复合物中释放C亚基(图3a)。我们使用PKA-R亚基 和PKA-C亚基之间充分表征的相互作用来验证用于研究PPI的基于纳米珠粒 的SiMPull测定。

用于本研究的表达载体是用于GFP表达的pEGFP-n1(Addgene目录号 6085-1)、pcDNA3-小鼠PKA-C-α-mEGFP(Addgene目录号45521)和pcDNA3- 小鼠PKA-RII-α-mEGFP(Addgene目录号45527)。通过用mCherry序列替代 pcDNA3-PKA-C-α-mEGFP中的GFP序列，构建pcDNA3-PKA-C-α-mCherry。

在HEK293T细胞中检测了PKA-C-eGFP和PKA-R-mCherry的相互作用， 因为这些荧光融合蛋白质允许在无免疫染色的情况下直接显现PKA-C亚基 和PKA-R亚基，并且有利于评估下拉效率和特异性(图3b)。当使用预包被有 抗GFP抗体的磁性纳米珠粒时，PKA-C-eGFP和PKA-R-mCherry两者都被下 拉。如果在这些实验中用mCherry替代PKA-R-mCherry，则很少的mCherry 分子与PKA-C-eGFP共沉淀(图3c)；这表明PKA-C-eGFP和PKA-R-mCherry之间的相互作用(图3b)特异性地取决于PKA-R。此外，cAMP类似物cpt-cAMP 破坏了PKA-C-eGFP和PKA-R-mCherry的相互作用(图10)，表明该相互作用 是生理性的。

GFP和mCherry信号的大部分明显共定位(图3b)，尽管一小部分没有。 GFP和mCherry的这种不完全共定位可能归因于几个原因：(1)仅75％的GFP 分子恰当地折叠并发荧光(Waldo,G.S.等，“使用绿色荧光蛋白质的快速蛋白质 折叠测定(Rapid Protein-Folding Assay Using Green Fluorescent Protei)”,Nature Biotechnology,1999；17(7):691-695)；(2)复合物中GFP或mCherry分子的荧光 被不均匀地淬灭；以及(3)PKA-C和PKA-R的不平衡表达。

实施例4

微孔阵列的示意图和制作

作为包含多个微米大小的特征的衬底的代表性示例，依照先前公开的程 序并经过一定修改制备微孔阵列芯片(图4)(Huang,L.等，“在截锥形微孔阵列 芯片中进行离心辅助的单细胞捕集用于实时观察细胞凋亡(Centrifugation- Assisted Single-CellTrapping in a Truncated Cone-Shaped Microwell Array Chip for the Real-TimeObservation of Cellular Apoptosis)”,Analytical Chemistry,. 2015；87(24):12169-12176)。取决于目标细胞的大小，每个芯片上的微孔直径是 变化的(范围：15微米到50微米)，并且微孔深度是70微米，其被设计成捕 集细胞并使裂解物扩散最小化(图4、图5a和图5b)。

通过在玻璃盖片上生成微孔图案化的多孔PDMS膜来实现细胞捕集微孔 阵列的制作。简单地说，首先通过使用Bosch深度反应离子蚀刻(DRIE)工艺 制作以微柱图案为特征的硅模具。通过使用标准光刻技术控制柱的直径(15微 米到50微米范围)和间距(柱的直径的4倍，边缘到边缘)。将柱的蚀刻深度控 制在75微米。然后将制作的硅模具切成大小为1.0×1.0cm²的芯片并且在真 空容器中用二甲基二氯硅烷(Sigma-Aldrich)蒸气硅烷化过夜，之后用丙酮和去 离子水依序洗涤，并且在使用前用N₂干燥。然后，将5微升预脱气的PDMS预聚物(10:1，碱与固化剂的重量比)轻轻倒入硅烷化的硅模具中，并且使用氧 等离子体预处理且在台式超声清洁器(Bransonic)中用丙酮(BDH1101)、2-丙醇 (BDH1133)和DI水洗涤的一片玻璃盖片与芯片紧密接触，使预聚物均匀地铺 展在整个芯片上。随后，将200g重量置于盖片上以确保微制造的柱完全穿透 预聚物层并接触玻璃盖片。然后将整个组件置于60℃烘箱中保持3h。在去除 重量之后，将盖片与特征在于各种大小的微孔图案化的多孔PDMS膜一起从 形成细胞捕集装置的模具上缓慢剥离。在一些实施方案中，PDMS是可固化的聚二甲基硅氧烷。在一些实施方案中，PDMS是SYLGARD 184硅酮弹性 体套件(Dow)。PDMS可具有交联聚二甲基硅氧烷聚合物的可固化组分。在一 些实施方案中，交联剂可以是具有铂催化剂(例如，六氯铂酸盐)的二甲基,甲 基氢硅氧烷共聚物。在一些实施方案中，聚二甲基硅氧烷的预固化粘度可以 是5100cP。在一些实施方案中，套件粘度(具有交联剂的PDMS)可以是3500 cP。在一些实施方案中，PDMS在100℃下的固化时间可以是35分钟或更短， 或者在150℃下的固化时间可以是10分钟或更短。

实施例5

单细胞下拉测定的示意图

首先，将单细胞捕集在微孔中。接着，施加预先包被有诱饵抗体的磁性纳 米珠粒。在不存在磁体的情况下，仅通过重力使纳米珠粒缓慢地沉降。经由外 部磁体施加3分钟磁场将纳米珠粒下拉到微孔底部(图7a和图7b)。随后，将 裂解缓冲剂添加到芯片以原位裂解细胞。固定在纳米珠粒上的诱饵抗体捕获 微孔中的溶解产物中的诱饵蛋白质和猎物蛋白质。在整个实验期间，在磁体 存在下，磁性珠粒保持固定在玻璃底部。使用TIRF或共焦显微术显现和鉴别 荧光标记或使用免疫染色标记的猎物蛋白质(图8a和图8b)。

如先前所述(Alsina等，2017)且稍加修改，使用装配有油浸物镜(NA＝1.49, 100×,UAPON,Olympus)的Olympus IX-73倒置荧光显微镜(Olympus)拍摄来 自该实施例和所有实施例的荧光图像。使用sCMOS相机(Zyla-4.2P-Cl10, Andor Technology有限公司)采集图像。使用488nm激光(Coherent公司，USA) 以300ms的曝光时间激发GFP。使用物镜全内反射照明仅激发盖片表面附近 的GFP。使用ZT488/561rpc(Chroma)作为分色镜，并且通过ET525/50m (Chroma)发射滤光片收集发射信号，以收集来自GFP的荧光信号。激光聚焦 在物镜的后聚焦面上。将15X扩束器(Edmond Optics,Singapore)和聚焦透镜用 于均匀地照射样品。通过将照明光束从透镜中心移开而产生全内反射照明。 在室温下进行所有实验。

单细胞占有率(每孔的单细胞)达到大约60％(图6)，这取决于施加到芯片 的细胞密度。

实施例6

单细胞GFP下拉

如图9a-9f中，通过从单细胞中下拉GFP来评价基于纳米珠粒的单细胞 SiMPull测定。在通过胰蛋白酶化悬浮后，将表达GFP的HEK293T细胞添加 到空白微孔芯片上并且使其经受通过施加到芯片表面的磁性纳米珠粒进行的 SiMPull。GFP被通过生物素化第2抗体包被有抗GFP抗体的磁性纳米珠粒 下拉(图9a和图9b)，但不被包被有单独的第2抗体的纳米珠粒下拉(图9c和 图9d)。这些结果表明GFP与纳米珠粒的最低非特异性结合，并且这些实验 中的SN比为大约12(图9e)。此外，光漂白揭示这些斑点显示一步漂白(图 9f)，这表明存在单个GFP单体。

实施例7

PKA复合物的单细胞下拉

如图3a-3c中，研究PKA-R亚基和PKA-C亚基之间的相互作用以验证 用于研究PPI的本公开方法。研究了单个HEK293T细胞中PKA-C-eGFP和PKA-R-mCherry之间的相互作用(图10a)。当使用经抗GFP包被的磁性纳米 珠粒时，PKA-C-eGFP和PKA-R-mCherry两者都被下拉，并且值得注意的是， 在cAMP类似物cpt-cAMP存在下，很少的PKA-R-mCherry被下拉(图10b)； 这表明PKA-R-mCherry的下拉特异性取决于其与PKA-C-eGFP的生理相互作 用，而不是取决于与珠粒或微孔底部的非特异性结合。与图3b中所示的结果 类似，大部分GFP和mCherry信号明显共定位，尽管一小部分没有(图10a)。

接着，测试基于纳米珠粒的SiMPull的更一般的应用：猎物蛋白质(PKA- R)不加荧光标签并且需要通过免疫染色进行显现。使共表达PKA-C-eGFP和 PKA-R-HA的单个HEK293T细胞经受使用经抗GFP包被的纳米珠粒的 SiMPull。在将细胞裂解后，将抗HA抗体和Alexa-561偶合的第2抗体的混 合物添加到芯片表面以使PKA-R-HA显现。PKA-R-HA在免疫染色后清晰可 见，并且约80％GFP斑点与Alexa-561斑点共定位(图10c)。如果在这些实验 中PKA-R-H被PKA-R-GFP替代，则很少的Alexa-561斑点可见(图10d)，表 明图10c中的Alexa-561信号是HA-标签特异性的。图3b中GFP和mCherry 斑点不完全共定位的类似原因可能是图10c中GFP和Alexa斑点不完全共定 位的原因。

本文所描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于 在具体实施方式中陈述或描述或提到的那些。但这并不旨在是包括一切的， 并且本文所描述和要求保护的本发明不限于在具体实施方式中确定的特征或 实施方案，或不受其限制，包括具体实施方式的目的仅在于说明而不是限制。 本领域普通技术人员将容易认识到，在不脱离本发明的范围的情况下，许多 组分和参数可在一定程度上改变或修改，或者可被替代为已知的等同物。应 当了解，此类修改和等同物如同单独陈述一样被并入本文。本发明还包括本 说明书中单独或共同提到或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所 述步骤或特征中的任两个或更多个的任何和所有组合。

本文所引用或提到的所有专利、出版物、科学文章、网站和其他文献和材 料指示本发明所属领域的技术人员的技术水平，且每一此类引用的文献和材 料均在此以引用方式并入，其程度如同其已单独地以引用方式整体并入或整 体陈述于本文中一般。申请人保留将来自任何此类专利、出版物、科学文章、 网站、电子可用信息和其他参考材料或文件的任何和所有的材料和信息物理 地并入本说明书中的权利。在本说明书中对任何申请、专利和出版物的引用 不是，也不应当被认为是承认或任何形式的暗示它们构成有效的现有技术或 形成世界上任何国家的公知常识的一部分。

本文所述的具体方法和组合物代表优选实施方案并且是示例性的，而不 旨在作为对本发明范围的限制。本领域技术人员在考虑本说明书后将想到其 他目的、方面和实施方案，并且这些目的、方面和实施方案被涵盖在如由权利 要求的范围所限定的本发明的精神内。对本领域技术人员将易于显而易见的 是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可对本文所公开的发明作出不 同的替代和修改。本文所说明性地描述的本发明可在不存在本文未明确公开 为必需的任何一种或多种要素、或一种或多种限制的情况下被合适地实施。 因此，例如，在本文中的每种情况下，以及在本发明的实施方案或实施例中， 术语“包括”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任一个在说明书中可用 其他两个术语中的任一个替代。本文说明性描述的方法和过程可以不同的步 骤顺序适当地实施，并且它们不必限于本文或权利要求中指出的步骤顺序。 如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一 (a/an)”和“所述”也包括复数指代。在任何情况下，本专利都不能被解释为受限 于本文具体公开的具体实施例或实施方案或方法。此外，提供名称、标题等以 增强读者对本文档的理解，并且不应被解读为限制本发明的范围。本文所提到的本发明的方面、实施方案或组成部分的任何示例应被视为非限制性的。

已采用的术语和表达是以描述而非限制的术语被使用，并且使用这些术 语和表达并不意在排除所显示和描述的特征或其部分的任何等同物，而应认 识到可在如所要求保护的本发明范围内作出各种修改。因此，应当理解，虽然 已通过优选实施方案和任选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可 采用本文所公开的构思的修改和变更，并且认为此类修改和变更在如由所附 权利要求限定的本发明范围内。

本文已对本发明进行了宽泛的和一般性的描述。落入该一般公开的每个 较窄的类和次一般的组合也构成本发明的一部分。这包括带有将任何主题从 一般性中去除的附带条件或负面限制来一般性地描述本发明，而不管被除去 的内容是否在本文中明确述及。

其他实施方案在所属权利要求内。另外，在用马库什组描述本发明的特 征或方面时，本领域技术人员将认识到，由此也是以马库什组的任何单个成 员或成员亚组来描述本发明。

Claims (46)

1.一种系统，其包括：包含多个微米大小的特征的玻璃衬底、多个经抗体包被的珠粒、针对诱饵生物分子的多种一级抗体、多种诱饵分子、多种靶猎物生物分子和针对所述靶猎物生物分子的多种一级抗体。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个经抗体包被的珠粒包含针对针对所述靶诱饵生物分子的所述一级抗体的多种二级抗体。

3.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个经抗体包被的珠粒包含针对所述靶诱饵生物分子的多种一级抗体。

4.根据权利要求1所述的系统，其进一步包含一种或多种类型的细胞。

5.根据权利要求4所述的系统，其中所述细胞包含一种或多种类型的靶猎物生物分子。

6.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个经抗体包被的珠粒在所述多个微米大小的特征内。

7.根据权利要求4所述的系统，其中所述多个细胞位于所述多个微米大小的特征中。

8.根据权利要求1所述的系统，其进一步包含细胞裂解缓冲剂。

9.根据权利要求8所述的系统，其中所述细胞裂解缓冲剂包括非变性洗涤剂。

10.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个经抗体包被的珠粒包含结合与诱饵生物分子结合的所述多种一级抗体的二级抗体。

11.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个微米大小的特征包括一系列孔，所述孔中的每一个具有约15微米到约45微米的直径，各孔的中心之间的距离为约100微米到约5000微米范围，和各孔的深度为约25微米到约150微米。

12.根据权利要求11所述的系统，其中所述一系列孔的所述直径为约30微米。

13.根据权利要求11所述的系统，其中各孔的中心之间的所述距离为约150微米。

14.根据权利要求11所述的系统，其中各孔的深度为约75微米。

15.根据权利要求4所述的系统，其中多个细胞包括平均直径小于孔的平均直径的细胞。

16.根据权利要求15所述的系统，其中所述多个细胞包括平均直径为约30微米的细胞。

17.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个经抗体包被的珠粒进一步包含磁性珠粒。

18.根据权利要求17所述的系统，其中所述磁性珠粒包含氧化铁芯。

19.根据权利要求17所述的系统，其进一步包含磁体。

20.根据权利要求4所述的系统，其中所述多种靶猎物生物分子包括在所述细胞的细胞膜中发现的分子。

21.根据权利要求4所述的系统，其中所述多种靶猎物生物分子包括在所述细胞的细胞质中发现的分子。

22.根据权利要求1所述的系统，其中将所述多个微米大小的特征直接蚀刻到所述玻璃衬底中。

23.根据权利要求1所述的系统，其中所述多个微米大小的特征由聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成。

24.根据权利要求23所述的系统，其中所述衬底包括固化的PDMS。

25.根据权利要求1所述的系统，其中所述玻璃衬底是厚度为0.085mm到0.64mm的玻璃盖片。

26.根据权利要求25所述的系统，其中所述玻璃衬底被配置为能通过TIRF(全内反射显微镜术)测量。

27.根据权利要求1所述的系统，其中所述诱饵生物分子和猎物生物分子独立地选自：蛋白质、DNA、RNA、mRNA、tRNA、cRNA、抗体、抗体片段、ScFv、肽和小分子。

28.根据权利要求27所述的系统，其中所述DNA或RNA进一步经生物素修饰。

29.一种系统，其包括包含多个微米大小的特征的玻璃衬底、结合诱饵生物分子的多种第一捕获剂、多种诱饵生物分子、多种猎物生物分子、结合所述猎物生物分子的多种第二捕获剂，

其中结合诱饵分子的所述多种第一捕获剂进一步包括磁性珠粒。

30.根据权利要求29所述的系统，其中将所述诱饵生物分子连接到荧光团。

31.根据权利要求29所述的系统，其中将所述猎物生物分子连接到荧光团。

32.根据权利要求29所述的系统，其进一步包含一种或多种类型的细胞。

33.根据权利要求32所述的系统，其中所述细胞包含一种或多种类型的猎物生物分子。

34.根据权利要求29所述的系统，其进一步包含磁体。

35.根据权利要求29所述的系统，其中所述多个经抗体包被的珠粒在所述多个微米大小的特征内。

36.根据权利要求29所述的系统，其中所述多个细胞在所述多个微米大小的特征中。

37.根据权利要求29所述的系统，其中所述多个微米大小的特征包括一系列孔，所述孔中的每一个具有约15微米到约45微米的直径，各孔的中心之间的距离为约100微米到约5000微米范围，和各孔的深度为约25微米到约150微米。

38.一种用于鉴别生物分子-生物分子相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使一种或多种细胞类型与根据权利要求1或29中任一项所述的系统接触，

(b)将裂解缓冲剂提供给所述系统，

(c)通过荧光显微术使所述系统成像。

39.根据权利要求38所述的方法，其中对所述系统部件中的至少一个进行荧光标记。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述荧光显微术选自全内反射显微镜术或共焦显微术。

41.一种用于鉴别生物分子-生物分子相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)使包含多个微米大小的特征的衬底与一种或多种细胞类型接触，其中所述一种或多种细胞类型的一部分或全部进入所述多个微米大小的特征的一部分或全部中；

(b)将多个经抗体包被的磁性珠粒提供给所述衬底，其中所述经抗体包被的磁性珠粒包含可结合诱饵生物分子的抗体；

(c)任选地，向所述经抗体包被的珠粒施加磁场；

(d)使所述衬底与裂解缓冲剂接触；

(e)形成复合物，所述复合物选自所述经抗体包被的磁性珠粒的抗体和诱饵生物分子、所述诱饵生物分子和所述猎物生物分子、或与所述经抗体包被的磁性珠粒的抗体结合的所述诱饵生物分子和所述猎物生物分子的全部；

(f)提供结合所述猎物生物分子的抗体或抗体复合物；

(g)通过荧光显微术使结合到所述猎物生物分子的所述抗体或抗体复合物成像；

其中所述细胞包含诱饵生物分子和猎物生物分子，并且

其中结合所述猎物生物分子的所述抗体或抗体复合物带有荧光标记。

42.根据权利要求38所述的方法，其中结合到所述猎物生物分子的所述抗体复合物包含结合到所述猎物生物分子的一级抗体，以及结合到与所述猎物生物分子结合的所述一级抗体的二级抗体，其中所述二级抗体带有荧光标记。

43.根据权利要求38所述的方法，其中所述猎物生物分子和诱饵生物分子分别地选自：蛋白质、DNA、RNA、mRNA、tRNA、cRNA、抗体、抗体片段、ScFv、肽和小分子。

44.根据权利要求38所述的方法，其中步骤(g)通过荧光显微术使结合到所述猎物生物分子的所述抗体或抗体复合物成像是通过TIRF(全内反射显微镜术)或共焦显微术进行。

45.根据权利要求38或41中任一项所述的方法，其中所述信噪比高于10。

46.根据权利要求38或41中任一项所述的方法，其中每个纳米大小的官能化珠粒分离单个猎物生物分子。

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