JP6771010B2 - 細胞の捕捉および解析のデバイスおよび方法 - Google Patents
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Description
本出願は、それぞれが、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、2009年8月20日に出願した米国特許仮出願第61/235,615号、2009年3月24日に出願した米国特許仮出願第61/163,009号、および2010年1月27日に出願した米国特許仮出願第61/298,871号に対する優先権を主張する。
本発明は、溶液から対象の細胞および分子などの標的を捕捉するためのマイクロチャネルデバイス、ならびに循環細胞の捕捉後解析に関する。特定の態様において、本発明は、生理液から標的細胞(例えば、循環腫瘍細胞)の捕捉するための方法およびデバイス、ならびにそれらの解析に関する。
不均一試料からの標的細胞または標的分子の単離は、研究用途ならびに診断および治療などの医療用途にとって、大きな関心対象となっている。具体的には、生体組織および体液からの希少な細胞型の分離は、大きな組織試料を入手する必要性をなくし、かつそのような試料を入手するのに必要とされる方法に不随する危険性を回避する。例えば、遺伝子検査のための母体血試料からの遺伝子検査用胎児細胞の単離は、羊水穿刺または絨毛採取に不随する危険性を回避する。患者からの循環腫瘍細胞の単離は、臨床家が、癌を評価し患者の腫瘍の生理的変化をモニターすること、ならびに侵襲性の生検方法を実施することなく現在行われている薬物治療の効果を評価することを可能にする。
以下に、本発明の基本的な諸特徴および種々の態様を列挙する。
[1]
以下を含む、試料中の標的を検出するための方法:
試料を第1の結合要素と接触させ、前添加混合物を形成する工程であって、該第1の結合要素が、標的の表面の標的要素に特異的に結合する、前記工程、
前添加混合物をマイクロチャネルに通す工程であって、該マイクロチャネルの表面が、第1の結合要素に直接的または間接的に特異的結合する能力を有する第2の結合要素でコーティングされている、前記工程、および
マイクロチャネルの表面の標的の存在を検出する工程。
[2]
第1の結合要素が、抗体または抗体カクテルである、[1]記載の方法。
[3]
標的が、生体試料中の希少細胞である、[1]記載の方法。
[4]
標的細胞が、生体試料中に10 10 細胞のうち1細胞、5×10 7 細胞のうち1細胞、または10 4 細胞のうち1細胞の比率で存在する細胞である、[3]記載の方法。
[5]
標的細胞が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、子宮頸癌細胞、肝臓癌細胞、腎癌細胞、甲状腺癌細胞、骨癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、および非黒色腫癌細胞から選択される癌細胞である、[3]記載の方法。
[6]
第1の結合要素が、上皮細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を含む、[1]記載の方法。
[7]
第1の結合要素が、上皮細胞接着分子(EpCAM)抗体である、[1]記載の方法。
[8]
標的細胞が、乳癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、Her2/neu、EpCAM、MUC-1、EGFR、TAG-12、IGF1R、TACSTD2、CD318、CD104、もしくはN-カドヘリンに特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[9]
標的細胞が、黒色腫癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、メラニン細胞分化抗原、癌胎児性抗原、腫瘍特異的抗原、SEREX抗原、またはそれらの組み合わせ特異的に結合する抗体である、[3]記載の方法。
[10]
メラニン細胞分化抗原が、チロシナーゼ、gp75、gp100、MelanA/MART1、またはTrp2からなる、[9]記載の方法。
[11]
癌胎児性抗原が、MAGE-A1、MAGE-A4、BAGE、GAGE、またはNY-ESO1からなる、[9]記載の方法。
[12]
腫瘍特異的抗原が、CDK4およびβ-カテニンからなる、[9]記載の方法。
[13]
標的細胞が前立腺癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、EpCAM、MUC-1、EGFR、PSMA、PSA、TACSTD2、PSCA、PCSA、CD318、CD104、もしくはN-カドヘリンに特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[14]
標的細胞が、結腸直腸癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、EpCAM、CD66c、CD66e、CEA、TACSTD2、CK20、CD104、MUC-1、CD318、もしくはN-カドヘリンに特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[15]
標的細胞が、肺癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、CK18、CK19、TACSTD2、CD318、CD104、CEA、EGFR、もしくはEpCAMに特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[16]
標的細胞が、膵臓癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、MUC-1、CEA、TACSTD2、CD104、CD318、N-カドヘリン、MUC-1、もしくはEpCAMに特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[17]
標的細胞が、卵巣癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、MUC-1、TACSTD2、CEA、CD318、CD104、N-カドヘリン、もしくはEpCAMに特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[18]
標的細胞が、内皮膀胱癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、CD34、CD146、CD62、CD105、CD106、VEGF受容体、もしくはMUC-1に特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[19]
標的細胞が、上皮膀胱癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、TACSTD2、EpCAM、CD318、EGFR、6B5、N-カドヘリン、もしくは葉酸結合受容体に特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[20]
標的細胞が、癌幹細胞であり、かつ第1の結合要素が、CD133、CD135、CD117、もしくはCD34に特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルである、[3]記載の方法。
[21]
標的細胞が、間葉系抗原を発現する循環癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、FGFR1、FGFR4、EGFR、葉酸結合受容体、N-カドヘリン、もしくはMSCに特異的に結合する抗体であるか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体である、[3]記載の方法。
[22]
標的細胞が、血管形成表面抗原を発現する循環癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、VEGF受容体に特異的に結合する抗体である、[3]記載の方法。
[23]
第1の結合要素がビオチン化抗体であり、かつ第2の結合要素がアビジンである、[1]記載の方法。
[24]
前処理混合物を第3の結合要素と接触させる工程をさらに含み、第1の結合要素が、一次抗体であり、第3の結合要素が、検出可能または捕捉可能な要素に結合した二次抗体であり、かつ第1の結合要素に特異的に結合し、かつ第2の結合要素が、検出可能または捕捉可能な要素を介して第3の結合要素に特異的に結合する、[1]記載の方法。
[25]
前処理混合物を第3の結合要素と接触させる工程をさらに含み、第1の結合要素が、一次抗体であり、第3の結合要素が、第1の結合要素に特異的に結合するビオチン化二次抗体であり、かつ第2の結合要素が、アビジンである、[1]記載の方法。
[26]
第1の結合要素が、少なくとも第1の抗体と第2の抗体との混合物であり、かつ第1の抗体が、標的要素の第1のエピトープに特異的に結合し、かつ第2の抗体が、標的要素の第2のエピトープに特異的に結合する、[1]記載の方法。
[27]
第1の抗体が、幹細胞抗原に特異的に結合し、かつ第2の抗体が、癌細胞抗原に結合する、[26]記載の方法。
[28]
第1の抗体が、CD133、CD135、CD117、CD34、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する、[27]記載の方法。
[29]
第1の抗体が、間葉系マーカーに特異的に結合し、かつ第2の抗体が、癌細胞抗原に特異的に結合する、[26]記載の方法。
[30]
第1の抗体が、FGFRl、FGFR4、MSC、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する、[29]記載の方法。
[31]
第1の抗体が、血管形成マーカーに特異的に結合し、かつ第2の抗体が、癌細胞抗原に特異的に結合する、[26]記載の方法。
[32]
第1の抗体が、VEGF受容体に特異的に結合する、[31]記載の方法。
[33]
マイクロチャネルが、ランダムパターンでマイクロチャネルの表面に分布するポストの集団を含む、[1]記載の方法。
[34]
マイクロチャネルの表面に結合した標的を架橋する工程をさらに含む、[1]記載の方法。
[35]
標的の存在を検出する工程が、第1の結合要素の存在を検出する工程により行われる、[1]記載の方法。
[36]
マイクロチャネルおよび添加混合物を含むデバイスであって、
該マイクロチャネルが、ランダムパターンでマイクロチャネルの表面に分布するポストの集団を含み、
該添加混合物が、標的細胞を含む疑いがある生体試料および第1の結合要素を含み、
該第1の結合要素が、標的細胞上の標的要素に特異的に結合し、かつ
該マイクロチャネルの表面が、第1の結合要素に直接的にまたは間接的に特異的に結合する第2の結合要素でコーティングされる、
前記マイクロチャネルおよび添加混合物を含むデバイス。
[37]
第1の結合要素が、少なくとも第1の抗体および第2の抗体を有する結合要素混合物を含み、かつ第1の抗体が、標的要素の第1のエピトープに特異的に結合し、かつ第2の抗体が、標的要素の第2のエピトープに特異的に結合する、[36]記載のデバイス。
[38]
生体試料が、血液、血漿、骨髄、血清、精液、膣分泌物、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、滑液、肺洗浄液、細針吸引液(FNA)、および生検組織試料からなる群より選択される生理液または生理組織である、[36]記載のデバイス。
[39]
添加混合物が、検出可能な要素に結合した第3の結合要素をさらに含み、第1の結合要素が一次抗体であり、第3の結合要素が、第1の結合要素に特異的に結合する二次抗体であり、かつ第2の結合要素が、第3の結合要素に特異的に結合する、[36]記載のデバイス。
[40]
添加混合物が、第3の結合要素をさらに含み、第1の結合要素が一次抗体であり、第3の結合要素が、第1の結合要素に特異的に結合するビオチン化二次抗体であり、かつ第2の結合要素がアビジンである、[36]記載のデバイス。
[41]
標的細胞の存在を検出する工程が、第3の結合要素の存在を検出する工程により行われる、[1]記載の方法。
[42]
以下を含む生体試料中の標的細胞を捕捉するための方法:
生体試料を第1の結合要素と接触させ、前添加混合物を形成する工程であって、該第1の結合要素が標的細胞の表面で標的要素に特異的に結合する、前記工程、
前添加混合物をマイクロチャネルに通す工程であって、該マイクロチャネルの表面が、第1の結合要素に特異的に結合する能力を有する第2の結合要素でコーティングされている、前記工程、および
マイクロチャネルの表面で標的細胞を捕捉する工程。
[43]
標的細胞が循環腫瘍細胞(CTC)である、[42]記載の方法。
[44]
捕捉標的細胞が、マイクロチャネルの表面に付着している間に検出される、[42]記載の方法。
[45]
標的細胞が、インサイチューまたはインビトロで解析される、[42]記載の方法。
[46]
標的細胞が、異数性について評価される、[42]記載の方法。
[47]
標的細胞が、1番、3番、4番、7番、8番、11番、および/または17番染色体の1つまたは複数にある異数性について評価される、[46]記載の方法。
[48]
異数性が、FISHにより評価される、[46]記載の方法。
[49]
サイトケラチン(CK)発現とは無関係に循環細胞の異数性を評価する工程を含む、単離した循環細胞の悪性度を評価するための方法。
[50]
サイトケラチン染色を伴わない、[49]記載の方法。
[51]
細胞が、1番、3番、4番、7番、8番、11番および/または17番染色体の異数性について評価される、[49]記載の方法。
[52]
細胞が、8番、11番、および/または17番のモノソミーまたはトリソミーについて評価される、[51]記載の方法。
[53]
細胞が、8番、11番、および/または17番のモノソミーについて評価される、[51]記載の方法。
[54]
異数性が、FISHにより評価される、[49]記載の方法。
[55]
追加の悪性度のマーカーを検出する工程をさらに含む、[49]記載の方法。
[56]
追加の悪性度のマーカーが、Her2発現である、[49]記載の方法。
本発明は、液体試料から生体標的を捕捉および/または解析するためのデバイスおよび方法を提供する。種々の態様において、本発明は、癌患者の疾患の評価のための、生体試料から循環腫瘍細胞を捕捉するための方法を提供する。これらの態様および他の態様において、本発明は、サイトケラチン発現なしにまたはサイトケラチン発現とは無関係に循環細胞の悪性度を同定および/または評価するための方法を提供する。
バイオ分子または細胞を分離するためのマイクロチャネルデバイスの1つの態様を、図1に示す。デバイスは、デバイスの第1の端で入口または注入口として機能する開口部またはウェル15およびを通って試料液体が供給されるマイクロチャネル13、およびデバイスの第2の端で排出口として機能する開口部19を含む、流路により形成される基板または支持体11を含む。収集領域17の横断面は、注入口開口部15から通じる注入口部分18の横断面より大きい。注入口部分は、収集領域17に入るための領域18の端に広がっている場所のすぐ上流に、1つまたは複数組の軸方向に並んだ仕切り/支持体21を含む。これら中心の仕切りは、流れを2つまたはそれより多い進路に分け、かつ液体の流れが収集領域17の入口端に送られる際にそれをより均等に分散させるよう機能する。収集領域は、液体流路に対して横方向に配列され、かつフローチャネルの収集領域部分の幅全体にわたって不規則で概してランダムなパターンで配置される複数の直立ポスト23を含む。ポストのパターンは、収集領域を通る直線の流れが存在しえず、かつ流線型の流れが乱されているようになっていて、流路に沿って流れる液体とポストの表面との間に好適な接触が存在することを確実にする。ポストは、収集領域17の平面基部と一体であり、かつ基部から垂直に伸び、基板11のフローチャネルを通って流れる液体の水平面の進路に対して垂直となる表面を提示す。別のフロー仕切り/支持体21aは、収集領域からの出口に位置する。
2005年1月18日に出願したU.S. Published Application No. 2006/0160243およびほか(Nagrath et al. (2007) Nature, Vol. 450(7173): 1235-9)に記載の通り、対象の細胞を捕捉するための以前のデバイスは、対象の細胞上の抗原に特異的である抗体で誘導体化されたマイクロチャネルを含んだ。次いで、対象の希少細胞を含む懸濁液をチャネルに通過させ、細胞を細胞特異的抗体により捕捉した(図2)。
従来、チャネルの上への抗体の前添加が最も効率的であると考えられていた。しかしながら、複数の抗体をチャネルに添加することの細胞捕捉に対する負の効果を、以前は考慮されていなかった。抗原特異的抗体の一般的な結合パートナー(例えば、抗体またはタンパク質)でコーティングされたマイクロチャネルを用いることの利点は、複数の抗体を、任意の単一抗体の有効性を減ずることなく、細胞懸濁液に加え、細胞を前標識することができるとことである。細胞上の複数の抗原部位は相互排他的であるため、細胞懸濁液に複数の抗体を添加する場合、チャネル上の捕捉効率は任意の単一抗体について低減しない。例として、チャネルが100の抗体部位に適応し、かつ5種類の異なる抗体の混合物を添加しチャネルをコーティングした場合、各抗体はチャネル空間の約20%を占める。よって、各個別の抗体に対する可能性のある結合効率は、チャネル全体を覆う場合の結合効率のわずか20%である。細胞上の抗原の数にかかわらず、チャネルは本質的に、その個別の抗体の細胞捕捉効率をわずか20%とする。細胞の標的抗原の数が少ない場合、これらの抗原低発現細胞を捕捉する効率は、マイクロチャネルデバイスの基板または支持体に結合させる前に、細胞懸濁液中に他の標的抗原に特異的な抗体の添加により増幅されうる。例えば、同じ5種類の抗体を細胞懸濁液に添加した場合、各抗体は、細胞上の異なるエピトープに結合する他の抗体の存在による緩衝や減少なしに、全ての同種の細胞表面抗原に独立して最大限に結合することができる。一般的な捕捉タグ(例えばビオチン)で5種類の異なる抗体のそれぞれを誘導体化することにより、捕捉タグの結合パートナー(例えばストレプトアビジン)でコーティングしたチャネルは、5種類の抗体全てをそれらの細胞上の各抗原に同時に結合させ、よって細胞捕捉に相加作用を生じることができる。
いくつかの場合では、非誘導体化一次抗体が、対象の抗原により効率的に結合する可能性があるか、またはより利用しやすい可能性がある。いくつかの抗体では、それらの活性は、それらの表面アミノ酸を修飾する誘導体化法により悪影響を受ける。細胞抗原への結合に非誘導体化一次抗体を使用することを望む場合、誘導体化された二次抗体を細胞懸濁液に加え、細胞標的抗原に結合した一次抗体と複合体を形成させてもよい。よって、一次抗体混合物、半精製ハイブリドーマ上清または非クローン化ハイブリドーマ上清を細胞懸濁液に加えることができ、細胞上の抗原に付着する任意の抗体を誘導体化(例えばビオチン化)二次抗体の添加により標識することができる。細胞に結合しない抗体は、簡単に洗い流される。
マイクロチャネルデバイスで細胞を捕捉する工程は、液体中に懸濁された細胞のフローを伴う。したがって、細胞は、捕捉された後にチャネルから細胞を取り除く可能性もある液体フロー由来の剪断力を受ける。細胞と抗体によりチャネル表面に結合した特異的細胞表面抗原との間に付着点は比較的少ないことから、この作用は、より低レベルの表面抗原を有する細胞でより顕著である。したがって、チャネルへの細胞の付着をより安定化するために、架橋試薬の手段によりチャネル表面へ追加で細胞を外部付着させることは、有利である。チャネルは典型的には、結合タンパク質(例えばストレプトアビジンまたは抗体)でコーティングされるため、細胞をチャネルにさらに固定するための容易な手段は、タンパク質架橋試薬を介する。
尿路上皮癌(UC)細胞株は、より浸潤性の高い腫瘍モデルにおいてEpCAMを低発現する。循環中のそのような細胞は、EpCAMに基づくCTC捕捉の利用を制限することが予測される。5種類のUC細胞株(UMUC3、UMUC5、UMUC9、T24、およびKU7)のコホートは、より上皮性かより間葉系様かいずれかであるとして、遺伝子発現ヒートマップ解析に基づき選択された。後者の場合、これらの細胞は、間葉系の発現および形態学的特徴を伴う上皮細胞をもたらす上皮間葉移行(EMT)を受けている。このEMTは、上皮細胞が腫瘍から解離し、循環中でより遊走性かつ浸潤性になることができるメカニズムとして提案されている。
抗体のカクテルを複数の異なる癌細胞型に同時に結合させるよう用いる場合、共通の検出方法が必要とされる。サイトケラチン染色は上皮細胞に対してよく機能するが、いくつかの上皮細胞は、実施例6に記載の様にサイトケラチン発現を喪失している。幹細胞など他の細胞型ついては、チャネルに非特異的に結合する可能性がある他の血液細胞型に対して有意な交差反応性を有さないこれらの細胞を染色するための特定の方法は存在しない。しかしながら、細胞の表面上の高レベルのビオチン化一次抗体または二次抗体は、マイクロチャネル上のアビジンにより特異的に捕捉される全ての細胞に共通である。ビオチン結合抗体のカクテルを用いる利点は、標的細胞上の表面ビオチンを増加させるという相加効果にある。すなわち、腫瘍患者で見られる細胞集団など不均一な細胞集団中の抗原低発現細胞、または様々なレベルで1つもしくは複数の抗原を発現する細胞の捕捉を増強するのに有用である。図8、9、および13参照。
図17では、血液試料に、10 ml血液試料あたり約10〜250細胞の範囲で、様々な数のSKBr3細胞、高レベルのEpCAMを発現する細胞株を添加した。EpCAM抗体を、前記添加した血液試料に加えられ、EpCAM Ab-結合細胞を実施例1に記載の方法を用いてマイクロチャネルデバイスで捕捉した。
表2は、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌および卵巣癌を有すると診断された患者由来の10 mL血液試料からマイクロチャネルデバイスで捕捉した循環腫瘍細胞(CTC)の結果を示す。血液試料を、CD340、EGFR、CD318、Muc-1、Trop-2、EpCam、Mov-18、およびMSCに対して作られた抗体を含む可溶性抗体のカクテル、または抗EpCAM抗体のみで前標識した。細胞を、蛍光標識抗サイトケラチンで染色することにより同定した。
血液試料を、マイクロチャネルデバイスでの捕捉用に抗EpCAM抗体と共にプレインキュベートするか、または微細鉄粒子と接合させた抗体(免疫強磁性Ab)と共にプレインキュベートし、CellSearch(登録商標)(VERIDEX、LLC)を用いて捕捉した。捕捉細胞を、CKマーカー、CD45マーカーおよびDAPI、核染色剤について染色した。CK+/CD45-/DAPI+でインサイチュー染色された細胞を計数した。
循環腫瘍細胞(CTC)を、ステージIV(表4)およびステージIII(表5)の乳癌患者の血液試料から捕捉した。CTCを、CD340、EGFR、CD318、Muc-1、Trop-2、EpCam、Mov-18、およびMSCに対する抗体を含む抗体カクテルで前標識し、マイクロチャネルデバイスでから遊離させた。捕捉細胞を、8番および17番染色体の異数性および乳癌マーカー、Her2の増幅について蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)により解析した(表4)。これらの細胞は、マイクロチャネルから全く遊離されず、全てのFISHは、FISH解析用の計数の後に再配置させた細胞を有するチャネル内で行われる。異数性が陽性だとわかったCTCの総数を、CKマーカーが陽性で染色された細胞の総数と比較した。
循環腫瘍細胞(CTC)を膀胱癌患者の血液試料から捕捉した。CTCを、CD340、EGFR、CD318、Muc-1、Trop-2、EpCam、Mov-18、MSC、c-metおよびN-カドヘリンに対する抗体を含む抗体カクテルで前標識した。捕捉細胞を、3番、7番および17番染色体中の異数性について蛍光インサイチューハイブリダイゼーションによりマイクロチャネルデバイス内で直接的に解析し、捕捉CTC上のCKマーカーの染色と比較した。
Claims (41)
- 試料中の標的を捕捉するための方法であって、
標的を含む疑いがある試料を第1の結合要素および第3の結合要素と接触させ、前添加混合物を形成する工程であって、該第1の結合要素が標的の表面で標的要素に特異的に結合し、該第3の結合要素が該第1の結合要素に特異的に結合して第1の結合複合体を形成することができ、かつ、該第1の結合要素が固体支持体に結合していない、工程、および
前添加混合物を、前記第3の結合要素に特異的に結合して前記第1の結合複合体および第2の結合要素の複合体を形成することができる第2の結合要素と、接触させ、それにより試料中に存在する場合に標的を捕捉する工程
を含む方法。 - 試料中の標的を検出するための方法であって、
標的を含む疑いがある試料を第1の結合要素および第3の結合要素と接触させ、前添加混合物を形成する工程であって、該第1の結合要素が、標的の表面の標的要素に特異的に結合し、該第3の結合要素が該第1の結合要素に特異的に結合して第1の結合複合体を形成することができ、かつ、該第1の結合要素が固体支持体に結合していない、工程、
前添加混合物を、前記第3の結合要素に特異的に結合して前記第1の結合複合体および第2の結合要素の複合体を形成することができる第2の結合要素と、接触させる工程、および
試料中に存在する場合に標的の存在を検出する工程
を含む方法。 - 第1の結合要素が抗体を含む、請求項1または2記載の方法。
- 第2の結合要素が抗体でない、請求項1または2記載の方法。
- 第2の結合要素がアビジンである、請求項1または2記載の方法。
- 第1の結合要素が、一次抗体またはリガンドであり、第3の結合要素が、検出可能または捕捉可能な要素に結合した二次抗体またはリガンドであり、かつ第2の結合要素が、検出可能または捕捉可能な要素を介して第3の結合要素に特異的に結合する、請求項1または2記載の方法。
- 第1の結合要素が、一次抗体またはリガンドであり、第3の結合要素が、ビオチン化二次抗体またはリガンドであり、かつ第2の結合要素が、アビジンである、請求項1または2記載の方法。
- 第1の結合要素が抗体カクテルを含む、請求項1または2記載の方法。
- 標的が標的細胞である、請求項1または2記載の方法。
- 標的が、生体試料中の希少細胞である、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、生体試料中に10 10 細胞のうち1細胞、5×10 7 細胞のうち1細胞、または10 4 細胞のうち1細胞の比率で存在する細胞である、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、子宮内膜癌細胞、子宮頸癌細胞、肝臓癌細胞、腎癌細胞、甲状腺癌細胞、骨癌細胞、リンパ腫癌細胞、黒色腫癌細胞、および非黒色腫癌細胞から選択される癌細胞である、請求項9記載の方法。
- 第1の結合要素が、上皮細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を含む、請求項1または2記載の方法。
- 第1の結合要素が、上皮細胞接着分子(EpCAM)抗体を含む、請求項1または2記載の方法。
- 標的細胞が、乳癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、Her2/neu、EpCAM、MUC-1、EGFR、TAG-12、IGF1R、TACSTD2、CD318、CD104、もしくはN-カドヘリンに特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、黒色腫癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、メラニン細胞分化抗原、癌胎児性抗原、腫瘍特異的抗原、SEREX抗原、またはそれらの組み合わせ特異的に結合する抗体を含む、請求項9記載の方法。
- メラニン細胞分化抗原が、チロシナーゼ、gp75、gp100、MelanA/MART1、またはTrp2からなる、請求項16記載の方法。
- 癌胎児性抗原が、MAGE-A1、MAGE-A4、BAGE、GAGE、またはNY-ESO1からなる、請求項16記載の方法。
- 腫瘍特異的抗原が、CDK4およびβ-カテニンからなる、請求項16記載の方法。
- 標的細胞が前立腺癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、EpCAM、MUC-1、EGFR、PSMA、PSA、TACSTD2、PSCA、PCSA、CD318、CD104、もしくはN-カドヘリンに特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、結腸直腸癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、EpCAM、CD66c、CD66e、CEA、TACSTD2、CK20、CD104、MUC-1、CD318、もしくはN-カドヘリンに特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、肺癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、CK18、CK19、TACSTD2、CD318、CD104、CEA、EGFR、もしくはEpCAMに特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、膵臓癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、MUC-1、CEA、TACSTD2、CD104、CD318、N-カドヘリン、MUC-1、もしくはEpCAMに特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、卵巣癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、MUC-1、TACSTD2、CEA、CD318、CD104、N-カドヘリン、もしくはEpCAMに特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、内皮膀胱癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、CD34、CD146、CD62、CD105、CD106、VEGF受容体、もしくはMUC-1に特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、上皮膀胱癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、TACSTD2、EpCAM、CD318、EGFR、6B5、N-カドヘリン、もしくは葉酸結合受容体に特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、癌幹細胞であり、かつ第1の結合要素が、CD133、CD135、CD117、もしくはCD34に特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体カクテルを含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、間葉系抗原を発現する循環癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、FGFR1、FGFR4、EGFR、葉酸結合受容体、N-カドヘリン、もしくはMSCに特異的に結合する抗体を含むか、または第1の結合要素が、それらの組み合わせに特異的に結合する抗体を含む、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、血管形成表面抗原を発現する循環癌細胞であり、かつ第1の結合要素が、VEGF受容体に特異的に結合する抗体を含む、請求項9記載の方法。
- 第1の結合要素が、少なくとも第1の抗体と第2の抗体との混合物であり、かつ第1の抗体が、標的要素の第1のエピトープに特異的に結合し、かつ第2の抗体が、標的要素の第2のエピトープに特異的に結合する、請求項1または2記載の方法。
- 第1の抗体が、幹細胞抗原に特異的に結合し、かつ第2の抗体が、癌細胞抗原に結合する、請求項30記載の方法。
- 第1の抗体が、CD133、CD135、CD117、CD34、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する、請求項30記載の方法。
- 第1の抗体が、間葉系マーカーに特異的に結合し、かつ第2の抗体が、癌細胞抗原に特異的に結合する、請求項30記載の方法。
- 第1の抗体が、FGFRl、FGFR4、MSC、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する、請求項30記載の方法。
- 第1の抗体が、血管形成マーカーに特異的に結合し、かつ第2の抗体が、癌細胞抗原に特異的に結合する、請求項30記載の方法。
- 第1の抗体が、VEGF受容体に特異的に結合する、請求項35記載の方法。
- 標的細胞が循環腫瘍細胞(CTC)である、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、インサイチューまたはインビトロで解析される、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、異数性について評価される、請求項9記載の方法。
- 標的細胞が、1番、3番、4番、7番、8番、11番、および/または17番染色体の1つまたは複数にある異数性について評価される、請求項39記載の方法。
- 異数性が、FISHにより評価される、請求項39記載の方法。
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