JPH0714349B2 - 植物細胞での発現に適したキメラ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この研究は遺伝子工学、植物生物学、微生物学の分野に
関するものである。

従来技術 過去10年間の間に、遺伝子工学は急速に発展した。異種
生物の遺伝子をバクテリアの細胞内に入れ、そのバクテ
リアに組み込まれた遺伝子の形質を発現させるという手
法が数多く知られている。この場合、通常プラスミドを
使用する、そのプラスミドは、以下述べるようにレスト
リクション・エンドヌクレアーゼによって、一つまたは
いくつかの部分に分割できる。典型的な方法は、一つの
DNA鎖を分割して得た遺伝子を、プラスミドのようなベ
クターを分割して得たものと混ぜ合わせる、というもの
である。種々のDNAはつなぎ合わされて、新しくプラス
ミドを再構成する。U.S.パテント4,237,224（コーエン
・ボイヤー、1980）;4.264,731（シャイン、1981）;4,2
73,875（マニス、1981）;4,322,499（バクスター等、19
82）;4,336,336（シルヘイビー等、1982）を参照。この
他にも参考になるような例は数多くある。ある論文に
は、DNAの情報がメッセンジャーRNAに転写され、メッセ
ンジャーRNA（mRNA）の情報がタンパク質へうつし取ら
れていく過程が説明されている。例えば、ストライヤ
ー、1981（註：パテント以外のここに記載されている参
考は、すべて例の後に引用されている）、レーニンジャ
ー、1975。その他の論文は、遺伝子操作の方法、生産物
について述べている。マニアティス等、1982;セットロ
ー・ホレンダー、1979を参照。

今までに行われてきた遺伝子工学の研究では、遺伝子は
種々の細胞、主に大腸菌のようなバクテリテア、イース
トなどの微生物、あるいは哺乳動物の細胞へ組こまれて
きた。動物の細胞や微生物の細胞に用いられた技術や物
質は、植物を用いる遺伝子工学にそのまま利用すること
はできない。

ここで用いられている通り“植物”という言葉は、多細
胞の分化の進んだ個体、被子植物や多細胞の藻類のよう
に光合成を行うものを表している。バクテリテアやイー
ストなどの微生物、菌類はこの仲間に入らない。しかし
“動植細胞”という場合には植物から得られる細胞なら
なんでも、例えばカルス、樹冠の虫こぶ（腫腸）のよう
に未分化の組織、植物の種子、珠芽、花粉、植物の胚な
どにも適用されている。

数多くの植物遺伝子が単離されており、販売されている
ものもあり、又、そうでなくても公に手に入れることの
できるものもある。そのような遺伝子には、大豆のアク
ションジーン（シャー等、1982）、コーゼイン（ペダー
ソン等、1982）、大豆レジモグロビン（ハイルディッヒ
・ニールセン等、1982）、大豆貯蔵たんパく（フイッシ
ャー、ゴールドバーグ、1982）がある。

遺伝子の様々の領域 遺伝子が形質を発現する場合には、遺伝子から遺伝情報
を受け取ったポリペプチドが形成される。この過程は、
少なくとも二つの段階でできている。まず遺伝子の一部
を転写したメッセンジャーRNAができ、そのメッセンジ
ャーRNAの一部分がポリペプチドに翻訳される。転写、
翻訳の過程は完全には解明されていないが、DNA配列が
メッセンジャーRNAに転写される場合、DNAの何個所かの
領域でコントロールされている、と考えられている。DN
Aのそれぞれ部位とは、一連の塩基の配列のことであ
る。（つまり、アデノシン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シ
テイジン（Ｃ）、グアニジン（Ｇ）でできているヌクレ
オチド残基がある順序に配列したものである。）真核生
物の遺伝子に、一般的に存在している領域を図１に示
す。これらの領域については、それぞれ名前がつけられ
て簡単に説明されている。さらに、これらの領域につい
てもう少しくわしく説明を加えるため様々な用語が使わ
れていることに注意が必要である。

アソシエーションレイジョン２は、RNAポリメラーゼをD
NAの断片に会合させる。アソシエーションレイジョン２
は転写されないが、この遺伝子領域の働きで、活性化さ
れた後、RNAポリメラーゼは、インタービーニングレイ
ジョン４にそってある距離（例えば塩基100〜300個位）
移動する。

転写開始シークエンス６は、RNAポリメラーゼに命令を
下し、mRNAの合成を開始する。適当な信号を受け取ると
RNAポリメラーゼは、転写開始シークエンス６をある距
離だけ（例えば塩基20〜30個分）越えてmRNAの合成を始
める、と考えられている。これは第１図にインタービー
ニングレイジョン８として表されている。

それ以前の配列は、遺伝子のプロモーター領域と、集合
的に呼ばれている。

DNAと次の塩基配列はRNAポリメラーゼの作用でメッセン
ジャーRNAに転写される。しかしこれが翻訳されてタン
パク質が生産されるということはない。一般に、mRNAの
５′末端はリボソームに付着している。バクテリアの細
胞では、“リボソーム結合部位”（RBS）と呼ばれる塩
基の配列で、接着が容易になっている。しかしながら、
真核生物の細胞では、RBSの存在は確かめられていな
い。ｍ−RNA鎖にRBSが存在するかしないかに拘わらず、
mRNAはリボソームにそって開始コドンに到達するまで移
動する。開始コドンは通常AUGという三個の塩基配列で
できている。まれに、GUGというコドンから翻訳が開始
されることもある。mRNAの５′末端と開始コドンの間に
ある、翻訳されない部分は、mRNAの５′非翻訳領域10と
呼ばれている。DNAのこれに相当する部分はここでは、
５′非翻訳領域12と呼ばれている。DNAのこの部分の塩
基の特殊な配列は、遺伝子の形質発現に重要であるとは
考えられていない。しかし、完成していない開始コドン
が存在することで、mRNAの翻訳に影響がでることもある
と言われている。コザック1978参照。

プロモーターシークエンスは、上述した以上に複雑であ
ろう。例えば、バクテリアに存在するある種のプロモー
ターには“オペレーター”と呼ばれる制御シークエンス
がある。その様な複雑なプロモーターには、遺伝子の誘
導あるいは抑制に関係している一つまたはそれ以上のシ
ークエンスが存在することが多い。一つの例はラックオ
ペロンと言われるものでこれは、細胞中に乳糖が存在し
なければ、乳糖利用酵素の転写を促進することはない。
もう一つの例はtrpオペレーターと呼ばれるもので、細
胞中にトルプトファンが過剰に存在すると、トリプトフ
ァン生成酵素の転写、翻訳を促すということはない。ミ
ラー・レニコフ、1982参照。

次の塩基配列は、コーディングシークエンスまたは構造
シークエンス14（DNA分子において）、あるいは16（mRN
A分子内で）と呼ばれている。上述したようにポリペプ
チドの翻訳は、mRNAの開始コドン（普通はAUGである）
が、リボソーム翻訳メカニズムに到達した時に始まる。
開示コドンの命令で、リボソームは、メチオニンを出発
点として各種アミノ酸をペプチド結合で結合させ、ポリ
ペプチドを形成する、メチオニンは、常にポリペプチド
のアミノ基末端となる。（このメチオニン残基はその
後、ほかの酵素の作用でポリペプチドから切り離され
る）AUG、開始コドンに続く塩基は、３個ずつ１組とな
りそれぞれコドンとなる。塩基がどのように３つ組にグ
ループ分けされていくかを規定する“リーディング・フ
レイム”は、開始コドンにより決まる。それぞれのコド
ンは、形成されつつあるポリペプチドへ特別のアミノ酸
を加えていく遺伝情報である。遺伝暗号（64個の異なっ
たコドンがあるが）はすべて解読されている。レーニン
ジャーの序文962頁参照、例えばCUAは、ロイシンという
アミノ酸に対応する暗号であり、GGUはグリシン、UGUは
システインの暗号である。

三つのコドン（UAA、UAG、UGA）は停止コドンである。
停止コドンがリボソームの翻訳メカニズムに到達する
と、形成されていたポリペプチドはリボソームから離
れ、最後のアミノ酸残基がポリペプチドのカルボキシル
末端となる。

モノシストロニック遺伝子中の３′側の停止コドンにあ
るmRNAの部分は、ここでは、３′−非翻訳領域18と呼ば
れている。この領域18は、mRNAが転写された後、そのmR
NAの処置、安定化あるいは輸送に関係していると考えら
れている。またこのレイジョン18には、細胞内に存在す
るある種の酵素により認識されるポリアデニレイション
シグナル20という塩基配列があると考えられている。こ
の酵素は、相当量のアデノシン残基をmRNAに加え、ポリ
−Ａテイル22を形成する。

DNA分子には３′非翻訳領域24とポリアデニレーション
シグナル26があり、それぞれmRNAの領域18、シグナル20
の遺伝情報を指定している。しかし、DNA分子には、ポ
リ−Ａテイルはない。mRNAのポリアデニレーションシグ
ナル20、DNAのポリアデニレーションシグナル26は図
中、大きな点で示されている。

遺伝子−宿主不適合性 地球上のすべての生物体に、同じ遺伝暗号が適用され
る。コドンに対応するアミノ酸は、植物、動物、微生物
等あらゆる生物に共通である。しかし、遺伝暗号となる
のは遺伝子の構造シークエンスだけである。これは、あ
る開始コドンから停止コドンまでのmRNAで、mRNAを翻訳
してポリペプチドが形成される場合の遺伝情報を持って
いる。

しかし、ある種の細胞の中で効率よく働く遺伝子が別の
種類に異なった細胞では全然働かないということもあり
うる。例えば、E.Coliで形質を発現する遺伝子が、異な
ったタイプのバクテリアの細胞、菌類、イーストに運ば
れていき、その新しい宿主のもとでは、形質を発現しな
いこともある。ある完全な遺伝子か、ある細胞内では形
質を発現するが別の細胞では発現しないということに関
しては様々な理由が考えられる。坂口：岡西、1981参
照。このような理由として次の事柄が挙げられる。

1. 遺伝子が複製されない、又は新しい宿主細胞の子孫
に安定して受け継がれていかない。

2. 遺伝子が新しい宿主細胞のレストリクションエンド
ヌクレアーゼあるいはその他の酵素で分解されてしま
う。

3. 新しい宿主細胞のRNAポリメラーゼが、遺伝子のプ
ロモーターレイジョンを認識しない。

4. DNAのある領域が、宿主DNAのオペレーターあるいは
その他の制御シークエンスと似ているため、遺伝子の一
部が宿主細胞のリプレッサーたんぱく質、あるいは他の
分子と結合する。例えば、ラックオペロンにはあるポリ
ペプチドがあり、このペプチドは、ポリペプチド自身が
ラクトースで不活性化されないと、ラックプロモーター
と隣り合ったある配列の塩基と結合する。ミラー・レッ
ニコフ、1982参照。

5. 遺伝子の一部分が削り取られてしまったり、再構成
されたり、移動して、宿主ゲノムの他の場所に付着する
例えば、数多くの原核生物の細胞中に遺伝子組み換えを
促進する酵素があるということが知られている。（例え
ば大腸菌のレックプロテイン、Shibata等、1979参照）
また、転座を促す酵素もある。（第45回、計量生物学コ
ールドスプリングハーバーシンポジウム、1981参照）。
更に、異なったDNA鎖の類似部分で自然遺伝子修飾が多
く現れる。ラディング、1978参照。

6. 遺伝情報を転写したmRNAに種々の問題が生じる。例
えば、リボソームに達する前に品質が低下することがあ
り、ポリアデニン化されなかったり、リボソームに運搬
されていかないこともあり、リボソームとうまく適合し
ないこともあり、大切な部分が、RNAプロセシング酵素
で削り取られてしまうこともある。

7. 遺伝子の遺伝情報を受け取ったmRNAを翻訳して形成
されたポリペプチドに問題が起こることもある。例えば
ポリペプチドが細胞に毒性を現す、グリコシル化され、
あるいは変換されて変性オリペプチドに変わってしま
う、分割されて小さなポリペプチドあるいはアミノ酸に
なる、細胞内の小さな部分に閉じ込められてしまい、そ
こでは作動できないというようなことが起こる可能性も
ある。

一般に、新しい宿主細胞がもとの宿主細胞とかなり異な
っている場合、外から入ってきた遺伝子が新しい細胞の
中で形質を発現する可能性は小さくなる。例えば、同じ
「属」に属していれば、ある「種」のバクテリアの遺伝
子は別の「種」のバクテリアに移されても発現する可能
性が大きい。異なった「属」のバクテリア内での発現の
可能性は小さくなり、バクテリア以外の微生物イース
ト、菌類、藻類の細胞内での発現の可能性は更に小さく
なる。ある１つの「界」に属する生物（植物界、動物
界、微生物界のうちの一つ）の細胞から取り出した遺伝
子が別の「界」の生物の細胞で発現するということはほ
とんど考えられない。

これらの問題があるために、これまで植物細胞で外来遺
伝子の形質を発現させることはできなかった。ある植物
細胞に、他の生物のDNAを組み込む研究を報告したグル
ープもある。ラルギン、1979、クレンス等、1982;デイ
ベイ等、1980を参照。少なくても三グループが植物細胞
に完全な遺伝子を組み込む方法について報告している。
放射性DNAを用いて、外来遺伝子又はその一部が、植物
細胞の子孫に安定して受け継がれていることが証明され
た。ヘルナルステーン等、1980;ガルフィンケル等、198
1;マック・チルトン、1981を参照。しかし外来遺伝子
が、植物細胞で発現したという報告はない。

遺伝子−宿主不適合性に、いくつかの例外があることが
発見された。例えば、大腸菌遺伝子のいくつかは、ある
種のイースト細胞で発現する、又その反対にイーストの
遺伝子が大腸菌で発現することもある。ベッグス、197
8;ストルール等、1979参照。

さらに、Agrobacterium tumefaciensやA.rhizogenesな
ど、ある種のバクテリア細胞は、種々の植物細胞に感染
し、根頭癌腫病やhairy root diseaseをひき起こす。こ
れらのAgrobacteriumは、Tiプラスミド、Riプラスミド
と呼ばれるプラスミドを持ち、この中に植物細胞で発現
する遺伝子がある。この遺伝子の暗号は“opines（オパ
イン）”と呼ばれる物質をつくり出す酵素に関するもの
である。opines（オパイン）に属する物質はoctopine
（オクトピン）、nopaline（ノパリン）、agropine（ア
グロピン）である。opinesはバクテリア細胞の炭素源、
窒素源エネルギー源として使われる。ペティット・テン
プ、1978を参照。opines遺伝子は、バクテリア細胞内で
は不活性であると考えられている。これらの遺伝子は植
物細胞に入って初めて発現する。

遺伝子−宿主不適合性という障壁をとり除くために、様
々な人為的工夫もなされてきた。例えば、宿主バクテリ
アの細胞に入ると質が低下する哺乳類のポリペプチド
を、正常な宿主細胞に存在するバクテリアのポリペプチ
ドとカプリングさせると質が低下しなくなる。融合たん
ぱくが生成されたことになる。板倉等、1977を参照。ま
た別の例としては、宿主細胞内のエンドヌクレアーゼで
組み込まれた遺伝子が切断されるのを防ぐため、（１）
数種のエンドヌクレアーゼを欠く宿主細胞に遺伝子をい
れるか、（２）細胞内で遺伝子を複製し、メチル化しや
すくする、という方法も報告されている。マニアティス
等、1981を参照。

さらに、遺伝子−宿主不適合性をとり除く方法として、
キメラ遺伝子に関するものがある。例えば、哺乳類のポ
リペプチド、インシュリン、成長ホルモン、インターフ
ェロン等の遺伝情報を指定する構造シークエンスを、バ
クテリアの物質シークエンスと結合させる。その結果つ
くられたキメラ遺伝子をバクテリア細胞に入れる。する
とその遺伝子は哺乳類のポリペプチドを生成する。グア
レンテ等、1980を参照。また、バクテリアの構造シーク
エンスとヴイルスの制御シークエンスとを結合させてで
きたものは、哺乳動物の細胞に感染することができる。
このキメラ遺伝子を哺乳動物の細胞に入れると、バクテ
リアのポリペプチドを生成したという報告がある。サウ
ザン・バーグ、1892;コルベル・カラピン等、1982を参
照。

レストリクションエンドヌクレアーゼ群 一般的に、エンドヌクレアーゼというのは、DNAをいく
つかのDNAの断片に切断していく酵素である。エンドヌ
クレアーゼは、一本のDNA鎖の中の何処へでもはたらき
かけ、それを切断することができる。これに較べて、エ
クソヌクレアーゼは、DNA鎖の末端からヌクレオチドを
とり除いていく。ここで述べられているエンドヌクレア
ーゼ群はすべて二本鎖のDNAとDNAの断片に切断していく
ことができる。このためには、二種の結合鎖を破す必要
がある。（１）燐酸基とデオキシリボース残基の間の共
有結合と、（２）DNAの二本鎖を結びつけている、水素
結合（Ａ−ＴとＣ−Ｇ）である。

レストリクションエンドヌクレアーゼ（これ以後、エン
ドヌクレアーゼと呼ぶ）は、DNAをある決まった塩基配
列のところで切っていく。例えば、EcoR I、Hae IIIは
次の配列を認識し、切断していく。

上の例において、EcoR Iによる切断は、５′突出（すな
わち、単鎖のテイルが３′末端ではなく５′末端を有す
る）を伴った粘着末端を創出した。粘着末端は望ましい
基を結合させることができる。例えば、EcoR Iの末端
は、Hae III末端と結合することはほとんどないが、別
のEcoR I末端と結合することはある。

百種以上のエンドヌクレアーゼが知られておりそれぞれ
が、DNAをある決まった塩基配列のところで切断するこ
とができる。ロバーツ、1982を参照。レストリクション
エンドヌクレアーゼはすべて、塩基の配列のちがいを読
み取ることができる。その上、ある種のものは、塩基が
メチル化されているかどうかを判断することもできる。
例えばMbo I、Sau3aという二つのエンドヌクレアーゼ
は、下に示されている様な塩基配列を切断する。

もしアデニン残基がメチル化されていれば（meA）、Mbo
Iはこの配列を切断できない。Sau3aは、アデニンがメ
チル化されていても、メチル化されていなくても、この
塩基配列を切断する。プラスミドのメチレイション（従
って切断）は、メチル化能力のある細胞でプラスミドを
複製することで、ある程度コントロールすることができ
る。大腸菌のある酵素、DNAアデニンメチラーゼ（dam）
は、GATCという塩基配列のアデニン残基をメチル化す
る。dam酵素を持たない大腸菌の菌株はdam^-細胞と呼ば
れる。それに対してdamを持っているものはdam⁺又はdam
細胞といわれている。

いくつかのエンドヌクレアーゼは、それぞれ異なった塩
基配列を切断し、他のエンドヌクレアーゼの作用ででき
た粘着末端と完全に適合するような結合性末端をつくり
出す。例えば、少なくても５種の異なったエンドヌクレ
アーゼが５′GATC突出部をつくり出す。これは表Ｉに示
されている。

表Ｉに挙げたエンドヌクレアーゼの作用で生じた結合力
のある末端は、どれか別のエンドヌクレアーゼの作用で
生じた結合性末端と結合することもあろう。例えばBg I
IIの使用で生じた末端とBamH Iの作用で生じた末端が結
合すると、次のような塩基配列になる。

AGATCC TCTAGG この配列はBg III、BamH Iでは切断できないが、MBO I
（メチル化されていない場合）又はSau3aでは切断でき
る。

GATCを切断するエンドヌクレアーゼはPvu Iと言われ次
のように、３′突出部をつくりだす。

また、エンドヌクレアーゼCla Iは次の配列を切断す
る。

もしX₁がＧ、あるいはX₂がＣであれば、この配列はMbo
Iで切断できる。（メチル化されていない場合、メチル
化されていればCla Iも阻害される。）あるいはSau3aで
も切断できる。

ウイルス性のプロモーター ウイルスとは、一本鎖又は二本鎖の核酸（DNA又はRNA）
が“カプシド”又は“コート”と呼ばれるたんぱく質性
のおおい（脂質が含まれることもある）に包まれてでき
ている微生物である。ウイルスは細胞より小さく、ほと
んどすべての生化学的反応を行うために必要な物質をも
っていない。その代わり、細胞に感染し、細胞の代謝系
を借りてウイルス自身を増殖させる。

次に簡単に、どのようにしてDNAウイルスが細胞に感染
するかを説明する。話をわかりやすくするためRNAウイ
ルスについてはふれない。まず最初に、普通宿主と呼ば
れている細胞にウイルスは付着するか、又は侵入する。
ウイルスのDNA（ウイルス粒子全体のこともある）は、
細胞のプラスミド（染色体の外のDNAループ）に入る。
ウイルスDNAの情報は、メッセンジャーRNAに転写され、
翻訳されてポリペプチドがいくつか生成される。このポ
リペプチドの一部が集まって、新しい“カプシド”をつ
くり、残りのポリペプチドは酵素として作用し、種々の
生化学的反応を触媒する。ウイルスDNAも複製され、カ
プシドポリペプチドと共に新しいウイルス粒子を形成す
る。これらウイルス粒子は徐々に放出されるか、あるい
は溶菌現象が起き、細胞は破壊し、ウイルスは放出され
る。放出されたウイルス粒子は、その後、新しい宿主細
胞に感染する。ウイルスに関するくわしい情報が必要で
あれば、ストライヤー、1981;マシュー、1970を参照。

ここで使用されている通り、“ウイルス”という言葉
は、ファージヴァイロイド、複製中間体にも適用され
る。また“ウイルス核酸”、“ウイルス由来のDNA又はR
NA"という表現は、広くウイルスの核酸から取り出され
たDNA、RNAのすべてに適用されている。例えば、ウイル
スRNAを鋳型として生成したDNA又は、ウイルスDNAを分
析し塩基配列を決定し、それと同じ配列のものを化学的
に合成したDNAも、ウイルス核酸とみなされるであろ
う。

ウイルスの宿主域（つまり一つのウイルスが感染できる
細胞の種類）は限られている。あるウイルスはある種の
バクテリアにしか感染できない。またあるウイルスは限
られた属の植物にだけ感染する。哺乳動物にだけ感染す
るウイルスもある。ウイルスが細胞に感染するという場
合、DNA又はRNAが宿主細胞に侵入するというだけでな
く、細胞内でウイルス粒子の増殖がおこるということで
ある。種々様々な分析を通して優れた技術を持った者
は、ある特定のウイルスが、ある特定の属、種、菌株に
感染できるかどうかをすぐに判定することができる。こ
こで用いられている様に、“植物ウイルス”いう言葉
は、植物細胞に感染できるウイルスを指しており、他の
細胞に感染するかしないかは問題ではない。

ヴァイロイド（現在、これについてくわしいことは分か
っていない）は例外かもしれないが、ウイルス粒子は、
感染した宿主細胞において発現する遺伝子を少なくても
１個は持っている。遺伝子が発現するには、DNAあるい
はRNAの一部がmRNAに転写されるか、mRNA鎖として働
き、mRNAが翻訳されてポリペプチド形成されなければな
らない。ほとんどのウイルスが５〜10個の異なった遺伝
子を持っており、適当な宿主細胞中で発現する。

ウイルス遺伝子に由来するプロモーターは、遺伝子工学
の様々な分野に利用されている。例えば、バクテリアの
遺伝子からとり出した構成シークエンス（コーディング
・シークエンスとも呼ばれている）を、哺乳動物の細胞
に感染するウイルスからとり出したプロモーターと結合
させて、キメラ遺伝子が作られた。（最も一般的に用い
られている哺乳動物のウイルスは、Simian Virus40,Her
pes Simplex Virus（HSV）と呼ばれている。）これらの
キメラ遺伝子は、哺乳動物の細胞に形質転換を起こさせ
るために利用されている。ムリガン等、1979;サウザン
・バーグ、1982を参照。更に、バクテリアに感染するウ
イルスから取り出したプロモーターを用いたキメラ遺伝
子は、バクテリア細胞の形質転換に用いられている。マ
ニアテス等の報告した”ファージラムダPLプロモータ
ー”を参照。

数人の研究者は、植物細胞の形質転換のベクターとして
植物ウイルスを利用することが可能であろうという説を
発表した。ホーン等、1982を参照。一般的に、“ベクタ
ー”とはある細胞に遺伝子を移入させる時に利用される
DNA分子である。普通、望みの遺伝子をベクターにそう
入し、そのベクターを宿主細胞に感染させる。

数人の研究者は、植物ウイルス遺伝子に由来するプロモ
ーターを用いて、植物細胞内で形質を発現するキメラ遺
伝子をつくり出すこともできるであろうという説をだし
た。ホーン等、1982、216頁参照。

しかしながら、多くの研究者達の努力にも拘わらず、こ
の発明に先立って、誰も（１）植物ウイルス性のプロモ
ーターを異種生物の構造シークエンスと結合させたキメ
ラ遺伝子を製造することに成功しなかった。また、
（２）植物細胞内でこのような遺伝子が発現したという
ことも明らかにされていない。

カリフラワーモザイクウイルス（CaMV） CaMVのDNAの塩基配列はすべて明らかにされている。ガ
ードナー等、1981;ホーン等、1982参照。最も一般的な
型では、CaMVゲノムの長さはおよそ8000bpである。しか
も、自然に生じた感染性のある突然変異体では、500bp
短くなっているものも発見されている。ハウアース等、
1981参照。CaMVゲノム全体が、１本のmRNAに転写され
る。このmRNAの沈降係数は35Sである。32S mRNAのプロ
モーターは、Gap1から左周りに1kb離れた大きなインタ
ージェニックレイジョンにある。（ギレイ等、1982参
照） CaMVは、少なくとも８個のたんぱく質を生産すると考え
られている。これらのたんぱく質をつくり出す遺伝子
は、遺伝子Ｉ〜VIIIと名付けられている。遺伝子VIは、
沈降係数19SのmRNAに転写される。19S mRNAは、P66とい
うたんぱく質に翻訳される。これは、ウイルス粒子内に
ふくまれているたんぱく質である。19S′mRNAは19Sプロ
モーターにより促進される。このプロモーターはGap1か
ら左周りに2.5kb離れたところに存在する。

発明の要約 この発明は植物細胞内で発現するキメラ遺伝子、それら
の遺伝子を作り出す方法に関するものである。

キメラ遺伝子にはプロモーター領域があり、このプロモ
ーターの作用で植物細胞のRNAポリメラーゼは、DNAに対
応するmRNAをつくり出す。このようなプロモーター領域
の１つに、ノパリンシンサーゼ（NOS）プロモーター領
域というものがあり、これは普通A.tumefaciensという
バクテリアのTiプラスミド内にある。NOSは、A.tumefac
iensの細胞内にある時は一般に不活性であり、Tiプラス
ミドが植物細胞内に入ると活性をもつようになる。これ
以外に二個のプロモーターがカリフラワーモザイクウイ
ルス（CaMV）からとり出された。その他のプロモーター
は、植物細胞内に存在する遺伝子から、あるいは、植物
細胞に感染するウイルスからとり出される。

キメラ遺伝子にはmRNAの５′非翻訳領域の暗号となる塩
基の配列も存在する。この領域は、植物細胞内でmRNAの
構造シークエンスの発現を可能にしたり増加させたりす
ることができる。必要とされる５′非翻訳領域は、NOS
遺伝子、植物ウイルス遺伝子、あるいは植物細胞中に存
在する遺伝子からとり出される。

キメラ遺伝子には、望ましい構造シークエンスも含まれ
ている。つまり、構造シークエンスとは、mRNAに転写さ
れて、そのmRNAが翻訳され、望みのポリペプチドを生成
する、そういう塩基配列を指している。構造シークエン
スは、プロモーター領域に対して異種的であり、細菌性
または哺乳動物たんぱく質等の所望のたんぱく質をコー
ドしてもよい。構造遺伝子には、開始コドンと停止コド
ンがある。また構造遺伝子には、翻訳に先立ってmRNAか
らとり除かれたイントロンが存在することもある。

キメラ遺伝子は、mRNAの３′非翻訳領域（ポリ−アデニ
レイションシグナルを含む）をコードするDNA配列を含
むこともできる。この領域は、構造遺伝子を適切に発現
させるため、普通植物細胞内で発現する遺伝子からとり
出される。このような遺伝子にはNOS遺伝子、植物ウイ
ルス遺伝子、植物細胞内の遺伝子がある。

この発明に用いられた方法については以下に述べられて
いる、また第２図のフローチャートに要約されている。

適切に集められ、そして植物のゲノムにそう入されれ
ば、ここで発明されたキメラ遺伝子は植物細胞内で発現
し、のぞみのポリペプチド、例えば哺乳類のホルモン、
植物に抗生物質や除草剤に対する抵抗性を与えるバクテ
リアの酵素などを生成するであろう。

図の簡単な説明 図は模式的なものであり、正確な寸法にもとづいて描い
たものではない。

第１図 典型的な真核細胞の遺伝子を表す。

第２図 この発明のステップをフローチャートで表した
もので、キメラNOS−NPT II−NOS遺伝子を例にして描か
れている。

第３図 TiプラスミドをHind IIIにより消化して得られ
たHind III−23の断片である。

第４図 NOSプロモーター領域、NOS5′非翻訳領域、NOS
構造シークエンスの最初の数個のコドンを持つDNAの一
部を表したものである。

第５図 NOSプロモーター領域、および完全な５′非翻
訳領域を含むDNA断片を得るための、DNA配列の正確な位
置での切断を表す。

第６図 NPT II構造遺伝子部位を保持しているプラスミ
ド、pMON1001とpMON40との生成を表す。

第７図 pMON58を得るためNOSプロモーター領域をプラ
スミドpMON40に組み入れる。

第８図 Ｍ−２と命名されているM13誘導体の生成、こ
のＭ−２は、NOS3′非翻訳領域とポリ−Ａシグナルを保
持している。

第９図 NOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子を組み立て、プ
ラスミドpMON38に組み入れ、プラスミドpMON75とpMON76
を生成する。

第10図 NOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子をプラスミドpM
ON120に組み入れ、プラスミドpMON128とpMON129を生成
する。

第11図 NPT I遺伝子を保持しているプラスミドpMON66
の生成。

第12図 キメラNOS−NPT IIシークエンスを保持してい
るプラスミドpMON73の生成。

第13図 キメラNOS−NPT Iシークエンスを保持している
プラスミドpMON78の生成。

第14図 キメラNOS−NPT I−NOS遺伝子を保持するプラ
スミドpMON106とpMON107の生成。

第15図 キメラNOS−NPT I−NOS遺伝子をpMON120に組み
入れ、プラスミドpMON130とpMON131を生成する。

第16図 大豆たんぱく（sbss）プロモーターを保持して
いるDNA断片の構造。

第17図 sbssプロモーターを保持しているプラスミドpM
ON121の生成。

第18図 キメラsbss−NPT II−NOS遺伝子をpMON120に組
み入れ、プラスミドpMON141とpMON142を生成する。

第19図 ウシ成長ホルモンの構造遺伝子領域と、NOS3′
領域を保持している、プラスミドpMON108の生成。

第20図 選択的に切断面にかこまれているBGH−NOSを保
持しているプラスミドN25−BGHの生成。

第21図 キメラsbss−BGH−NOS遺伝子をpMON120に組み
入れ、プラスミドpMON147とpMON148を生成する。

第22図 キメラNOS−BGH−NOS遺伝子を保持するプラス
ミドpMON149の生成。

第23図 EPSPシンサーゼを生産する構造遺伝子領域を保
持しているプラスミドpMON8の生成。

第24図 開始コドンの近くに切断面のあるEPSPシンサー
ゼ構造遺伝子領域を保持するプラスミドpMON25の生成。

第25図 EPSPシンサーゼとNOS3′領域を持ったキメラシ
ークエンスを保持するプラスミドpMON146の生成。

第26図 キメラNOS−EPSP−NOS遺伝子をpMON120に組み
入れpMON153を得る。

第27図 キメラsbss−EPSP−NOS遺伝子を保持するプラ
スミドpMON154の生成。

第28図 CaMV19Sプロモーターを保持するプラスミドMON
93の構造とその生成。

第29図 キメラCaMV（19S）−NPT−NOS遺伝子を保持す
るプラスミドpMON156の構造とその生成。

第30図 NPT遺伝子を部分的に保持するプラスミドpMON1
10の構造とその生成。

第31図 NPT−NOS遺伝子を部分的に保持するプラスミド
pMON132の構造とその生成。

第32図 キメラCaMV（19S）−NPT−NOS遺伝子を保持す
るプラスミドpMON155の構造とその生成。

第33図 CaMV32Sプロモーターを保持するプラスミドpMO
N81の構造とその生成。

第34図 CaMV32Sプロモーターを保持するプラスミドpMO
N125の構造と生成。

第35図 CaMV32Sプロモーターを保持するプラスミドpMO
N172の構造と生成。

第36図 CaMV32Sプロモーターを保持するファージM12の
構造と生成。

第37図 キメラCaMV（32S）−NPT−NOS遺伝子を保持す
るプラスミドpMON183とpMON184の構造と生成。

発明の詳細な説明 この発明の１つの好ましい実施態様において、キメラ遺
伝子は、次の要素を含み、生起される。

1. ノパリンシンサーゼ（NOS）遺伝子から誘導される
プロモーター領域および５′−非翻訳領域； 2. ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼII（NP
T IIあるいはNPT II）遺伝子から誘導された構造シーク
エンス； 3. ポリアデニル信号を含み、NOS遺伝子から誘導され
る３′−非翻訳領域。

このキメラ遺伝子は、この中でNOS−NPT II−NOS遺伝子
とみなされるが、集められていろいろな植物細胞に挿入
され、カナマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質に
対する抵抗性をひきおこす。このキメラ遺伝子を集合さ
せる方法は第２図のフローチャートに要約されている
が、詳細は以下および例に記述されている。この方法の
ステップを理解することにおいて読み手を助けるため
に、NOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子内に含まれた多くの
プラスミドおよび断片は、第２図のカッコ内に引用され
る。しかしながら、第２図の方法は広く多様な他のプラ
スミドおよび断片に適切である。読み手のさらなる助け
として第２図に示されたステップは呼び出し番号42以下
を付されている。この呼び出し番号は次の解説に引用さ
れる。この発明の技術およびDNAシークエンスは広く多
様な植物の変換に有益であり、かつ適当であり、A.tume
faciensあるいはA.rhizoglnesの１ないしそれ以上の菌
株により感染される植物のどれでもを含む。

NOSプロモーター領域および５′−非翻訳領域 出願者は、異種遺伝子の発現を支配するためにノバリン
シンサーゼ（NOS）プロモーター領域を得、利用するこ
とを決めた。NOSはpTiT37のような、ある型のプラスミ
ドに通常、保有されている。Sciaky他、1978。NOSプロ
モーターはA.tumefaciens細胞の中にある間は、通常は
不活性である。プロモーターおよび蛋白暗号シークエン
スを含む全NOS遺伝子は、TiプラスミドのＴ−DNA部にあ
り、それは植物が感染して根こぶ腫瘍を形成するとき、
植物の染色体に挿入される。１度植物細胞の内側に入る
と、NOSプロモーター領域が植物細胞の中のRNAポリメラ
ーゼを支配し、NOS蛋白暗号化シークエンスをmRNAに転
写する。そのmRNAは続いてNOS酵素に翻訳される。

プロモーター領域（結合領域２、中間領域４、転写開始
シークエンス６、中間領域８として第１図に示す）の異
なる部分間の境界およびプロモーター領域と５′−非翻
訳領域間の境界は十分にはわかっていない。出願者は完
全なプロモーター領域および５′−非翻訳領域をNOS遺
伝子から利用することを決定する。そのNOS遺伝子は植
物細胞内で発現されることが知られている。しかしなが
ら１ないしそれ以上のこのシークエンスが長さにおいて
の修正、あるいは他のシークエンスによる置換などの多
くの方法において修飾されることは、全く可能である。
プロモーター領域および５′−非翻訳領域内の、そのよ
うな修飾は、バクテリア細胞（参照例、Roberts他、197
9）および哺乳類細胞（参照例、Mcknight、1982）にお
いて研究されている。この発明により教えられた利用方
法論で、植物細胞内遺伝子の発現に対するプロモーター
領域及び５′−非翻訳領域内の修飾の効果を研究するこ
とは現在可能である。そのような修飾を用いて、植物細
胞内遺伝子の発現の増加を可能にする。そのような修飾
は、この発明のキメラ遺伝子に行われるとき、この発明
の範囲の中にある。

ノパリン型腫瘍誘発プラスミドは、pTiT37と命名される
が、それは基本的手順でA.tumefaciensの菌株から分離
される（CurrierとNester、1976）。それは多数の断片
を作るエンドヌクレアーゼHind IIIによって分解され
る。これらの断片はゲル上で大きさによって分離され、
断片の１つは単離されてゲルから取出される。この断片
はTiプラスミド由来の23番目の最大断片であるため、Hi
nd III−23と命名される；それはおよそ、大きさで3400
ベースペア（bp）であり、あるいは3.4キロベース（k
b）としてみなされる。他者の仕事（参照例、Hernalste
ens他、1980）からHind III−23断片は完全なnos遺伝子
を含み、それがプロモーター領域、５′−非翻訳領域、
開始コドン・終了コドンを有する構造シークエンス、
３′−非翻訳領域を含むことが知られている。

Hind III−23断片は第３図で示される。

多くの切断および配列決定の実験とから、Hind III−23
断片が他のエンドヌクレアーゼ、Sau3aにより分解可能
であること、断片の大きさを約350bpにすることが決定
される。そしてそれは完全なNOSプロモーター領域、
５′−非翻訳領域、NOS構造シークエンスのはじめの数
コドンを含む。この断片の配列が決定され、塩基シーク
エンスは、第４図に表される。NOS構造シークエンスの
開始コドン（ATG）は、350bp断片内のベースペア301で
始める。出願者はベースペア300および301の間の断片の
分割を決定する；これはNOSプロモーター領域および完
全５′−非翻訳領域を含む、長さ約300ベースペアの断
片をもって、しかし翻訳塩基をもってではなく、それら
を用意する。350bp断片を、精密に正しい位置で分割す
るため、出願者はSIAと命名されたM13クローンを得、以
下に記される手順を利用する。

SIAクローンを生起するためにWashington Universityの
Michael Bevan博士は、350bp Sau3a断片をDNA単鎖に転
換する。これはM13mp2ファージと命名されたウイルスの
ベクターを利用し、そのファージは生活環における二重
鎖（ds）および単鎖（ss）両階段を経る（Messing他、1
981）。ds350dp断片はM13mp2の二重鎖複製形成DNAに挿
入され、それはBamH Iによって切断される。２つの断片
は連紮され、E.coli細胞を感染させる。350dpを含むds
DNAは続いて複製された断片を挿入し、Ｉ鎖（ウイルス
性鎖）はM13ウイルス性蛋白殻蛋白によりまわりを包ま
れる。SIAと命名された１クローンにおいて350bp断片の
配向はNOS遺伝子のアンチセンス鎖（mRNAと同じシーク
エンスを含む）がウイルス性鎖で運搬されるということ
である。感染された細胞から解放されたウイルス性粒子
は分離され、出願者に提供される。

単鎖SIA DNAはアンチセンス350bp断片をNOSプロモータ
ー領域と共に含み、ウイルス性粒子から分離され反復さ
れる。14−merオリゴヌクレオチドプライマーは出版さ
れた手順（BeaucageとCarruthers、1981、Adams他によ
る修正、1982）を用いて合成される。この14−merは第
４図に示されるように350bp断片の塩基287から300に相
補的となるように設計される。

合成プライマー５′末端は²³pで放射能性標識される；
これは星印で図中に表す。

プライマーのコピーは350bp断片アンチセンス鎖を含む
単鎖SIA DNAのコピーと共に混合される。プライマーは
第５図の１番上に示されるようにSIA DNAの求められる
領域にアニーリングされる。この出現後、klenowDNAポ
リメラーゼおよび調節された量の非標識デオキシヌクレ
オシドシリン酸塩（dNTP′ｓ）、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇが加え
られる。klenowポリメラーゼはヌクレオチドをプライマ
ーの３′（非標識）末端（５′（標識）末端にでなく）
に加える。結果は、第５図に示されるように、単鎖DNA
の円形ループであり、その一部はDNAの第２鎖により合
わせられる。第２鎖の５′終了はSau3a挿入のNO300対塩
基に位置する。

部分的二重鎖DNAはその後第３エンドヌクレアーゼHae I
IIにより分解される。Hae IIIはDNA単鎖と二重鎖の両方
を分割し得る。Hae III分割部位は350bp挿入の外側の数
カ所に存在することが知られている。しかし350bp挿入
の内側には何も存しない。これは１平滑末端および、Sa
u3a挿入物の＃301塩基で開始する１つの３′突出を有す
る断片を生起する。Hae III断片混合物は、T₄DNAポリメ
ラーゼおよび非標識dNTP′Ｓで処理された。これはDNA
の単鎖部分の原因となり、これは断片から除去されるべ
きであるSau3a挿入の＃301塩基から最も近いHae III分
割部位までにわたる。この方法でATG開始コドンは＃300
ベースペアから除去され、およそ長さ550bpの平滑末端
二重鎖断片を生じる。

混合物はそれから第４エンドヌクレアーゼEcoR Iにより
分解され、それは550bp断片をNOSプロモーター領域の外
側の単部位で分解する。それから、断片はゲルの大きさ
により分離され、放射能性標識断片は分離される。この
断片は完全なNOSプロモーター領域および５′−非翻訳
領域を含む。

５′−…CTGCA …GACGTのシークエンスをもつ１平滑（ブラント）末端
を有し、 ５′ AATTC− Ｇ−のシークエンスをもつ１粘着（コーヘーシブ）末端
を（EcoR I部位に）有する。

短鎖の長さは約308bpである。

前述のステップはステップ42、44、46として第２図にあ
らわされている。

この断片は第７図に示されるようにpMON40（以下に記
述）に挿入されpMON58を得る。

NPT II遺伝子（pMON40）をもったプラスミドの生起 バクテリアtransposonはTn5と命名されているが、それ
は完全なNPT II遺伝子を含むことが知られ、プロモータ
ー領域および構造シークエンス、３′−非翻訳領域を含
む。NPT II酵素は、カナマイシン、，ネオマイシン、G4
18などの、あるアミノグリコシド抗生物質を不活性化す
る；参照JimenezとDavis、1980。この遺伝子は1.8kb断
片の中に含まれ、ファージラムダbbkan−I DNA（D.Berg
他、1975）を２エンドヌクレアーゼ、Hind III、BamH I
を用いて切断することによって得る。この断片はHind I
IIおよびBamH Iにより切断された公共研究所プラスミ
ド、pBR327に挿入された。第６図に示されるように起因
プラスミドはpMON1001と命名され、約4.7kbである。

NPT II構造シークエンスを運ぶDNA断片の大きさを縮小
するため、出願者は、次の方法でpMON1001プラスミドか
ら約500bpほど削除する。第１にpMON1001をNPT II遺伝
子の外側にある独自のSma1限定部位で分解する。次に、
10−mer合成ヌクレチド連鎖（リンカー） ５′CCGGATCCGG GGCCTAGGCCを Sma1分割部位に挿入する。これはSam1分割部位を除去
し、それをBamH I分割部位で置換する。第２のBamH I分
割部位はすでにあり、新しい分割部位から約500bpであ
る。出願者はBamH Iからプラスミドを分解し、4.2kb断
片から500bp断片を分離し、4.2kb断片を円形化する。起
因プラスミドは、E.coliに挿入され、これはそれからア
ムピシリン、カナマイシンに抵抗性があるとして選択さ
れる。E.coliのクローンコロニーは選択され、第６図に
示されるように、これらの細胞はpMON40と命名されるプ
ラスミドを含んでいる。

前述したステップは第２図にステップ48、50としてあら
わされている。

プラスミドpMON40へのNOSプロモーターの挿入 出願人はpMON40からNPT IIプロモーターを削除し、それ
を第７図に示すごとく次の方法で前記のごときNOSプロ
モーター断片と置き換えた。

あらかじめ開裂と配列決定実験は（Rao及びRogers 197
9、Auerswald他、1980）Bgl II開裂部位がプロモーター
領域と構造配列との間のNPT II遺伝子に存在することを
示した。プラスミドpMON40はBgl IIで消化した。粘着末
端を次に開裂プラスミドをクレノウポリメラーゼおよび
４つのdNTP′ｓと混合することにより満たし、次の平滑
末端を得た。

５′−AGATC GATCT− −TCTAG CTAGA−５′ ポリメラーゼおよびdNTP′ｓを除き、次いで開裂プラス
ミドをEcoR Iで消化した。NPT IIプロモーター領域を含
むより小さい断片を除き、１個のEcoR I末端と１個の平
滑末端を有する大きな断片をのこす。この大きな断片を
前記の、第５図に示したNOSプロモーターを含む308bp断
片と混合した。この断片をリゲートし、E.coliに挿入し
た。E.coliクローンをアンピシリン耐性に対して選択し
た。NPT IIプロモーター領域（細菌プロモーター）のNO
Sプロモーター領域（これは植物細胞においてのみ活性
であると信じられる）での置換えはNPT II構造配列をE.
coli中で不活性ならしめた。36個のカナマイシン感受性
クローンからプラスミドを得た。１個のクローンからの
プラスミドをpMON58と命名し、以下の工程に用いた。

プラスミドpMON58を消化してNOSプロモーター領域、NOS
5′−非翻訳領域およびNPT II構造配列を含む1.3kbのEc
oR I−BamH I断片を得る。この工程は工程56として第２
図に示す。

NOS3′配列をNPT II遺伝子に挿入 「背景技術」で既述したように、真核遺伝子における
３′非翻訳領域の機能は十分理解されていない。しか
し、少なくとも１つの重要な配列、ポリ−アデニールシ
グナルを含むと考えられている。

本発明者の推測によれば、細菌性３′非翻訳領域を有す
る遺伝子は、植物に発現されることが知られている、NO
Sの如き遺伝子由来の３′非翻訳領域を有する同一遺伝
子ほどには植物細胞にて有効に発現されなかったのであ
ろう。したがって、本発明者は既に存在するNPT II3′
非翻訳領域以外に、キメラ遺伝子にNOS3′非翻訳領域を
除きかつ植物細胞にて発現されることが知られている、
目的の３′非翻訳領域でそれを置換することが可能であ
る。各種型の３′非翻訳領域（例えばオクトピン型又は
アグロピン型Tiプラスミドからの３′領域、又は植物細
胞中に通常存在する遺伝子からの３′領域）が、任意の
キメラ遺伝子、任意の特定の植物細胞に使用するのに適
しているか、あるいは望ましいかは本発明方法を使って
通常の実験により、当業者により測定することができ
る。

植物細胞に挿入されるべき構造配列に当然に続く３′非
翻訳領域はその型の植物細胞にてその構造配列の有効な
発現を促進するかどうかは、当業者は常法の実験で測定
することができる。もしそうなら、異なる３′非翻訳領
域をキメラ遺伝子に挿入するのに要する数工程は、本発
明方法を行うために必要としないであろう。

前述した如く、pMON58から、NTP IIの構造的シークエン
スに結合するために適当なMOS3′の翻訳されていない領
域を含むDNAフラグメントを得るために、本発明者は、
第３図に示されたTiプラスミドからの3.4kb Hind III−
23フラグメントを利用した。この3.4kbフラグメントを
分離し、BamH Iを用いてダイジェストして、NOSの構造
的シークエンス〔停止コドン（stop codon）を含んでい
る〕の３′部分およびNOS遺伝子の翻訳されない３′部
分（ポリ−アデニレーションシグナルを含んでいる）を
得た。この1.1kbフラグメントを、Hind IIIおよびBamH
IでダイジェストされたpBR327中に入れた。この結果得
られたプラスミドを、第８図に示すした如くpMON42とし
て示した。

プラスミドpMON42をBamH IおよびRsa Iでダイジェスト
し、所望の翻訳されないNOS3′領域を含む720bpフラグ
メントをゲル中で精製した。この720bpフラグメント
を、他のエンドヌクレアーゼ、Mbo Iでダイジェスト
し、次いでE.coil DNAポリメラーゼＩの大きなフラグメ
ントで処理した。これにより、ポリ−Ａシグナルを含有
する翻訳されないNOS3′領域の大きな部分を含む、Mbo
I平滑末端（blunt ends）を有する260bpフラグメントを
得た。

前記操作を第２図中に工程58によって示した。しかし、
種々な変法を用いることができることは容易に理解され
るであろう。例えば、Hind III−23フラグメントを、Mb
o Iで直接ダイジェストし、翻訳されないNOS3′領域を
有する所望の260bpフラグメントを得ることが可能であ
る。

キメラ遺伝子のアセンブリー キメラ遺伝子のアセンブリーを完成させるために、（翻
訳されないNOS3′領域を含んでいた）260bp Mbo Iフラ
グメントを、pMON58由来の〔NOSプロモーター（promote
r）領域および翻訳されない５′領域およびNPT II構造
的シークエンスを含んでいた〕1.3kb EcoR I−BamH Iフ
ラグメントに、連結することが必要であった。この連結
を容易にしかつフラグメントの配向を調節するために、
本発明者は、260bpフラグメントのMbo I末端をBamH I末
端（フラグメントの５′末端）およびEcoR I末端（フラ
グメントの３′末端）に変換することに決定した。この
工程を実施するために、本発明者は次の方法を使用し
た。

前記260bp Mbo Iフラグメントは、その末端がクレノウ
・ポリメラーゼ（Klenow polymerase）によって平滑末
端に変更されており、M13mp8DNAのSma I切断部位に挿入
されている。前記Sma I切断部位は第８図に示されてい
るように、M13mp8DNAの中に存在する他の色々な切断部
位に囲まれている。Mbo Iフラグメントは、平滑Sam I末
端に、どちらの方向からでも挿入することが可能であ
る。各種の異なるクローンにおけるMbo Iフラグメント
のオリエンテーション（orientation）はMbo Iフラグメ
ントの中に不整的（assymetrically）に存在するHinf I
切断部位を用いて検出された。前記M13mp8DNAの中でEco
R I切断部位近くに存在するNOS3′−非翻訳領域の３′
末端を有するクローンが選ばれた。このクローンは第８
図に示されたように、Ｍ−２クローンと命名された。

前記Ｍ−２クローンから得られる複製型の（二重らせ
ん）DNAはEcoR IおよびBamH Iによって分解され、280bp
フラグメント（断片）が分離された。いっぽう、pMON58
プラスミドがEcoR IおよびBamH Iによって分解され、13
00bpフラグメントが分離された。前記２個のフラグメン
トを結合して、第９図に示されるように、EcoR I末端を
有するNOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子の組立を完了し
た。

前記２個のフラグメントの結合をコントロールする種々
の方法がある。例えば、２個のEcoR I−BamH Iフラグメ
ントは相互にDNAリガーゼを用いて結合させ、EcoR Iを
切断することが可能である。EcoR Iを不活性化させた
後、子牛アルカリ・ホスファターゼ〔calf alkaline ph
osphatase（CAP）〕で処理されたEcoR I末端を有するベ
クター分子を前述の混合物中に添加してもよい。前記混
合物中のフラグメントは、種々のオリエンテーションに
結合させることができる。前述のプラスミド混合物は大
腸菌（E.coli）を形質変換させるために用いられ、所望
のオリエンテーションを有するプラスミドを含む細胞
は、下記に説明されるように選択され、分別された。

pMON38と命名されたプラスミドは、前記のHind III−23
フラグメント（TiプラスミドpTiT37から得られたもの）
を、前記のプラスミドpBR327のHind III切断部位に挿入
することにより創製した。プラスミドpMON38は、固有の
EcoR I部位および大腸菌（E.coli）で発現するアムピシ
リン耐性遺伝子を含んでいる。プラスミドpMON38はEcoR
Iで切断され、それ自身が再結合することを防止するた
めにアルカリ・ホスファターゼで処理される。〔米国特
許第4,264,371（Shine,1981）参照〕。得られたフラグ
メントはpMON58から得られた1300bp NOS−NPT IIならび
に、前述のパラグラフにて説明されたように結合され、
EcoR I−切断して得られたＭ−２から製造された280bp
NOSフラグメントと混合された。前記のフラグメントは
結合され、大腸菌（E.coli）の中に挿入された。完全な
プラスミドとアムピシリン−耐性遺伝を獲得した前記の
大腸菌（E.coli）細胞はアムピシリンを含む板上で選別
された。数個のクローンが選別され、挿入されたキメラ
遺伝子のオリエンテーションは、切断実験により評価し
た。相反するオリエンテーションを有するNOS−NPT II
−NOS挿入物を保有するプラスミドを有する２個のクロ
ーンが選別され、それぞれpMON75およびpMON76と命名さ
れた。キメラ遺伝子はpMON75またはpMON76のいずれか一
方をEcoR Iで分解し、1580bpフラグメントを精製するこ
とによって分離することが可能である。

上記方法はステップ60により第２図上に表される。

これはNOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子の議論を完成す
る。この遺伝子の創製についての追加の情報は実施例に
おいて提供される。このキメラ遺伝子のコピーはプラス
ミドpMON128に含有される；それはEcoR Iを用いてのダ
イジェスションによりpMON128から取出すことができ
る。pMON128を含有するE.coliのカルチャーはアメリカ
ンタイプコレクションで寄託された；このカルチャーは
アクセッション番号39264がわりあてられた。

このキメラ遺伝子の利用性を証明するために、出願人は
それを植物細胞に挿入した。NPT II構造的配列は、植物
細胞において発現され、そしてそれらおよびそれらの子
孫に、植物細胞に対して通常毒であるカナマイシンの濃
度に対する抵抗性を獲得せしめた。

NPT Iキメラ遺伝子の創造 本発明の別の好ましい態様において （１）NOSプロモーター領域および５′非翻訳領域、 （２）NPT Iのコードである構造的配列、及び （３）NOS ３′非翻訳領域 を含むキメラ遺伝子を創造した。

NPT I及びNPT IIはそれらのアミノ酸配列及び基質特異
性において主要な差異を有する異なった且つ区別される
酵素である。例えば、イー・ベック等、1982を参照せ
よ。種々のタイプの植物細胞におけるこれらの２種の酵
素の相対的安定性及び活性はまだ十分に理解されていな
いそしてNPT Iは或るタイプの実験及び植物の形質転換
において使用するためにNPT IIより好ましいかもしれな
い。

完全NPT I遺伝子を含む1200bpフラグメントはpACYC177
（チャン及びコーエン（Chang and Cohen）1978）をエ
ンドヌクレアーゼAva IIで分解することによって得られ
た。Ava IIの末端をクレノウ（klenow）ポリメラーゼで
平滑末端に変換しそして合成リンカー（Syntheticlinke
r）を用いてBanH I末端に変換した。このフラグメント
を第11図に示したように、pBR327から得られたプラスミ
ド中の唯一のBanH Iサイト（site）中に挿入した。得ら
れたプラスミドをpMON66と命名した。

プラスミドpMON57（第11図で示したpBR327のデリーショ
ン（deletion）誘導体）をAva IIで分解した。pMON57の
225bpフラグメントをプラスミドpUC8（フィエイラおよ
びメシング（Vieira and Messing）1982）から得た225b
p Ava IIフラグメント同族体で置き換え、Pst I開裂部
位をもたないpMON57の誘導体を得た。このプラスミドを
pMON67と命名した。

プラスミドpMON58（前述及び第７図に示した）をEcoR I
及びBamH Iで分解し、MOSプロモーターとNP III構造配
列を有する1300bpフラグメントを得た。このフラグメン
トをEcoR I及びBamH Iで分解されたpMON67中に挿入し
た。得られたプラスミドをpMON73と命名し第12図に示し
た。

pMON73をPst IとBamH Iで分解し、NOSプロモーター領域
と５′非翻訳領域を含む2.4kbフラグメントを分離し
た。プラスミドをpMON66（第11図に示した）をXho I及
びBamH Iで分解し、NPT Iの構造配列を含む950bpフラグ
メントを得た。このフラグメントは構造配列の５′末端
で約30のヌクレオチドを欠落していた。欠落塩基を含有
し、適切なPst I及びXho I末端を有する合成リンカーを
作成した。pMON77フラグメント、pMON66フラグメント及
び合成リンカーを一緒に結合せしめて第13図に示すプラ
スミドをpMON78を得た。このプラスミドはNOSプロモー
ター領域と、NPT I構造配列と結合している５′非翻訳
領域を含有する。

ATG開始コドンはNOS構造配列のATG開始コドンが占める
位置と同一位置であった。

プラスミドpMON78をEcoR IおよびBamH Iでダイジェスト
し、キメラNOS−NPT I領域を有する1300bpフラグメント
の製出した。Ｍ−２クローン（前述しかつ第９図に示し
た）からの二重鎖DNAをEcoR IおよびBamH Iでダイジェ
ストし、ポリ−アデニレーションシグナルを有しかつNO
S3′非翻訳領域を有する280bpフラグメントの製出し
た。上部の二種のフラグメントを共にリゲイトし、EcoR
Iでダイジェストされた（前述の）プラスミドpMON38中
に入れられたNOS−NPT I−NOSキメラ遺伝子を造った。
この結果得られた、反対の配向をするキメラ遺伝子のイ
ンサートを有する二種のプラスミドを第14図中にpMON10
6およびpMON107として示した。

プラスミドpMON106またはpMON107のいずれかをEcoR Iで
消化し、キメラNOS−NPT I−NOS遺伝子を含む1.6kb断片
をつくる。この断片を、EcoR Iで消化しそしてアルカリ
ホスファターゼで処理したプラスミドpMON120に挿入す
る。得られたプラスミドは反対方向をもつ挿入物を有
し、第15図に示すごとくpMON130及びpMON131と命名し
た。

NOS−NPT I−NOSキメラ遺伝子を植物細胞に挿入した。
これはカナマイシンに対する耐性を獲得した。これは植
物細胞におけるキメラ遺伝子の発現を示す。

大豆プロモーターによるキメラ遺伝子の製造 本発明の別の望ましい具体例として、（１）大豆中に天
然に存在する遺伝子から得られるプロモーター領域及び
５′非翻訳領域〔この遺伝子はリブロース−1.5−ビス
−ホスフェートカルボキシラーゼの小さなサブユニット
（sbss、大豆の小さなサブユニットとして）をコードす
る〕、（２）NPT IIをコードする構造配列および（３）
NOS3′非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をつくった。

sbss遺伝子は光合成炭素固定に包含される大豆の葉にお
ける蛋白質についてコードする。このsbss蛋白は大豆の
葉において、最も豊富な蛋白質である（全体の葉蛋白質
の約10％にのぼる）ので、sbssプロモーター領域は多産
の転写を惹起する。

大豆のゲノム中のsbss蛋白質をコードするほぼ六つの遺
伝子があると信じられている。sbss遺伝子ファミリーの
メンバーの一つ、SRS1（高度に大豆の葉中に転写されて
いる）はクローンされかつ特徴づけられた。プロモータ
ー領域５′非翻訳領域および構造的配列の部分はプラス
ミドpBR325（Boliver、1978）のEcoR Iサイト中にサブ
クローンされた2.1kb EcoR Iフラグメント上に含有され
る。得られたプラスミドpSRS2.1は米国ジョージア州ア
ゼンス所在ジョージア大学のR.B.Meagher博士からモン
サント社に贈呈された。pSRS2.1からの2.1kb EcoR Iフ
ラグメントは第16図に示されている。

プラスミドpSRS2.1はダムE.coli細胞から造られ、800bp
フラグメントを得るためにMbo Iを以てクリーブ（切
断）された。このフラグメントはBgl IIを以てクリーブ
されたプラスミドpKC7（RaoおよびRogers、1979）中に
インサートされた。得られたプラスミドは第17図に示さ
れるようにpMON121と命名された。

プラスミドMON121はEcoR Iでダイジェストされ、そして
sbssプロモーター領域を含有する1200bpフラグメントは
単離された。別にプラスミドpMON75（前述された第９図
に示された）はEcoR IでおよびBgl IIを以てダイジェス
トされ、そして1250bpフラグメントはNPT II構造配列お
よびNOS3′非翻訳領域を含有して単離された。この二つ
のフラグメントは相溶性のBcl I/Bgl IIオーバーハング
スで結紮されてsbss−NPT II−NOSキメラ遺伝子を含有
する2450bpフラグメントを創出した。このフラグメント
はEcoR IでクリーブされたpMON120中にインサートされ
て、第18図に示されるように、反対のオリエンテーショ
ンを有するキメラ遺伝子を有する二つのプラスミドを創
出した。プラスミドはpMON141およびpMON142と命名され
た。

sbss−NPT II−NOSキメラ遺伝子が、二・三のタイプの
植物細胞に挿入され、該植物細胞がカナマイシン耐性を
持つようにする。

この成功裡の転換は、一つのタイプの植物からのプロモ
ーター領域が、完全に異なる属、科及び目の植物からの
植物細胞内の遺伝子を発現させることができるというこ
とを証明した。

キメラsbss−NPT II−NOS遺伝子はまた、もう一つの有
意な特徴を有していた。シークエンシング実験は、800b
p Mbo I断片がsbss構造配列のATG開始コドンを含有し
ていたことを示した。この開始コドンを除くよりもむし
ろ、出願人は読み取り枠内の開始コドンの後に停止コド
ンを挿入することに決定した。これはジシストロニック
mRNA配列を創り出した。該配列はsbssポリペプタイドの
トランケーテッドアミノ部分と完全NPT IIポリペプタイ
ドとをコードした。NPT IIポリペプタイドの発現は、ジ
シストロニックmRNAが植物細胞内で翻訳されうることを
最初に立証した。

sbssプロモーターは以下に述べられるプラスミドpMON15
4に含有される。このプラスミドを含有するE.coliの培
養物はアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託
されている。この培養物は受付番号39265となった。

BGHキメラ遺伝子の製造 本発明の代わりの好ましい具体例において、（１）sbss
プロモーター領域及び５′非翻訳領域、（２）ボビン
（ウシ）成長ホルモン（BGH）をコードする構造配列、
及び（３）NOS3′非翻訳領域、を含むキメラ遺伝子が製
造された。このキメラ遺伝子は次の如く製造された。

このポリペプチドである牛成長ホルモン（例えば1982年
0 Woychikらの著書参照）をコードする構造配列がpBR32
2−誘導プラスミドに挿入された。得られたプラスミド
をプラスミドCP−１と命名した。このプラスミドをEcoR
IとHind IIIで消化し、上記構造配列を含有する570bp
のフラグメントを得た。二重ストランドになっているＭ
−２ RF DNA（既に記載し第８図に示したもの）をEco
R IとHind IIIで開裂し、ポリ−アデニル化シグナルを
有するNOS3′の翻訳されていない領域を含む290bpのフ
ラグメントを得た。２つのフラグメントをリガーゼで結
合しEcoR Iで消化してEcoR I端部を有する860bpのフラ
グメントを生成させた。これはNOS3′の翻訳されない領
域に結合されたBGH−コーディング構造配列を含んでい
た。このフラグメントをEcoR Iで消化され、アルカリ性
ホスファターゼで処理されているプラスミドpMON38中に
挿入し、第19図に示され、pMON108と命名される新規プ
ラスミドを生成させた。

pMON108をEcoR Iで消化し860bpのフラグメントを得るこ
とにより、そして生成するEcoR Iフラグメント上に平滑
末端（blunt ends）を生じさせるためにKlenowポリメラ
ーゼを用いて、特異なBg IIIレストラクションサイトを
BGH構造配列の５′端部に導入した。このフラグメント
をリガーゼでプラスミドN25（BamH Iサイトに挿入され
たBg III及びXba Iを運搬する合成リンカーを含有するp
BR327誘導体）に結合させた。なおこのプラスミドはXba
Iであらかじめ開裂され、Klenowポリメラーゼで処理さ
れて平滑末端を得たものである（N25はXba Iサイトから
12塩基だけはなれた特異なBg IIIサイトを含有する）。
第20図に示されたオリエンテーションにおいて860bpのB
GH−NOSフラグメントを含有する、生成プラスミドをプ
ラスミドN25−BGHと命名した。このプラスミドはBGH構
造配列の５′端部から約25塩基はなれた特異なBgl II開
裂サイトを含有する。

dam−E.coli細胞より調製されたプラスミドN25−BGHはB
g III及びCla Iにより消化され860bp断片を生成し、こ
の断片はNOS3′の翻訳されない領域についているBGH構
造配列を含んでいた。一方、別にdam−E.Coli細胞より
プラスミドpMON121（既述及び第17図を参照）を調製しC
la I及びBcl Iで消化されsbssプロモーター領域を含む1
100bp断片を生成した。この断片は相応するBcl I/Bgl I
Iオーバーハング（overhang）に於てリガーゼで結合さ
れ、Cla Iで消化されてキメラ的sbss−BGH−NOS遺伝子
を含む約2kbのCla I断片を生成した。この断片は予めCl
a Iにより消化されたpMON120（既述、第10図参照）にイ
ンサートされた。第21図に示される如く生成されたプラ
スミド、逆方向に（inoppositedirections）キメラ的遺
伝子をインサートされたものはpMON147及びpMON148と命
名された。

第22図に示す方法で別のキメラ的BGH遺伝子、即ち （１）NOSプロモータ領域及び５′非翻訳領域 （２）BGHの為のコードである構造配列、及び （３）NOS3′非翻訳領域 を創製した。

プラスミドpMON76（上述及び第９図参照）はEcoR I及び
Bgl IIで消化されNOSプロモータ領域及び５′非翻訳領
域を含む308bp断片を生成した。dam−E.coli細胞より調
製されたプラスミドN25−BGH（上述及び第20図参照）は
Bgl II及びCla Iにより消化されBGH構造配列及びNOS非
翻訳領域を含む900bp断片が生成された。この２断片は
リガーゼで結合されEcoR I及びCla I端をもつ断片の中
にキメラ的NOS−BGH−NOS遺伝子が得られた。この断片
はpMON120をEcoR I及びCla Iで消化して得られた8kb断
片と結合された。結果として生成したプラスミドはpMON
149と命名され第22図に示されている。

キメラNOS−EPSP−NOS遺伝子の創製 他の、好ましい具体例として、（１）NOSプロモータ領
域と５′非翻訳領域、（２）大腸菌酵素、５−エノール
ピルビルシキメート−３−リン酸シンテーゼ（EPSP酵
素）の暗号となる構造配列、（３）NOS3′非翻訳領域と
から成るキメラ遺伝子を創製した。

EPSPシンテーゼは、モンサント社から「ラウンドアッ
プ」の登録商標で市販されている除草剤、glyphosateの
標的酵素と考えられている。glyphosateはEPSPシンテー
ゼ活性を抑制することが知られており（Amrhein他、198
0）、細菌中のEPSPシンテーゼ遺伝子の増殖が、そのgly
phosateに対する耐性を増大することも知られている。
それ故、植物中のEPSPシンテーゼ活性の水準を増加する
ことが、形質転換された植物に、glyphosate耐性を付与
するのであろう。glyphosateは大抵の植物に有毒である
から、これは雑草の防除に有益な手段を与える。EPSPシ
ンテーゼ活性を増大する様に形質転換された、目的の作
物の種子を、畠に播く。glyphosateを、形質転換されな
い植物を全部、絶滅する濃度で畠に施し、形質転換され
た植物を、被害を受けずに残すことが出来よう。

EPSPシンテーゼ遺伝子は、次の方法を含む各種の方法で
単離することが出来る。大腸菌DNAのHind III切断によ
り作られた各種のDNA断片を有するλファージライブラ
リを創製することが出来る。例えばManiatis他、1982を
参照。

EPSPシンテーゼ遺伝子は、芳香族アミノ酸の生成に関与
する遺伝子の一種である。これらの遺伝子は「アロ」遺
伝子と呼ばれ、EPSPシンテーゼはaro Aと呼ばれる。機
能的アロ遺伝子を含まない細胞はアロー細胞と呼ばれ
る。アロー細胞は通常、芳香族アミノ酸を補給した培地
で生育されなければならない。Pittard及びWallis、196
6を参照。

EPSPシンテーゼ遺伝子を持たない変異大腸菌細胞に感染
させるのに、各種のHind III断片を持つ異なったλファ
ージを用いることが出来よう。感染したアロー細胞を芳
香族アミノ酸を含まない培地で培養し、この様な培地で
生育し得る形質転換されたアロ^＋クローンを選択するこ
とが出来よう。この様なクローンはEPSPシンテーゼ遺伝
子を含む可能性が強い。この様なクローンからファージ
粒子を単離し、この様なファージからDNAを単離するこ
とが出来よう。ファージDNAは１、またはそれ以上の制
限エンドヌクレアーゼで切断され、何回かの分析過程に
より、EPSPシンテーゼ遺伝子を含む断片を単離すること
が出来よう。

上記に要約したのと同様の操作を用いて、申請人は、全
大腸菌EPSPシンテーゼ遺伝子を含む11kbのHind III断片
を単離した。この断片をBg IIIで消化して、全EPSPシン
テーゼ遺伝子を含む、3.5kbのHind III−Bg III断片を
生成させた。この3.5kb断片をプラスミドpKC7（Rao及び
Rogers、1979）に挿入して、第23図に示すプラスミドpM
ON4を生成させた。

プラスミドpMON4をCla Iで消化して、EPSPシンテーゼ構
造配列を含む2.5kbの断片を得た。この断片をCla Iで消
化したpBR327に挿入し、第23図に示すpMON8を創製し
た。

pMON8をBamH IとNde Iで消化して、4.9kb断片を得た。
この断片は、EPSPシンテーゼ構造順列のアミノ末端を記
号化する約200のヌクレオチドを欠いていた。

不在のヌクレオチドは、第24図に示す様にpMON8から得
られるHinf I/Nde I断片と、（１）EPSPシンテーゼの出
発コドンと最初の３つのヌクレオチド、（２）特異Bg I
IIサイト、（３）適当なBamH IとHinf I末端を含む合成
オリゴヌクレオチド順列を連結することによって置き換
えられた。その結果出来上がったプラスミド、pMON25
は、そのままのEPSPシンテーゼ構造順列と、出発コドン
の付近に位置する特異なBamH IとBg IIIとを含んでい
る。二重鎖Ｍ−２ DMA（前述し、第８図に示した）をH
ind IIIとEcoR Iで消化し、NOS3′非翻訳領域とポリア
デニル化信号を含む290bp断片を得た。この断片を、Eco
R IとHind IIIで消化したpMON25プラスミドに導入し、N
OS3′非翻訳領域に接合したEPSP構造順列を含むpMON146
（第25図に示す）と呼ばれるプラスミドを創製した。

pMON146をCla IとBg IIIで切断し、NOS3′非翻訳領域に
接合したEPSP構造配列を持つ2.3kb断片を得た。pMON76
（前述し、第９図に示した）をBg IIIとEcoR Iで消化
し、NOSプロモーター領域と５′−非翻訳領域を含む310
bp断片を創製した。これらの断片をCla IとEcoR Iで消
化したpMON120（第10図に前述し、示した）と混合し、
混合物を連結した。その結果、出来上がったプラスミド
をpMON153と命名し、第26図に示す。このプラスミドは
キメラNOS−EPSP−NOS遺伝子を含む。

キメラsbss−EPSP−NOS遺伝子を含むプラスミドは第27
図に示す様に、次の方法で作られた。プラスミドpMON14
6（前述し、第25図に示した）をCla IとBg IIIで消化
し、2.3kb断片を精製した。この断片は、ポリアデニル
化信号を持つNOS3′非翻訳領域に接合したEPSPシンテー
ゼ構造配列を含んでいた。プラスミドpMON121（上記に
前述し、第17図に示した）をCla IとBC IIで消化し、1.
1kb断片を精製した。この断片はsbssプロモーター領域
と５′−非翻訳領域とを含んでいる。２種の断片を混合
し、T4DNAリガーゼで連結し、次いでCla Iで消化した。
これによって共存的Bgl IIおよびBcl I末端で結合した
キメラsbss−EPSP−NOS遺伝子が創製された。このCla I
末端を持つキメラ遺伝子をCla Iで消化され、仔牛アル
カリ・フォスファターゼ（CAP）で処理されたプラスミ
ドpMON120に挿入した。この混合物をT4DNAリガーゼで連
結した。その結果、出来上がった断片とプラスミドの混
合物をスペクチノマイシン耐性のために選択された大腸
菌細胞を形質転換するのに使用した。耐性細胞の集落を
単離し、この集落中のプラスミドを、第27図に示す様
に、pMON154と呼ぶことにした。

pMON154を含む大腸菌の培養物を、American Type Cultu
re Centerに寄託した。この培養物は受入番号39265を与
えられた。

CaMV（19S）−NPT II−NOS遺伝子の創製 この発明の他の好ましい具体例として、次の要素を含む
キメラ遺伝子が創製された。

1. プロモータ領域と、p66蛋白質の暗号となるCaMV（1
9S）遺伝子由来の５′非翻訳領域 2. NPT II遺伝子の所要のATG出発コドンの直ぐ内側のT
GA停止配列と同じ枠の中のATG出発コドンと、何個かの
内部ATG順列を含むVaMV（19S）遺伝子からの部分的暗号
配列 3. ネオマイシン・フオスフォトランスフェラーゼII
（NPT II）遺伝子由来の構造配列。この順列はNPT II構
造配列内のTGA配列と同じ解読わく内の疑似ATG配列によ
って先行された。

4. Nopalineシンテーゼ（NOS）遺伝子由来のポリアデ
ニル化信号を含む３′非翻訳領域 ここでCaMV（19S）−NPT II−NOS遺伝子と呼ぶキメラ遺
伝子を、プラスミドpMON120に挿入し、第29図に示し、
９例に記述するpMON156と呼ばれるプラスミドを創製し
た。プラスミドpMON156を、A.tumefaciens細胞に挿入
し、そこでA.tumefaciens細胞内のTiプラスミドとの単
回交叉により、共同組込みTiプラスミドが形成された。
共同組込みプラスミド中のキメラ遺伝子は、Tiプラスミ
ド中の修正Ｔ−DNA領域内にあり、左右のＴ−DNA境界に
囲まれていた。

同様のキメラ遺伝子が、第32図に示し、10例に記述する
pMON155と呼ばれるプラスミド中で創製され、組み合わ
された。このキメラ遺伝子は２つの例外の点を除いてpM
ON156内の遺伝子に似ていた。

1. ３個の解読わくの全部に停止コドンを有するオリゴ
ヌクレオチドリンカーが、CaMV（19S）部分的構造順列
とNPT II構造配列の間に挿入されたこと。

2. NPT II構造配列の５′側の疑似ATG順列が除かれた
こと。

このキメラ遺伝子の構造を、10例に記述した。この遺伝
子はA.tumefaciens細胞に、次いで植物細胞に挿入され
た。その発現水準は、より高濃度のカナマイシンでの生
長で定量される様に、pMON156内の同様な遺伝子より
も、明らかに高かった。共同組込みTi::pMON155プラス
ミドを含むA.tumefaciens細胞は、American Type Cultu
re Centerに寄託され、受入番号39336が与えられた。

キメラCaMV（32S）−NPT II−NOS遺伝子の創製 この発明の、他の好ましい具体例では、 （１）32S CaMV mRNAの転写を起こすプロモーター領
域 （２）NPT IIの暗号となる構造配列 （３）NOS3′非翻訳領域 より成るキメラ遺伝子が創製された。

このキメラ遺伝子の組み合わせは、11例と、第33〜37図
に記述されている。この遺伝子は植物細胞に挿入され、
その植物をカナマイシン耐性にした。

ペチュニア植物は通常、CaMGに感染しない。この技術に
卓越した人々は、一定の実験手段によって、何か特別の
植物ビールス・プロモーター（CaMVプロモーターの様
な）が、そのプロモーターが得られたビールスの通常の
宿主範囲以外の植物細胞を含む、何等かの型の植物細胞
内で、満足すべき水準で機能するか否かを決定すること
が出来よう。

キメラ遺伝子を植物細胞に挿入する方法 異種のDNAを植物細胞中に挿入するいくつかの方法が知
られている。出願人によって用いられた一つの方法は、
キメラ遺伝子を、A.tumefaciensを担体としたTiプラス
ミドに挿入し、A.tumefaciens細胞を植物と共存培養す
る方式を含んでいた。キメラ遺伝子を持つＴ−DNAの一
片を植物ゲノムに移し、形質転換を起こさせた。この方
法は「植物細胞の形質転換のためのプラセミド」Serial
No.458,411と「遺伝的に形質転換された植物」Serial
No.458,402の1983年１月17日付出願の２つの米国特許出
願に詳細に記述されている。

以下に各種の他の方法を記す。これらの方法は、今日迄
に達成された形質転換の効率は低いものの、理論的に、
本発明のキメラ遺伝子を植物細胞に挿入出来る方法であ
る。本発明のキメラ遺伝子（特に、選択標識として利用
されるNPT I及びNPT IIの様なキメラ遺伝子）はDNAを植
物や植物細胞に挿入する方法の研究を便ならしめると思
われる。

1. DNAを植物細胞に挿入する他の一つの技術は、リポ
ゾームとも呼ばれる脂質小胞の利用を含む。リポゾーム
は１またはそれ以上のDNA分子をカプセル化するのに用
いられる。リポゾームとそのDNA含量は植物細胞に取り
入れられる。例えばLurquin、1981を参照。若しも、挿
入されたDNAが植物ゲノムに併合され、複製され、遺伝
されれば、植物細胞は形質転換される。

今日までリポゾームを用いてDNAを植物細胞に届けよう
という努力は大きな成果を挙げていない（Fraley及びPa
paphadjopoulos、1981）。比較的小さなDNA分子だけ
が、リポゾームで植物細胞に移し換えられているが、発
現されているものはない。しかし、リポゾーム送達技術
は、活発に開発されつつあり、本発明のキメラ遺伝子を
含むプラスミドをリポゾームを含む手段で植物細胞に移
し換えるために、種々の方法が開発される可能性が強
い。

2. 他の別の技術は、植物細胞を、（ａ）poly−Ｌ−or
vithine（Davey他、1980）の様な多価カチオン物質か、
（ｂ）燐酸カルシウム（Krens他、1982）で錯体としたD
NAと接触させることを含む。今日まで達成された形質転
換の効率は低いが、これらの方法ではいまでも活発に研
究されている。

3. 所要のプラスミドを含む細菌の植物細胞との融合を
含む方法が開発された。この様な方法は細菌をスフェロ
プラスに、植物細胞を原形質体に転換することを含む。
これらの方法の両方とも、酵素消化を用いて、細菌及び
植物細胞から細胞壁バリヤーを除くのである。２つの細
胞型は、その後、ポリエチレングリコースの様な化学薬
品に暴露することによって融合される。

Hasezawa他、1981を参照。今日までこの方法で、達成さ
れた形質転換効率は低いが細胞及び動物細胞の融合を用
いる同様の実験は良い結果を生んでいる。Rassoulzadeg
an他、1982を参照。

4. 遺伝的に動物細胞を形質転換するのに用いられて、
成功した他の２つの方法は（ａ）微小ガラス針を用いる
DNAの動物細胞への直接微量注入（Capecchi、1980）
と、（ｂ）動物細胞によるDNAの電流誘導取り込み（Wor
g及びNeuwann、1982）を含む。これらの技術の何れも
が、今日まで植物細胞の形質転換に用いられていない
が、本発明のキメラ遺伝子を植物細胞に挿入するのに有
用であろう。

植物レギュレーターを同定するためのキメラ遺伝子の利
用 本発明のキメラ遺伝子をDNA配列の同定、単離、研究に
用いて、これらが植物細胞内で遺伝子の発現の促進や他
の調製が可能であるかどうかを決定することが出来る。

例えば、どの様な細胞からのDNAでも部分ヌクレアーゼ
消化や他の方法を用いて、断片にすることが出来る。DN
A断片は、構造配列のATG出発コドンから、５′の方向に
位置する特異切断部位で切断したキメラ遺伝子の複数の
コピーと混合される。出来れば、構造配列は若し適当に
転写されれば、ある種の抗生物質に対する耐性を宿主に
与えるポリペプチドの様な選択標識に、翻訳されるとよ
い。DNA混合物は連結されて、プラスミドを形成し、そ
のプラスミドは、その抗生物質に感受性のある植物細胞
を形質転換するのに用いられる。この細胞は、その抗生
物質の適当な濃度を含む培地上で培養される。植物細胞
は構造配列が転写され、抗生物質に耐性を与えるポリペ
プチドに翻訳される場合にのみ、生存し、再生する。こ
れは挿入されたDNA断片が遺伝子プロモーターの役割を
果たす場合にのみ、起こると考えられる。耐性のある集
落は更に、評価を受けて、その通りであるか否かを決定
するのに用いられる。

この技術を用いて、細菌、酵母、カビ、藻やその他の微
生物や動物細胞のプロモーター領域を評価し、これらが
又、植物細胞の各種の型で遺伝子プロモーターとして作
用するか否かを決定することが出来る。又、ある型の植
物からのプロモーターを他の植物細胞の型の中で評価す
ることも出来る。同じ様な方法で、キメラ遺伝子の切断
サイトを変えることにより、どの様なDNA配列でも、
５′非翻訳領域、３′非翻訳領域、又は他の調整配列の
如何なる型でも、その挙動を評価することが出来る。

若し、望まれれば各種DNA配列の調整効果の評価方法に
部分キメラ遺伝子を用いることが出来る。例えば、NOS
プロモーター領域とNOS5′非翻訳領域の両方又は一方を
NOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子から除くことが出来る。
これにより、NPT II構造配列の前に切断サイトを有する
がプロモーター領域をもたないキメラ遺伝子を創製する
ことが出来る。

挿入されたDNA断片が、（１）構造配列の解読わくを変
えるか、（２）ポリペプチドのアミノ端末を変える出発
コドンを含む場合は、オリゴヌクレオチドを切断サイト
と構造配列の出発コドンの間に置くことが出来る。オリ
ゴヌクレオチドはすべての３の解読わくに停止コドンを
含むであろう。それ故、若しも、出発コドンが挿入され
たDNA断片に含まれていれば、遺伝子は２シストロン遺
伝子であろう。最初のポリペプチドの末端は挿入された
出発コドンの解読わくの中にあるどちらかの停止コドン
になるであろう。第２の出発コドンは選択標識酵素であ
る別のポリペプチドの翻訳を始めるであろう。

種々の句の意味 請求の範囲に用いられるいろいろな句は、請求の範囲の
意味、および適用範囲を明らかにするために、定義され
記述されなければならない。

どの特殊用語でもその意味は、この出願の本文及び図に
関して説明されなければならない。特に、文献において
矛盾して用いられるいろいろな用語が展開することが認
められる。たとえば、いろいろな意味が“プロモータ
ー”という語を発展させ、その語のあるものは５′−非
翻訳領域を含み、またあるものは含まないということに
なる。説明によっておこる問題を努力してさけるため
に、出願者は種々の用語を定義するよう試みた。しかし
ながら、そのような定義は仮定されることなく、あるい
は包括的であるようにも意図されることなく、適切な文
献に照らして説明されなければならない。

“キメラ遺伝子”の語は、異なる独特な遺伝子から誘導
された、最低２つの部分を含む遺伝子とみなす。この中
に用いられているように、この語は集合、合成、あるい
はその逆に人工の努力として生み出された遺伝子、ある
いはそこから複製または誘導されるいずれかの遺伝子に
限定される。“人工の努力”は、もしもそれが人間的努
力、あるいは介在により引き起こされ、高められ、支配
された状態のもとで起こった過程ならば、酵素の、細胞
の、また他の生物学的過程を含む；すなわち自然な過程
で単に作られただけの遺伝子は除外する。

ここに用いられているように、“遺伝子”は当業者によ
り遺伝子として順当に認められているDNAの断片に限定
される。たとえばプラスミドは植物誘導プロモーター領
域及び異種構造シークエンスを含むが、もし、それら２
つの断片がプロモーター領域が構造シークエンスの転写
を起こすようなプラスミドの中で互いに位置しないなら
ば、その時、その２つの断片は同じ遺伝子に含まれたも
のとしてみなされることはない。

この発明はキメラ遺伝子に関するものであり、そのキメ
ラ遺伝子は、それらプロモーター領域に関しては“異
種”である構造シークエンスを有する。これは少なくと
も２型のキメラ遺伝子を含む。

1. 植物細胞とは異種の遺伝子のDNA、たとえばもしも
哺乳類蛋白またはバクテリア蛋白を暗号化する構造シー
クエンスが植物プロモーター領域に連らならせられるな
らば、そのような遺伝子は異種とみなされる。

2. 異なる植物プロモーター領域により自然に助長され
る植物細胞遺伝子、たとえば、もしも植物蛋白を暗号化
する構造シークエンスが順当に少量のプロモーターによ
って支配されれば、構造シークエンスは多産プロモータ
ーと一緒にされる。これは、より多量の構造シークエン
ス転写をひきおこし、それにより高い蛋白をもった植物
の誘導が十分になる。そのような構造シークエンスは多
産プロモーターに関しては異種とみなされる。

しかしながら、この発明にとって完全な構造シークエン
スが完全なプロモーター領域に異種であることは重要で
はない。たとえば、この発明のキメラ遺伝子は、“融合
蛋白”、すなわち２つの別個の構造シークエンスから誘
導されたポリペプチド部分を含む蛋白に翻訳されるよう
に創製されてもよい。これは全部あるいは一部の異種構
造シークエンスを、植物遺伝子の構造シークエンス中
の、その構造シークエンスの開始コドンの後方のどこか
に挿入することにより完成される。

この中に用いられるように、“特定の遺伝子から誘導さ
れたプロモーター領域”という句は、１ないしそれ以上
の部分のプロモーター領域が特定の遺伝子から誘導され
ている場合のプロモーター領域をその意味に含む。たと
えば、１ないしそれ以上の特定の植物誘導プロモーター
領域の部分（第１図に示される介在領域８のような）
は、特定の型の宿主細胞内において、得られたキメラ遺
伝子の発現を低減することのない異種構造シークエンス
を含む遺伝子のような、異なる遺伝子から誘導された１
ないしそれ以上のシークエンスで置換されることが見出
されるであろう。そのようなキメラ遺伝子は植物誘導結
合領域２、介在領域４、ならびに異種介在領域８、５′
−非翻訳領域10、および構造シークエンス14があとにつ
く転写開始シークエンス６を含む。そのようなキメラ遺
伝子はこの発明の範囲内である。

この中に用いられているように、“〜から誘導された”
という句は、広く解釈される。たとえば、構造シークエ
ンスは次のことを含むいろいろな過程により特定な遺伝
子“から誘導”される： 1. 遺伝子は、プラスミド内挿入および、細胞培養によ
るプラスミド複製、試験管内複製、また他の方法などの
ような種々の方法により再生産され、求められるシーク
エンスはエンドヌクレアーゼ分解のような種々の方法に
よりDNAコピーから得られる； 2. 遺伝子により暗号化されたmRNAを得、mRNAから相補
的DNAを調製し、次いでcDNAをエンドヌクレアーゼ消化
するなどの種々な方法で処理する； 3. 構造シークエンスにおける塩基配列をエンドヌクレ
アーゼマッピングあるいはMaxam−Gibert法のような種
々の方法で決定してもよい。求められるシークエンスの
複製または近似物であるDNA鎖を化学合成、またオリゴ
ヌクレオチド断片の結紮法により創製してもよい。

4. 塩基の構造シークエンスは、遺伝子コードをポリペ
プチド内のアミノ酸残基シークエンスに適合することに
よりもとをたどれる。一般に、いろいろなDNA構造シー
クエンスが重複する遺伝子コードのためにポリペプチド
に対して決定される。これらの種々のもののうちから、
塩基の求められるシークエンスが選択され、その（選択
された）シークエンスを持つDNA鎖が作られる。

もし求められるなら、どのDNAシークエンスも存在塩基
を、ある塩基と代えることにより修飾される。そのよう
な修飾は多くの理由で行われる。たとえば、シークエン
ス内の１またはそれ以上の塩基は特殊なエンドヌクレア
ーゼの分割部位を作り、あるいは削除するために他の塩
基と置換される。もう１つの例としてシークエンス内の
１ないしそれ以上の塩基がメッセンジャーRNAの“茎と
輪（ステムとループ）”構成の発生を低減するために置
換される。そのような修飾シークエンスは、この発明の
範囲内にある。

構造シークエンスはイントロンとエクソンを含む；その
ような構造シークエンスはDNAあるいは第一転写mRNAか
ら誘導される。別法として、１個以上のイントロンの除
去処理を受けたmRNAから構造シークエンスを誘導するこ
ともできる。

出願人はプラスミドpMON128およびpMON154を含むE.coli
細胞の２つの培養物をAmerican Type Culture Collecti
on（ATCC）に預けている。これらの細胞はATCC受託番号
39264及び39265として、それぞれ寄託されている。出願
人はいずれの培養物にも関連する特徴を持つ微生物培養
物を請求した。この中に用いられるように、細胞培養物
の“関連する特質”は、培養を、ここに含まれる情報に
より明らかにされ、示唆され、あるいは可能にされる用
法にかなったものとするような特徴に限定される。培養
物の多くの特質は当業者に知られた技術により修飾され
る；たとえば、細胞内への特定のプラスミドあるいは遺
伝子の挿入により特定の抗生物質に対して細胞が耐性を
付与され、あるいは、pMON128またはpMON154プラスミド
が指示細胞から移動され、また細胞の異なる菌株内に挿
入される。そのような変化はこの発明の範囲内にある。
しかもそれは非常に改良され、その改良が、この細胞培
養に接する多くの研究を経て起こることは疑う余地がな
い。

当業者は、ここに記述される特定の実施態様の多数の等
価等を、通常程度を越えない実験を使用して認識し、ま
たは確認することができるであろう。そのような等価物
はこの発明の範囲内にある。

例 例1:pMON1001の創製 50マイクログラム（ug）のラムダファージbbkan−1DNA
（Berg他、1975）は、100単位のHind III（すべての制
限的エンドヌクレアーゼはNew England Biolabs.Beverl
y,MAで得られ、別な方法で書かれていなければ、供給者
の指示に従って緩衝剤と共に用いられる）を用いて２時
間、37℃で分解される。加熱不活性化（70℃、10分間）
後、3.3kb Tn5 Hind III断片はスクロース勾配上で純
化される。1ugの純化されたHind III断片はBamH I（２
単位、１時間、37℃）を用いて分解され、1.8kb断片を
生起させる。エンドヌクレアーゼを加熱不活性化する。

プラスミドpBR327（Soberon他、1981）、1ugは、Hind I
IIおよびBamH I（各２単位、２時間、37℃）を用いて分
解される。分解に続きエンドヌクレアーゼは加熱不活性
化され、分割されたpBR327DNAはBamH I−Hind III Tn5
断片に加えられる。0.7mMの濃度へのATP添加後、10単位
のT₄DNAリガーゼ（Murray他、1979の方法により調製）
が加えられ、反応は16時間、12−14℃で続けられる。１
単位のT₄DNAリガーゼは５分間、22℃で1ugのHind III−
分割pBR327プラスミドの90％環化をなす。

結紮（連結）されたDNAはCaC₁₂−ショックE.coliC600re
c A56細胞（Maniatis他、1982）を変換するのに用いら
れる。ルリアブロス（LB）における１時間、37℃の発現
後、細胞は200ug/mlアムピシリンおよび40ug/mlカナマ
イシンを含む固体LB培地板上に広げられる。37℃、16時
間の培養保育に続き数百のコロニーが出現する。プラス
ミドミニプレプDNAはこれらのうち６コロニーから準備
された（Ish−HorowiczとBurke、1981）。エンドヌクレ
アーゼ分解は全６プラスミドが1.8kb Hind III−BamH
I断片を保持することを示す。これらの単離物の１つが
第６図に示されるようにpMON1001と命名される。

例2:pMON40の創製 5ugプラスミドpMON1001（例１に記述）は、Sma Iを用い
て分解される。反応はフェノール抽出により終了、DNA
はエタノールにより沈殿される。BamH IリンカーCCGGAT
CCGG（0.1ug）はATPおよびT₄ポリヌクレオチドキナーゼ
（Bethesda Research Laboratory,Rockville,MD）用い
てリン酸化されているが、それは1ugのpMON1001断片に
加えられる。混合物はT₄DNAリガーゼ（100単位）を用い
て18時間、14℃で処理される。DNAリガーゼを不活性化
するために、70℃10分間加熱後、DNA混合物はBamH Iエ
ンドヌクレアーゼ（20単位、３時間、37℃）を用いて分
解され、電気泳動により0.5％アガロースゲル上で分離
される。4.2kb Sma I−BamH Iベクター断片に対応する
バンドをゲルから切出した。4.2kb断片はガラスビース
上で吸着により純化され（VogelsteinとGillespie、197
9）、エタノール沈殿され、ATPを含む20ulのDNAリガー
ゼ緩衝剤中に再懸濁される。T₄DNAリガーゼ（20単位）
が加えられ、混合物は、15時間、室温でインキュベート
される。DNAはルビジウム塩化物ショックE.coliC600細
胞と共にDNA形質転換のために混合される（Maniatis
他、1982）。１時間、37℃ LB中で発現後、細胞は200u
g/mlのアムピシリンおよび20ug/mlカナマイシンを含むL
Bプレート上に広げられる。プレートは37℃、16時間、
インキュベートされる。12のアムピシリン抵抗、カナマ
イシン抵抗コロニーが選ばれ、2ml培養を育成し、ミニ
プラスミド調製が行われる。プラスミドのエンドヌクレ
アーゼマッピングは12のうちの10はSma I部位を有さ
ず、単一のBamH I部位を含むことを示し、かつ適切な大
きさ、4.2kbを有していた。10コロニーの１つからのプ
ラスミドは第６図に示されるように、pMON40と命名され
る。

例3:NOSプロモーター断片の創製 次のシークエンス５′−TGCAGATTATTTGC−３′を有する
オリゴヌクレオチドが合成される（BeaucageとCarruthe
r、1981、Adams他1982により変更を加えた）。このオリ
ゴヌクレオチドは³²p放射能ラベルを含む。この放射能
ラベルは５′シミジン残基にポリヌクレオチドキナーゼ
により加えられる。

S1Aと称されるM13mp7誘導体はWashington University,S
t.Louis,MOのM.BevanとM.−D.Chiltonとにより出願人に
提供された。出願人の知識と信念のうち最良のものはS1
A DNAが次の方法により得られたことである。pTiT37プ
ラスミドはHind IIIを用いて分解され、3.4kb断片を単
離してHind III−23断片と命名した。この断片はSau3a
を用いて分解され、Sau3a末端を有する344bp断片を生起
する。この断片は二重鎖の複製可能な形態のM13mp⁷ファ
ージベクター由来のDNAに挿入され（Messing他、198
1）、それはBamH Iを用いて切断される。344bp挿入のあ
る２つの組みかえファージはNOSプロモーター断片のア
ンチセンス鎖を含むものの１つを結果として生ずる。組
みかえファージはS1Aと命名され、クローンコピーが出
願人に与えられる。

出願人はS1A DNA（14.4ug;6pmol）の単鎖形態を調製
し、上述の20pmolの14−merオリゴヌクレオチドと共に
アニールする（10分間、70℃、後室温にさます）。オル
ゴヌクレオチドは第４図および第５図で示されるように
塩基286−300の、Sau3a挿入物にアニールする。

200ulのS1Aテンプレートおよびアニール化オリゴヌクレ
オチドは、4dNTP′Ｓ（1mM、2.5ulの最終濃度で出現）
と50ulのKlenowポリメラーゼと共に混合される。混合物
は30分間、室温でインキュベートされる。この間ポリメ
ラーゼはdNTP′ｓをオリゴヌクレオチドの３′末端に加
える。ポリメラーゼは加熱不活性化され（70℃、３分
間）、Hae III（160単位）が加えられる。混合物はイン
キュベートされ（１時間、55℃）、Hae IIIは不活性化
され（70℃、３分間）、4dNTP′ｓ（1mM、12u）およびT
₄DNAポリメラーゼ（50単位）が加えられる。混合物はイ
ンキュベートされ（１時間、37℃）、ポリメラーゼは不
活性化（70℃、３分間）される。

これは約570bpの断片を生ずる。EcoR I（150単位）が加
えられ、混合物はインキュベート（１時間、37℃）さ
れ、EcoR Iは不活性化（70℃、３分間）される。

分別された混合物は25％グリセロールを含む６％アクリ
ラマイド上にて分けられる。オートラジオグラフィーは
大きさ約310bpの放射能標識帯を示す。この帯が切出さ
れる。前述の手順は第５図に示される。

例4:pMON58の創製 5ugプラスミドpMON40（例２に記述）はBgl II（10単
位、1.5時間、37℃）を用いて分解され、Bgl IIは不活
性化（70℃、10分間）される。4dNTP′ｓ（1mM、12ul）
およびKlenowポリメラーゼ（８単位）は加えられ、混合
物はインキュベートされ（37℃、40分間）され、ポリメ
ラーゼは不活性化（70℃、10分間）される。EcoR I（10
単位）が付加され、インキュベート（１時間、37℃）さ
れて、ウシアルカリフォスファターゼ（CAP）が付加さ
れ、インキュベート（１時間、37℃）される。約3.9kb
の断片はNA−45膜を用いてアガロースゲル上で純化され
る（ScheicherとScheull,Keene NH）。断片（1.0pM）
は例３に記されたようにNOSプロモーター断片（0.1p
M）、T₄DNAリガーゼ（100単位）と共に混合される。混
合物はインキュベート（４℃、16時間）される。得られ
たプラスミドはE.coli細胞に挿入され、そのE.coli細胞
は200ug/mlアムピシリンを含む媒質上で選ばれる、36ク
ローンAmp^Rコロニーは選択され、ミニプレプラスミドは
これらのコロニーから作られる。１コロニーからのプラ
スミドは308bpのEcoR I−Bgl II断片、308NOS断片に保
持される新たなSst II切断部位、および新たなPst I部
位を示した。このプラスミドはpMON58と命名され、第７
図で示されるようにpMON58DNAが上述のように調製され
る。

例5:pMON42の創製 プラスミドpBR325−Hind III−23はプラスミドpBR325の
誘導体であり、（Bolivar、1978）Hind III部位にpTIT3
7のHind III−23断片を保持するのであるが（第３図参
照）。それはWashington University,St.Louis,MOのM.
BevanとM.−D.Chiltonにより出願人に提供された。この
プラスミドのDNAを調製し、30ugをHind III（50単位）
とBamH I（50単位）とを用いて分解する。1.1kb Hind
III−BamH I断片はアガロースゲル電気泳動後ガラスビ
ーズ上の吸着により純化される（VogelsteinとGillespi
e、1979）。純化された断片（0.5ug）はpBR327の2.9kb
Hind III−BamH I断片に加えられる。DNAリガーゼ（2
0単位、４時間、22℃）で処理後、得られたプラスミド
はE.coli600細胞に挿入される。200ug/mlのアムピシリ
ンに対して起こる耐性クローンは固体媒質上で選択され
る:220クローンが得られる。ミニプレプラスミドDNAは
これらのクローンのうちの６クローンから作られ、Hind
IIIとBamH Iを用いて分解後1.1kb断片の存在について
テストされる。正しい挿入を証明する１プラスミドはpM
ON42と命名される。プラスミド pMON42DNAは先の例で
記されたように準備される。

例6:M13クローンＭ−２の創製 dam−E.coli細胞から調製された75ugプラスミドpMON42
（例５に記述）は、Rsa IおよびBamH I（各50単位、３
時間、37℃）により分解され、720bp Rsa I−BamH I断
片はNA45膜を用いて純化される。純化720bp BamH I−R
sa I断片のうち8ugはMbo Iを用いて分解（10分間、70
℃）され、末端はDNAポリメラーゼＩの巨大Klenow断片
および４種のdNTPを用いて補填により平滑化される。次
いで0.1ugの得られたDNA混合物は、あらかじめSma Iに
より分解された（１単位、１時間、37℃）0.05ug M13m
p8およびウシアルカリホスファターゼ（0.2単位）に加
えられる。結紮（10単位T₄DNAリガーゼ16時間、12
℃）、およびE.coli JM101細胞の感化後、数百の組み
かえファージが得られる。二重のRFDNAは12の組みかえ
ファージ保有クローンから調製される。RFDNA（0.1ug）
はEcoR I（１単位、１時間、37℃）を用いて分割され、
³²p−dATPとKlenowポリメラーゼを用いて末端標識化さ
れBamH I（１単位、１時間、37℃）を用いて再分割され
る。EcoR IおよびBamH I部位はSma I部位を補う。その
ため260bp Mbo I断片を含むクローンは、６％ポリアク
リラマイドゲル上の電気泳動とオートラジオグラフィー
後、標識270bp断片を生ずるように同定される。12クロ
ーンのうちの４つはこの断片を保有していた。挿入物の
方向は、Hinf I（１単位、１時間、37℃）を用いたEcoR
I切断、末端標識RFDNA（0.1ug）の分解により決定され
る。Hinf Iは１度目は断片の３′末端から99bp、２度目
はNOSコドン領域に最も近い末端から42bpで260bp Mbo
I断片を分割する。各方向の２クローンが得られる。１
クローンは第８図に示されるようにＭ−２として消化さ
れ、該断片の３′末端にEcoR I部位を有する260bp断片
を含む。Ｍ−２ RFDNAはMessing他1981の手順で準備さ
れた。

例7:pMON75およびpMON76の創製 50ugM−2RFDNA（例６に記述）は50単位のEcoR Iおよび5
0単位BamH Iと共に２時間、37℃で分解される。270bp断
片（1ug）はアガロースゲルおよびNA−45膜を用いて純
化される。プラスミドpMON58（例４に記述）はEcoR Iお
よびBamH I（各50ug、50単位、２時間、37℃）を用いて
分解、1300bp断片はNA−45膜を用いて純化する。270bp
EcoR I−BamH I（0.1ug）および1300bp EcoR I−Bam
H I（0.5ug）断片は混合され、T₄DNAリガーゼ（２単
位）を用いて12時間、14℃で処理される。70℃で10分間
加熱し、リガーゼを不活性化したあと、混合物はEcoR I
（10単位）で１時間、37℃で処理、その後不活性化する
ために70℃、10分間EcoR Iを加熱する。これは第９図に
示されるように、キメラNOS−NPT II−NOS遺伝子集合を
1.6kb断片上に完成する。

プラスミドpMON38はpBR327のHind III部位内に挿入され
たpTiT37Hind III−23断片のクローンである（Soberon
他、1980）。pMON38DNA（20ug）はEcoR I（20単位、２
時間、37℃）およびウシアルカリフォスファターゼ（0.
2単位、１時間、37℃）と共に分解される。pMON38DNA反
応はフェノールと共に抽出され、エタノールにより沈殿
され、乾燥され、20ulの10mM Tris−HCl、1mM EDTA、p
H8中に再懸濁される。

0.2ugの分割pMON38DNAは上述のキメラ遺伝子混合物に加
えられる。混合物はT₄DNAリガーゼ（４単位、１時間、2
2℃）で処理され、Rb塩化物処理E.coliC600rec A56細胞
と共に形質転換するために混合される。アムピシリン耐
性（200ug/ml）コロニーの選択をする平面培養後、63の
有力な候補が得られる。プラスミドDNAのアルカリミニ
プレプはこのうちの12で作られ適正な構成のための制限
エンドヌクレアーゼ消化により選別される。1.5kb Eco
R I断片及び新Bgl II部位を含むプラスミドDNAはBamH I
を用いて分解され、1.5kb EcoR I断片の配向を決め
る。それぞれの挿入方向の１つが選ばれる。１プラスミ
ドは第９図に示されるようにpMON75および他方はpMON76
と命名される。これらのプラスミドからDNAは先の例に
おいて記されたように調製される。

例8:プラスミドpMON128およびpMON129の創製 1.5kb EcoR I断片はEcoR I分解によりpMON75あるいはp
MON76から切出され、先の例に記述したようにアガロー
スゲル電気泳動後純化される。プラスミドpMON120（先
に引用した別出願“植物細胞の形質転換用プラスミ
ド”）からの5ug DNAはEcoR Iと共に分解、カーファル
カリフォスファターゼで処理する。フェノール蛋白分離
およびエタノール沈殿後、EcoR I切断pMON120の線形DNA
は0.5ug 1.5kb EcoR Iキメラ遺伝子断片と共に混合さ
れる。混合物は、２単位のT₄DNAリガーゼにより１時
間、22℃で処理される。E.coli細胞の形質転換（Maniat
is他、1982）およびスペクチノマイシン（50ug/ml）に
耐性を示すコロニーの選択後、数千のコロニーがあらわ
れる。そのうちの６コロニーが選ばれ、育てられプラス
ミドミニプレグが作られる。プラスミドDNAはEcoR Iを
用いて分解され、1.5kbキメラ遺伝子挿入がチェックさ
れ、BamH Iを用いて挿入配向を決定する。BamH I分解
は、pMON128内のキメラ遺伝子がpMON120の完成ノパリン
合成物遺伝子と同じ方向に転写されることを示す。pMON
129内の挿入定位はpMON128内のそれ（挿入定位）に対
し、反対側になる:pMON129の分解における付加1.5kb B
amH I断片の出現はプラスミドpMON129が第10図で示され
るように、キメラNOS−NPT II−NOS遺伝子の直列の重複
を保有することを示す。

例9:プラスミドpMON156の創製 CaMV DNAを含むプラスミドは、University of Califor
nia,DavisのR.J.Shepherd博士からMonsanto Companyへ
提供された。出願人の最良の知識と信念にとってこれら
のプラスミド（pOSIと命名）はCM4−184（Howarth他、1
981）と命名されるCaMV鎖の完全なゲノムのpBR322プラ
スミドのSal I制限部位への挿入により得られる。E.col
i細胞はpOSIを用いて変換され、アムピシリン（Amp^R）
に耐性を示し、テトラサイクリン（Tet^S）に感応性があ
る。

この発明に用いられ得るCaMV DNAの分離に適したCaMV
の多くの菌株は公に入手可能である；参照、例えば、AT
CC Catalogue of Strains11、P.387（３版、1981）。p
OSI DNAはHind IIIと共に分割される。３つの小断片は
NA−45膜を用いて0.8％アガロースゲル上の電気泳動後
純化される（SchleicherとSchuell,Keen NH）。最小断
片の大きさは約500bpで19Sプロモーターを含む。この断
片は６％アクリルアミドゲル上でさらに純化される。こ
の断片のシークエンスを変えない、多くの処置の後（第
28図に示す）、それはMbo Iを用いて分解されて455Bp
Hind III−Mbo I断片を生じる。この断片はBgl IIおよ
びEcoR Iを用いてpMON75（例７に記述、第９図に示す）
を分解することにより得られた1250bp断片と混合され
る。この断片はNPT II構造シークエンスおよびNOS3′−
非翻訳領域を含む。２つの断片は融和性のあるMbo Iお
よびBal II突出部により共に結紮され、CaMV（19S）−N
PT II−NOSキメラ遺伝子を含む断片を創製する。この断
片は、Hind IIIおよびEcoR Iを用いて切断されたpMON12
0内に挿入される。得られたプラスミドは第29図に示さ
れるようにpMON156と命名される。

プラスミドpMON156はE.coli細胞内に、次いでA.tumefac
iens細胞内に挿入され、ここでＴ−DNA端により囲まれ
たCaMV（19S）−NPT II−NOSキメラ遺伝子をもつ相互融
和Tiプラスミドを形成する。相互融和プラスミドを含む
A.tumefaciens細胞は、ペチュニア細胞と共に共培養さ
れる。共培養ペチュニア細胞はカナマイシンを含む媒質
上で培養される。共培養ペチュニア細胞のあるものは、
カナマイシンを50ug/mlまで含む媒質上でコロニーを生
じた。これはCaMV（19S）−NPT II−NOS遺伝子がペチュ
ニア細胞内に発現されることを示す。この結果は形質転
換植物細胞のDNAのSouthern blot analysisにより確認
された。

例10:pMON155の創製 プラスミドpMON72はバクテリアトランスポゾンTn5（NPT
II構造シークエンスを含む）由来の1.8kb Hind III−
BamH I断片を、Hind IIIおよびBamH Iを用いて切断され
たPst I−pBR327プラスミド内に挿入することにより得
られる。このプラスミドはBgl IIおよびPst Iを用いて
切断され、NPT II構造シークエンスが除去される。

dam−細胞からのプラスミドpMON1001（例１に記述、お
よび第６図に示す）はBgl IIおよびPst Iを用いて切断
され、NPT II構造シークエンスの１部を伴う218bp断片
を得る。この断片はMbo¹を用いて切断され、194bp断片
を得る。

三重結紮は（ａ）pMON72の巨大なPst I−BS III断片；
（ｂ）pMON1001よりのPst I−Mbo¹断片；（ｃ）すべて
の３読み込みわく内の終了コドンをもちBgl IIおよびMb
o I末端を有する合成リンカーを用いることにより行わ
れる。E.coli細胞の形質転換およびアムピシリン耐性コ
ロニーの選択後、Amp^RコロニーからのプラスミドDNAは
分析される。プラスミドを求められる構成と共に含むコ
ロニーが確認される。このプラスミドは第30図に示され
るようにpMON110と命名される。

NPT II構造シークエンスの３′末端をpMON110内の５′
部に加えるためにpMON110はXho Iで処理される。得られ
た突出末端は補填されてKlenowポリメラーゼおよび４デ
オキシヌクレオシド三リン酸塩（dNTP′ｓ）、Ａ、Ｔ、
Ｃ、Ｇでの処理により平滑末端をもたらす。Klenowポリ
メラーゼは加熱により不活性化され、断片はPst Iを用
いて切断され、3.6kb断片は純化される。プラスミドpMO
N76（例７に記述、第９図に示す）はHind IIIで切断さ
れ補填されて平滑末端をKlenowポリメラーゼおよび4dNT
P′ｓを用いてもたらし、Pst Iを用いて分解される。11
00bp断片は純化され、それはNPT II構造シークエンスの
１部およびノパリンシンテース（NOS）３′−非翻訳領
域を含む。この断片は、pMON110由来の3.6kb断片と共に
結紮される。混合物はE.coli細胞を形質転換するために
使用され;Amp^R細胞は選択され、求められる構成をもつ
プラスミドのあるコロニーが確認される。

このプラスミドは第31図に示されるようにpMON132と命
名される。プラスミドpMON93（第28図に示す）はHind I
IIを用いて分解され、476bp断片が分離される。この断
片はMbo Iを用いて分解され、455bp断片が純化される。
そしてそれはCaMV（19S）プロモーター領域および５′
−非翻訳領域を含む。プラスミドpMON132はEcoR Iおよ
びBgl IIを用いて分解され、（１）３つ全部の読み込み
わくにおいて終了コドンを有する合成リンカー；（２）
NPT II構造シークエンス；および（３）NOS3′−非翻訳
領域を有する1250bp断片を得る。これら２断片は一致し
たMbo IおよびBgl II終了を通して共に結合され、CaMV
（19S）−NPT II−NOSキメラ遺伝子が創製される。

この遺伝子はpMON120に挿入される。pMON120はHind III
およびEcoR Iを用いて分解され、プラスミドpMON155を
第32図に示すように生起する。

プラスミドpMON155はTiプラスミド、pTiB653を含むA.tu
mefaciens GV3111細胞内に挿入される。pMON155プラス
ミドは単一交差を用いてTiプラスミドの共に相互融和プ
ラスミドを形成する。この相互融和プラスミドを含む細
胞はAmerican Type Culture Collectionに寄託され、AT
CC受託番号39336に指定されている。この発明のキメラ
遺伝子を含む断片は相互融和プラスミドをHind IIIおよ
びEcoR Iにより分解し、また1.7kb断片を純化すること
により、得ることができる。これらの細胞はペチュニア
細胞を変換するために用いられ、そのペチュニア細胞は
少なくとも100ug/mlカナマイシンを含む媒質上で育つよ
うにされている。

例11:pMON183・184の創製 プラスミドpOSI（例９に記述）はBgl IIを用いて分解さ
れ、1200bp断片が純化される。この断片は32Sプロモー
ター領域および５′−非翻訳領域の１部を含む。それは
BamH IおよびBgl IIを用いて分解されたプラスミドpSHL
72内に挿入される（pSHL72はPAGO60と機能上等しい。Co
lbere−Garapin他、1981に記述）。得られたプラスミド
は第33図に示されるようにpMON50と命名される。

クローンBgl II断片はポリアデニル化部位として32S R
NA転写のために作用するDNA領域を含む。このポリアデ
ニル化領域は次のように除去される:pMON50はAVA IIを
用いて分解され、1100bp断片が純化される。この断片は
EcoR I^＊およびEcoRVを用いて分解される。得られた190
bp EcoR I−EcoRV断片は純化され、プラスミドPBR327
に挿入され、それはEcoR IおよびEcoRVを用いて分解さ
れる。得られたプラスミド、pMON81は190bp EcoR V−E
coR I断片上のCaMV 32Sプロモーターを含み、第33図に
示される通りである。

CaMV（32S）を全プロモーター領域がpMON81内に存在す
ることを確認するために、断片の５′（EcoR V）末端に
隣接する領域が次の方法でpMON81に挿入される。dam−
細胞により調製されるプラスミドpMON50はEcoR Iおよび
Bal IIを用いて分解され、得られた1550bp断片は純化さ
れ、Mbo Iを用いて分解される。得られた725bp Mbo I
断片は純化され、プラスミドpKC7（RaoとRogers、197
9）の固有のBal II部位に挿入して、プラスミドpMON125
を得る。第34図に示される通りである。２つのMbo I末
端に隣接する塩基のシークエンスはBal II部位を再生
し、725bp断片がBgl IIにより切断されることを可能と
する。

32Sプロモーターを保有する断片を生成させるために、7
25bp Bgl II断片はpMON125から純化され、続いてEcoR
VおよびAlu Iを用いて分解され、190bp断片を生ずる。
プラスミドpMON81はBamH Iを用いて分解され、Klenowポ
リメラーゼで処理し、EcoRVを用いて分解される。3.1kb
EcoRV−BamH I（blunt）断片は純化され、190bp Eco
R V−Alu I断片と共に混合、DNAリガーゼで処理する。
形質転換およびアムピシリン耐性細胞の選択に続いてCa
MV（32S）プロモーターシークエンスを380bp BamH I−
EcoR I断片上に保有するプラスミドpMON172が得られ
る。第35図に示される通りである。この断片は32S RNA
のためのポリアデニル化領域を有していない。Alu¹末端
の補填BamH I部位への結紮はBamH I部位を再生する。

CaMV（32S）プロモーターに隣接した制限エンドヌクレ
アーゼ部位を再配列するために380bp BamH I−EcoR I
断片をpMON172から純化、Klenowポリメラーゼで処理
し、ファージM13mp8の独特Sma I部位に挿入される。１
つの組みかえファージM12は380bp断片を第36図に示され
る配向をもって保有する。このファージからの複製形成
DNAは32Sプロモーター断片をEcoR I（５′）−BamH I
（３′）断片上に保有する。

キメラ遺伝子（CaMV（32S）プロモーター領域NPT II構
造シークエンス−NOS3′−非翻訳領域）を保有するプラ
スミドは次のように組立てられる。380bp EcoR I−Bam
H I CaMV（32S）プロモーター断片はファージM12RF D
NAから純化され、pMON75由来の1250bp Bgl II−EcoR I
NPT II−NOS断片と共に混合される。これら２つの断
片の一致したBamH IおよびBgl II末端を介しての結合は
1.6kbCaMV（32S）−NPT II−NOSキメラ遺伝子を生じ
る。この遺伝子は両方向の配向をもってEcoR I部位でpM
ON120に挿入される。得られたプラスミド、pMON183およ
びpMON184に第37図にあらわされる。

これらのプラスミドはペチュニア細胞を形質転換するた
めに用いられる。形質転換された細胞は100ug/mlカナマ
イシンを含む媒質上での成長を可能にする。

参考文献 S.Adams他、Abstract ＃ 149,183rd Meeting of the Am
er.Chemical Society（1982） N.Amrhein他、Plant Physiol.66:830（1980） E.Auerswald他、Cold Spr.Hbr.Symp.Quant.Biol.45:107
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07:584（1982） R.Woychik他、Nucleic Acids Res.10:7197（1982） 図面の簡単な説明 第１図は典型的な真核細胞の遺伝子の構造を表す模式図
である。

第２図は本発明の工程を表すフローチャートである。キ
メラNOS−NPT II−NOS遺伝子を例にして描かれている。

第３図はTiプラスミドをHind IIIにより消化して得られ
たHind III−23の断片を表す模式図である。

第４図はNOSプロモーター領域、NOS5′−非翻訳領域、N
OS構造シークエンスの最初の数個のコドンを持つDNAの
一部を表した部分構造式である。

第５図はNOSプロモーター領域、および完全な５′−非
翻訳領域を含むDNA断片を得るための、DNA配列の正確な
位置での切断を表す模式図である。

第６図はNPT II構造遺伝子部位を保持しているプラスミ
ド、pMON1001とpMON40との生成を表す模式図である。

第７図はpMON58を得るためNOSプロモーター領域をプラ
スミドpMON40に組み入れる模式図である。

第８図はＭ−２と命名されているM13誘導体の構築を示
す模式図である。このＭ−２は、NOS3′−非翻訳領域と
ポリ−Ａシグナルを保持している。

第９図はNOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子を組み立て、プ
ラスミドpMON38に組み入れ、プラスミドpMON75とpMON76
を構築する模式図である。

第10図はNOS−NPT II−NOSキメラ遺伝子をプラスミドpM
ON120に組み入れ、プラスミドpMON128とpMON129を構築
する模式図である。

第11図はNPT I遺伝子を保持しているプラスミドpMON66
の構築を示す模式図である。

第12図はキメラNOS−NPT IIシークエンスを保持してい
るプラスミドpMON73の構築を示す模式図である。

第13図はキメラNOS−NPT Iシークエンスを保持している
プラスミドpMON78の構築を示す模式図である。

第14図はキメラNOS−NPT I−NOS遺伝子を保持するプラ
スミドpMON106とpMON107の構築を示す模式図である。

第15図はキメラNOS−NPT I−NOS遺伝子をpMON120に組み
入れ、プラスミドpMON130とpMON131の構築を示す模式図
である。

第16図は大豆たんぱく（sbss）プロモーターを保持して
いるDNA断片の構築を示す模式図である。

第17図はsbssプロモーターを保持しているプラスミドpM
ON121の構築を示す模式図である。

第18図はキメラsbss−NPT II−NOS遺伝子をpMON120に組
み入れプラスミドpMON141とpMON142の構築を示す模式図
である。

第19図はウシ成長ホルモンの構造遺伝子領域と、NOS3′
領域を保持している、プラスミドpMON108の構築を示す
模式図である。

第20図は選択的な切断面にかこまれているBGH−NOSを保
持しているプラスミドN25−BGHの構築を示す模式図であ
る。

第21図はキメラsbss−BGH−NOS遺伝子をpMON120に組み
入れプラスミドpMON147とpMON148の構築を示す模式図で
ある。

第22図はキメラNOS−BGH−NOS遺伝子を保持するプラス
ミドpMON149の構築を示す模式図である。

第23図はEPSPシンサーゼを生産する構造遺伝子領域を保
持しているプラスミドpMON8の構築を示す模式図であ
る。

第24図は開始コドンの近くに切断面のあるEPSPシンサー
ゼ構造遺伝子領域を保持するプラスミドpMON25の構築を
示す模式図である。

第25図はEPSPシンサーゼとNOS3′領域を持ったキメラシ
ークエンスを保持するプラスミドpMON146の構築を示す
模式図である。

第26図はキメラNOS−EPSP−NOS遺伝子をpMON120に組み
入れpMON153の構築を示す模式図である。

第27図はキメラsbss−EPSP−NOS遺伝子を保持するプラ
スミドpMON154の構築を示す模式図である。

第28図はCaMV 19S プロモーターを保持するプラスミ
ドpMON93の構造とその構築を示す模式図である。

第29図はキメラCaMV（19S）−NPT−NOS遺伝子を保持す
るプラスミドpMON156の構造とその構築を示す模式図で
ある。

第30図はNPT遺伝子を部分的に保持するプラスミドpMON1
10の構造とその構築を示す模式図である。

第31図はNPT−NOS遺伝子を部分的に保持するプラスミド
pMON132の構造とその構築を示す模式図である。

第32図はキメラCaMV（19S）−NPT−NOS遺伝子を保持す
るプラスミドpMON155の構造とその構築を示す模式図で
ある。

第33図はCaMV 32Sプロモーターを保持するプラスミドp
DMON81の構造とその構築を示す模式図である。

第34図はCaMV 32Sプロモーターを保持するプラスミドp
MON125の構造とその構築を示す模式図である。

第35図はCaMV 32Sプロモーターを保持するプラスミドp
MON172の構造とその構築を示す模式図である。

第36図はCaMV 32Sプロモーターを保持するファージM12
の構造とその構築を示す模式図である。

第37図はキメラCaMV（32S）−NPT−NOS遺伝子を保持す
るプラスミドpMON183とpMON184の構造とその構築を示す
模式図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/12 9359−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）植物細胞内で天然に発現される遺伝
   子由来のプロモーター領域； （ｂ）５′非翻訳領域； （ｃ）ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼポリペ
   プチドをコードする構造コード配列；および （ｄ）mRNAのポリアデニル化シグナル配列をコードし、
   植物細胞内で天然に発現される遺伝子由来の３′非翻訳
   領域； を順番に含み、前記プロモーターが前記構造コード配列
   に対して異種である、植物細胞内でポリペプチドを発現
   することができるキメラ遺伝子。
2. 【請求項２】プロモーターが、ノパリンシンサーゼ遺伝
   子およびリブロース−1,5−ビス−ホスフェートカルボ
   キシラーゼ小サブユニット遺伝子からなる群の遺伝子か
   ら選択される特許請求の範囲１項に記載の遺伝子。
3. 【請求項３】３′非翻訳領域が、Agrobacterium tumefa
   ciensのＴ−DNA領域由来の遺伝子類からなる群から選択
   される特許請求の範囲１項に記載の遺伝子。
4. 【請求項４】３′非翻訳領域が、Agrobacterium tumefa
   ciensのノパリンシンサーゼ遺伝子由来である、特許請
   求の範囲１項または２項のいずれか一つに記載の遺伝
   子。
5. 【請求項５】（ａ）植物細胞内で天然に発現される遺伝
   子由来のプロモーター領域； （ｂ）５′非翻訳領域； （ｃ）ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼポリペ
   プチドをコードする構造コード配列；および （ｄ）mRNAのポリアデニル化シグナル配列をコードし、
   植物細胞内で天然に発現される遺伝子由来の３′非翻訳
   領域； を順番に含み、前記プロモーターが前記構造コード配列
   に対して異種である、植物細胞内でポリペプチドを発現
   することができるキメラ遺伝子を保持するプラスミドに
   より計質転換され、ATCC受託番号第39265号により同定
   される微生物。