JP3089282B2 - 高性能遺伝子コントロール配列 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物内に自然の遺伝子または、人工的に改
変された遺伝子または人工的に合成された遺伝子、ある
いはそれらの遺伝子断片またはその他の有用なDNA配列
を導入することを可能にすると共に、そのようにして導
入された遺伝子を効率的かつ優れた発現性能で発現し、
さらにそのように植物内に導入された遺伝子、その断片
またはその他のDNA配列の保持を可能にする新しい遺伝
子コントロール配列及びそれを利用して新たに見出され
た発現ベクターに関するものである。

本発明の遺伝子コントロール配列及び発現ベクター系
は、広い適応性を有することを目的としても開発されて
おり、従来その効率的な発現ベクター系、植物内に導入
されて高い形質保持安定性を有する発現ベクター系及び
その遺伝子コントロール配列の開発が求められてきた
が、これらの要求をも満たすものである。

また、本発明の新しい遺伝子コントロール配列は、真
核生物全般に広く応用して優れた効果を得られる可能性
を有するものである。

（従来技術） 従来からカリフラワーモザイクウィルス（CaMV）に由
来する35Sプロモーター配列を改変する試みはなされて
いる（Robert Kay et al.,Science,Vol.236,1299−1302
（1987）;David Ow et al.,Proc.N.A.S.,Vol.84,4870−
4874（1987）;Joan Odell et al.,Plant Mol.Biol.,10,
263−272（1988））が、その得られたものは必ずしもそ
の活性が満足しうるものではないと言われたり、その再
現性が疑問視されたりしてきている。

また、35Sプロモーターは本来双子葉植物由来で禾本
科植物を含む単子葉植物では必ずしも充分に働かないこ
とが予想される。

また、トウモロコシなどでは、イントロンがメッセン
ジャーRNAの量を増加させるのにあずかっているという
ことが報告されている（Genes ＆ Dev.１;1183−1200,1
987）。しかしながら、このようなイントロトンをどの
ような形態で利用ができるかということは知られていな
い。

さらにまた、植物だけでなく、動物、特に哺乳動物、
菌類、例えば酵母、糸状菌などのすべての真核生物、そ
の細胞中で高い遺伝子発現制御活性を有するプロモータ
ーが強く求められている。

（解決すべき課題） 従来タバコを中心として有用遺伝子を導入したトラン
スジェニク植物の作成が進められているが、多くの場合
導入遺伝子の発現効率が大きな問題となっている。従来
から繁用されてきていたカリフラワーモザイクウィルス
（CaMV）の35Sプロモーターの強さはかならずしも満足
しうるものではなく、今後の分子育種を進める上で、よ
り効率的な発現ベクターの開発が望まれていた。

特に35Sプロモーターはカリフラワーモザイクウィル
ス由来であることから、禾本科植物に外来遺伝子、例え
ば除草剤抵抗性遺伝子、病害虫病原菌耐性獲得のための
遺伝子等を導入するには必ずしも適当なものではなかっ
た 本発明者らは、このように広く利用はされてはいる
が、特に有用植物として価値のある単子葉植物にも効率
よく用いることのできる発現ベクターを開発する目的
で、その35Sプロモーターの改変を試みた。本発明者ら
は、この研究の過程で35Sプロモーターを改変すること
により、そのプロモーター活性が失われるどころか、様
々な優れた性質機能を有する遺伝子コントロール配列が
得られることを発見した。

本発明者らは、これらの知見を基に更に研究をすすめ
た結果広い適応性を有するのみでなく、非常に優れた且
つ強い発現活性を有する発現ベクターを構築することに
成功した。

（課題の解決） 本発明は、広い適応範囲を有すると共に高い安定性を
有し、且つ強く遺伝子、その断片あるいはその他の有用
DNA配列を制御することのできる遺伝子コントロール配
列に関する。

本発明の遺伝子コントロール配列は適当な修飾によっ
てその機能を高めることができるものである。

特に本発明は、植物用の遺伝子コントロール配列とし
て用いられているカリフラワーモザイクウィルス由来の
35Sプロモーター配列から誘導されたところの35Sプロモ
ーターの−290ないし−90に相当するDNAに関する。

本発明はさらにこのような35Sプロモーターの−290な
いし−90に相当するDNA配列がスペーサーを介しまたは
介さずに複数個配置されたDNAに関する。

本発明の35Sプロモーターの−290ないし−90に相当す
るDNA、またはそのDNA配列がスペーサーを介しまたは介
さずに複数個配置されたDNAは、単子葉植物においても
有効な遺伝子コントロールが期待でき、特に従来強くそ
の安定且つ強力で操作しやすい遺伝子コントロール配列
が求められていた禾本科植物、例えば大麦、小麦、トウ
モロコシ、サトウキビなどにおいても好ましい遺伝子コ
ントロールが好ましい形態で行うことができる。

さらに、本発明のそれらのDNA配列は、双子葉植物に
おいても、例えば野菜植物、果物植物においても従来に
ない優れた特性を発揮することができ、耐病性とか耐害
虫性、抗ウィルス性などの発現に有効に利用できる。

本発明の35Sプロモーターの−290ないし−90に相当す
るDNA、またはそのDNA配列がスペーサーを介しまたは介
さずに複数個配置されたDNAは、プロモーターとして大
変優れており、その下流に位置する構造遺伝子を、植
物、例えば双子葉類植物、単子葉類植物など、動物また
は菌類、例えば酵母、糸状菌などのすべての細胞で、一
時的発現（トランジェント発現）したり、恒常的発現
（ステーブル発現）させたりすることができると考えら
れる。

さらには、上記した以外の生物あるいはウィルスなど
にも導入応用することが期待でき、各種有用生物、有用
産物の製造に利用できるばかりでなく、医薬、遺伝子治
療への応用の可能性もある。

また、動物の分野では、遺伝的にガンになり易い動
物、例えばマウスなどの育成、ガン治療剤の開発試験供
試動物の作出、乳質、肉質の改良、成長促進などのほ
か、生ワクチンの産生に関与する遺伝子の導入などで、
飼料効率が高く、肉質のよい家畜、魚類の育成に利用で
きると考えられる。

本発明は、上記遺伝子コントロール配列を利用したベ
クターあるいは発現ベクター系にも関する。

本発明は、特にカリフラワーモザイクウィルス由来の
35Sプロモーター配列から誘導されたところの35Sプロモ
ーターの−290ないし−90に相当するDNA、またはそのDN
A配列がスペーサーを介しまたは介さずに複数個配置さ
れたDNAと、遺伝子発現制御配列とを有するベクターあ
るいは発現ベクターに関する。

本発明はまた遺伝子発現制御配列を組み合わせること
により新しい高活性発現ベクターが作成できることをも
示すものである。

特に本発明は、35Sプロモーターの−290ないし−90に
相当するDNA、またはそのDNA配列がスペーサーを介しま
たは介さずに複数個配置されたDNAと、その下流域にイ
ントロンから誘導された配列とを有する発現ベクターに
関する。

本発明の発現ベクターは、特に植物内に自然の遺伝子
または、人工的に改変された遺伝子または人工的に合成
された遺伝子、あるいはそれらの遺伝子断片またはその
他の有用なDNA配列を効率よく導入することができると
共に安定的に保持させることができ、さらにそれらの遺
伝子等を高い活性でもって発現させることができるとい
うことで特徴づけられるものである。

本発明のベクターは、植物、特に単子葉植物、とりわ
け禾本科植物においても優れた外来遺伝子等の発現効率
を達成できるのみでなく、双子葉植物においても、有用
な発現ベクター系として利用できる。

また、双子葉植物では、アグロバクテリア（Agrobact
eria）のTiプラスミド由来のベクターが頻用されている
が、これらのベクターに上記遺伝子コントロール配列を
挿入することにより、有用な発現ベクター系を作成し、
利用できる。

さらに、これ以外のベクター系に本発明の遺伝子コン
トロール配列を挿入し、有用な発現ベクター系を作成
し、利用することも可能である。

したがって、本発明は、またこの様な新規なベクター
にも関するものである。

本発明はまた、利用して有用な外来遺伝子などを、上
記発現ベクターに組み込んでなる新規な発現ベクターに
も関するものである。

本発明のベクターを用いて遺伝子導入などの操作をす
る場合、選択マーカー遺伝子（例えば、ハイグロマイシ
ン耐性、カナマイシン耐性などの抗生物質に対する耐性
に関する遺伝子など）が有利に利用されるが、必ずしも
同じベクター上に選択マーカー遺伝子を挿入する必要は
ない。

選択マーカー遺伝子を持つプラスミドと本発明のベク
ターを混ぜて、コトランスフォーメーション（R.Schoch
ev et.al.,Bio/Technology,４,1093−1096（1986））に
より遺伝子導入することも可能である。

また、選択マーカー遺伝子を挿入した発現ベクターを
作成することも可能である。

次に本発明の遺伝子コントロール配列について説明す
る。

本発明の遺伝子コントロール配列は、CaMV35Sプロモ
ーターから誘導され、その35Sプロモーター機能を有す
ると共にそのCaMV35Sプロモーターにはない特異な性状
を有するDNAである。本発明のこのDNAは、特には35Sプ
ロモーターの−290ないし−90に相当するDNAである。

また特には、本発明の35Sプロモーターの−290ないし
−90のDNA配列は、制御酵素Alu I及びEcoR V作用末端を
有するものである。35Sプロモーターの塩基配列は、Cel
l,21,285−294（1980）などによって知られ、その位置
のナンバーリングも決まっている。従って、本発明にお
いてもナンバーリングはそれらに従うものである。

本発明の35Sプロモーターの−290ないし−90に相当す
るDNAは、上記文献記載の35Sプロモーター配列のうちの
制限酵素Alu I及びEcoR Vで処理して得られたところの
−290番目から連続して続き−90番目までのDNA塩基配列
のみだけでなく、それと相補的な配列をも含むものであ
る。さらに本発明の35Sプロモーターの−290ないし−90
に相当するDNAは、上記−290番目から−90番目までの連
続したDNAのみでなく、それと同等の機能を有するもの
であれば、その−290ないし−90の範囲のDNA配列よりも
長くても、短くてもよく、さらには、そのうちの塩基配
列のうちの塩基の１個、または２個あるいは複数個、さ
らには一部の塩基配列を、置換したり、付加したり、あ
るいは欠失させたり、さらにはそれらを組み合わせて処
理して得られたものであってもよい。

したがって、本発明の35Sプロモーターの−290ないし
−90に相当するDNAは、本明細書において具体的に開示
された配列が有する機能と同じ機能を有するもののみで
なく、種々の改変により、それから誘導されてその有す
る機能が質的あるいは量的に付加されたものをも含むも
のである。

これら塩基配列の修飾法としては、制限酵素などによ
る切断、DNAポリメラーゼ、クレノーフラグメント（断
片）、DNAリガーゼなどによる処理等による連結等の処
理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩
基置換法（特定部位指向突然変異法;Mark Zoller and M
ichael Smith,Methods in Enzymology,100,468−500（1
983））によってなすことができるが、この他にも通常
当該遺伝子組換えの分野で用いられる方法によってなす
こともできる。

特に、本明細書の実施例において具体的に開示された
本発明の35Sプロモーターの−290ないし−90に相当する
DNAを有する機能のうちには、以下に説明するような機
能があげられる。

複数個のDNA配列をスペーサーを介しまたはスペーサ
ーを介さずに配置した場合、強い転写増強活性が得られ
る。

複数個のDNA配列をスペーサーを介しまたは介さずに
配置した配列によってもたらされた強い転写増強活性
は、植物体中に導入された後においても安定に保持され
る。

他の遺伝子コントロール配列、例えば、適当なイント
ロンあるいは先導配列と組み合わせることにより、相乗
的な遺伝子発現効果をもたらす。

植物体として禾本科植物中においても安定且つ強い遺
伝子発現効率を有する。

以上のような機能はそれらの一部を有するものであっ
てもあるいはそれらの任意の機能を組み合わせて持つも
のであっても、あるいはそれらの全部の機能を有するも
のであってもよい。

上記したところの代表的な配列である35Sプロモータ
ーの−290ないし−90のDNA配列は、上記したすべての機
能を有し、遺伝子コントロール配列として有用で、特に
エンハンサー配列として有用である。またさらにその35
Sプロモーターの−290ないし−90のDNA配列は複数個、
例えば２〜９個を隣接して結合し、好適には５個〜８個
さらに特には７個を隣接して結合した場合には高い遺伝
子発現活性を示す。

また35Sプロモーターの−290ないし−90のDNA配列を
複数個を有する遺伝子コントロール領域、好ましくは５
個から８個、さらに特に好ましくは７個を有する遺伝子
コントロール領域の下流にファゼリオン遺伝子（Proc,
N.A.S.80,1987−1901,1983）から得られたイントロンＩ
を導入して、遺伝子コントロール領域を形成せしめる
と、そのすぐ下流にある遺伝子の発現を極端に増大化せ
しめるという作用を有している。そしてこのようにして
得られた遺伝子コントロール領域を持つ発現ベクター
は、禾本科植物、特にイネ、小麦、大麦、トウモロコシ
等において、さらに好適にはイネ植物において高い発現
活性を示すという機能を有する。

本発明の35Sプロモーターの−290ないし−90に相当す
るDNAは、基本的に上述したような機能を持つものであ
れば、特に限定されないDNA配列を持つものであること
が理解できよう。また上記したことからも明らかなよう
に上記典型的な35Sプロモーターの−290ないし−90のDN
A配列から誘導され且つ改変されたものも、本発明の35S
プロモーターの−290ないし−90に相当するDNAの範囲内
に入る。

このような塩基配列の改変にあたっては、前述したよ
うにホスホアミダイト法、ホスホジエステル法、ホスホ
トリエステル法などとして知られた化学的核酸合成法、
特定部位指向突然変異法など、あるいは制限酵素、リガ
ーゼなどを使用する方法などあるいはそれらの組合わせ
によって行うこともできる。

本発明の遺伝子コントロール配列の一つである35Sプ
ロモーターの−290ないし−90に相当するDNAの製造につ
いて以下簡単に説明する。

ここでは、35Sプロモーターの−290ないし−90に相当
するDNAの製造について、35Sプロモーターの−290ない
し−90のDNA配列をとりあげて具体的に説明する。

本発明の35Sプロモーターの−290ないし−90のDNA配
列は、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）35Sプロ
モーターを保持していることが知られている種々のベク
ターから通常の遺伝子組換実験の手法に従って、特に
は、後述する文献等に記載の方法に従って得ることがで
きる。

本発明で用いられる代表的なCaMV35Sプロモーター保
持プラスミドとしては、pBI121,pBI221（EMBOJ,６,3901
−3907（1987））、pMON530,pGSJ280（Methods in Enzy
mology 153,253−292（1987））などがあげられるが、p
BI221が好適に用いることができる。またこれらに限定
されないことも理解されよう。

この35Sプロモーター保持プラスミドから所望の35Sプ
ロモーター領域を適当な制限酵素を用いて切断して、断
片を切り出し、こうして得られた断片を適当なプラスミ
ド調製用の宿主ベクター系に組み換えて、目的の遺伝子
コントロール配列領域を得る。

本発明で使用できる制限酵素は、各種市販のものから
選んで用いることができる。

上記の大量にプラスミドあるいは35Sプロモーターま
たはその断片を調製するために使用される宿主−ベクタ
ー系としては当該分野で一般に用いられているものが制
限なく使用できる。このうち代表的なベクターとして
は、pBR322由来の各種のベクターがあげられ、そのよう
なもののうちにはpUC系ベクターとして知られたものが
あげられる。本発明で好適に用いられるベクターを例示
すれば、pUC18,pUC19（Gene,33,103−119（1985））,pU
C118,pUC119,SMなどがあげられるが、これらのものに限
定されないことは言うまでもない。

宿主細胞としては特に限定なく、必要に応じ各種細胞
を用いることができ、グラム陰性あるいはグラム陽性菌
の中からも選択して用いることもできるが、大腸菌を宿
主として用いることが取り扱い上からも便利である。

該35Sプロモーター保持プラスミドから所望の配列を
得るための改変処理、特には断片化、組換えプラスミド
の調製は適宜１回で行ってもよいし、複数回行って徐々
に所望の断片を確実に調製することもできる。

以上の操作により大量に得られたCaMV35Sプロモータ
ーに由来する35Sプロモーター機能あるいはエンハンサ
ー機能を有するDNA断片は、適当なレポータープラスミ
ドに挿入され、連続的遺伝子導入装置などの方法で植物
のプロトプラスト内に導入され、そのレポータープラス
ミド内のマーカー遺伝子の発現量を調べることによりそ
の遺伝子コントロール活性を調べることができる。

この方法で用いられるレポータープラスミドは、種々
のものを公知のプラスミドから改変して得たものであっ
てよい。このようなプラスミドとしては、植物内での発
現が可能であること、植物内への導入が可能であるこ
と、植物内で検知可能なマーカー遺伝子を持つことが重
要であるが、そのような特性を持つものであれば好適に
用いることができる。

このようなレポータープラスミドの代表的なものは、
例えばpNOSCAT（Michael Fromm et al.,Proc,N.A.S.82,
5824−5825,（1985））とpBI221（EMBOJ,６,3901−3907
（1987））から作成したものなどがあげられるほか、pB
I101を用いて作成できる。

また、レポータープラスミドにある適当な検出用のマ
ーカー遺伝子としては、クロラムフェニコール耐性遺伝
子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（CAT）遺伝子な）、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グル
クロニダーゼ（GUS）遺伝子などがあげられるが、特にC
AT遺伝子がアッセイの都合上好適に使用できる。

植物への組換えプラスミドの導入方法としては、ポリ
エチレングリコール法、エレクトロポレーション法、ポ
リエチレンイミン法、ポリオルニチン法、マイクロイン
ジェクション法、パーティクルガン法など、植物に適用
できる種々の方法で行えるが、植物のプロトプラスト内
への導入法としては特にポリエチレングリコール法、エ
トクトロポレーション法、マイクロインジェクション法
があげられ、エレクトロポレーション法は簡単かつ確実
に行え便利である。

マーカー遺伝子として、CAT遺伝子を用いた場合、そ
の活性は、Hirochikaらの方法（J.Virol,61,2599−2606
（1987））に従って行うことができる。この方法を概説
すると、組換え細胞をライゼートとし、これにトリス−
HCl、アセチルコエンザイムＡ、［¹⁴C］クロラムフェニ
コールからなる反応液を加え、通常37℃で１時間インキ
ュベーション処理した後、Gorman et al.,Mol,Cell,Bio
l ２,1044−1051（1982）のようにして処理し、クロラ
ムフェニコールのアセチル化体への変換率を液体シンチ
レーションカウンターで測定する。

こうして得られた所望DNAまたはその断片は、適当な
ベクター中に挿入する場合、その挿入されるベクター断
片に対してその所望DNAまたはその断片を過剰量存在せ
しめて、ライゲーション反応を行うことにより、複数個
を挿入することができる。こうして複数個挿入されたも
のは、複数個配置されたとか、多コピーあるいは複数個
コピーを有するとかと表現される。

ここで用いられるベクターとしては、レポータープラ
スミドとして用いられるものを好適に使用することがで
きる。このようなベクターの例としては、例えば35Sプ
ロモーターの−90から−１のDNA配列に相当するようなT
ATAボックス、CAATボックスを形成しうる配列を持つも
のがあげられる。

さらに、それらベクターとしては、バイナリーベクタ
ー、例えばpBIN19およびその誘導体例えばpBI121等、pG
A482、pGA580など、クローニングベクター例えばpUC
系、具体例を挙げればpUC19,pUC18,pUC119,pUC118など
のうちから、必要に応じ適宜修飾を加えるなどし、好ま
しいものを選んで使用できる。

このようにして得られた35Sプロモーターの−290ない
し−90に相当するDNA、またはそのDNA配列がスペーサー
を介しまたは介さずに複数個配置されたDNAは、それ自
体でエンハンサー機能を持つ遺伝子コントロール配列と
して、各種の真核生物細胞のための制御配列として使用
できることが期待できる。さらにまた本発明のこのDNA
は、適当な遺伝子制御系を付加するなどして、温度感受
性、光感受性、ストレス感受性（例えば、水、病害虫
病、薬剤などの影響のもとに起こるストレス）などのプ
ロモーター機能を持つ配列にすることもできよう。

また得られた本発明の35Sプロモーターの−290ないし
−90に相当するDNA、またはそのDNA配列がスペーサーを
介しまたは介さずに複数個配置されたDNAは、遺伝子発
現制御配列と適当に組合せることにより、高い発現活性
を示す遺伝子コントロール系を構成することができる。

特に、本発明においては、35Sプロモーターの−290な
いし−90に相当するDNAまたはそのDNA配列をスペーサー
を介してまたは介さずに複数個配置されたDNAと、その
下流域に該遺伝子発現制御配列とを配置したものが好ま
しいものとしてあげられる。

該遺伝子発現制御配列として、本発明において好適と
考えられるのは、イントロン、RNAタイプウィルスの
５′末端付近の配列に対応する配列、翻訳活性制御配
列、例えば種々の先導配列があげられる。

本発明において、該遺伝子発現制御配列として好適に
使用できるものとしては、ファゼオリン遺伝子から誘導
されたイントロン、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子
のイントロン、タバコモザイクウィルスの先導配列、例
えばオメガ（Ω）配列、アルファルファモザイクウィル
スの先導配列、イネシマハガレ病ウィルスの先導配列、
キュウリモザイクウィルスの先導配列、ブロムモザイク
ウィルスの先導配列などがある。

本発明において用いられる遺伝子発現制御配列として
特に好適に用いられるのはファゼオリン遺伝子から誘導
されたイントロンＩがあげられる。

これらの配列は、それを本発明に適したかたちに適宜
修飾して用いることができる。

この他、各種植物の遺伝子のイントロンや他のウィル
ス由来の先導配列も利用することが可能であり、さらに
は、これから明らかにされるであろう他の遺伝子発現コ
ントロール配列も同様に利用可能である。

こうして得られる遺伝子コントロール配列及びその系
もすべて本発明の範囲に入ることは明らかである。

こうして得られた本発明の遺伝子コントロール系を用
いて高い遺伝子発現活性を有する発現ベクターを構築す
ることができる。本発明の新規な発現ベクターは、上記
遺伝子コントロール系の下流域に外来遺伝子挿入用のサ
イトを導入することにより得られる。

このような外来遺伝子挿入用のサイトはポリリンカー
サイトと呼ばれるが、そこには、適当な制限酵素部位
が、例えばNOSターミネーター部位との間に存在するも
のである。

特に好ましい本発明の35Sプロモーターの−290ないし
−90に相当するDNA、またはそのDNA配列がスペーサーを
介しまたは介さずに複数個配置されたDNAと、その下流
域にイントロンから誘導された配列を有する遺伝子コン
トロール系としては、35Sプロモーターの−290ないし−
90のDNAを複数個、例えば４〜９個、好ましくは７個を
有するものとイントロンＩ断片とからなるものがあげら
れ、そのイントロンＩ断片は、適当な位置の下流域にあ
るものが優れている。

本発明のこのようなベクターのうち特に好ましいもの
の代表例としては、pREX−１と命名されたものがあげら
れる。

このベクターにおいては、35Sプロモーターの−90な
いし−１に相当する配列も含まれ、そのTATAボックス、
CATTボックスなる領域もあり有用な発現がなし得る。

このようにして得られた本発明の発現ベクターは次の
ような特徴を有している。

（１） 外来遺伝子の挿入部が適度な位置にあること。

（２） 植物内、特に単子葉植物においても高い発現効
率を有する。

（３） 由来が双子葉植物である遺伝子コントロール配
列系を含むことから、その適応範囲が広いことが期待さ
れ、野菜などの植物用の発現ベクターとして利用しえ
る。

（４） 高い発現活性を有する割りに、遺伝的に安定で
ある。

（５） 遺伝子発現コントロール部位が、制限酵素を用
いた切断により容易に切り出され、これを用いて新たな
ベクター系（例えばTiプラスミドベクター）の構築に利
用できる。

本発明に従えば、植物として好適なベクター系中に本
発明の遺伝子コントロール系を導入することにより、各
種の発現ベクターを構築することができる。

こうして構築されたベクター系も本発明の範囲内のも
のである。

このような発現ベクター系を開発するのに用いられる
ベクターとしては、バイナリーベクターとして知られた
ものがあげられ、例えばpBIN19およびその誘導体があげ
られ、例えばpBI121などがあげられる。

また別の用いられるベクターとしてはクローニングベ
クターとして知られたものがあげられ、例えばpUC系の
ベクターがあげられ、例えばpUC19,pUC18,pUC119,pUC11
8等があげられる。

さらにまたアグロバクテリア、特にはアグロバクテリ
ウムツメファシェンス（Agrobacterium tumefaciens）
由来のTiプラスミドあるいはそれから誘導されたプラス
ミド、Tiプラスミドなどと一緒に用いられるバイナリー
ベクターとして知られたもの、例えばpGA482、pGA580な
どが、あげられる。

またこれらに限定されることなく広く選択することも
できる。

また本発明の発現ベクター及びそれから誘導されたベ
クターには、抗生物質耐性、特殊栄養要求性、ホルモン
非要求性などの選択マーカーがあってもよいし、あるい
は必要に応じ導入することもできる。またマーカー遺伝
子としては、コトランスホーメーション法を用いること
によってそれを利用することもできる。

代表的な抗生物質耐性遺伝子としては、カナマイシン
耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フォスフィ
ノシリシン耐性遺伝子などがあげられる。

また、当該分野で知られた種々の遺伝子制御配列、例
えばイニシエーター、ターミネーターなども、必要に応
じ改変したり置きかえたりして利用することができる。

本発明でこの発現ベクターに組み込んで利用される外
来遺伝子としては、除草剤抵抗性遺伝子、抗菌性制御遺
伝子、病原生物耐性遺伝子、抗体産生遺伝子、有用タン
パク質産生遺伝子、栄養代謝制御遺伝子、薬剤耐性遺伝
子、薬物産生遺伝子、耐水性付与遺伝子、窒素固定遺伝
子、色素産生遺伝子、有用有機または無機物質代謝及び
／又は産生遺伝子、あるいはそれらの制御遺伝子などが
あげられる。

したがって、これら遺伝子は必ずしも構造遺伝子に限
られず、非構造遺伝子であっても、目的の達成しうるも
のであれば限定されない。

かかる外来遺伝子として使用し得る有用遺伝子のもの
を具体的に例示すれば、薬剤耐性遺伝子としては、抗生
物質抵抗性遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、
ネオマイシン耐性遺伝子、メトトレキセート耐性遺伝子
など、除草剤抵抗性遺伝子、例えば、グルホセート抵抗
性遺伝子、スルホナミド抵抗性遺伝子、アトラジン抵抗
性遺伝子、スルフロン抵抗性遺伝子、スルホニルウレア
抵抗性遺伝子、バスタ抵抗性遺伝子、パラコート抵抗性
遺伝子など、さらにはbar遺伝子（ビアラフォス耐性遺
伝子）などがあげられる。

また、Bacillus thuringiensisのタンパク毒性遺伝子
（Endotoxin遺伝子）、ピレスロイド系殺虫成分産生遺
伝子、あるいはそれらの前駆体産生遺伝子であって、植
物などに殺虫性毒物等を産生させ、鱗し目昆虫、例えば
ニカメイガ、コブノメイガ、ハスモンヨトウ、モンシロ
チョウ、ワタノメイガ、ジャガイモガなど、甲虫目のイ
ネミズゾムシ、キスジノミハムシ、ウリハムシ、マメコ
ガネなどに対し耐虫性を付与するために有効な遺伝子、
などあるいはそれに類縁する遺伝子などがあげられる。

有用タンパク質産生遺伝子としては、例えばファゼリ
オン、グリシニン、ゼインに関連した遺伝子、大豆タン
パク質、インゲンマメなどの貯蔵タンパク質遺伝子など
があげられる。

本発明の発現系は、特に貯蔵タンパク質の発現制御に
有効なことが期待される。

さらにまた耐乾制遺伝子、耐塩性遺伝子、耐寒性遺伝
子、耐熱性遺伝子といった、気候・風土に耐性を与える
遺伝子があげられる。

また光合成に関連した遺伝子、例えばC₃植物をC₄植物
としての機能を持たせるための遺伝子があげられる。

本発明の発現ベクターに導入して有用な外来遺伝子と
しては、耐病性遺伝子があげられるが、その代表的なも
のを例示すると耐糸状菌性、例えばいもち病、灰色かび
病など、耐ウィルス病性、例えばタバコモザイクウィル
ス、キュウリモザイクウィルスなどの各種モザイクウィ
ルス、イネツングロウィルス、委縮ウィルスなど、耐細
菌病性、例えばかいよう病、青枯病、白葉枯病、ごま葉
枯病などに関係した遺伝子があげられる。

また、このようなものの範囲に入る遺伝子として糸状
菌の細胞壁などを分解する酵素、β−1,3−グルカナー
ゼ、キチナーゼなどの遺伝子もある。

以上のように導入して用いられる遺伝子は、所要の目
的を達成するものが、構造遺伝子、非構造遺伝子の別な
く使用しうる。

本発明で得られた発現ベクターの使用できると考えら
れる植物としては、単子葉植物及び双子葉植物のうちか
ら好適に選んで用いることができる。単子葉植物のうち
代表的なものとしては、禾本科植物があげられ、イネ、
小麦、大麦、トウモロコシ、サトウキビ、カラスムギ、
エンバク、ライムギなどの植物があげられる。

双子葉植物としては、アブラナ科、ナス科、キク科、
ユリ科、アカネ科、ジョウジ花科、ブドウ科、ヒガン
科、アカザ科、マメ科、マツカゼ草科、ラン科、バショ
ウ科、ガガイモ科などのものがあげられる。このような
範囲のうちの代表的な植物としてはタバコ、カリフラワ
ー、大豆、インゲンマメ、ナンキンマメ、トマト、キュ
ウリ、ジャガイモ、ピーマン、サツマイモ、ワタ、メロ
ンなどの植物があげられるが、これらに限定されない。

このように、本発明の発現ベクターに外来遺伝子を組
み込んで得られたものは、当該分野でよく知られた方法
によって植物細胞内に導入することができる。

植物細胞内への本発明の発現ベクターの導入法として
は、前記したような方法があげられ、例えば、エレクト
ロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレン
グリコール法、マイクロインジェクション法、ポリエチ
レンイミン法、ポリオルニチン法といった化学的処理
法、機械的処理法などがあげられる。

この他の導入法としては、Tiプラスミドを利用した方
法があげられる。この方法はTiプラスミドあるいはそれ
から誘導した発現系を用いたり、アグロバクテリウム−
Tiプラスミド−バイナリーベクター法として知られた方
法に基づくものである。

これらの導入法のうち、パーティクルガン法、Tiプラ
スミド利用の場合、植物細胞体をそのまま用いたり、カ
ルスを用いることができ、優れた方法である。

形質転換された植物細胞の保持、培養は、通常の広く
用いられる培地、方法が用いられる。

このようなもののうち、培地としては、N6,MS,R2など
の培地の他、SH,B5,KM培地なども適宜用いられ、またこ
れらに限定されない。

本発明における各種の遺伝子操作の手法は、マニアチ
ス等Molecular Cloning−A Laboratory Manual,Cold Sp
ring Harbor Laboratory 1982年に記載の方法あるいは
そこに記載の参考文献に記載の方法を用いることによっ
て行うことができる。

更に本発明における各種の遺伝子操作は、Methods in
Enzymology,Vol.68（1980年）（Ed by Ray Wu）;Vol.1
00（1983年）（Ed by Ray Wu et al.）;Vol.101（1983
年）;Vol.153（1987年）;Vol.154（1987年）;Vol.155
（1987年）（Edby Ray Wu）;Academic Press.CA.USAに
記載の方法及びそこに記載の参考文献に記載の方法を用
いて行うこともできるし、さらに改変することもでき、
さらには本発明は、これらに記載の方法を用いて容易に
応用することができる。

本発明で得られた遺伝子コントロール配列のうち、そ
の代表的なものは、それをベクターの中に組換えたもの
を保有する微生物をブタペスト条約に基づき微生物工業
技術研究所に寄託され、受託番号、微工研条寄第3145号
（FERM BP−3145）としてエシエリヒアコリ JM109/pREX
−１（Escherichia coli JM109/pREX−１）が、微工研
条寄第3146号（FERM BP−3146）としてエシエリヒアコ
リ JM109/pEN7−INT3（Escherichia coli JM109/pEN7−
INT3）が保存されている。

本明細書で記載の他のプラスミドpEN2,pEN3,pEN4,pEN
5,pEN6,pEN7,pEN8,pEN9,pEN6−INT3,pEN8−INT3,pEN9−
INT3などは、上記のものからも通常の手法で容易に得る
ことができる。

次に本発明について、実施例を示して具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものでなく、
その精神の範囲内で種々の改変が可能で、それらの応用
されたものも本発明の範囲内とみなしてよい。

実施例１ 一般的な組換えDNA実験法 本発明においては、次に示すような一般的な組換えDN
A実験法に従って行うことができる。各実施例において
はこれら一般的な組換えDNA技法についての詳細な説明
は一部省略されているが、これらは本明細書中の記載及
び前記したマニアチス等（1982年）「Molecular Clonin
g−A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborato
ry」（以下「マニアチス等（1982年）の文献」という）
を参照すれば当業者にとって明らかとなるものである。

A.制限酵素によるDNAの切断 TOYOBOまたはNew England Biolab社の制限酵素を用い
て、これらの会社によって推奨される緩衝液中及び温度
条件下でDNAを１ないし３時間培養する。DNA1μｇに対
して２ないし10単位の制限酵素を添加する。反応後フェ
ノール抽出とエタノール沈澱によりDNAを精製する。こ
の方法はマニアチス等（1982年）の文献104〜106頁にも
記載されている。

B.DNA末端の平滑化 DNA断片をTOYOBO社により推奨される緩衝液中に添加
する。添加するDNAは、50−500μg/mlで反応は15℃で30
分間行い、その後、フェノール抽出、エタノール沈澱に
より精製を行う。用いる酵素はTOYOBO社のDNAポリメラ
ーゼ、クレノー断片で、１反応あたり５単位を用いた。

C.DNA断片のアガロースゲル電気泳動及びゲルからの精
製 アガロースゲル電気泳動は、マニアチス等（1982年）
の文献150〜163頁に記載された水平型装置で行った。用
いた泳動用緩衝液はトリスー酢酸緩衝液である。DNA
は、臭化エチジウム（0.5μg/ml）で染色し、長波長の
紫外線で可視化する。DNA断片のゲルからの精製には、
低融点アガロール（Seachem社）を用いる。DNA断片を含
むゲル断片を泳動後に切り出し、65℃20分加熱し、ゲル
を融解する。フェノール抽出を２回、エタノール沈澱を
１回行うことにより精製DNAが得られる。

D.DNA断片の連結 各々のDNA断片約0.1μｇを、BRL社のT4DNAリガーゼ0.
2から１単位存在下で連結させる。添付の緩衝液を用い
て、室温で１〜20時間培養する。

E.大腸菌の形質転換 マニアチス等（1982年）の文献252〜253頁に記載され
た塩化ルビジウム法を用いて大腸菌JM109株のコンピテ
ント細胞を調製する。組換えDNA約100ngと100μのコ
ンピテント細胞を０℃で20分培養し、42℃１分間加熱処
理後、2mlのＬ培地を加えて１時間37℃で培養する10〜1
00μの培養液をＬ寒天培地（アンピシリン50μg/mlを
含む）に塗布し、37℃一晩培養することにより形質転換
体を得る。Ｌ培地及びＬ寒天培地はマニアチス等（1982
年）の文献440〜442頁に記載されている。

F.組換え体プラスミドのスクリーニング 形質転換により得られた大腸菌コロニーから迅速プラ
スミド調製法によりプラスミド調製し、制限酵素切断に
より目的とするプラスミドを同定する。迅速プラスミド
調製法はマニアチス等（1982年）の文献366〜367頁に記
載されている。

G.プラスミドの大量調製 プラスミドの大量調製は、マニアチス等（1982年）の
文献88〜94頁に記載された方法に従って行った。

実施例2:レポータプラスミドp35SCAT−Ｎの作成 エンハンサーの解析に用いたp35SCAT−Ｎは、pSV2CAT
（Mol.Cell.Biol.,2:1044−1051,1982）とpBI121（EMBO
J.6:3901−3907,1987）を用いて作成した。

以下この構築について説明する。

pBI121からHind IIIとBamH I切断により940塩基対のC
aMV35Sプロモーター断片を調製し、pUC18（Gene,33:103
−119,1985）のHind III−BamH I部位に挿入した。得ら
れたプラスミドのSac I−EcoR I部位にpBI121をSac I,E
coR I切断により得られたNOSターミネーターを挿入し
た。

得られたプラスミドp35SterのSma I部位にpSV2CAT由
来のCAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ）遺伝子を挿入した。２方向に挿入されたものが
得られたが、35Sプロモーターからの転写方向の同じ方
向のものを、p35SCAT−Ｎとして以下の遺伝子発現の解
析に利用した。

なお、その挿入配列の方向は前記実施例１に従って調
製されたプラスミドを実施例１・Ｆに記載されているよ
うにして塩基配列を調べることによりなされた。

また上記のCAT遺伝子断片は、Hind III−Hga I切断断
片として切り出したものを、DNAポリメラーゼ・クレノ
ー断片で処理し、平滑末端化したものである。

なお、pBI121の代わりにpBI221を用いても同様な操作
により目的を達成することができる。

実施例3:35Sプロモーター領域のエンハンサーの改変 （ｉ） −90から−290領域の改変 p35SCAT−Ｎから、35Sプロモーターの−90から−290
領域をEcoR VとAlu I切断により調製し、p35SCAT−Ｎの
EcoR V部位（−90）に挿入する。p35SCAT−ＮにはEcoR
V部位は一ケ所のみ存在する。多数コピーの断片を挿入
するため、EcoR Vで切断したp35SCAT−Ｎに較べて約10
倍のモル比のDNA断片を連結に用いる。p35SCAT−N0.1μ
ｇに対してDNA断片を約40ng用いた。EcoR V切断したp35
SCAT−Ｎの自己環状化を防ぐために、アルカリ・フォス
ファターゼで処理したものを用いる。アルカリ・フォス
ファターゼはベーリンガー・マンハイムより購入し、添
付の緩衝液中で、DNA4μｇに対して１単位を用いた。処
理は37℃１時間行った。アルカリ・フォスファターゼの
除去は、フェノール抽出２回、エタノール沈澱１回によ
って行った。

この様にして、−90から−290領域を含むDNA断片を２
コピーから５コピーまでもつ組換え体プラスミド（pEN2
−pEN5）が得られた。さらに、５コピーをもつプラスミ
ド（pEN5）のEcoR V部位（−90）に、上記と同じ条件で
−90から−290領域を含むEcoR V−Alu I断片を挿入し、
６コピーから９コピーをもつプラスミド（pEN6−pEN9）
が得られた。挿入されたDNA断片の方向性は全て一方向
（正方向）であった。逆方向に挿入されたものは、プラ
スミドが不安定なためと考えられる。

これらプラスミド及びその方向性の確認は実施例１に
従って単離されたプラスミドを制限酵素で処理した後、
その得られる断片の大きさ及び含まれる塩基配列を解析
することによりなされた。

（ii） −90から−390領域の改変 p35SCAT−Ｎから、35Sプロモーターの−90から−390
領域をAcc IとEcoR V切断により調製した。DNAポリメラ
ーゼ・クレノー断片により平滑末端化した後に、p35SCA
T−ＮのEcoR V切断部位に挿入した。その他の方法は
（ｉ）に従った。２コピーから６コピー挿入されたもの
が得られた。（ｉ）の場合と同様に全て正方向の挿入で
あった。

前記（ｉ）と同様にして、得られたベクターを解析す
ることにより確認された。

（iii） −90から−940領域の改変 p35SCAT−Ｎから、35Sプロモーターの−90から−940
領域をHind IIIとEcoR V切断により調製した。得られた
断片は（ii）に従って平滑末端化し、p35SCAT−ＮのEco
R V切断部位に（ｉ）に従って挿入した。２コピーから
３コピー挿入されたものが得られ、この場合も全て正方
向の挿入であった。

前記（ｉ）と同様にして、得られたベクターを解析す
ることにより確認された。

実施例４ ファゼオリン遺伝子のイントロンＩを含むDNA断片の調
製とクローン化 ファゼオリン遺伝子（Rroc.N.A.S.80:1897−1901,198
3）を含むラムダ−ファージ（λ177−４）からイントロ
ンＩからIVまで含む1200塩基対を含むDNA断片をEcoR I,
Sac I切断により調製し、pUC12のEcoR I,Sac I部位に挿
入する。得られたプラスミド（pUCPh−ES）からポリメ
ラ−ゼチェインリアクション（PCR）によりイントロン
Ｉの領域を増幅させる。PCRに用いた合成オリゴヌクレ
オチドの配列を以下に示す。

５′−CCTCTAGAGTGGTAAGTAATTGCTA−３′ ５′−TTGGATCCCTGAAATTATAAAAAAC−３′ 増幅には、Perkin Elmer Cetus社のDNA増幅キット（G
ene Amp^TM）とDNA増幅装置を用いた。増幅条件は、同社
のプロトコールに従った。用いた合成オリゴヌクレオチ
ドの５′末端には、Xba IとBamH I制限酵素の認識配列
が存在するので、増幅されたDNA断片を制限酵素Xba I,B
amH Iで処理後、p35SCAT−ＮのXba I,BamH I切断部位に
挿入できる。

こうして得られたプラスミドは、pINT−３と名付けら
れた。

Xba I,BamH I部位は、CAT遺伝子の上流に存在する
が、CATの遺伝子の下流にイントロンＩ断片を挿入する
ために以下の操作を行った。PCRによって増幅されたイ
ントロンＩ断片を、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（TOYO
BO）処理することにより５′未満のリン酸化を行った。
TOYOBO社によって推奨される緩衝液中で、５単位のT4ポ
リヌクレオチドキナーゼを加えて、37℃で30分リン酸化
処理を行った。一方、p35SCAT−ＮをKpn Iで切断し、T4
DNAポリメラーゼ（TOYOBO）処理により平滑末端化を行
った。

TOYOBO社によって推奨される緩衝液中で、５単位の酵
素を加えて、37℃で15分平滑末端化処理を行った。得ら
れたDNAとリン酸化処理をしたイントロンＩ断片を連結
させた。イントロン断片が正方向に挿入されたものが得
られた（pINT−４）。

得られたプラスミドpINT−４の確認は、実施例１に記
載されたようにして単離されたプラスミドを制限酵素処
理し、その断片の塩基配列を解析することによりなされ
た。

実施例５ 改変した35SプロモーターとイントロンＩを連結したプ
ラスミドの作成 実施例３（ｉ）で作成したプラスミドのうちエンハン
サーを6,7,8,9コピーを含むもののXba I,BamH I切断部
位に、実施例４で得られたイントロンＩ断片のうちXba
I,BamH I切断末端をもつものを挿入、連結させた。得ら
れたプラスミドは、pEN6−INT3,pEN7−INT3,pEN8−INT
3,pEN9−INT3と名付けた。

こうして得られたプラスミドは、実施例１の記載のよ
うにしてそのプラスミドを単離した後制限酵素処理し、
得られた断片の大きさ及び含まれる塩基の配列を解析し
て確認された。

またpEN7−INT3を保有する大腸菌JM109/pEN7−INT3
（Escherichia coli JM109/pEN7−INT3）は、工業技術
院微生物工業技術研究所にブタペスト条約に基づく寄託
がなされており、寄託番号微工研条寄第3146号（FERM B
P−3146）が付与されている。

実施例6:発現ベクターpREX−１の作成（図１） 実施例５で作成したpEN7−INT3をBamH IとEcoR Iで切
断し、CAT遺伝子とNOSターミネーターを除去し、実施例
２で作成したp35S terからBamH I,EcoR I切断によって
切り出したNOSターミネーター及びポリリンカーサイト
を挿入しpREX−１を作成した。

こうして作成されたpREX−１と名付けられたプラスミ
ドを保有する大腸菌JM109/pREX−１（Escherichia coli
JM109/pREX−１）は、工業技術院微生物工業技術研究
所にブタペスト条約に基づく寄託がなされており、寄託
番号微工研条寄第3145号（FERM BP−3145）が付与され
ている。

またpREX−１の構造は図１に示されており、その図か
らも理解されるようにイントロン領域とNOSターミネー
ター領域との間に複数の制限酵素部位すなわち、BamH
I,Sma I,Kpn I,Sac Iを有しており、この制限酵素部位
に外来遺伝子を有利に挿入することができる。

実施例7:イネ・プロトプラストの調製 イネ品種日本晴由来の懸濁培養細胞は、表１で示され
るN6培地で培養される。一週間に１度継代をするが、プ
ロトプラスト調製前の継代は、６％のショ糖を含む表１
で示されるMS培地で行う。この培地に変えて、３〜６日
培養後、酵素処理をすると活性の高いプロトプラストが
収率良く得られる。

酵素処理は酵素液Ａ（組成Cellulase Onozuka RS 2％
（w/v）,Pectolyase Y−23 0.05％（w/v）,CaCl₂・2H₂O
0.01％（w/v）,K−デキストランサルフェート0.1％（w
/v）及びマニトール９％（w/v）,pH5.6）を用いて行っ
た。

培養細胞を三角フラスコに移し、培養液を吸引除去
し、酵素液Ａを加える。

30℃の恒温水槽に入れ、毎分30回往復程度で１時間、
ゆっくり振とうしたあと、振とうをやめ、さらに２時間
放置する。未分解の際病を30μｍのナイロンメッシュに
よるろ過で除去する。その後遠心及びCaCl₂（0.01％）
を含む0.5Mマニトール液による洗浄でプロトプラストを
精製する。得られたプロトプラストは、１〜２×10⁷/ml
の濃度になるように上記洗浄液に懸濁させる。

実施例８ エレクトロポレーションによるイネ・プロトプラストへ
の遺伝子導入 0.1mM MgSO₄を含む0.5Mマニトール1mlにキャリア−DN
Aとして子牛胸腺のDNAを20μg/mlの濃度で加える。さら
に調べようとするプラスミド（滅菌蒸留水にとかす）を
１〜10μｇと実施例７で得られたプロトプラスト100μ
を加える。連続的遺伝子導入装置CET−200（日本分
光）を用いてエレクトロポレーションを行った。エレク
トロポレーションの電気的条件は、パルス巾1ms、電解
強度1000V/cm、パルス印加数６回である。エレクトロポ
レーション後、プロトプラストは遠心によって集めて1m
lのR2液体培地（表１）に懸濁し、25℃、暗黒、１日の
培養を行う。プロトプラストをエッペンドルフチューブ
に移し、3000回転、５分間の遠心により集める。上清を
完全に取り除き−80℃で保存する。

実施例９ CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ）アッセイ CAT活性の測定は、Hirochikaらの方法に従った（J.Vi
rol.61:2599−2606,1987）。プロトプラスト沈澱に、10
0μの0.25M Tris−HCl（pH7.8）を加え、凍結−融解
を３回繰り返しプロトプラストを破壊する。15,000回転
10分遠心後上清40μを60μの反応液（0.25MTris−H
Cl,pH7.8;0.8mMアセチルコエンザイムA;0.1μCi¹⁴C−ク
ロラムフェニコール）と混ぜ、37℃10分から１時間保温
する。100μの酢酸エチルで¹⁴C−クロラムフェニコー
ルを抽出後、シリカゲル薄層クロマトグラフィー、オー
トラジオグラフィーによりアセチル化クロラムフェニコ
ールの割合を調べる。定量は、液体シンチレーションカ
ウンターを用いて行った。

実施例10 エンハンサーの改変による活性の増強（図2,図３） 実施例３で作成した種々のプラスミドをエレクトロポ
レーションによりイネ・プロトプラストに導入し、エン
ハンサーの活性をCATの発現を指標に調べた。−90から
−290の領域を増幅させた場合、最も高い活性が得られ
た（図２）。図２では７コピーまで調べているが、９コ
ピーまでコピー数を増やしてもそれ以上の活性の上昇は
みられない（図３）。実験ごとに結果は少し違うが、７
コピーで１コピーに較べて、10倍から15倍の活性の上昇
がみられる。

−90から−290の領域を増幅させた場合、最も高い活
性が得られたが、増幅させる領域を増減させた場合に、
さらに高い活性が得られると考えられる。

実施例11:イントロンの遺伝子発現に及ぼす影響 実施例４で作成されたpINT−３とpINT−４をイネ・プ
ロトプラストに導入し、CATの発現を指標に遺伝子発現
を調べた。コントロールとしてp35SCAT−Ｎを用いた。p
INT−３においては、p35SCAT−Ｎの約20倍の活性が示さ
れた。pINT−４はほとんどコントロールと同程度の活性
しか得られなかった。イントロンは遺伝子の上流に挿入
した時、顕著な効果が見られることが確認された。

実施例12 エンハンサーとイントロンの相乗作用による遺伝子発現
の増強（図４） 実施例５で作成したpEN6−INT3,pEN7−INT3,pEN8−IN
T3,pEN9−INT3をエレクトロポレーションによりイネ・
プロトプラストに導入し、CATの発現を指標に遺伝子発
現の増強を調べた。いずれのプラスミドも、コントロー
ル（p35SCAT−Ｎ）に較べて50〜100倍の高いCAT活性を
発現した。

相乗的な効果が得られ、これは従来のものからは全く
予想外の優れたものであった （効果） 本発明では、植物における発現ベクター系として従来
にないすぐれた発現効率を有するものが提供され、分子
育種上大きな進歩をもたらすものとして期待される。

【図面の簡単な説明】

図１、発現ベクターpREX−１の構造を示す。 図２、35Sプロモーターの種々のエンハンサー領域を増
幅させた時の遺伝子発現への影響を相対的なCATの発現
量で示す。増幅された領域は図中に示される。 図３、3Sプロモーターの−90〜−290領域を増幅させた
時の遺伝子発現への影響を相対的なCATの発現量で示
す。 図４、エンハンサーとイントロンの相乗作用による伝子
発現の増強をCATの発現量で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 福地 淳 栃木県宇都宮市平松本町780番地 県営 平松住宅４―33 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84，Ｐ．4870− 4874（1987) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．236，Ｐ. 1299−1302（1987) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】35Sプロモーターの−290ないし−90に相当
   するDNA配列がスペーサーを介しまたは介さずに複数個
   配置されたDNA。
2. 【請求項２】複数個が２〜９個である請求項１記載のDN
   A。
3. 【請求項３】複数個が５〜８個である請求項１記載のDN
   A。
4. 【請求項４】35Sプロモーターの−290ないし−90に相当
   するDNA配列がスペーサーを介しまたは介さずに複数個
   配置されたDNAと、その下流域に遺伝子発現制御配列と
   を含有することを特徴とするDNA。
5. 【請求項５】該遺伝子発現制御配列がイントロンである
   請求項４に記載のDNA。
6. 【請求項６】該遺伝子発現制御配列がファゼオリン遺伝
   子から誘導されたイントロンＩである請求項４に記載の
   DNA。
7. 【請求項７】35Sプロモーターの−290ないし−90に相当
   するDNA配列がスペーサーを介しまたは介さずに複数個
   配置されたDNAと、その下流域に遺伝子発現制御配列と
   を含有するDNAを組み込んでなることを特徴とするベク
   ター。
8. 【請求項８】更に外来遺伝子を含有している請求項７に
   記載のベクター。