CN101621921B

CN101621921B - 水稻avrXa27基因对Xa27的诱导赋予抗水稻白叶枯病菌的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性

Info

Publication number: CN101621921B
Application number: CN2008800065901A
Authority: CN
Inventors: 尹中朝; 田冬生
Original assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Current assignee: Temasek Life Sciences Laboratory Ltd
Priority date: 2007-01-29
Filing date: 2008-01-08
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2028-01-08
Also published as: WO2008094127A1; US8334427B2; US20100162438A1; AU2008211358B2; CN101621921A; AU2008211358A1

Abstract

一般而言，本发明提供了一种在植物中产生抗水稻白叶枯病的广谱抗性的方法。更具体地，本发明提供了一种产生抗水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病的致病菌)的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌(水稻细菌性条斑病的致病菌)的增强抗性的方法。Xa27是一种可诱导的水稻白叶枯病R基因，受宿主表达的关联avrXa27基因诱导。携带avrXa27转基因和野生型Xa27基因的水稻具有抗非亲和性病原菌和亲和性病原菌的抗性和抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性。在IRBB27和携带pHM1avrXa27的L8之间的互作中也观察到Xa27介导的抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性。IRBB27的Xa27基因受细菌avrXa27基因诱导这一事实进一步证实了这一点。该方法可用于改造水稻对白叶枯病的广谱抗性和对水稻细菌性条斑病的增强抗性。该技术稍加修改后，可应用于控制其他作物的细菌性病害。

Description

水稻avrXa27基因对Xa27的诱导赋予抗水稻白叶枯病菌的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性

相关申请的交叉引用

本发明主张2007年1月29日提交的美国临时专利申请60/897,864的优先权。每件申请以引用方式纳入本文。

发明背景

一般而言，本发明涉及改造植物对细菌性病害的增强和广谱抗性的植物分子生物学和遗传学方法。

本文用于阐述本发明背景的出版物和其他材料，特别是提供实施附加细节的例子以引用方式纳入本文，为方便起见，在下文中按作者和日期进行引用，并在所附参考书目中按作者的字母顺序进行排列。

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)引起的水稻(Oryzasativa)白叶枯病(bacterial blight)是世界上最具破坏力的细菌性病害之一(Mew，1987)。水稻白叶枯病菌通过排水器进入感病品种，在上皮繁殖，随后迁移到木质部导管，引起整株感染(Ronald，1997)。抗病品种中无毒小种的生长减缓表现为细菌群体下降、病斑形成减少、防御基因表达活化、毗邻无毒细菌细胞的细胞壁和质膜改变(Young等人，1996；Gu等人，2005)。

细菌性条斑病(bacterial leaf streak)是另一种由水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)引起的水稻细菌性病害，它是水稻种植国家面临的新问题(Nino-Liu等人，2006)。水稻细菌性条斑病菌主要通过气孔进入叶片，在气孔下腔内繁殖，随后在薄壁组织的细胞间隙建群(Nino-Liu等人，2006)。与水稻白叶枯病菌一样，水稻细菌性条斑病菌也可通过伤口进入植物，但只限于叶肉组织的质外体，不侵入木质部(Ou，1985)。水稻细菌性条斑病菌从叶片的天然开口处呈链状或带状溢出，或在潮湿条件下呈小珠状溢出，这是细菌性条斑病的典型症状(Nino-Liu等人，2006)。

使用抗病品种是控制白叶枯病最经济有效的方法(Ogawa，1993)。水稻和水稻白叶枯病菌之间的小种专化性互作被认为遵循了经典的基因对基因概念(Flor，1971)。植物抗性(R)基因产物识别可能由病原菌的无毒(Avr)基因编码的激发分子或与其互作，导致级联防御反应的活化，有效抑制病原菌的侵入。目前，已从水稻鉴定出24种以上抗水稻白叶枯病菌的R基因或位点，其中大多数提供完整的小种专化抗性(Kinoshita，1995；Lin等人，1996；Zhang等人，1998；Khush和Angeles，1999；Gao等人，2001；Chen等人，2002；Yang等人，2003；He等人，2006)。已通过图位克隆分离出4种显性R基因即Xa21(Song等人，1995)、Xa1(Yoshimura等人，1998)、Xa26(Sun等人，2004)和Xa27(Gu等人，2005)和2种隐性R基因xa5(Iyer和McCouch，2004)和xa13(Chu等人，2006)。

很少开展关于细菌性条斑病控制方法的研究。和白叶枯病一样，实际上宿主的遗传抗性是细菌性条斑病最重要的控制措施，但到目前为止只局限于数量抗性(Gnanamanickam等人，1999；Sheng等人，2005；Tang等人，2000)。

与其他从双子叶植物分离的R基因不同的是，从水稻分离的白叶枯病抗性R基因编码差异极大的产物。Xa21和Xa26编码受体样蛋白(Song等人，1995；Sun等人，2004)。Xa21推定激酶结构域的生化分析揭示Xa21编码可在多个位点催化自身磷酸化的功能性丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Liu等人，2002)。Xa1基因产物含有核苷酸结合位点(NBS)和富含亮氨酸重复区域(LRR)，它是植物R蛋白最大类中的成员(Yoshimura等人，1998)。xa5基因编码转录因子IIA(TFIIA)的γ亚基，它是一个真核转录因子，没有先前已知的抗病作用(Iyer和McCouch，2004)。xa13基因编码MtN3样蛋白(Chu等人，2006)。该基因的显性等位基因在疾病易感性和花粉发育中可能都发挥作用(Chu等人，2006)。新近分离的Xa27基因编码一种新蛋白，它与水稻以外的生物的蛋白质没有明显的序列同源性(Gu等人，2005)。

目前，已从水稻白叶枯病菌分离出5种Avr基因，它们都属于III型效应物的AvrBs3家族。4种III型效应物AvrXa3(Li等人，2004；Lee等人，2005)、AvrXa7(Hopkins等人，1992；Vera Cruz等人，2000)、AvrXa10(Hopkins等人，1992；Zhu等人，1998)和avrXa27(Gu等人，2005)分别被宿主的4种关联显性R基因Xa3、Xa7、Xa10和Xa27识别。如果Xa5基因型易感水稻白叶枯病菌，推测III型效应物Avrxa5靶向野生型Xa5以产生致病性。Avrxa5在致病期间不能靶向突变蛋白xa5，因此含有纯合xa5等位基因的植物可抵抗或不易感水稻白叶枯病菌感染(Schornack等人，2006)。

Xa27和avrXa27是第一对分别从水稻和水稻白叶枯病菌分离的R基因和Avr基因(Gu等人，2005)。avrXa27是定位于细胞核的III型效应物AvrBs3/PthA家族的成员，具有含16.5个34氨基酸直接重复的中央重复结构域、含有3个核定位信号(NLS)基序的保守C末端区域和转录活化结构域(AD)。中央重复区域决定avrXa27激发的抗性特异性，而NLS基序和AD结构域则是Xa27依赖性的激发和抗性所需要的。出乎意料的是，Xa27作图群体的抗病亲本品系和感病亲本品系编码相同的Xa27蛋白。位于推测的Xa27/xa27启动子之间的核苷酸序列的多态性表明这两个等位基因可能存在不同的表达。的确，RNA印迹分析只检测到Xa27等位基因，而没有检测到xa27等位基因。进一步研究揭示，仅当水稻被携带avrXa27的细菌激发时，才发生Xa27等位基因表达，而当水稻被缺乏avrXa27的突变同基因株激发时，不发生Xa27等位基因表达。这些数据表明，Xa27对非亲和性病原菌的抗性特异性涉及Xa27等位基因在avrXa27效应物存在下的差异表达。

Avr基因具有毒性和宿主识别的双功能信号(Kjemtrup等人，2000；Alfano等人，2004；Yang等人，2000)。当Avr基因发挥其毒性功能时，它抑制亲和性互作中致病期间的宿主防御。但是，当Avr基因作为无毒基因时，它背叛病原菌，转而参与植物防御，被宿主的关联R基因识别，触发非亲和性互作中的过敏反应(HR)。发现植物表达的几种Avr蛋白的毒性功能可在缺乏关联R基因的植物中引起宿主防御抑制、细胞死亡或坏死(Gopalan等人，1996；McNellis等人，1998；Duan等人，1998；Chen等人，2000；Chen等人，2004；Hauck等人，2003)。在携带特异R基因的植物中，植物表达的Avr蛋白可激发HR或引起致死(Gopalan等人，1996；Scofield等人，1996；Tang等人，1996；Van den Ackerveken等人，1996；de Feyter等人，1998；McNellis等人，1998；Stevens等人，1998)。

有必要开发在植物中产生抗病性的方法，特别是开发产生抗白叶枯病的广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。

发明内容

一般而言，本发明提供了在植物中产生抗白叶枯病的广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。更具体地，本发明提供了一种产生抗水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病的致病菌)的广谱抵抗性和抗水稻细菌性条斑病菌(水稻细菌性条斑病的致病菌)的增强抗性的方法。Xa27是一种可诱导的水稻白叶枯病R基因，受宿主表达的关联avrXa27基因诱导。携带avrXa27转基因和野生型Xa27基因的水稻具有抗非亲和性病原菌和亲和性病原菌的抗性和抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性。同样在IRBB27和携带pHM1avrXa27的L8之间的互作中观察到Xa27介导的抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性。IRBB27的Xa27基因受细菌avrXa27基因诱导这一事实进一步证实了这一点。该方法可用于改造水稻对白叶枯病的广谱抗性和对细菌性条斑病的增强抗性。该技术稍加修改后，可应用于控制其他作物的细菌性病害。

因此，在第一方面，本发明提供了具有稳定整合到其基因组的avrXa27基因的转基因植物。在一个实施方式中，avrXa27基因是从水稻白叶枯病菌分离的野生型基因。在另一实施方式中，avrXa27基因已被修饰。在另一实施方式中，所述基因是avrXa27样的III型效应物基因，其可为野生型或修饰型。本文使用的avrXa27基因一般意义上指这些实施方式中的每一种，除非上下文另有说明。

在第二方面，本发明提供了具有avrXa27基因和Xa27基因的植物。在一个实施方式中，以avrXa27基因转化含有Xa27基因的植物，产生所述植物。在另一实施方式中，以含有avrXa27基因的转基因植物与含有Xa27基因的植物杂交，产生所述植物。在一个实施方式中，含有Xa27基因的植物是含有该基因的天然植物，所述植物天然含有该基因或是来自常规育种。在另一实施方式中，含有Xa27基因的植物是Xa27基因的转基因植物。具有avrXa27基因和Xa27基因的植物对亲和性和非亲和性白叶枯病菌菌株具有广谱抗性，对细菌性条斑病菌菌株具有增强抗性。

在第三方面，本发明提供了一种通过在植物中表达avrXa27基因来诱导Xa27基因表达的方法。avrXa27基因在启动子控制下在植物中表达。在一个实施方式中，启动子是组成型启动子。在另一实施方式中，启动子是诱导型启动子。在另一实施方式中，启动子是组织特异性启动子。植物可为上述的任何植物。

在第四方面，本发明提供了一种在植物中产生抗白叶枯病的增强和广谱抗性的方法。该方法包括在含有Xa27基因的植物中表达avrXa27基因，其中avrXa27基因的表达诱导Xa27基因的表达。在一个实施方式中，avrXa27基因在感染致病病原菌前表达。在另一实施方式中，avrXa27基因在植物已被感染后表达。植物可为上述的任何植物。

在第五方面，本发明提供了一种在植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。该方法包括在含有Xa27基因的植物中表达avrXa27基因，其中avrXa27基因的表达诱导Xa27基因的表达。在一个实施方式中，avrXa27基因在感染致病病原菌前表达。在另一实施方式中，avrXa27基因在植物已被感染后表达。植物可为上述的任何植物。

依据本发明的植物可为稻(rice)、胡椒、番茄、豆类(bean)、棉花、黄瓜、甘蓝(cabbage)、大麦、燕麦(oat)、小麦、玉米和柑橘(citrus)。

附图简述

图1显示了pCPR1avrXa27的T-DNA区域的示意图。箭头表示Hpt基因的转录方向。LB，左边界；RB，右边界；T_35S，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的终止子；P_35S，CaMV 35S基因的启动子；P_PR1，水稻PR1基因的启动子；avrXa27ORF，水稻白叶枯病菌PXO99^A的avrXa27编码区域；T_nos，胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子。B，BamHI；N，NdeI；X，XbaI；F1，PR1启动子的正向引物；R1，PR1启动子的反向引物；F2，T_nos的正向引物；R2，T_nos的反向引物。

图2显示了转基因avrXa27植物的分子分析。从转基因植物(L1、L14、L24和L25)以及对照植物分离的2-5微克DNA以限制性内切酶NdeI和XbaI消化，或仅以BamHI消化。以来自avrXa27的³²P-标记的3234-bp BamHI片段探测DNA印迹。箭头表示pCPR1avrXa27中avrXa27编码区域的BamHI片段的位置。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。

图3显示了avrXa27转基因在转基因植物中的表达。对4种选择的avrXa27转基因植物(L24、L1、L14和L25)以及对照植物进行RNA印迹分析。分离未接种植物(UI)或以水稻白叶枯病菌菌株PXO99^A接种3天后的植物(3DAI)的总RNA。每泳道上样约30μg总RNA。以亚甲蓝对RNA印迹进行染色，评价RNA上样。以来自avrXa27的³²P-标记的3234-bp BamHI片段探测RNA印迹。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。

图4a和4b显示了F₁植株中avrXa27转基因对Xa27基因的特异诱导。图4a：Xa27在源自IRBB27与不同转基因植物(L24、L1、L14和L25)杂交的F₁植株中的表达。在两个实验中，每泳道上样约5μg mRNA，水稻泛素基因2(Ubi)的表达用作上样对照。以³²P-标记的全长Xa27 cDNA探测RNA印迹。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。图4b：来自L24的avrXa27转基因特异诱导Xa27，但没有特异诱导xa27。

图5显示IRBB27x L24的F₁植株具有抗非亲和性和亲和性水稻白叶枯病菌菌株的抗性。PXO99^A和AXO1947(pHM1avrXa27)是携带野生型Xa27基因的IRBB27植物上的非亲和性水稻白叶枯病菌菌株，而AXO1947是亲和性菌株。Nipponbare是野生型粳稻品种。L24是以Nipponbare为背景的avrXa27转基因品系。Nipponbare和L24易感所有受试的细菌菌株。F₁植株(F₁₎源于IRBB27和L24之间的杂交。

图6a-6e显示了Xa27基因的表达提供抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性。图6a：以水稻细菌性条斑病菌菌株L8接种后第10天时IRBB27x对照品系、IR24x L24和IRBB27x L24的BC₃F₁植株叶片上的细菌性条斑病的病害表型。对照品系源自以pC1305.1转化的Nipponbare。图6b：注射浸润10天内，IRBB27x对照品系、1R24x L24和1RBB27x L24的BC₃F₁植株叶片上的水稻细菌性条斑病菌菌株L8的细菌群体。图6c：以水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)(叶1和3)和L8(pHM1avrXa27)(叶2和4)接种后第3天(叶1和2)和第10天(叶3和4)时，IRBB27植物叶片上的细菌性条斑病的病害表型。图6d：注射浸润10天内，IRBB27植物叶片上水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)和L8(pHM1avrXa27)的细菌群体。图6e：水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)和L8(pHM1avrXa27)对IRBB27植物叶片中Xa27的诱导。泳道1，注射浸润后第0天时以L8(pHM1)浸润的IRBB27；泳道2，注射浸润后第0天时以L8(pHM1avrXa27)浸润的IRBB27；泳道3，注射浸润后第3天时以L8(pHM1)浸润的IRBB27；泳道4，注射浸润后第3天时以L8(pHM1avrXa27)浸润的IRBB27。

具体实施方式

植物对病原菌的小种专化抗性是由宿主的抗性(R)基因和病原菌的关联无毒(Avr)基因控制的。一般而言，本发明提供了在植物中产生抗白叶枯病的广谱抗性的方法。一般而言，本发明还提供了在植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。更具体地，本发明提供了一种产生抗水稻白叶枯病菌(水稻白叶枯病的致病菌)的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌(水稻细菌性条斑病的致病菌)的增强抗性的方法。Xa27是一种可诱导的水稻白叶枯病R基因，受宿主植物表达的关联avrXa27基因诱导。携带avrXa27转基因和野生型Xa27基因的水稻具有抗非亲和性病原菌和亲和性病原菌的抗性和抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性。该方法可用于改造水稻对白叶枯病的广谱抗性。该技术稍加修改后，可应用于控制其他作物的细菌性病害。

细菌性病原菌与其植物宿主之间的互作一般分为两类：(1)亲和性互作(病原菌-宿主)，导致宿主植物出现细胞内细菌生长、症状和发生病害；和(2)非亲和性互作(病原菌-非宿主)，导致过敏反应，这是一种特殊类型的、没有出现日益严重的病害症状的非亲和性互作。与宿主植物发生亲和性互作时，细菌群体显著增加，并出现日益严重的症状。发生非亲和互作时，细菌群体没有增加，也没有出现日益严重的症状。

在本发明的一个实施方式中，以农杆菌介导的转化产生稳定的avrXa27转基因品系。也可使用本文描述的DNA构建体和技术人员熟知的技术制备稳定的转基因品系。avrXa27基因在转基因品系中的表达在缺乏Xa27的Nipponbare中没有引起明显的HR或其他可见的应激表型。以RNA印迹分析揭示来自IRBB27(Xa27/Xa27)与avrXa27转基因品系杂交的F₁植株中Xa27基因的组成型诱导。即使没有在免疫印迹分析中检测到转基因品系的avrXa27蛋白，但F₁植株仍表现出对非亲和性病原菌和亲和性病原菌的高度抗性。Xa27基因是1R24遗传背景中的显性抗性基因。但是，它在其他水稻遗传背景例如CO39中可能为半显性抗性基因(Gu等人，2004)。Xa27在源自IRBB27与Nipponbare杂交的F₁植株中也表现出对白叶枯病的中抗或半显性表型。本发明提供了一种在源自IRBB27与Nipponbare杂交的F₁植株中以及其他植物中产生Xa27基因对白叶枯病的增强抗性或完全抗性的新方法。即使Xa27基因具有抗多种水稻白叶枯病菌菌株的广谱抗性，IRBB27植物仍易感5种亲和性水稻白叶枯病菌菌株(Gu等人，2004)。本发明提供了一种产生抗亲和性水稻白叶枯病菌菌株的增强抗性的新方法，因此，改造的水稻比IRBB27植株具有更宽的抗谱。此外，本发明提供了一种产生抗细菌性条斑病菌的增强抗性的新方法，因此，改造的水稻与亲本植株相比，具有增强的抗性。总之，本发明提供了一种在水稻和其他植物中产生抗白叶枯病的增强抗性和广谱抗性的新方法，以及一种在水稻和其他植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的新方法。

更具体地，本发明的方法包括以无毒基因稳定转化植物，该无毒基因具体为编码avrXa27蛋白的核酸，其可操作连接于可驱动基因在植物细胞内表达的启动子。多核苷酸如果在其天然状态下或以本领域技术人员熟知的方法操作时，可被转录和/或翻译产生mRNA和/或多肽或多肽片段时，即被认为“编码”多肽。反义链是这类核酸的互补链，可从反义链推导出编码序列。无毒基因的表达诱导Xa27基因，从而提供了抗亲和性和非亲和性病原菌(具体为黄单胞菌属)的广谱和增强抗性。

在一个实施方式中，avrXa27蛋白具有SEQ ID NO：2列出的氨基酸序列(GenBank登录号AAY54168)。当在含有Xa27抗性基因的植物中表达时，avrXa27蛋白提供抗白叶枯病的广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性。

在又一实施方式中，avrXa27蛋白可为修饰的或可为活性片段。本文使用的“蛋白质修饰物或片段”与初级结构序列基本同源，但含有例如体内或体外化学和生化修饰或掺有非常见氨基酸，但一般不影响该蛋白质的生物学活性。这类修饰包括例如乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(例如以放射性核素进行的标记)、各种酶学修饰，这些修饰容易为本领域技术人员所理解。为方便起见，将使用avrXa27蛋白(或相应基因)用于本文的描述目的。但是，应理解的是，该蛋白质(或相应基因)可指野生型或修饰型avrXa27蛋白(或基因)。

其他的蛋白质修饰包括氨基酸置换。置换变体一般在蛋白质内的一个或多个位点处含有一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，可设计用于调节多肽的一种或多种属性，例如对蛋白酶剪切的稳定性，而不损失其他功能或属性。可根据涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性，进行氨基酸置换。优选的置换是保守的置换，即一个氨基酸被替换为一个具有类似形状和电荷的氨基酸。保守置换为本领域技术人员所熟知，一般包括但不限于下列基团内的置换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。

蛋白质结构中的某些氨基酸可被置换为其他氨基酸，而该蛋白质与结构例如抗体的抗原结合区域或底物分子的结合位点或与多肽互作的蛋白质的结合位点的交互结合能力没有明显损失。由于正是蛋白质的交互能力和性质决定了该蛋白质的生物功能活性，可对蛋白质序列及其DNA编码序列进行某些氨基酸的置换，仍得到具有类似属性的蛋白质。进行这类变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。疏水氨基酸指数在赋予蛋白质交互生物学功能中的重要性一般为本领域所理解。或者，可根据亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。亲水性在赋予蛋白质交互生物学功能中的重要性一般为本领域所理解(例如参阅美国专利4,554,101)。疏水指数或亲水性在设计多肽中的应用进一步在美国专利5,691,198中进行了描述。

本发明还提供了融合多肽，其包含avrXa27多肽及其片段和本领域知晓的多肽或其他蛋白质的片段。同源多肽可为两个或更多多肽序列之间的融合物或avrXa27序列和相关蛋白序列之间的融合物。同样，可构建表现出衍生蛋白的属性或活性组合的异源融合物。例如，配体结合结构域或其他结构域可在不同的新融合多肽或片段之间“交换”。这类同源或异源融合多肽可表现出例如改变的结合强度或特异性，可包括例如配偶体例如FLAG表位、免疫球蛋白、细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白A、β-内酰胺酶、α-淀粉酶、醇脱氢酶和酵母α-交配因子。

本发明的多核苷酸组成(composition)包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式，可被化学或生化方式修饰，或含有非天然或衍生的核苷酸碱基，这些容易为本领域的技术人员理解。这类修饰包括例如标记、甲基化、以类似物置换一个或多个天然核苷酸、核苷酸间修饰例如不带电的连接(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电的连接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰键(例如α-异头核酸等)。模拟多核苷酸经氢键和其他化学相互作用结合到指定序列的能力的合成分子也包括在内。这类分子为本领域知晓，包括例如分子骨架中的磷酸酯键被替换为肽键的分子。本发明的多核苷酸可为分离的或基本上纯的。“分离的”或“基本上纯的”核酸或多肽是基本同其他细胞组分分离开的核酸或多肽，其中其他细胞组分在自然状态下伴随天然序列或蛋白质，例如核糖体、聚合酶、许多其他人类基因组序列和蛋白质。该术语包括已从其天然环境除去的核酸序列或蛋白质，包括重组或克隆DNA分离物和化学合成类似物或以异源系统生物合成的类似物。

在一个实施方式中，编码avrXa27蛋白的核酸具有SEQ ID NO：1列出的核酸序列(GenBank登录号AY986494)。还预见了编码该蛋白质的其他核酸序列，例如源自遗传密码简并性的核酸。此外，还预见了编码该被修饰的蛋白质的核酸序列。

需要时，可优化无毒序列和任何其他基因，以增加在转化植物中的表达。即可使用植物优选的密码子合成这些核苷酸序列，提高表达。本领域有合成植物优选基因的方法。例如参阅美国专利5,380,831、美国专利5,436,391和Murray等人(1989)，其中每篇以引用方式纳入本文。

若可操作连接于在植物中有功能的启动子和/或其他调控序列时，本发明无毒基因的核苷酸序列可用于任何植物的基因操作。术语“启动子”或“调控元件”系指位于转录起始点上游或下游的区域或序列决定子，参与对RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合，以启动转录。“植物启动子”是可在植物细胞内启动转录的启动子。这类启动子无需为植物来源，例如源自植物病毒的启动子例如CaMV35S启动子可用于本发明。“调控序列”系指影响基因表达(包括基因转录、信使RNA的翻译、剪切、稳定性等)的序列。所谓“可操作地连接”是指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列启动和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般而言，可操作地连接是指相连的核酸序列是紧邻的，并在需要连接两个蛋白质编码区域时也是紧邻的，并处于同一阅读框内。

本发明的核苷酸序列提供在表达盒内，用于在目的植物中表达。“表达盒”系指核酸构建体，当它被导入到宿主细胞后，会导致RNA或多肽的分别转录和/或翻译。该定义明确地包括不翻译或不能翻译的反义构建体或有义构建体。“构建体”是从天然基因分离的核酸分子或已被修饰成含有核酸片段的核酸分子，其中这些核酸片段以自然状态下不会存在的方式被合并和并列在一起。这类表达盒含有可操作连接于本发明无毒基因序列的5′和3′调控序列。表达盒还可含有至少一个待共转化到生物体内的附加基因。或者，附加基因可提供到多个表达盒上。

一般而言，从5′-3′的转录方向，表达盒含有在植物中具有功能的转录和翻译起始区、本发明无毒基因序列、转录和翻译终止区。对于植物宿主而言，转录起始区即启动子可为天然的或类似的，或为外源的或异源的。此外，启动子可为天然序列或者为合成序列。所谓“外源”是指转录起始区不存在于导入转录起始区的天然植物，或者在转化后位于基因组上的不同位点。本文使用的嵌合基因包含可操作连接于转录起始区的编码序列，其中转录起始区与编码序列是异源的。

实施本发明时可使用许多启动子，其中包括组成型、诱导型、病原菌诱导型、伤口诱导型和组织特异性启动子。例如参阅美国专利7,109,397。例如，为了实现过表达，可使用植物启动子片段，指导基因在再生植株的所有组织中表达。这类启动子在本文中被称为“组成型”启动子，它们在大多数环境条件、发育或细胞分化状态下都具有活性。

广泛用于诱导转基因表达的一些组成型启动子的实例包括但不限于来自根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(NOS)基因(美国专利5,034,322)、花椰菜花叶病毒(CMV)35S和19S启动子(美国专利5,352,605)、源自已知在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中任何一种的启动子(美国专利6,002,068)、泛素启动子(已知可在许多细胞类型中积累的基因产物)、增强型35S启动子(美国专利5,106,739)、双35S启动子、来自玄参花叶病毒的FMV启动子(美国专利5,378,619)、RIT-DNA启动子(美国专利5,466,792)、章鱼碱T-DNA启动子(美国专利5,428,147)、醇脱氢酶1启动子(Callis等人，1987)、patatin启动子B33(Rocha-Sosa等人，1989)、E8启动子(Deikman和Fishcer，1988)、β-伴大豆球蛋白启动子(Tierney等人，1987)、酸性几丁质酶启动子(Samac等人，1990)、拟南芥组蛋白H4启动子(美国专利5,491,288)、或用于单子叶植物基因表达的重组启动子(美国专利5,290,924)。包括用于单子叶植物有效表达的调控元件的其他组成型调控元件也是本领域所知晓的，例如pEmu启动子和基于水稻肌动蛋白-15′区域的启动子(Last等人，1991；McElroy等人，1991；McElroy等人，1990)。

诱导型启动子是在诱导物作用下可直接或间接活化一种或多种DNA序列或基因转录的启动子。如果没有诱导物，DNA序列或基因不会被转录。诱导物可为化学剂，例如代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或直接施加给植物的生理应激，例如冷、热、盐、毒素，或通过病原菌或致病剂例如病毒或真菌的作用。可通过向细胞或植物外部施加诱导物例如通过喷雾、浇水、加热或通过暴露于致病病原菌使含有诱导型启动子的植物细胞暴露于诱导物。诱导型启动子系统的一个实例使用XVE转录因子(美国专利6,784,340)。诱导型启动子的另一实例是病原菌诱导型启动子。这类启动子包括来自致病相关蛋白(例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶)的启动子，感染病原菌后它们被诱导表达(例如参阅Redolfi等人，1983；Uknes等人，1992和Van Loon，1985)。在一个实施方式中，启动子是水稻PR1基因的启动子(Gu等人，2005；SEQ ID NO：13)。

或者，使用暴露于植物激素例如生长素时可被诱导的植物启动子来表达本发明的核酸。例如，本发明可使用大豆(Glycine max L.)的生长素应答元件E1启动子片段(AuxREs)(Liu，1997)；生长素应答拟南芥GST6启动子(也应答唾液酸和过氧化氢)(Chen等人，1996)；来自烟草的生长素诱导型parC启动子(Sakai等人，1996)；植物生物素应答元件(Streit和Phillips，1997)和应答应激激素脱落酸的启动子(Sheen，1996)。

此外，诱导型启动子包括以组织特异性方式在植物的选择组织内调控目的基因的启动子。处于发育控制下的组织特异性启动子的实例包括仅在某些组织例如果实、种子、根或花中启动转录的启动子。这类组织特异性启动子的实例为本领域熟知(美国专利5,750,385)，包括茎尖分生组织中表达的H4A748启动子(Atanassova等人，1992)。RCc2和RCc3启动子指导水稻的根部特异性基因转录(Xu等人，1995)。

因此，从5′-3′转录方向，表达盒含有在植物中具有功能的转录和翻译起始区、编码本发明无毒蛋白的核苷酸序列、转录和翻译终止区。终止区可与转录起始区为同一来源、与目的DNA序列为同一来源或可源自另外的来源。可从根癌农杆菌的Ti质粒获得方便的终止区，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。同样参阅Guerineau等人，(1991)；Proudfoot(1991)；Sanfacon等人，(1991)；Mogen等人，(1990)；Munroe和Jacobson(1990)；Joshi(1987)。

其他的序列修饰已知可提高细胞宿主内的基因表达。这些序列修饰包括消除编码假多腺苷酸化信号的序列、外显子-内含子剪切位点信号、转座子样重复和可能有害于基因表达的其他良好表征的序列。序列的G-C含量可调节至特定细胞宿主的平均水平，其水平参考宿主细胞内表达的已知基因进行计算。如果可能，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒在表达盒构建体中还可含有5′前导序列。这类前导序列可增强翻译。翻译前导序列为本领域知晓，包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)(Elroy-Stein等人，1989)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等人，1986)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak和Samow，1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling和Gehrke，1987)；烟草花叶病毒前导序列(Gallie等人，1989)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人，1991)。同样参阅Della-Cioppa等人，(1987)。还可使用其他已知可增强翻译的方法，例如内含子等。

制备表达盒时，可操作各种DNA片段，以提供具有适宜定向和需要时适宜阅读框的DNA序列。为了实现这一目的，可使用衔接头或接头连接DNA片段，或可涉及其他操作，以提供适宜的限制酶切位点、多余DNA的除去、限制酶切位点的除去等。出于该目的，可涉及体外诱变、引物修复、限制酶切、退火、替代例如转换和颠换。

包含本发明基因序列(例如启动子或编码区域)的载体一般包含赋予植物细胞选择表型的标记基因。例如，标记基因可编码杀生物剂抗性，特别是抗生素抗性，例如卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素抗性，或除草剂抗性，例如氯磺隆或Basta抗性。可在瞬时测定中使用任何可评分或可筛选的标记基因。用于本发明启动子或启动子片段的瞬时分析的优选标记基因包括GUS基因(美国专利5,599,670)或GFP基因(美国专利5,491,084)。含有可操作连接于标记基因的启动子或启动子片段的构建体被递送到组织内，根据标记基因以适宜的机制分析组织。使用定量或定性分析作为工具，评估启动子或启动子片段可操作连接于稳定植物中具有农艺价值的基因时的潜在表达概况。

一旦核酸已被克隆到表达载体上，可使用常规转化方法将它导入到植物细胞。术语“植物细胞”旨在涵盖源自植物包括未分化组织例如愈伤组织和悬浮培养以及植物种子、花粉或植物胚的任何细胞。适合转化的植物组织包括叶组织、根组织、分生组织、原生质体、下胚轴、子叶、盾片、茎尖、根、幼胚、花粉和花药。“转化”是指通过外部施加来自具有不同基因型的另一种细胞的重组DNA对细胞基因组进行的定向修饰，导致重组DNA被吸收并整合到对象细胞的基因组上。可以这样的方式得到遗传修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。

含有本发明无毒序列的DNA构建体可用于转化任何植物，并可通过各种常规技术导入所需植物宿主的基因组上。转化各种高等植物物种的技术是熟知的，并在技术和科学文献中进行了描述。例如参阅Weising等人(1988)。转化方案可依靶向转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异，而这是技术人员所熟知的。例如，可使用植物细胞原生质体电穿孔和显微注射等技术将DNA构建体直接导入植物细胞的基因组DNA，或者可使用冲击法(ballistic method)例如DNA粒子轰击法将DNA构建体直接导入植物组织。或者，DNA构建体可与适宜的T-DNA侧翼区结合，导入到常规的根癌农杆菌宿主载体上。当细胞被细菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒性功能将指导构建体和邻近的标记基因插入到植物细胞DNA上。

显微注射技术为本领域知晓，并在科学和专利文献中进行了很好的描述。Paszkowski等人(1984)描述了使用聚乙二醇沉淀法导入DNA构建体。Fromm等人(1985)和美国专利5,384,253描述了电穿孔技术。Klein等人(1987)；Tomes等人(1995)；美国专利4,945,050；美国专利5,015,580；美国专利5,550,318；美国专利5,538,880；美国专利6,160,208；美国专利6,399,861和美国专利6,403,865描述了微弹轰击技术。

根癌农杆菌介导的转化技术，包括双元载体的解毒(disarming)和使用，在科学文献中得到了很好的描述。例如参阅Horsch等人(1984)；Fraley等人(1983)；美国专利5,563,055；美国专利5,824,877；美国专利5,591,616；美国专利5,981,840；美国专利6,384,301和美国专利7,112,721。

可培养源自以上转化技术中任何一种的转化植物细胞，再生成具有转化基因型和所需表型的完整植株，例如转基因植物。“转基因植物”是导入外源DNA的植物。“转基因植物”包括转基因植物有性繁殖或无性繁殖产生的继续携带外源DNA的所有后代、杂交种和杂种。再生技术依赖某些植物激素在组织培养生长培养基中的操作，一般依赖于与所需核苷酸序列一同导入的杀生物剂和/或除草剂标记基因。Evans等人(1983)；Binding(1985)；Vasil(1984)和Vasil(1986)描述了来自培养的原生质体的植物再生。还可从植物愈伤组织、外植体、器官或部分的愈伤组织、外植体、器官得到再生。Klee等人(1987)概括地描述了这类再生技术。已知可从培养的细胞或组织再生几乎所有植物。

再生的方法依植物物种而异，但一般首先提供转化原生质体的混悬液或含有转化外植体的培养皿。形成愈伤组织，可从愈伤组织诱导出茎，随后生根。或者，可在愈伤组织上诱导胚形成。这些胚作为天然胚开始发育，形成植株。培养基一般含有各种氨基酸和激素，例如生长素和细胞因子。向培养基加入谷氨酸和脯氨酸也是有利的，特别是对于玉米和苜蓿等物种。有效的再生取决于培养基、基因型和培养时间。如果控制这三个变量，再生通常是可再现和可重复的。

上述转化方法一般用于产生稳定整合表达盒的转基因品种。表达盒被稳定整合到转基因植物后，它可通过有性杂交转移到其他植株。在一个实施方式中，转基因品种随后与另一(非转化或转化)品种杂交，以产生新的转基因品种。或者，可使用植物育种领域熟知的传统回交技术将利用上述转化技术改造到特定棉花品系上的遗传性状转移到另一品系。例如，可使用回交方法将改造的性状从公共的、非优良品种转移到优良品种，或从基因组含有外源基因的品种转移到不含有该基因的单个品种或多个品种。根据上下文，本文使用的“杂交”可指简单的X与Y的杂交，或回交过程。根据待杂交的物种，可使用许多标准育种技术中的任何一种。

一旦产生这一类型的转基因植物，这些植物本身可按照常规方法进行培养。当然，可从转基因植物回收转基因种子。随后可使用常规方法将这些种子种植到土壤中进行培养，以产生转基因植株。

依据本发明，产生含有avrXa27基因的转基因植物。在一个实施方式中，以本文描述的avrXa27基因转化水稻细胞，产生转基因植物。在一方面，转化的水稻细胞不含有Xa27基因。在第二方面，转化的水稻细胞可含有Xa27基因，这样就得到同时含有avrXa27基因和Xa27基因的转基因植物。含有Xa27基因的水稻细胞可源自天然含有Xa27基因的水稻品种，或源自依据本文描述原理已被稳定转化从而含有Xa27基因的水稻品种。SEQID NO：4列出了Xa27蛋白，SEQ ID NO：3列出了Xa27基因的一个实施方式。还预见了编码Xa27蛋白的其他核酸序列，例如源自遗传密码简并性的核酸。与avrXa27蛋白一样，Xa27蛋白可为被修饰的蛋白质，只要它保留其活性。蛋白质修饰包括本文对avrXa27蛋白所描述的蛋白质修饰。还预见了编码所述被修饰的蛋白质的核酸序列。

根据本发明，提供了具有avrXa27基因和Xa27基因的植物。在一个实施方式中，所述植物是含有这两种基因的转基因植物。在一个方面，使用例如本文描述的技术以avrXa27基因和Xa27基因同时转化植物，产生转基因植物。在另一方面，使用例如本文描述的技术首先以avrXa27基因或Xa27基因转化植物，产生转基因植物，随后使用例如本文描述的技术以另一基因转化该转基因植物。在另一实施方式中，使用常规植物育种技术以含有avrXa27基因的转基因植物与含有Xa27基因的植物杂交，产生所述植物。在一个实施方式中，含有Xa27基因的植物是含有该基因的天然植物，其中该基因或是天然含有，或是来自常规育种。在另一实施方式中，所述植物是含有Xa27基因的转基因植物。这些植物具有抗白叶枯病致病菌的亲和性和非亲和性细菌菌株的广谱抗性。这些植物还具有抗细菌性条斑病的增强抗性。

依据本发明，提供了一种通过在植物中表达avrXa27基因来诱导Xa27基因表达的方法。在一个实施方式中，avrXa27基因在还含有Xa27基因的植物中表达。该植物可为转基因植物或可通过常规育种产生。avrXa27基因在本文所述启动子的控制下在植物中表达。在一个实施方式中，启动子是组成型启动子，其中avrXa27基因在植物生长期间的各个时期表达。在另一实施方式中，启动子是诱导型启动子，其中avrXa27基因在植物生长期间在诱导物的存在下被诱导表达。在另一实施方式中，启动子是组织特异性启动子，其中avrXa27基因表达局限于植物生长期间具有该活性启动子的组织。

同样依据本发明，提供了一种在植物中产生抗白叶枯病的增强和广谱抗性和抗细菌性条斑病的增强抗性的方法。该方法包括在含有Xa27基因的植物中表达avrXa27基因，其中avrXa27基因的表达诱导Xa27基因的表达。在一个实施方式中，avrXa27基因在感染致病病原菌前表达。在另一实施方式中，avrXa27基因在植物已被感染后表达。avrXa27基因的表达可为组成型、诱导型或组织特异性的。如果表达是组成型的，avrXa27基因在植物生长期间的各个时期表达。如果表达是诱导型的，avrXa27基因在植物生长期间因诱导物在植物中的存在而被诱导表达。如果表达是组织特异性的，avrXa27基因表达局限于植物生长期间具有活性启动子的组织。avrXa27基因表达引起的Xa27基因表达产生抗亲和性和非亲和性病原菌菌株引起的白叶枯病的广谱抗性。avrXa27基因表达引起的Xa27基因表达还产生抗细菌性条斑病的增强抗性。

本文描述的技术稍加修饰后，应用于控制其他植物的细菌性病害，这些植物包括但不限于胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘。除1例以外(来自茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)的Brg11)(Cunnac等人，2004)，III型效应物的AvrBs3/PthA家族成员均只存在于黄单胞菌属(Lahaye和Bonas，2001)。来自野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(X.campestris pv.vesicatoria，一种胡椒和番茄的病原菌)的AvrBs3(Bonas等人，1989)、来自地毯草黄单胞菌柑桔致病变种(X.axonoposis pv.citri，一种柑橘病原菌)的PthA(Swarup等人，1991)、来自野油菜黄单胞菌锦葵致病变种(X.campestris pv.malvacearum，一种棉花病原菌)的Avrb6(De Feyter和Gabriel，1991)、来自水稻白叶枯病菌(一种水稻病原菌)的AvrXa7或AvrXa10(Hopkins等人，1992)的无毒活性激发携带相应R基因的抗性植物的HR和抗性。这些无毒效应物在宿主植物的表达激发抗这些病原细菌的R基因介导的抗性。应注意的是，AvrBs3/PthA家族的一些成员不仅表现出无毒活性，还有助于细菌的毒性(Swarup等人，1991；Yang等人，1996；Bai等人，2000；Marois等人，2002)。因此，应使用诱导型启动子(例如病原菌诱导型启动子)控制这些Avr基因在携带相应R基因的植物宿主内的表达。

除非另有说明，本发明的实施采用了化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，它们都位于本领域的技术内。例如参阅Maniatis等人，1982，Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)；Ausubel等人，1992)，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley & Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Russell，1984，Molecular biology ofplants：a laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)；Anand，Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press，New York，1992)；Guthrie和Fink，Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology(Academic Press，New York，1991)；Harlow和Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical GuideTo Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu等人.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，EssentialImmunology，6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988。

实施例

参照下列实施例对本发明进行了描述，提供的这些实施例用于阐释，而绝非用于限制本发明。使用了本领域熟知的标准技术或下文具体描述的技术。

实施例1

材料和方法

质粒、细菌菌株和生长条件

本研究使用的质粒是粘粒99-avrXa27-20(Gu等人，2005)和pHM1avrXa27、克隆载体pGEM-T-easy(Promega，WI 53711，USA)和植物转化载体pC1305.1(CAMBIA，Canberra，Australia)和pCPR1avrXa27(本文描述了制备方法)。本研究使用的细菌菌株是大肠杆菌菌株DH10b(Carlsbad，CA92008，USA)、根癌农杆菌菌株AGL1(Lazo等人，1991)、水稻白叶枯病菌菌株PXO99^A、AXO1947、AXO1947(pHM1avrXa27)、K202、ZHE173和CIAT1185以及水稻细菌性条斑病菌菌株L8(pHM1)和L8(pHM1avrXa27)。大肠杆菌以Luria-Bertani培养基37℃培养；根癌农杆菌菌株以YEB培养基28℃培养；水稻白叶枯病菌菌株和水稻细菌性条斑病菌菌株以PSA培养基28℃培养(Gu等人，2004)。采用电穿孔将质粒导入大肠杆菌、根癌农杆菌、水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌菌株(Sambrook等人，1989)。

植物材料和生长条件

本研究使用的水稻品系是Xa27的近等基因系IRBB27(Gu等人，2004)和Nipponbare品种。以26℃(夜)到32℃(日)的温室培养水稻，其中包括以水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌菌株接种的水稻。

植物转化

按照前人描述方法对Nipponbare进行根癌农杆菌介导的转化(Yin和Wang，2000)。简而言之，源自成熟胚盾片且生长旺盛的胚性愈伤组织与携带pCPR1avrXa27的根癌农杆菌菌株AGL1进行共培养。共培养后，以含有250mg/L头孢噻肟、200mg/L氨苄西林、2mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和50mg/L潮霉素的NB₀培养基26℃暗处培养水稻组织3-4周。抗潮霉素的愈伤组织以新鲜选择培养基传代培养两周；随后转移到含有1mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)、2mg/L萘乙酸(NAA)、5mg/L脱落酸(ABA)和50mg/L潮霉素的NB₀培养基，培养2-3周。表现出潮霉素抗性的致密白色胚性愈伤组织转移到含有2mg/L 6-BA、1mg/L吲哚乙酸(IAA)、1mg/L NAA、1mg/LKT(激动素)和50mg/L潮霉素的NB₀培养基上，采用14小时光照、10小时黑暗的周期在26℃下培养胚性愈伤组织。再生植株随后转移到罐中土壤，温室培养。

白叶枯病接种

使用剪叶法进行白叶枯病接种(Kauffrnan等人，1973)。简而言之，水稻白叶枯病菌菌株以PSA培养基(10g/L蛋白胨、10g/L蔗糖、1g/L谷氨酸、16g/L细菌培养用琼脂，pH 7.0)培养2-3天。细菌细胞以无菌水混悬，菌体密度OD₆₀₀为0.5。使用蘸取接种物的剪刀距叶片顶部5-6cm处剪取叶片，将细菌细胞混悬液施用给每个分蘖的两片最嫩完全展开叶。接种两周后测量病斑长度(LL)。病害症状依次分为抗病(R，LL＜3.0cm)，中度抗病(MR，3.0cm＜LL＜6.0cm)，中度感病(MS，6.0cm＜LL＜9.0cm)和感病(S，LL＞9.0cm)(Amante-Bordeos等人，1992)。

细菌性条斑病接种

为了进行细菌性条斑病接种，水稻细菌性条斑病菌菌株L8、L8(pHM1)或L8(pHM1avrXa27)以含有适宜抗生素的PSA培养基培养2-3天。细菌细胞以无菌水混悬，菌体OD₆₀₀密度为0.5。6周时，使用无针注射器以细菌混悬液浸润叶片对水稻进行接种(Schaad等人，1996)。使用Makino等人(2006)报道的方法，稍加修改，测定接种植物的细菌群体。简而言之，取下水稻叶片的浸润区域，以5ml无菌水研磨。制备逐级稀释液，涂抹到含有适宜抗生素的PSA琼脂平板上。28℃下接种平板，直到可计数单个菌落。随后估算每叶片的CFU数目，使用来自重复实验的菌落数目计算标准差。实验重复5次。

DNA印迹分析

从叶片提取水稻基因组DNA(Dellaporta等人，1984)。约2μg的水稻DNA以适宜的限制性内切酶消化，随后以0.65-0.8％琼脂凝胶电泳分离。按照标准方法进行DNA印迹分析(Sambrook等人，1989)。以来自AmershamBiosciences的Rediprime^TMII进行探针标记和信号检测。

RNA印迹分析

使用QIAGEN的RNeasy Plant Mini Kit从水稻叶片分离总RNA。每份样品约20μg总RNA用于RNA印迹分析。按照标准方法进行RNA印迹分析(Sambrook等人，1989)。通过溴化乙锭(EtBr)染色或通过与水稻泛素1(Ubi)基因的杂交评估RNA上样。按照上述方法进行探针标记和信号检测。

实施例2

pCPR1avrXa27的构建

基于CAMBIA载体pC1305.1构建pCPR1avrXa27。来自粘粒99-avrXa27-20(Gu等人，2005)avrXa27基因的3482-bp基因组克隆(包括3411-bp的全长编码序列(SEQ ID NO：5))被亚克隆到pGEM-T-easy载体(Promega)上，生成中间构建体pTavrXa27。pTavrXa27中avrXa27基因的3234-bp BamHI片段被替换为来自pZWavrXa27(Gu等人，2005)的avrXa27F2H基因的BamHI片段，生成pTZWavrXa27。分离来自pTZWavrXa27(含有avrXa27基因(SEQ ID NO：I))的Sac II-AseI片段，经平端化后，克隆到pC1305.1中的水稻PR1启动子(Gu等人，2005；SEQ ID NO：5)下游，产生pCPR1avrXa27(图1)。用于测定转基因植物中PR1启动子和胭脂碱合成酶基因(Tnos)存在的引物对分别是PF/PR(5′-CCATGATTACGAATTCGAGCTCGG-′3(SEQ ID NO：6)和5′-AAGAAGCGACGGATCGAACTGAC-3′(SEQ ID NO：7))以及TF/TR(5′-CGAAGAGGAGCTCGCATGGTTGAT-3′(SEQ ID NO：8)和5′-CACTGATAGTTTAATTCCCGATCTAG-3′(SEQ ID NO：9))。

实施例3

avrXa27转基因植物的生成

以双元质粒pCPR1avrXa27(图1)对Nipponbare品种进行农杆菌介导的转化，产生avrXa27转基因植物。pCPR1avrXa27在其T-DNA区携带P_PR1-avrXa27-Tnos融合基因。一共产生34株独立的转基因T₀植株。但是，经过分子分析，仅发现4株T₀植株(L1、L14、L24和L25品系)携带完整的avrXa27基因。在这4株转基因植株中(图2，泳道5、7、9和11)，DNA印迹分析均检测到对应于avrXa27编码区域(图1)的预计BamHI片段的3.2-kb条带。在L24(图2，泳道8)中检测到对应于预计Nde I-XbaI片段的4.5-kb条带，该片段包含PR1启动子和avrXa27编码区域(图1)。但是，没有在L1、L14和L25中检测到这条4.5-kb的Nde I-XbaI条带。相反，它们都携带分子大小大于4.5kb的Nde I-XbaI条带(图2，泳道4、6和10)。为了进一步鉴定这些转基因植物中的avrXa27基因，我们分别采用引物对F1/R1和F2/R2经PCR分离P_PR1-avrXa27-Tnos融合基因的5′启动子区域和3′终止子区域。PCR扩增产物的DNA序列表明L24携带完整的5′启动子和3′终止子。L1、L14和L25也含有完整的3’终止子区域。但是，它们在PR1启动子5′端的少数几个碱基对处发生轻微突变，导致XbaI位点丢失。这些avrXa27转基因植物的形态与非转基因的Nipponbare或以空载体pC1305.1转化的对照品系的形态类似。avrXa27转基因植物进行自交，选择纯合后代用于进一步研究。

实施例4

avrXa27基因在转基因植物中的表达

RNA印迹分析表明，avrXa27转基因在L1、L14、L24和L25中呈组成型表达(图3)。未接种(UI)植株和以水稻白叶枯病菌菌株PXO99^A接种的植株在接种后第三天(3DAI)的avrXa27表达没有明显差异。RNA印迹分析检测到的全长avrXa27转录物为约4kb的杂交条带。avrXa27转基因品系和对照品系用作花粉供体，分别与IRBB27(具有IR24背景的近等基因系)和IR24杂交。

实施例5

L24白叶枯病抗性的病害评估

为了检测水稻的avrXa27基因是否具有毒性和/或无毒功能，我们以5种亲和性和1种非亲和性水稻白叶枯病菌菌株接种纯合的L24T₂植株。感染细菌时，avrXa27基因在Nipponbare中的表达没有表现出任何的毒性功能。相反，在这5种亲和互作和1种非亲和互作中(表1)，L24T₂植株上的白叶枯病病斑比未转化的野生型植株略短。这些数据表明宿主的avrXa27基因对水稻白叶枯病菌的致病没有或只有极弱的毒性功能。

表1

Nipponbare的avrXa27转基因对亲和性或非亲和性水稻白叶枯病菌菌株均没有表现出任何毒性功能^a

病斑长度(cm)和抗性评分^b

品系

PXO99^A

AXO1947

AXO1947(PHM1avrXa27)

K202

ZHE173

CIAT1185

Nipponbare

20.8±4.7(S)

24.5±8.3(S)

18.9±4.2(S)

15.6±±4(S)

4.7±2.5(MR)

L24

20±2.4(S)

19.7±±3(S)

16.9±2.5(S)

16.5±3.1(S)

14±±3.2(S)

3.7±2.5(MR)

^a六周龄植株以水稻白叶枯病菌接种。对于每种水稻白叶枯病菌菌株，至少接种来自四棵植株的16片叶。病斑长度是16片受感染叶片的平均值。示出了均值的标准差。

^b括号中抗性评分的标准差。R，抗病，0cm＜病斑长度＜3.0cm；MR，中度抗病，3.0cm＜病斑长度＜6.0cm：MS，中度感病，6.0cm＜病斑长度＜9.0cm；S，感病，病斑长度＞9.0cm

实施例6

水稻avrXa27转基因对Xa27基因的诱导

我们以前发现IRBB27(Xa27/Xa27)中的Xa27受非亲和水稻白叶枯病菌菌株的III型效应物avrXa27的特异诱导。为了研究水稻avrXa27基因是否具有类似功能，我们将IRBB27分别与avrXa27品系和对照品系进行杂交。采用RNA印迹分析源自这些杂交的F₁植株的分离信使RNA(mRNA)，检测Xa27的诱导。Xa27在源自IRBB27与avrXa27转基因品系杂交的F₁植株中被组成型诱导(图4a，泳道2-5)。与IRBB27x L24的F₁植株的Xa27高表达相比，源自IRBB27与L1、L14或L25杂交的F₁植株的Xa27表达要低些(图4a，泳道2-5)。源自IRBB27与对照转基因植株杂交的F₁植株中没有检测到信号(图4a，泳道1)。

IR24(xa27/xa27)携带Xa27基因的感病等位基因，该等位基因与Xa27具有相同的编码区域，但不受携带avrXa27的水稻白叶枯病菌菌株的诱导(Gu等人，2005)。这种抗性特异性在水稻中的Xa27(或xa27)和avrXa27基因中得到了保留。没有在源自IR24和L24杂交的F₁植株中诱导出IR24的感病等位基因xa27(图4b，泳道4)。我们的结果表明，就特异诱导Xa27表达而言，水稻avrXa27基因与细菌的avrXa27基因具有相同的功能。这些结果符合并补充了我们以前的发现，即Xa27在III型效应物avrXa27的存在下被特异诱导。在本例中，水稻avrXa27基因的表达产生avrXa27。

实施例7

来自IRBB27与avrXa27品系杂交的F₁植株的病害评估

我们以前的研究表明，处于水稻PR1启动子控制下的Xa27异位表达提供了抗非亲和性和亲和性水稻白叶枯病菌菌株的抗性(Gu等人，2005)。为了研究水稻avrXa27基因对Xa27的诱导是否起了类似于抗白叶枯病的作用，我们对源自IRBB27植株(F)与avrXa27转基因品系(F)杂交的F₁植株的白叶枯病抗性进行了病害评估。IRBB27x L24的F₁植株以Xa27-非亲和菌株(PXO99^A)或Xa27-亲和菌株(AXO1947、K202和ZHE173)接种。源自IRBB27与L24杂交的F₁植株不仅表现出对PXO99^A的完全抗性，还提供了抗3种原本为亲和菌株的广谱完全抗性(图5和表1)。在源自IRBB27与L1、L14、L24和L25回交的BC₁F₁植株上也观察到抗亲和菌株AXO1947的增强抗性(表2)。在对照实验中，IRBB27提供了抗非亲和性菌株PXO99^A的抗性(表2)。源自IRBB27与对照品系杂交的对照F₁植株部分抗非亲和性菌株PXO99^A，易感3种亲和性菌株，而源白IR24与L24杂交的F₁植株易感所有受试菌株(表1)。

表2

野生型植株、转基因品系及其F₁后代对各种水稻白叶枯病菌菌株的病害评估^a

^a根据两次独立实验计算平均病斑长度和标准差。对于每个菌株，至少接种来自8棵不同植株的60片叶。抗性评分请参阅材料和方法。R，抗病；S，感病；MR，中度抗病；MS，中度感病；ND，未检测。

^b以空载体pC1305.1转化Nipponbare，产生对照品系。杂交时，L24或对照转基因植株用作花粉供体。

实施例8

avrXa27转基因诱导的Xa27表达也提供了抗水稻细菌性条斑病菌的增强抗性

在IRBB27x对照品系或IR24x L24的BC₃F₁植株中，由于缺乏Xa27或avrXa27基因，没有检测到Xa27的表达(数据未显示)。水稻细菌性条斑病菌菌株L8接种后第10天，细菌性条斑病的大病斑在这些BC₃F₁植株叶片上朝叶基和叶尖两个方向发展(图6a，叶1和2)。叶片表面观察到许多黄色珠状的水稻细菌性条斑病菌(图6a，叶1和2)。在IRBB27x L24的BC₃F₁植株中，Xa27基因受来自L24的avrXa27基因诱导(数据未显示)。IRBB27x L24的BC₃F₁植株具有比IRBB27x对照品系或IR24x L24的BC₃F₁植株小的细菌性条斑病病斑(图6a，叶3)。但是，在IRBB27x L24的BC₃F₁植株的病斑边缘仍观察到黄色珠状的水稻细菌性条斑病菌(图6a，叶3)。后一结果表明Xa27介导的抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性是部分的或不完全的。这一点进一步被以下事实证实，即IRBB27x L24的BC₃F₁植株接种叶片的细菌群体在注射浸润后的10天内仍保持增长(图6b)。但是，IRBB27x L24的BC₃F₁植株接种叶片的细菌群体比对照BC₃F₁植株的细菌群体要低10到5000倍(图6b)。

为了进一步证实抗水稻细菌性条斑病菌菌株L8的增强抗性源自于Xa27的表达，我们以含有或不含有avrXa27基因的水稻细菌性条斑病菌菌株L8接种IRBB27植株。细菌注射浸润后第3天，两种互作中感染部位处的叶片组织变成褐色(图6c，叶1和2)。但是，发现以水稻细菌性条斑病菌L8(pHM1avrXa27)接种的IRBB27植株只有很少或没有微小黄色珠状的细菌，而在以水稻细菌性条斑病菌L8(pHM1)接种的IRBB27植株的叶片感染部位处观察到许多珠状细菌(图6c，叶1和2)。感染后第10天，以L8(pHM1avrXa27)接种的IRBB27植株的细菌性条斑病病斑比以L8(pHM1)接种的IRBB27植株要小，分布更窄(图6c，叶3和4)。同样，以L8(pHM1avrXa27)浸润的IRBB27植株叶片的细菌群体比以L8(pHM1)接种的IRBB27植株的细菌群体要低8到8373倍(图6d)。此外，接种后第3天检测到来自L8(pHM1avrXa27)的avrXa27对IRBB27的Xa27的诱导，而当L8(pHM1)用于接种时则没有发现诱导(图6e)。

总之，Xa27异位品系提供了抗非亲和性和亲和性水稻白叶枯病菌菌株的抗性(Gu等人，2005)。本文我们通过以水稻avrXa27转基因诱导Xa27基因的野生型等位基因，生成了另一种具有抗水稻白叶枯病菌菌株的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌增强抗性的Xa27异位品系。

在描述本发明的上下文中(特别是在下列权利要求的上下文中)，术语“一个”、“一种”和“该”以及类似的指称对象应理解为同时涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应理解为开放术语(即意为“包括但不限于”)，除非另有说明。除非本文另有说明，本文列举的数值范围仅用作一种单独提及该范围内的每个独立数值的简写方法，每个独立数值按照本文单独列举的方式被纳入到本说明书中。可以任何适宜次序实施本文描述的所有方法，除非本文另有说明或除非与上下文明显矛盾。本文提供的任何和全部实施例或例示性语言(例如“例如”)的使用仅仅是为了更好地阐述本发明，而不构成对本发明范围的限制，除非另有说明。本说明书的语言不应理解为表明任何非主张的要素对于本发明的实施是必不可少的。

本文描述了本发明的实施方式，其中包括发明人已知可实施本发明的最佳实施方式。本领域的技术人员在阅读上述说明后，这些实施方式的各种变化对于他们可变得清楚明了。发明人预计技术人员可使用适宜的变化，而且发明人计划可按照不同于本文具体描述的方式实施本发明。因此，本发明包括本发明所附权利要求列举的主题的所有修改和等同物，只要适用法律许可。而且，本发明涵盖上述要素在本发明所有可能的变化中的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。

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Claims

1.一种在植物中产生抗细菌性条斑病的增强抗性的方法，其包括在基因组中含有Xa27基因的植物中诱导Xa27基因的表达，所述方法包括在所述植物中表达核酸，其中所述核酸可操作连接于在所述植物中具有活性的启动子，其中所述核酸编码由SEQ ID NO:2列出的氨基酸序列所组成的avrXa27蛋白，并且所述核酸被稳定整合到植物基因组中。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸由SEQ ID NO:1列出的核苷酸序列所组成。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述启动子选自组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子组成的组。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述植物是稻。

5.如权利要求3所述的方法，其中所述植物是稻。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

7.如权利要求3所述的方法，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述Xa27基因的表达在感染细菌性条斑病的植物中诱导。

9.权利要求1的方法，其中在基因组中含有Xa27基因的植物是转基因植物并且所述转基因植物具有稳定整合到植物基因组中的第二核酸，其中所述第二核酸可操作连接于在植物中具有活性的启动子，并且其中所述第二核酸编码由SEQ ID NO:4列出的氨基酸序列所组成的Xa27蛋白。

10.权利要求9的方法，其中所述第二核酸由SEQ ID NO:3列出的核苷酸序列所组成。

11.一种在易感植物中产生抗水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)的广谱抗性和抗水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)的增强抗性的方法，其包括在基因组中含有Xa27基因的植物中诱导Xa27基因的表达，所述方法包括在所述植物中表达核酸，其中所述核酸可操作连接于在所述植物中具有活性的启动子，其中所述核酸编码由SEQID NO:2列出的氨基酸序列所组成的avrXa27蛋白，并且所述核酸被稳定整合到植物基因组中。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述核酸由SEQ ID NO:1列出的核苷酸序列所组成。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述启动子选自组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子组成的组。

14.如权利要求11或12所述的方法，其中所述植物是稻。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述植物是稻。

16.如权利要求11或12所述的方法，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述植物选自胡椒、番茄、豆类、棉花、黄瓜、甘蓝、大麦、燕麦、小麦、玉米和柑橘组成的组。

18.权利要求11的方法，其中在基因组中含有Xa27基因的植物是转基因植物并且所述转基因植物具有稳定整合到植物基因组中的第二核酸，其中所述第二核酸可操作连接于在植物中具有活性的启动子，并且其中所述第二核酸编码由SEQ ID NO:4列出的氨基酸序列所组成的Xa27蛋白。

19.权利要求18的方法，其中所述第二核酸由SEQ ID NO:3列出的核苷酸序列所组成。