CN111286506A - 水稻抗白叶枯病基因Xa2在改良水稻抗病性中的应用 - Google Patents

水稻抗白叶枯病基因Xa2在改良水稻抗病性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及水稻抗白叶枯病基因Xa2在改良水稻抗病性中的应用。本发明提供了一种水稻抗白叶枯病基因Xa2，其具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2‑15所示所示。Xa2基因属于BED‑NB‑LRR基因家族，该基因编码的蛋白质与植物抗病性相关。通过遗传转化，将Xa2基因转入宿主普通水稻品种，能够提高水稻对白叶枯病的抗性，从而减轻白叶枯病产生的危害，以达到增产的目的。

Description

水稻抗白叶枯病基因Xa2在改良水稻抗病性中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及水稻抗白叶枯病基因Xa2在改良水稻抗病性中的应用。本发明Xa2基因属于BED-NB-LRR基因家族，编码的蛋白质与植物抗病性相关。通过遗传转化将Xa2基因转入普通水稻品种，来提高水稻对白叶枯病的抗性。
背景技术
水稻是研究单子叶植物的模式植物，同时也是世界上最主要的粮食作物之一。但是水稻在实际生产中却面临着很多挑战，病害和非生物环境的影响常常造成产量和品质的下降，从而对粮食的安全形势造成非常严重的影响。白叶枯病是水稻生产过程中最重要的三大病害之一，其侵染的方式是通过水孔或伤口进入水稻叶片，靠吸取水稻的营养物质供自己繁殖，在维管束细胞传播，最后导致水稻叶片形成长条枯死状病斑的症状。白叶枯病菌侵染水稻，往往会使水稻枯死，从而导致大幅度减产，严重时使水稻减产20％-30％(Kou和Wang 2010)。实践和研究表明，发掘和利用优良抗性基因资源改良水稻是控制病害发生、减少或避免病害所带来的损失最经济有效的措施。
等位基因(allele)的概念是由Johannsen提出的，指的是位于一对同源染色体的相同位置上控制相对性状的不同形态的基因。等位基因控制着性状的显隐性关系和遗传效应，当一个等位基因决定生物性状的作用强于另一等位基因并使生物表现出该性状时，就出现显隐性关系。根据在染色体位置上的基因个数分为等位基因和复等位基因。在水稻抗稻瘟病基因克隆研究中，Pi1、Pikm、Pik-p和Pik互为等位基因且是由双基因控制的复等位基因(Liu等2014)，比如Pi1是通过基因Pil-5C与Pil-6C共同作用对稻瘟病菌的抗性，即单独的Pil-5C或Pil-6C转入感病品种不能使其抗病(Zhai等2011)；Pikm是由NB-LRR基因Pikm1-TS与Pikm2-TS共同控制，但只有Pikm1-TS会受到病原菌诱导表达(Hayashi等2006)。同样的情况也存在于Pik-p和Pik中，这两个基因分别由Pikp-1和Pikp-2、Pik-1和Pik-2共同控制(Ashikawa等2008；Yuan等2011)。这几个基因的抗性都是由两个不相同的NB-LRR共同控制的。此外，抗稻瘟病基因中还存在Pi25和Pid3互为等位基因(Qu等2006；Zhou等2006；Shang等2009)；Piz-t、pi9、pi2和Pigm互为等位基因(Okuyama等2011；Deng等2017)。目前，在抗白叶枯病的研究中还未发现主效抗病基因互为等位基因的情况。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种抗白叶枯病的基因Xa2，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明另一目的是提供一种利用抗白叶枯病基因Xa2提高水稻对白叶枯病抗性的应用。
本发明的技术方案如下所述：
本发明采用遗传学和生物信息学的方法，通过遗传转化Xa2基因，使感病水稻品种出现抗白叶枯病菌的表型，证实了该基因的功能。
本发明Xa2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长6516bp，该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2-15所示。该蛋白属于BED-NB-LRR家族，活性中心300-591区段为保守的NB-ARC区，包括ATP结合区等。应当理解，在不影响Xa2蛋白活性的前提下，本领域技术人员可对SEQ ID NO：2所示的蛋白质序列进行各种替换、添加或/和缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。
此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区或非编码区不影响蛋白表达的条件下，对SEQ ID NO：2-15所示蛋白质序列进行修改。因此，本发明还包括对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加或/和缺失一个或多个核苷酸，与上述编码蛋白基因具有相同或相似功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体，含有所述载体的宿主细胞以及含有所述核苷酸序列或其片段的转化植物细胞和转基因植物。
附图说明
图1：本发明鉴定和分离克隆水稻抗病基因Xa2以及验证Xa2基因功能的流程图。
图2：候选基因的同源性分析。
图3：Xa2与其它等位基因的序列分析
图4：是本发明起始转化载体pCAMBIA1301的图谱。
图5：是本发明所用遗传转化载体D263O的结构示意图。RB和LB分别表示T-DNA的右边界和左边界，GUS表示β-葡糖苷酸酶基因，Hpt表示潮霉素磷酸转移酶基因，NOS表示胭脂碱合成酶基因的多聚腺苷酸化信号，PXa2表示Xa2自身启动子。
图6：T0代遗传转化植株(D263OZ1)中基因型与抗性检测。附图标记说明：图6中的A图为用Xa2基因内部特异引物Xa2-19F/Xa2-14R鉴定T0代转基因植株(1～20)；图6中的B图为接种白叶枯病菌后叶片的病斑长度调查分析，对照为水稻感病品种中花11(ZH11)(遗传转化的受体)。星号(**)表示与对照相比，转化植株的病斑长度显著减小(P＜0.01)。
图7：T1代遗传转化植株(D263OZ1)对白叶枯病菌T7174菌株的抗性增强表型与Xa2基因型共分离。附图标记说明：图7中的A图和图7中的B图为3号遗传转化植株(D263OZ1-3)的T1代接种白叶枯病菌的病斑长度和Xa2基因型；图7中的C图和图7中的D图为6号遗传转化植株(D263OZ1-6)的T1代接种白叶枯病菌的病斑长度和Xa2基因型；图7中的E图和图7中的F图为10号遗传转化植株(D263OZ1-10)的T1代接种白叶枯病菌的病斑长度和Xa2基因型。对照是遗传转化受体水稻品种中花(ZH11)。病斑长度为接种白叶枯病菌两周后的数据，每个数据是平均值(4个重复)±标准差。星号(**)表示与对照相比，转化植株的病斑长度显著减小(P＜0.01)。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的Xa2基因的核苷酸序列。该基因199-6081bp的序列是该基因的编码区。
序列表SEQ ID NO：2-15是Xa2基因编码的蛋白质序列。
以下实施例进一步定义本发明。但不应理解为对本发明的限制。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1：Xa2候选基因的鉴定
为了进一步分析Xa2基因，分别对水稻品种IRBB2(国际水稻研究所)、IR24(国际水稻研究所)、中花11(中国农业科学院作物科学研究所)和牡丹江8(黑龙江大学)中的RGAf测序，测序完成后将序列分别命名为：RGAf-BB2、RGAf-IR24、RGAf-ZH11、RGAf-MDJ8。将序列RGAf-BB2、RGAf-IR24、RGAf-ZH11、RGAf-MDJ8、RGAf-BB1、RGAf-BB14和RGAf-Nip进行同源性分析，对比后发现RGAf-BB2和RGAf-ZCL基因组序列与RGAf-BB1、RGAf-BB14基因组序列都非常相似(图1)。
进一步分析不同的水稻品种RGAf序列的差异。RGAf-MDJ8编码的也是一个完整的NB-LRR蛋白，与RGAf-Nip序列一致性达到99.9％；RGAf-IR24和RGAf-ZH11基因组序列都发生了碱基的缺失，并导致翻译提前终止；RGAf-BB2基因组序列与RGAf-BB1基因组序列的主要区别在于其LRR编码区域缺失279bp，而其余序列一致性为99.9％；RGAf-BB2基因组序列与RGAf-BB14基因组序列差别很大，它们在LRR编码区有一个同源性较低的区域，该区域把RGAf-BB14序列分为前后两部分，其前面部分和RGAf-BB2的一致性为99.0％，后面部分和RGAf-BB2的一致性为89.8％。因此，将RGAf-BB2基因命名为Xa2。
实施例2：Xa2候选基因的结构和编码产物分析
1.基因末端序列分析
按常规方法抽取水稻IRBB2总RNA，随后采用Invitrogen公司的Micro-FastTrackTM2.0Kit(Invitrogen K1520-02)抽提mRNA，再采用Invitrogen公司的GeneRacer Core Kit试剂盒，通过5’-RACE(rapid amplification of cDNA end)和3’-RACE分析方法，确定水稻家系IRBB2中的Xa2候选基因的5’和3’末端序列，操作按Invitrogen公司提供的试剂盒说明书进行。进行5’-RACE第一轮扩增的引物是Xa2-1R(5′-CAAAGCTGATGTCCCGTTCTTAGATGTGC-3′)和UPM(试剂盒自带)；第二轮扩增引物是Xa2-2R(5′-ATGCCTTGGACCGTTTCTTG-3′)和NUP(试剂盒自带)；进行3’-RACE第一轮扩增的引物是Xa2-1F(5′-CAGGGCTATGAGCTATGCCC-3′)和UPM；第二轮扩增引物是Xa2-2F(5′-GCGGAAGTGAAGTGGCAAGA-3′)和NUP；然后通过电泳回收目标大小的片段，用pGEM-T Vector System I试剂盒(美国Promega公司)对回收片段进行克隆。最后对克隆进行测序分析。
2.基因末端序列分析
采用GenScan(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)软件对包含Xa2基因区段的基因组DNA序列进行分析，预测存在2个内含子和3个外显子，采用跨越内含子的三对PCR引物Xa2-3F(5′-CGAGAAGGTGGATGGGGT-3′)和Xa2-2R、Xa2-4F(5′-GGAGATGGAGCAGAGGACGA-3′)和Xa2-4R(5′-GGGTGCGTGCTAACTGCCTCGTGGTGTG-3′)扩增基因组DNA和RNA反转录产物，RT-PCR产物Xa2-3F/Xa2-2R和Xa2-4F/Xa2-4R均比从基因组中扩增出的产物小，说明确实存在2个内含子。将RT-PCR产物克隆、测序、与基因组DNA序列比较，确定了各内含子长度及的剪切位点。采用Xa2基因区段的其它引物进行RT-PCR、5’RACE和3’RACE分析，没有再发现其它内含子的存在。
比较分析Xa2基因的基因组序列和cDNA序列，确定Xa2基因由6516个核苷酸组成，包含3个外显子和2个内含子。第一个外显子由505个核苷酸组成，它包括由198个核苷酸组成的5′端非翻译区(UTR)(位于序列表SEQ ID NO：1的1-198bp处)和由306个核苷酸组成的编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的179-485bp处)；第一个内含子由104个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的506-610bp处)；第二个外显子(即第二段编码区)由309个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的611-920bp处)；第二个内含子由647个核苷酸组成(位于序列表SEQ ID NO：1的921-1568bp处)；第三个外显子由4947个核苷酸组成，它包括由4512个核苷酸组成的第四段编码区(位于序列表SEQ ID NO：1的1571-6078bp处)和由434个核苷酸组成的3′端UTR(位于序列表SEQ ID NO：1的6082-6516bp处)。
3.基因编码产物分析
Xa2基因编码一个长度为1712个氨基酸的蛋白质。用Blastp方法分析，推测该基因编码一个BED-NB-LRR类蛋白质，包含核苷酸结合位点和富亮氨酸拉链结构域。预测显示该蛋白质的氨基末端有一个保守的BED锌指结构域。
实施例3：Xa2基因的功能验证与应用
本发明采用农杆菌介导的遗传转化方法，通过将Xa2基因转入水稻感病品种中花11(中国农业科学院作物科学研究所)中，进一步验证该基因的功能。
1.遗传转化载体的构建
本发明所用的起始载体是常用载体pCAMBIA1301(图5，Cao等，2007)。根据基因组测序的结果，设计引物(5'-GGTACCGGCATAAGAAATCATAGCAGTGG-3'，5'-CCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGGTGTAAGGCCTCCATTCTAACAG-3')，其中包括HindIII和BamHI的接头，扩增抗白叶枯病水稻IRBB14的基因组。PCR反应体系总体积50μl：1μl DNA，10×buffer5μl，10mM dNTPs5μl，10μM引物各1μl，高保真Taq酶0.5μl；灭菌的双蒸水37.5μl；反应条件：94℃2min，94℃15s，58℃30s，72℃7min，共30个循环；产物用TAE胶分离，过回收柱纯化。所得序列包括Xa2上游2000bp的启动子、5724bp的基因组序列和下游的460bp的3'非编码区。用限制性内切酶HindIII和BamHI组合酶切，酶切体系总体积50μl：PCR产物约15μl，10×反应buffer 5μl，酶各2μl，混匀后37℃酶切过夜，试剂盒纯化回收所需片段。pCAMBIA1301载体酶切体系同上，试剂盒纯化回收。连接反应：基因组片段3.8μl，载体0.5μl，T4ligase 0.2μl，10×反应buffer 0.5μl，4℃，连接过夜；连接产物与大肠杆菌DH10B混匀，电转化后涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃，过夜培养。挑单克隆，扩大培养，抽质粒，酶切验证。把构建好的载体电转化农杆菌EHA105，抽质粒，PCR验证正确，加入等体积的50％的甘油混匀，置于-70℃冰箱保存。
2.遗传转化水稻和T0代基因型检测
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Lin和Zhang，2005)将上述Xa2基因组转化载体(D263O)转入感病水稻品种ZH11中。具体的操作步骤在上述参考方法的基础上改良如下：
(1)诱导愈伤组织：将水稻品种ZH11的成熟种子去壳后，用0.15％的氯化汞浸泡消毒20分钟，每隔5分钟剧烈震荡一次。之后在无菌操作台上用灭菌蒸馏水清洗种子5次。将种子放置在诱导培养基上(成分见后)，置于暗室培养一个月，培养温度为25±1℃。
(2)愈伤组织继代：在无菌操作台上挑取亮黄色、质地紧密且干燥的愈伤组织，放置在继代培养基上(成分见后)，置于暗室培养两周，培养温度为25±1℃。
(3)愈伤组织预培养：在无菌操作台上挑取亮黄色、质地紧密且干燥的愈伤组织，放置在预培养基上(成分见后)，置于暗室培养两周，培养温度为25±1℃。
(4)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养含有D263O载体的农杆菌EHA105(来源于澳大利亚CAMBIA实验室商用菌株)，培养时间为两天，培养温度为28℃；之后将上述农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)，于28℃摇床上培养2-3小时。
(5)农杆菌侵染愈伤组织：调节农杆菌的悬浮液至OD600数值为0.8-1.0，将预培养后的愈伤组织在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟，之后转移至无菌滤纸上吸干，然后放置在共培养基(成分见后)上于黑暗处培养3天，培养温度为19℃。
(6)愈伤组织选择培养：用灭菌蒸馏水彻底清洗愈伤，之后转移愈伤至无菌滤纸上吸干，将愈伤转移至选择培养基(成分见后)上培养2-3次，每次2周。
(7)愈伤组织分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上于黑暗处培养5-7天，之后转移至分化培养基上(成分见后)，于光照培养室内培养，温度为26℃。
(8)遗传转化苗生根处理：剪去分化得到的遗传转化苗的一部分根，将其转移至生根培养基中，于光照培养室内培养2-3周，温度为26℃。之后将遗传转化苗移栽在土壤中。
遗传转化中所用的培养基组分及其配方如下：
(1)试剂和溶液的缩写
本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基氨基嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6培养基大量成分溶液)；N6mix(N6培养基微量成分溶液)；MSmax(MS基本培养基大量成分溶液)；MSmix(MS基本培养基微量成分溶液)。
(2)主要溶液配方
1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：
Figure BDA0002082995230000051
Figure BDA0002082995230000061
于室温下逐一溶解，最后定容至1000ml。
2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制：
Figure BDA0002082995230000062
于室温下逐一溶解，最后定容至1000ml。
3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制：
准备800ml的去离子水并加热至70℃，加入3.73克的乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，最后定容至1000ml。
4)维生素贮存液(100X)的配制：
Figure BDA0002082995230000063
加去离子水定容至1000ml。
5)MS基本培养基大量元素母液(10X)的配制：
Figure BDA0002082995230000064
室温下逐一溶解并定容至1000ml。
6)MS基本培养基微量元素母液(100X)的配制：
Figure BDA0002082995230000065
室温下逐一溶解并定容至1000ml。
7)2,4-D贮存液(1mg/ml)的配制：
称取2,4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：
称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。
9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。
10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：
称取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：
称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液的配制：
称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml，溶解后分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液的配制：
称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，室温保存备用。
(3)用于水稻遗传转化的培养基配方
1)诱导培养基
Figure BDA0002082995230000071
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
Figure BDA0002082995230000072
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
Figure BDA0002082995230000081
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
Figure BDA0002082995230000082
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。
5)悬浮培养基
Figure BDA0002082995230000083
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
Figure BDA0002082995230000084
Figure BDA0002082995230000091
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入对应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
Figure BDA0002082995230000092
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入对应抗生素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
Figure BDA0002082995230000093
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
Figure BDA0002082995230000101
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
最终获得的遗传转化植株被命名为D263OZ1(其中前面部分为遗传转化载体名称，Z1代表水稻品种ZH11)。本发明共获得独立转化植株20株。在抽穗期阶段取植株的剑叶，抽提DNA，采用PCR技术检测转化植株中Xa2基因型。结果显示，与对照ZH11相比，所有的阳性遗传转化植株中的DNA带型都是杂合的两条带(见图6中的B图)。
3.T1代遗传转化植株的抗病性分析
为检测Xa2基因遗传转化植株是否对白叶枯病表现出抗性，申请人选取T0代3株遗传转化植株(D263OZ1-3，D263OZ1-6和D263OZ1-10)的T1代家系进行基因型和抗病性分析。在孕穗期接种白叶枯病菌T7174，接种两周后调查，同时取样抽提DNA，采用PCR技术检测转化植株的基因型。结果显示，T1代遗传转化家系中，与对照ZH11相比，所有携带Xa2基因的阳性植株对白叶枯病菌T7174(国际水稻研究所)的抗性显著增强(P＜0.01)，而转基因阴性植株对白叶枯病菌的抗性没有变化(图7)。这些结果说明，Xa2基因能够显著增强水稻对白叶枯病的抗性。
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Claims (2)

1.Xa2基因在改良水稻对白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，所述的Xa2基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.Xa2基因在改良水稻对白叶枯病抗性中的应用，其特征在于，所述的Xa2基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2-15所示。
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