JP2002525033A - 植物に疾患抵抗性を付与するＰｉ−ｔａ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 真菌病原体によって引き起こされる疾患に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を植物に付与する単離核酸フラグメントの製造および使用が記載されている。このような核酸フラグメントを導入する遺伝子は、単独でまたはＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメントまたはその機能的に均等なサブフラグメントおよび適当な調節配列と組み合わせて、各種真菌病原体とくにイネいもち病真菌に対してＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を産生できるトランスジェニック植物を創製するために使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【技術分野】

本発明は、真菌病原体によって引き起こされる疾患に対し、植物にＰｉ−ｔａ
抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメントの製造ならびに使用
に関する。このような核酸フラグメントの単独またはＡＶＲ−Pita 単離核酸フ
ラグメントもしくはその機能的に均等なサブフラグメントおよび適当な調節配列
との組み合わせを導入する遺伝子は、様々な真菌病原体とくにイネいもち病（bl
ast）真菌に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を生じることが可能な
トランスジェニック植物の創製に使用することができる。

【０００２】

【背景技術】

植物は、ウイルス、細菌、真菌および線虫を含む広範囲の病原性生物によって
損傷を受けることがある。潜在的な病原体による植物の侵襲は広範囲の帰結を生
じる。すなわち、病原体は宿主内での増殖に成功して関連する疾患症状の原因と
なり、または宿主の防御によりその増殖は停止する。一部の植物−病原体相互作
用では、能動的な防御応答の可視的特徴は、いわゆる過敏性応答（ＨＲ）である
。ＨＲには感染部位付近の細胞の急速な壊死が関与し、また可視的な褐色の斑紋
もしくは病変の形成が包含される。与えられた宿主対してＨＲを誘発する病原体
はその宿主に対して無毒性（ＡＶＲ）であるといわれ、宿主は抵抗性であるとい
われ、その植物−病原体相互作用は不和合性であるといわれる。特定の宿主上で
増殖して疾患を起こす株は毒性であるといわれ、この場合、宿主は感受性である
といわれ、その植物−病原体相互作用は和合性であるといわれる。

【０００３】 特定の真菌または細菌病原体の一連の株（種族）が特定の宿主種の一連の栽培
種に対して毒性であるかまたは非毒性である場合には、遺伝子分析が植物−病原
体認知の遺伝的基礎の説明の補助に用いられてきた。このような場合の多くは、
宿主および病原体両者の遺伝子分析によって、無毒性真菌および細菌株の多くは
宿主中に相当する「抵抗性」（Ｒ）遺伝子をもつ１種もしくは２種以上の無毒性
（"avr" または「ＡＶＲ」）遺伝子を有することにより毒性株とは異なることが
明らかにされている。

【０００４】 この無毒性遺伝子−抵抗性遺伝子モデルは「遺伝子対遺伝子」モデルと呼ばれ
ている（Cruteら, 1985, pp 197-309, in Mechanisms of Resistance of Plant
Disease. R.S.S.Fraser編; Ellingboe, 1981, Annu.Rev.Phytopathol. 19: 125-
143; Flor, 1971, Annu.Rev.Phytopathol. 9: 275-296）。このモデルの単純な
説明によれば、分子シグナルに特異的な受容体をコードする植物抵抗性遺伝子が
avr 遺伝子を発生させる。ついで、シグナル伝達経路によりシグナルが１組の標
的遺伝子に運ばれ、宿主防御が開始される。この単純な予測的モデルにもかかわ
らず、avr−抵抗性遺伝子相互作用の分子的基盤は依然として不明である。

【０００５】 クローン化された最初のＲ−遺伝子は、トウモロコシ（Zea mays）からのＨｍ
Ｉ遺伝子であった。これは真菌病原体 Cochliobolus carbonum の特定の種族に
対する抵抗性を付与する（Johalら, 1992, Science 258: 985-987）。ＨｍＩは
病原体により産生される毒素を解毒するレダクターゼをコードする。次にクロー
ン化されたのはトマト（Lycopersicon pimpinellifollium）からのＰｔｏ遺伝子
であった（Martinら, 1993, Science 262: 1432-1436; 米国特許 5,648,599）。
Ｐｔｏは avrPto 無毒性の遺伝子を発現して、トマトに、細菌病原体 Pseudomon
assyringae pv. tomato 株に対する抵抗性を付与するセリン−スレオニンプロテ
インキナーゼをコードする。現在注目されているのは富ロイシンリピート（ＬＲ
Ｒ）を含有する蛋白質をコードするＲ−遺伝子である（Jones and Jones, 1997,
Adv. Res. Bot. Incorp. Adv. Plant Pathol. 24: 89-167）。細胞外ＬＲＲを
有する膜係留蛋白質の２つのクラスが同定されている。そのサブクラスには真菌
Cladosporium fulvum に対する抵抗性のトマトＣｆ−９遺伝子のような細胞質
セリン／スレオニンキナーゼドメインを欠くＲ−遺伝子産物が包含され（Jones
ら, 1994, Science 266: 789-793; ＷＯ95/18230）、他のサブクラスには細胞質
セリン／スレオニンキナーゼドメインを有するＲ−遺伝子産物、細菌病原体 Xan
thomonas oryzae に対する抵抗性遺伝子、イネＸa−21（Songら, 1995, Science
270: 1804-1806; 米国特許 5,859,339）が包含される。Ｒ−遺伝子の最大のク
ラスには細胞質ＬＲＲを有する蛋白質をコードする遺伝子、たとえば Arabidops
is Ｒ−遺伝子ＲＰＳ2（Bentら, 1994, Science 265: 1856-1860; Mindrinosら,
1994, Cell 78:1089-1099）およびＲＰＭ1（Grantら, 1995, Science 269: 843
-846）が包含される。これらのＲ−蛋白質はまた推定ヌクレオチド結合部位（Ｎ
ＢＳ）およびロイシンジッパー（ＬＺ）モチーフまたは Toll／Interleukin−１
受容体（ＴＩＲ）に同種の配列のいずれかを有する。表１には、現在までにクロ
ーン化されたＲ−遺伝子のクラスの簡潔なまとめおよび各クラス内のクローン化
された遺伝子の例としてBakerら（1997, Science 276: 726-733）から一部再掲
した。

【０００６】

【表１】

【０００７】 ヌクレオチド結合部位（ＮＢＳ）は、基礎的真核細胞機能たとえば細胞増殖、
分化、細胞骨格の組織化、小胞の輸送および防御に重要な蛋白質の多くのファミ
リー中に見いだされる。鍵となる実例には、ＲＡＳグループ、アデノシントリホ
スファターゼ、延長因子およびＧ−蛋白質と呼ばれるヘテロトリマーＧＴＰ結合
蛋白質が包含される（Sarasteら, 1990, Trends in Biochem. Science 15: 430
）。これらの蛋白質は、共通してＡＴＰまたはＧＴＰに結合する能力を有する（
Traut,1994, Eur.J.Biochem. 229: 9-19）。

【０００８】 イネいもち病システムは H.H.Flor（Flor, 1971, Annu.Rev.Phytopathol. 19:
125-143）により定義された典型的遺伝子対遺伝子システムを表すものと長い間
考えられていた。イネいもち病病原体 Magnaporthe grisea 中にＡＶＲ−遺伝子
を同定するのに必要な遺伝子分析は、イネに感染する M.grisea の野生単離体の
特徴である低い稔性によって妨害されてきた。繁殖力の貧弱な M.grisea イネ病
原体と他の草（たとえば、weeping lovegrass, Eragrostis curvula, およびシ
コクビエ Eleusine coracana）の繁殖力の高い M.grisea 病原体との間の遺伝子
交配によりＡＶＲ−遺伝子の同定に要求される性的稔性レベルをもつ真菌の実験
室的株が提供された（Valentら, 1991, Genetics 127: 87-101）。稀な稔性のイ
ネ病原体は以来いもち病真菌ＡＶＲ−遺伝子と特定のイネＲ−遺伝子の間の１対
１遺伝性または機能性対応の証明を可能にした（Silueら, 1992, Phytopatholog
y 82: 577-580）。

【０００９】 真菌病原体 Magnaporthe grisea（Hebert）Barr（anamorph Pyricularia gris
ea Sacc.）により世界中に引き起こされるイネいもち病は、10年にもわたるその
制御に向けた研究にもかかわらず、イネ穀類に最も激しい損傷を与える可能性の
ある疾患として続いていることから、イネいもち病の病理体系にはきわめて興味
がもたれる。いもち病抵抗性遺伝子の操作は真菌集団が、展開される抵抗性戦略
の打破を徐々に導き出すことから、イネ品種改良プログラムのすべてにおいて、
主要標的の一つとして残されている（The Rice Blast Disease, 1994, Zeigler,
Leong & Teng ed., CAB International, Wallingford 参照）。

【００１０】 遺伝子制御戦略を補充するための市販殺カビ剤の使用は、1915年頃にイネの栽
培者が無機銅をベースとした殺カビ剤を用いていた時代に開始された（Chapter
29, The Rice Blast Disease, 1994, Zeigler, Leong & Teng ed., CAB Interna
tional, Wallingford）。いもち病の制御に使用された殺カビ剤は時代とともに
変化し、1950年代には有機水銀のようなある種の化合物が用いられ、大きな環境
汚染を生じた。イネいもち病の殺カビ剤による制御は最近では１年に５億ドルを
越える栽培者の経費となっている。このいもち病制御の出費は世界のイネ殺カビ
剤市場の最大部分を占め、１９９８年には総計７億５２００万ドルに達している
（Wood Mackenzie）。１９９０年と２０２５年の間に１年あたり１.７％と推定
される世界的コメ需要の増加に伴い（The Rice Blast Disease, 1994, Zeigler,
Leong & Teng ed, CAB International, Wallingford）この疾患の問題は深刻化
することが考えられる。増加する人口を養うために１年におよそさらに１３００
万トンと見積もられるコメの需要増は減少する利用可能な土地での生産の増強に
よらねばならない。高収穫を目指した耕種学的生産実務ではイネいもち病には恵
まれ、したがって、イネいもち病に対し永続性のある遺伝子抵抗性をイネに操作
できるのでなければ、コメ穀類収率を抑制するものとしてこの疾患は続き、むし
ろ増加が見込まれる。本発明はとくにイネいもち病抵抗性遺伝子の一つのクロー
ン化を目標とするものであり、イネいもち病に対して永続性のある抵抗性遺伝子
を操作する長い間の目的に至る最初の重要な工程に関する。

【００１1】 真菌 M.grisea は、緑草科内の様々な種族、Triticeae（たとえば、コムギ）
、Oryzeae（たとえばイネ）、Clorideae（たとえばシコクビエ）、Paniceae（た
とえばトウジンビエ）、Andropogoneae（たとえばモロコシ）および Maydeae（
たとえば、トウモロコシ）を包含する大きな宿主範囲を有する。分子分析により
、現在では、それぞれ限られたセットの宿主種特異的サブ集団を有する M.grise
a の８つの種特異的なサブ集団が定義されている（Valent, 1997, The Mycota V
, Plant Relationships, Carroll／Padzynski, eds., Springer-Verlag Berlin
Heidelberg, pp 37-54）。表２はミトコンドリアＤＮＡ（mtＤＮＡ）型による病
原体サブ集団の最近の概観を示す。この観察はリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）多
型［制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）および内部転写スペーサー（ＩＴＳ）配列
の両者を含む］、ならびに反復ＤＮＡおよび単一コピー配列の両者における多型
の別個の分析によって強く支持される。

【００１２】 イネ、コムギ、シコクビエ、オオムギおよびトウモロコシの病原体（mtＤＮＡ
型Ｉa-e）はきわめて類似し、一方 Digitaria spp. および Pennisetum spp. の
病原体（mtＤＮＡ型II−IV）は前述のグループからおよび互いに著しく分岐して
いる。しかしながら、M.grisea 株はこの広い宿主範囲にわたり有意な穀物の損
害を起こすことができる。この病原体は、アフリカにおけるシコクビエ（Eleusi
ne coracana）の収穫の損失の主要な原因であり、一方ではコムギ（Triticum ae
stivum; Urashimaら,1993, Plant Disease 77: 1211-1216）、トウジンビエ（Pe
nnisetum glaucum; Hannaら, 1989, J.Heredity 80: 145-147）における感染は
それ程広範ではないが、湿気のある気候条件下にも働くことが可能である。この
疾患はオオムギおよびトウモロコシについても報告されている（Urashimaら, 19
93, Plant Disease 77: 1211-1216 参照）。

【００１３】

【表２】

【００１４】 植物病原体の真菌についての病原性および宿主特異性の知識は細菌およびウイ
ルス病原体の場合ほど進歩していない。同様に、穀類植物における抵抗性の分子
的基盤についても、双子葉植物もしくは双子葉モデル系、たとえば Arabidopsis
（Bakerら, 1997, Science 276: 726-733）の場合ほど知られていない。Sasaki
はイネいもち病に対する抵抗性の遺伝に関する最初の結果を1917年に日本で始め
た研究から報告した（Sasaki, 1922, Japanese Genetics, Japan 1: 81-85）。

【００１５】 このときから、広範な遺伝子分析により全世界で 30 以上のＲ−遺伝子が定義
され、これらのいもち病抵抗性遺伝子の多くはイネの染色体にマップされている
（Takahashi, 1965, The Rice Blast Disease, Johns Hopkins Press, Baltimor
e,303-329; Causseら, 1994, Genetics 138: 1251-1274 参照）。これらのＲ−
遺伝子には、２０種の主要抵抗性遺伝子と１０種の推定定量的特徴部位（ＱＴＬ
）が包含される。Kiyosawa は１３種の主要抵抗性遺伝子について記載し、これ
らの遺伝子中の９種を３つの遺伝子座における多重対立遺伝子として、５種を染
色体１１上のＰｉ−ｋ遺伝子座に、２種を染色体６上のＰｉ−ｚ遺伝子座にそし
て２種を染色体１２上のＰｉ−ｔａ遺伝子座に見いだした（Kiyosawa, 1984, Ri
ce GeneticsNewsletter 1: 95-97）。日本（Ise, 1992, International Rice Re
search Newsletter 17: 8-9）および International Rice Research Institute
（ＩＲＲＩ）（Mackillら, 1992, Phytopathology 82: 746-749）における最近
の研究はどの抵抗性遺伝子が真菌の個々の株の制御に有効であるかを決定するた
めの「検定」イネ品種として使用される近同質イネ系統（ＮＩＬ）を産生した。
熱帯地方のいもち病真菌集団のインディカ検定種を提供するＩＲＲＩ ＮＩＬは
それらの抵抗性遺伝子と Kiyosawa の検定種に存在する抵抗性遺伝子の間の遺伝
的関係について分析した（Inukaiら, 1994, Phytopathology 84: 1278-1283)。

【００１６】 Ｒ−遺伝子に緊密に連結した分子マーカー（またはタグ）は品種改良プログラ
ムにおいてそれらのＲ−遺伝子の有効な浸透および操作に利用できる。近同質系
統、それらのドナーおよびそれらの反復親のゲノタイプパターンを比較すること
によって、Yuら（1987, Phytopathology 77: 323-326）は３つのいもち病抵抗性
遺伝子に連結した５つの制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーを同定するこ
と、およびそれらを分断集団の使用によってイネ染色体にマッピングすることが
できた。Ｒ−遺伝子に連結したＲＦＬＰマーカーが報告されている（Yuら, 1991
,Theor Appl Genet 81: 471-476）。耕種学的に重要なＲ−遺伝子の分子クロー
ニングは、Ｒ−遺伝子を、鍵となる穀類品種における他のインプットおよびアウ
トプット特性と結合させる研究者の能力の更なる進歩を表している。

【００１７】 抵抗性の遺伝に関する上述の研究の過程で Sasaki は、いもち病真菌の異なる
野生単離体が、イネの様々な品種に対し疾患を起こす能力には変動のあることを
観察し、イネいもち病真菌病原体の生理学的な種族を発見した（Sasaki, 1922,
Journal of Plant Protection 9: 631-644; Sasaki, 1923, Journal of Plant
Protection 10: 1-10）。イネいもち病真菌に対する主要なＲ−遺伝子抵抗性の
不安定性または野生条件における「分解」が、異なるイネ品種に対する毒性スペ
クトルによって定義される多数の種族または病理型の同定を生じた（Chapter 13
および 16, The Rice Blast Disease, 1994, ed. Zeigler, Leong & Teng, CAB
International, Wallingford）。病原体集団は新しい抵抗性遺伝子の発生に対し
てダイナミックな応答を示し、時には抵抗性遺伝子の野外での発生から１〜２年
以内に、抵抗性遺伝子を克服する新たな種族を生じた。

【００１８】 研究者はまだイネいもち病の病理体系における無毒性遺伝子／Ｒ−遺伝子ペア
を徹底的に特性づけるには至っていない。

【００１９】 1997年7月15日に Tanksley & Martin に発行された米国特許 5,648,599 には
植物の細菌病原体における無毒性遺伝子に応答して植物に疾患抵抗性を付与する
Pto セリン／スレオニンキナーゼをコードするトマトからの単離遺伝子フラグメ
ントが記載されている。

【００２０】 1995年10月26日公開のＷＯ95/28423 には Pseudomonas syringae ＲＰＳ２遺
伝子ファミリーによる抵抗性、プライマー、プローブおよび検出方法が記載され
ている。この公開国際出願は、病原体に対して植物を保護する特定のＮＨ₂−末
端モチーフ、ＮＢＳモチーフ、および富ロイシンリピートを有する蛋白質をコー
ドする遺伝子の広範な請求の範囲を包含する。Ｐｉ−ｔａ蛋白質のある種のユニ
ークな特徴が示されている。Ｐｉ−ｔａ遺伝子産物はＲＰＳ2 遺伝子産物サブフ
ァミリーのロイシンジッパーモチーフの可能性（Bentら, 1994, Science 265: 1
856-1860; Mindrinosら, 1994, Cell 78: 1089-1099）またはＮ遺伝子サブファ
ミリーによりコードされるToll/Interleukin−1 受容体ホモロジー（Whitmanら,
1994, Cell78: 1101-1115）のいずれかを欠くユニークなアミノ末端を有する。
最も重要な点はＰｉ−ｔａ遺伝子産物のカルボキシ末端部分はロイシンに富むが
、Ｒ−遺伝子産物について報告されたロイシン富リピートのコンセンサス配列に
は適合しないことである（Jones & Jones, 1997, Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plan
t Pathol. 24: 89-167）。

【００２１】 1996年11月5日に Bakerらに発行された米国特許 5,571,706 はＮ遺伝子により
付与される植物ウイルス抵抗性をカバーするものである。 1999年1月12日に Staskawiczらに発行された米国特許 5,859,351 にはトマト
の疾患抵抗性に関与するＰＲＦ蛋白質および核酸配列が記載されている。

【００２２】 1999年1月12日に Ronaldらに発行された米国特許 5,859,339 にはＬＲＲおよ
びセリン／スレオニンキナーゼドメインの両者とともに完全な膜蛋白質をコード
するイネＸa−21 からクローン化された最初の抵抗性遺伝子が記載され、これは
イネに細菌の胴枯れ病に対する抵抗性を付与する。

【００２３】 1991年10月17日に公開されたＷＯ91/15585 および 1999年2月2日に Witらに発
行された米国特許 5,866,776 には、病原体無毒性遺伝子および相当する植物抵
抗性遺伝子の組み合わせを用いる、病原体に対する植物の保護方法が記載されて
いる。

【００２４】 1997年10月7日に Kawasakiらに発行された米国特許 5,674,993（'993 特許）
には、イネいもち病抵抗性遺伝子Ｐｉ−ｂ、Ｐｉ−ｔａおよびＰｉ−ｔａ² で共
分断される核酸マーカー、ならびにイネいもち病抵抗性遺伝子はこれらの核酸マ
ーカーを用いて単離されクローン化できるとの示唆が記載されている。しかしな
がら '993 特許には、イネいもち病抵抗性遺伝子のヌクレオチド配列は全く提供
されていない。Ｐｉ−ｂイネいもち病抵抗性遺伝子の推定配列は現在、Genbank
（受入番号：AB013448）から入手できることに留意すべきである。

【００２５】 さらに Kawasakiらは２つの論文を発表した。第一の論文は“High Resolution
Mapping of the Indica-Derived Rice Blast Resistance Genes.II．Pi-ta² and
Pi-ta and a Consideration of Their Origin."と題する MPMI, 10(4): 517-524
(1997) である。519頁の12欄の最初に掲げられたＲＡＰＤプライマーの配列は、
'993 特許の配列番号：２に掲げられたＲＡＰＤプライマーとは同じではない。
この論文におけるプライマー配列は TCCCCAGCCA である。'993 特許におけるプ
ライマー配列は TCGCCAGCCA である。どちらの配列が正しいかは明らかでない。
しかしながら、この論文がイネいもち病遺伝子のヌクレオチド配列は全く示して
いないことは明瞭である。第二の論文は Nakamuraら, Mol.Gen.Genet. 254:611-
62 (1997) である。この論文はイネＢＡＣライブラリーを用いてイネいもち病抵
抗性遺伝子Ｐｉ−ｔａ²の近セントロメア領域における８００−kbコンティグの
構造を記載している。この論文にも、イネいもち病遺伝子のヌクレオチド配列は
開示されていない。

【００２６】 したがって Magnaporthe grisea の制御における有用性が証明され、他のイネ
科穀類に対しても同様に、穀類保護のツールとして重要な価値があると思われる
イネからのＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子はこれまで誰によってもクローン化されたこ
とも配列決定されたこともなかったと考えられる。したがって、ここに記載され
る発明は、イネいもち病病原性システムにおけるＰｉ−ｔａ無毒性遺伝子／Ｒ−
遺伝子ペアの分子的特徴を初めて提示するものである。

【００２７】

【発明の開示】

本発明は、真菌病原体によって引き起こされる疾患に対するＰｉ−ｔａ抵抗性
遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメントに関し、上記核酸フラグメ
ントは配列番号：１もしくは68に示すヌクレオチド配列またはその機能的に均等
なサブフラグメントに実質的に相当する核酸フラグメントである。

【００２８】 他の態様においては、本発明は、真菌病原体によって引き起こされる疾患に対
するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸からなる遺伝子に
関し、上記核酸フラグメントは配列番号：１もしくは６８に示すヌクレオチド配
列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当し、これらの核酸
フラグメントは適当な調節配列に操作性に連結している。

【００２９】 さらに他の態様においては、本発明は真菌病原体により引き起こされる疾患に
対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を植物に付与する方法において、真
菌病原体により引き起こされる疾患に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応
答を付与する単離核酸からなる遺伝子を植物に導入することからなり、上記核酸
フラグメントは配列番号：１もしくは６８に示すヌクレオチド配列またはその機
能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当し、これらのフラグメントは適当
な調節配列に操作性に連結している方法に関する。

【００３０】 さらに他の態様においては、本発明は植物の真菌病原体による感染部位に抵抗
性遺伝子仲介防御応答を付与する方法において、（１）真菌病原体によって引き
起こされる疾患に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核
酸フラグメントであり、上記核酸フラグメントは配列番号：１もしくは６８に示
すヌクレオチド配列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当
するフラグメントならびに（２）配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド
配列またはそれと機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−
Pita 単離核酸フラグメントからなる組換え発現構築体で植物をトランスフォー
ムすることからなり、上記核酸フラグメントは調節配列に操作性に連結し、さら
に上記構築体は感染部位に真菌病原体により引き起こされる疾患に対する抵抗性
遺伝子仲介防御応答を植物に付与する方法に関する。

【００３１】 本発明はまた、（１）真菌病原体によって引き起こされる疾患に対してＰｉ−
ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメントであり、上記遺
伝子フラグメントは配列番号：１もしくは68に示すヌクレオチド配列またはその
機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するフラグメントならびに（２
）配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド配列またはその機能的に均等な
サブフラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメントから
なり、上記核酸フラグメントは調節配列に操作性に連結している、真菌病原体に
よって感染部位に引き起こされる疾患に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を植物
に付与する組換え発現構築体に関する。

【００３２】 このような遺伝子または組換え発現構築体によりトランスフォームされた植物
、およびこのような植物から得られる種子にも興味がもたれる。

【００３３】生物の寄託 真菌株のＯ−137は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）, 10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 に寄託され、以下の名称、受
入番号および寄託日を与えられた。日本において Digitaria smutsii から単離
された病原体真菌株Ｇ−213 は、Jean Loup Notteghem, Laboratoire de phytop
athologie, Institut de Recherches Agronomiques Tropicales et des Culture
sVivrieres, Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomiqu
epour le Developpement（ＣＩＲＡＤ）, BP 5035, 34032 Montpellier Cedex 1
,France の収集から得られ、ＪＰ34 の名称で利用可能である。この株もＡＴＣ
Ｃに寄託された。

【００３４】 生物体 受入番号 寄託日 M. grisea Ｏ−137 ATCC 74457 1998年8月3日 M. grisea Ｇ−213 PTA-191 1999年6月8日

【００３５】配列番号の簡単な説明 本出願の一部である以下の詳細な説明および配列の記載から、本発明はさらに
完全に理解できるものと確信する。配列の記載は 37 C.F.R.1.822（引用により
本明細書に導入される）に記載されたアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレ
オチド配列は５′から３′へと読む。

【００３６】 配列番号：１は Oryza sativa の品種 Yashiro-mochi からのＰｉ−ｔａ遺伝
子のゲノムクローンの５７５７ヌクレオチド配列である。 配列番号：２は、配列番号：１に掲げたＰｉ−ｔａ遺伝子によってコードされ
る推定蛋白質配列である。 配列番号：３は感受性 Oryza sativa の品種 Tsuyuake からのＰｉ−ｔａ遺伝
子のゲノムクローンの 5113 ヌクレオチド配列である。 配列番号：４は、配列番号：３に掲げたｐｉ−ｔａ遺伝子によってコードされ
る推定蛋白質配列である。 配列番号：５は、M.grisea イネ病原体Ｏ−137からのＡＶＲ−Pita（以前には
ＡＶＲ２−ＹＡＭＯと呼ばれた）ｃＤＮＡの６７２ヌクレオチドコード配列であ
る。

【００３７】 配列番号：６は、配列番号：５に掲げた配列によってコードされる推定蛋白質
配列である。 配列番号：７は Digitaria 種に感染する M.grisea 病原体Ｇ−213からのＡＶ
Ｒ−Pita ｃＤＮＡの６７５ヌクレオチドコード配列である。 配列番号：８は、配列番号：７に掲げた配列によってコードされる推定蛋白質
配列である。 配列番号：９〜２４はＰｉ−ｔａ領域の遺伝子マッピングおよびクローニング
に用いられるオリゴヌクレオチド（ＲＡＰＤ）プライマーの配列である。 配列番号：２５〜３１はＢＡＣ挿入端のＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレ
オチドプライマーである。

【００３８】 配列番号：３２および３３は、ＲＡＰＤマーカーＳＰ4Ｂ９の位置を確証する
ために用いられるＰＣＲプライマーである。 配列番号：３４〜３６はＰｉ−ｔａ候補遺伝子ＰＲＧ２の単一コピーを含有す
るＢＡＣクローンＲＢ142Ｅ8から得られる部分配列である。 配列番号：３７〜６４は配列番号：１に示したＰｉ−ｔａ（ＰＲＧ２）のゲノ
ムクローンの完全配列決定に用いられる配列決定プライマーである。 配列番号：６５はＰｉ−ｔａ核酸フラグメントを得るために用いられるオリゴ
ヌクレオチドプライマーである。 配列番号：６６および６７は、推定成熟プロテアーゼを直接コードするＡＶＲ
−Pita₁₇₆およびＡＶＲ−Pita 核酸フラグメントを増幅するために用いられるＰ
ＣＲプライマーである。

【００３９】 配列番号：６８は２４２５bpのネイティブなＰｉ−ｔａプロモーター（ヌクレ
オチド１〜2425）ならびにＰｉ−ｔａ ｃＤＮＡ（ヌクレオチド 2426〜5211）を
含有するＥcoＲＩ−Ｈind IIIフラグメントの5222ヌクレオチド配列である。 配列番号：６９および７０はｐＭＬ135の構築においてリンカーフラグメント
の発生に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーである。 配列番号：７１および７２は、トウモロコシゲノムＤＮＡから Adh1−６イン
トロンを増幅するために用いられるＰＣＲプライマーである。 配列番号：７３および７４はｐＡＶＲ3 の構築過程においてＡＶＲ−Pita 核
酸フラグメント（配列番号：５）を増幅するために用いられるＰＣＲプライマー
である。

【００４０】 添付図面において： 図１は、Ｒ−遺伝子を含有する染色体領域の分子マップ。 Ａ．1440 ＲＡＰＤプライマーのそれぞれを、イネ品種 Yashiro-mochi に由来
するＲ−遺伝子に連結した多型の同定のために試験した。この図は、二重一倍体
（ＤＨ）集団の１１９のメンバーにおけるＲ−遺伝子で分断された多型ＤＮＡフ
ラグメントを同定する１６プライマーを用いて調製された連結マップを示す。マ
ーカーの最も有望な順序（コンピュータープログラム Mapmaker, バージョン２
によって定義する）を左側にセンチモルガン（cＭ）で示したマーカー間の距離
とともに与える。マップは一定の比率で描かれたものではないことに注意すべき
である。この集団中、マーカーＳＰ7Ｃ3，ＳＰ7Ｈ8 およびＳＰ8Ｃ6 はＲ−遺伝
子との組換えを示さないが、マーカーＳＰ8Ｂ8 およびＳＰ3Ｇ6 は連結グループ
の遠位端にマッピングされた。 Ｂ．連結マップの分解能は付加的な 151ＤＨ系統および７２０のＦ２子孫に対
して１６マーカーを試験して上昇させた。９９０個体のより大きな総集団におい
て、マーカーＳＰ7Ｃ3、ＳＰ7Ｈ8 およびＳＰ8Ｃ6 は同様にＲ−遺伝子との組換
えを示さなかった。しかしながらこの分析は、以前に群をなすとされた隣接マー
カーを分解した。マーカーＳＰ4Ｂ9 およびＳＰ9Ｆ3 はＲ−遺伝子領域に最も直
ぐに隣接する。

【００４１】 図２は、Ｐｉ−ｔａのポジショナルクローニング。 染色体歩行実験は、元はＲＡＰＤマーカーＳＰ7Ｃ3 で同定された単一コピー
多型配列で開始された。左への一歩は、マーカーＳＰ4Ｂ9 を含有するＢＡＣク
ローンである一方の組換え境界を同定し、これはＲ−遺伝子から、Ｆ２子孫系統
Ｋ25における組換え現象によって分離された。白い四角は重複ＢＡＣクローンを
同定するために用いたＢＡＣプローブの位置を指示し、黒い四角は重複を確証す
るために用いたプローブを指示する。ランダムゲノム配列決定によって分析され
たＢＡＣクローンは破線で指示する。Pi-ta 遺伝子候補（ＰＲＧ2）、ならびに
179Ｇ5Ｒから 77Ｄ8-12 までのＤＮＡマーカー（ゲノム領域を表す線上に示す）
はマーカーＳＰ7Ｃ3 と再結合せず、イネマッピング集団のメンバー中に表現型
によりＲ−遺伝子と定義された（感染アッセイにより決定）。右の境界を定義す
るマーカーＳＰ9Ｆ3 は一つのＤＨ系統、ＹＴ171 との組換えを示した。

【００４２】 図３は、ＢＡＣ ＲＢ142Ｅ8 のランダムゲノム配列決定により得られた最初の
３つのサブクローン（破線）の位置を示すＲ−遺伝子の制限マップである。 bac142e8.pk0001.f12（f12, 配列番号：３４），bac142e8.pk0001.b7（b7, 配
列番号：３５）および bac142e8.pk0001.f8（f8, 配列番号：３６）があった。
以後の配列決定により「ヒットなしのクラス」から重複サブクローン bac142e8.
pk0001.e10（e10）および bac142e8.pk0005.c10（c10）が同定された。ＢＡＣ
ＲＢ142Ｅ8（#7）からの５.３kbフラグメントをプラスミド bac142e8.pk0001.f8
にサブクローニングして図４Ａに記載したように全Ｒ−遺伝子を含有するｐＣ
Ｂ1641を得た。一番上部の線上の２つの濃い黒い線は、Ｐｉ−ｔａコード配列を
指示し、介入する薄い黒い線は遺伝子中の単一イントロンを表し、矢印は遺伝子
転写の方向を示す。制限部位にはＢamＨＩ（Ｂ）およびＥcoＲＩ（Ｅ）が包含さ
れる。

【００４３】 図４は、プラスミドｐＣＢ1641 およびｐＣＢ1645 の構築。制限部位はＢamＨ
Ｉ（Ｂ）、ＥcoＲＩ（Ｅ）、Ｈind III（Ｈ）、Ｓst IIおよびＳalＩを包含する
。イタリック表示の制限部位（Ｅ，ＳalＩ）はベクターからのもので、イネゲノ
ム配列からのものではない。 Ａ．ゲノムの完全長ＰＲＧ２コード配列を、１２５5bpプロモーター配列、１
４６３bpイントロンおよび２kbの３′非翻訳配列とともに含有するプラスミドｐ
ＣＢ1641 は、bac142e8.pk0001.f8中の２.２kbイネＤＮＡ挿入体からの（２０１
bp）ＥcoＲＩフラグメントの代わりに、クローン #7 からの５.３kb ＥcoＲＩイ
ネゲノムフラグメントをライゲートして構築した。 Ｂ．３′の１０２８bp ＰＲＧ２コード配列（位置 4477〜5505）を含むプラス
ミドｐＣＢ1645 はプラスミドｐＣＢ1641 からのこの領域を、プライマーＧＢ46
（配列番号：６３）およびＧＢ47（配列番号：６４）を用いＰＣＲで増幅して構
築した。これらのプライマーはそれぞれＳalＩおよびＥcoＲＩの制限部位を含有
する。このＰＣＲフラグメントをＳalＩおよびＥcoＲＩで消化し、ｐＧＡＬ4-Ａ
Ｄ（Stratagene）の相当する部位にクローン化した。

【００４４】 図５は、プラスミドｐＣＢ1641 中に含まれるＰＲＧ２核酸フラグメントにお
ける相対的なプライマー位置。 これらのプライマーは抵抗性および感受性イネ品種からのゲノムＤＮＡフラグ
メントの増幅およびＤＮＡ配列決定に使用した。

【００４５】 図６は、推定 Pi-ta タンパク質配列。 感受性品種に見いだされた５つのアミノ酸の相違を上記Ｒ−蛋白質配列に指示
する。本文に論じた上記Ｒ−蛋白質の特徴に下線を付す。アミノ酸２３６〜２４
４の間のＰ−ループドメイン、アミノ酸３１４〜３２３の間のキナーゼ 2a ドメ
イン、アミノ酸３４２〜３５３の間のキナーゼ 3a ドメイン、アミノ酸４０７〜
４１５間の疎水性ドメインである。４個のＮ−グリコシル化部位の可能性がある
位置、３３９、５５６、６５４および８３８には二重下線を付した。

【００４６】 図７は、プラスミドｐＣＢ1947、ｐＭＬ63 およびｐＣＢ1926 における構築の
図解。 Ａ．ｐＣＢ1947 は、一過性発現実験のために、推定成熟プロテアーゼを直接
コードするように操作したＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメント（以前はＡＶＲ
２−ＹＡＭＯと呼ばれた）の構築体を含有する。ＡＶＲ−Pita₁₇₆と命名された
単離核酸フラグメントのこのプロセッシングされた型は、配列番号：６に掲げた
アミノ酸 48〜223 からなるポリペプチドをコードする。開始メチオニンはクロ
ーニング過程で用いたＮcoＩ部位により構築体に添加した。ＡＶＲ−Pita コー
ド配列は、最初、インフレームなＮcoＩ部位を含むプライマーＹＬ30（配列番号
：６６）およびＫpnＩ部位を含有するＹＬ37（配列番号：６７）を用いてＰＣＲ
により増幅し、ｐＭＬ142 のＮcoＩ−ＫpnＩ部位にクローニングしてｐＣＢ1947
を得た。35Ｓプロモーターの下流へのトウモロコシの Adh1-6 イントロンの挿
入は単子葉植物の発現を上昇させた。このイントロンは Mascarenhas D.ら, 199
0, Plant Mol Biol 15: 913-920 に記載されている。

【００４７】 Ｂ．ｐＭＬ63 は、ＣaＭＶ35Ｓプロモーターおよび３′ＮＯＳ配列に操作性に
連結した uidＡ遺伝子（ＧＵＳ酵素をコードする）を含有する。ｐＭＬ63はｐＭ
Ｈ40 から修飾し、最小限の３′ＮＯＳターミネーターフラグメントを産生させ
た。ｐＭＨ40 は 1998年4月23日に公開されたＷＯ98/16650 に記載されている。
この開示は引用により本明細書に導入される。本技術分野の熟練者には周知の標
準技術を用いて、ｐＭＨ40 に含まれる７７０塩基ペアターミネーター配列を De
pickerら（1982, J. Appl.Genet. 1: 561-574）によって報告されたヌクレオチ
ド 1277〜1556 からなる新しい３′ＮＯＳターミネーター配列で置換した。 Ｃ．ｐＣＢ1926はまず、第一鎖ｃＤＮＡからの２.１kb部分 Pi-ta ｃＤＮＡ核
酸フラグメントを、プライマーＦ12-1（配列番号：４４）およびＧＢ67（配列番
号：６５）を用いて増幅することにより創製された Pi-ta ｃＤＮＡ構築体を含
有する。合成完全長ｃＤＮＡを、ｐＣＢ1641 からのゲノムＰｉ−ｔａ遺伝子の
５′末端を含む７０６bp ＮcoＩ−ＢamＨＩフラグメントを導入することによっ
て生成し、プラスミドｐＣＢ1906 を生成させた。ネイティブな Pi-ta プロモー
ター配列（ｐPi-ta）および７３６bpの５′Pi-ta コード配列を含有するｐＣＢ1
649 からの３.１kb ＥcoＲＩフラグメントをついでｐＣＢ1906のＥcoＲＩ部位に
挿入して合成ｃＤＮＡ核酸フラグメントの７３６bp ５′末端を置換し、ｐＣＢ1
926 を産生させた。

【００４８】 図８は、イネ植物におけるＰｉ−ｔａ機能の粒子ボンバードメント一過性アッ
セイ。 これらのイネの葉は図７における構築体を用いたイネにおけるＧＵＳならびに
Ｐｉ−ｔａおよびＡＶＲ−Pita ｃＤＮＡのバイオリスティックな一過性発現の
結果を示す。実生はすべて 35Ｓ::ＧＵＳ（ｐＭＬ63）および 35Ｓ／adh::ＡＶ
Ｒ−Pita（ｐＣＢ1947）でコボンバードメントに付した。葉３および４は同じく
、ネイティブな２.４２５kb Pi-ta プロモーター（ｐＣＢ1926）の制御下に Pi
−ta ｃＤＮＡでボンバードされた実生から採取した。イネ品種ＹＴ14 およびＹ
Ｔ16 における内因性Ｐｉ−ｔａ遺伝子の存在（Ｐｉ−ｔａ）または不存在（−
）を指示する。ＧＵＳの発現は図中の葉における暗色の斑点のによって指示され
、これは一番左の葉で最も顕著である。青色のＧＵＳ染色の不存在はＨＲ抵抗性
応答の指標として使用された。クローン化されたＰＲＧ2 候補核酸フラグメント
はこのアッセイでは内因性Ｐｉ−ｔａ遺伝子を置換する。ＹＴ14 およびＹＴ16
はイネの葉のソースを指示する。両者ともＤＨイネ系統であるが、ＹＴ14 は内
因性 Pi-ta 核酸フラグメントを含有し、一方ＹＴ16 はそれを含まない。

【００４９】 図９は、無傷の Pi-ta 核酸フラグメントの存在を測定するための一次トラン
スフォーマントのＤＮＡゲルブロット分析。 ゲノムＤＮＡを、ＥcoＲＩ（ブロットの左側）またはＥcoＲＶ（ブロットの右
側）で消化し、プラスミドｐＣＢ1645 にクローン化したＰｉ−ｔａ核酸フラグ
メントの１０２８bp ＥcoＲＩ−ＳalＩ ３′末端フラグメントで探査した（図４
Ｂ）。Nipponbare トランスフォーマントおよびトランスフォームされていない
Nipponbare の親における内因性感受性 pi-ta 対立遺伝子に相当するバンドを指
示する。すべての他のバンドはプラスミドｐＣＢ1641 からのＰｉ−ｔａ核酸フ
ラグメントのコピーを表す。一次トランスフォーマント 22-6-1-1、 22-6-3-1 お
よび 22-6-11-4 は抵抗性であり、一方、22-2-7-2、 22-3-1-1 および 22-4-1-1
は中間抵抗性である。

【００５０】 図１０は、無傷のＰｉ−ｔａ核酸フラグメントの存在を測定するための中間抵
抗性一次トランスフォーマント 22-6-10-1 からの１１のハイグロマイシン抵抗
性Ｒ１個体のＤＮＡゲルブロット分析。 ゲノムＤＮＡを、ＥcoＲＶで消化して、プラスミドｐＣＢ1926 から単離され
た Pi-ta 核酸フラグメントの８６０bp ＥcoＲＶ−Ｈind III ３′末端フラグ
メントで探査した。Nipponbare トランスフォーマントおよびトランスフォーム
されていない Nipponbare の親における内因性感受性 pi-ta 対立遺伝子に相当
するバンドを指示する。上方の他のバンドはプラスミドｐＣＢ1641 からの Pi-t
a 核酸フラグメントのコピーを表す。Ｒ０一次トランスフォーマント 22-6-10-1
（レーン14）は１１のＲ１子孫（Ａ−Ｋ）と同じＲＦＬＰを有する。この植物か
らの貧弱なＤＮＡ量はサザンブロット上のレーン１４に歪んだ不均一のバンドを
生じた。すべての１１のＲ1 子孫は同じＲＦＬＰを含み、中間疾患抵抗性であり
、Ｐｉ−ｔａ核酸フラグメントおよび疾患抵抗性表現型の安定な遺伝を指示する
。

【００５１】 この開示に関連して、多くの技術用語が使用される。 「疾患抵抗性遺伝子」なる語は、植物細胞または植物組織に防御応答を誘導で
きるポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。「疾患抵抗性遺伝子」、「抵
抗性（Ｒ）遺伝子」および「Ｒ」遺伝子なる語は本明細書においては同義に用い
られる。防御応答から生じる抵抗は数種の形態を取ることができる。たとえば、
ある遺伝的背景では抵抗は接種された植物組織上に目に見える形を取らないし、
また他の抵抗では、小さな褐色の斑点を生じ、ここからは真菌は胞子を形成でき
ず、感染を再開することがない。いずれの場合も真菌病原体はその生活環を全う
せずに疾患の進展は停止する。ある場合には、疾患抵抗性は完全な疾患に典型的
な量の真菌胞子を生じないサイズの小さな病変の形態を取る。

【００５２】 「防御応答」は、感染物質または病原体の存在と戦うために宿主たとえば植物
によって生成される特異的な防御反応である。 「Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子」は、真菌病原体たとえば Magnaporthe grisea に
対し植物細胞または植物組織内に防御応答を誘導できるポリペプチドをコードす
る疾患抵抗性遺伝子である。

【００５３】 「Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答」なる語は、Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子
によりコードされ、真菌病原体の存在により誘導されるポリペプチドの産生によ
る防御応答を意味する。 「ＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメント」は病原体から単離される核酸フラグ
メントであり、この核酸フラグメントはＰｉ−ｔａ抵抗性蛋白質との直接的なま
たは間接的な相互作用がＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答の誘発に関与する
ポリペプチドをコードする。

【００５４】 「単離核酸フラグメント」は、一本鎖または二本鎖の、任意に合成、非天然ま
たは変化させたヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであ
る。ＤＮＡポリマー型の単離核酸フラグメントはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは
合成ＤＮＡの１または２以上のセグメントから構成されてもよい。

【００５５】 「機能的に均等であるサブフラグメント」および「機能的に均等なサブフラグ
メント」なる語は本明細書では同義に用いられる。これらの語は、フラグメント
またはサブフラグメントが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、遺伝子
の発現を変えるまたはある種の表現型を生成する能力を維持している単離核酸フ
ラグメントの部分またはサブ配列を意味する。たとえば、そのフラグメントまた
はサブフラグメントは、トランスフォームされた植物に所望の表現型を生成させ
るキメラ遺伝子の設計に使用することができる。キメラ遺伝子は核酸フラグメン
トまたはそのサブフラグメントを植物プロモーター配列に関して適当な方向に連
結することにより、それが活性な酵素をコードするか否かにかかわらず、共抑制
またはアンチセンスに使用するために設計することができる。

【００５６】 本明細書で用いられる「実質的に同じ」および「実質的に相当する」なる語は
、１または２以上のヌクレオチド塩基で核酸フラグメントの遺伝子発現の仲介能
力またはある種の表現型の生成能力に影響しない変化を受けた核酸フラグメント
を意味する。これらの語はまた、１または２以上のヌクレオチドの欠失または挿
入のような本発明の核酸フラグメントの修飾であって、最初の非修飾フラグメン
トに関して得られた核酸フラグメントの機能性は実質的に変化しない修飾を意味
する。したがって、本技術分野の熟練者には明らかなように本発明は特異的な例
示配列以上の配列を包含するものであることを理解すべきである。

【００５７】 さらに、本発明に包含される実質的に同じ核酸配列はまた、熟練技術者には明
らかなように、中等度の緊縮条件下（たとえば、０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ
、６０℃）において、ここに例示された配列と、またはここに報告されたヌクレ
オチド配列であり本発明のプロモーターと機能的に均等な任意の部分と、ハイブ
リダイズする能力によって定義される。本発明に包含される実質的に同じ核酸配
列は、好ましくは、ここに記載された核酸フラグメントと８０％の同一性を示す
配列またはここに記載されたヌクレオチド配列の任意の部分と８０％の同一性を
示す配列である。さらに好ましくは、ここに記載された核酸配列と９０％の同一
性を示すか、またはここに記載されたヌクレオチド配列の任意の部分と90％の同
一性を示す核酸フラグメントである。最も好ましくは、ここに記載された核酸配
列と95％の同一性を示すかまたはここに記載されたヌクレオチド配列の任意の部
分と95％の同一性を示す核酸フラグメントである。配列のアラインメントと類似
性％の計算は、ＬＡＳＡＲＧＥＮＥ情報コンピューター装置の Megalign プログ
ラム（Dnastar Inc., Madison, WI）を用いて行った。配列の多重アラインメン
トは Clustal のアラインメント法（Higgins & Sharp, 1989, CABIOS. 5:151-15
3）によりデフォルトパラメーター（GAP PENALTY＝１０，GAP LENGTH PENALTY＝
１０）を用いて実施した。Clustal 法を用いたペア毎のアラインメントおよび蛋
白質配列の同一性％の計算のためのデフォルトパラメーターは KTUPLE＝１、GAP
PENALTY＝３、WINDOW＝５および DIAGONALS SAVED＝５とする。核酸については
これらのパラメーターは GAP PENALTY＝１０、GAP LENGTH PENALTY＝１０、KTUP
LE＝２、GAP PENALTY＝５、WINDOW＝４および DIAGONALS SAVED＝４とする。ア
ミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的部分」はＢＬＡＳＴ（Altschul, S.F.
ら, 1993, J.Mol.Biol. 215: 403-410）およびギャップＢＬＡＳＴ（Altschul,
S.F.ら, 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）のようなアルゴリズムを用
いて、本技術分野の熟練者による配列の手作業での評価またはコンピューター自
動配列比較および同定により、そのポリペプチドもしくは遺伝子の同定候補を与
えるのに十分なポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列か
ら構成される（また、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/も参照）。

【００５８】 「遺伝子」は、コード配列に先立つ（５′−非コード配列）および以後の（３
′−非コード配列）調節配列を含めて、特定の蛋白質を発現する核酸フラグメン
トを意味する。「ネイティブな遺伝子」は天然にそれ自身の調節配列とともに見
いだされる遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見いだされる
ことはない調節配列およびコード配列からなるネイティブではない遺伝子である
任意の遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソースに由来す
る調節配列およびコード配列からなるか、または同じソースに由来する調節配列
およびコード配列からなるが、天然に見いだされるのとは異なる様式でアレンジ
されている。「内因性遺伝子」配列は、生物のゲノム中の天然の位置におけるネ
イティブな遺伝子を意味する。「異種」遺伝子は宿主細胞中に正常には見いださ
れないが、遺伝子トランスファーによって宿主生物中に導入された遺伝子を意味
する。異種遺伝子は、ネイティブでない生物中に挿入されたネイティブな遺伝子
、またはキメラ遺伝子からなる。「トランスジーン」はトランスフォーメーショ
ン操作によってゲノム中に導入された遺伝子である。

【００５９】 「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を意味する。
「調節配列」はコード配列の上流（５′−非コード配列）、その配列内、または
下流（３′−非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を意味し、それらは転
写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性または会合コード配列の翻訳に影響す
る。このような配列はネイティブでもネイティブでなくてもよい。調節配列には
、それらに限定されるものではないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イン
トロン、およびポリアデニル化認識配列が包含される。

【００６０】 「病原体」は、生存植物組織の細胞の周辺または内部へのその感染が疾患応答
を誘発する生物体または感染性物質を意味する。

【００６１】 「プロモーター」はコード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ
配列を意味する。プロモーター配列は近位およびさらに遠位の上流エレメントか
らなり、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、
「エンハンサー」はプロモーターの活性を刺激できるＤＮＡ配列であって、プロ
モーターの内生的エレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を
上昇させるために挿入された異種エレメントのＤＮＡ配列である。プロモーター
はそれらの全体がネイティブな遺伝子に由来するものであっても、天然に見いだ
される異種プロモーターに由来する異種エレメントから構成されても、また合成
ＤＮＡセグメントからなるものであってもよい。本技術分野の熟練者によれば、
異種プロモーターは異種組織もしくは細胞型において、分化の異なる段階でまた
は異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指図するものと理解されている。
大部分の細胞型で、大部分の時期に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、
一般に「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞において有用な様々な型の
新規プロモーターが絶えず発見され、多数の実例が Okamuro & Goldberg, 1989,
Biochemistry of Plants 15: 1-82 に列挙されている。調節配列の正確な境界は
大部分の場合、完全には定義されていないので、ある変動をもつＤＮＡフラグメ
ントが同一のプロモーター活性をもつことがさらに認められている。

【００６２】 「イントロン」は遺伝子中の介在配列であり、蛋白質配列の部分をコードする
ものではない。すなわちこのような配列はＲＮＡには転写されるが、ついで切断
されて、翻訳されない。この語はまた、切断されたＲＮＡ配列にも使用される。
「エキソン」は転写される遺伝子配列の部分であり、遺伝子から誘導される成熟
メッセンジャーＲＮＡ中に見いだされるが、必ずしも最終の遺伝子産物をコード
する配列の部分ではない。

【００６３】 「翻訳リーダー配列」とは遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に存在
するＤＮＡ配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全に
プロセッシングされたｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写体
のｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響する。
翻訳リーダー配列の例は Turner,R. & Foster, G.D., 1995, Molecular Biotech
nology 3: 225 に記載されている。

【００６４】 「３′-非コード配列」はコード配列の下流に存在するＤＮＡ配列を意味し、
ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響
できる調節シグナルをコードする他の配列を包含する。ポリアデニル化シグナル
は通常、ｍＲＮＡプレカーサーの ３′末端へのポリアデニル酸領域への付加に
影響することを特徴とする。異なる ３′-非コード配列の使用は Ingelbrechtら
, 1989, Plant Cell 1: 671-680 に例示されている。

【００６５】 「ＲＮＡ転写体」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生じる産
物を意味する。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補性コピーである場合には
それは一次転写体と呼ばれるか、またはそれは一次転写体の転写後プロセッシン
グに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジ
ャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンをもたず、細胞により蛋白質に翻訳さ
れるＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」は、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から
合成され、それと相補性のＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは一本鎖でもよく、また
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いて二本鎖型に変換すること
もできる。「センス」ＲＮＡはｍＲＮＡを包含し、したがって細胞内またはイン
ビトロで蛋白質に翻訳できるＲＮＡ転写体を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」
は標的一次転写体またはｍＲＮＡのすべてまたは部分に相補性で、標的遺伝子の
発現を遮断するＲＮＡ転写体を意味する（米国特許 5,107,065）。アンチセンス
ＲＮＡは特定の遺伝子転写体の任意の部分、すなわち ５′-非コード配列、３′
-非コード配列、イントロン、またはコード配列と相補性であってよい。「機能
性ＲＮＡ」とはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されないが
細胞過程に影響する他のＲＮＡを意味する。

【００６６】 「操作性に連結」の語は、一方の機能が他方によって影響されるように、単一
核酸フラグメントに対する核酸配列の会合を意味する。たとえばプロモーターは
それがコード配列の発現に影響できる場合（すなわちコード配列がプロモーター
の転写制御下にある場合）、コード配列と操作性に連結している。コード配列は
センスまたはアンチセンス方向で調節配列に機能性に連結することができる。

【００６７】 本明細書に使用される「発現」なる語は機能性最終産物の産生を意味する。遺
伝子の発現または過剰発現には、遺伝子の転写およびｍＲＮＡのプレカーサーま
たは成熟蛋白質への翻訳が包含される。「アンチセンス阻害」は標的蛋白質の発
現を抑制できるアンチセンスＲＮＡ転写体の産生を意味する。「過剰発現」なる
語はトランスジェニック生物における、正常なまたは非トランスジェニック生物
での産生レベルを越える遺伝子産物の産生を意味する。「共抑制」は、同一のま
たは実質的に同じ異種もしくは内因性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転
写体の産生を意味する（米国特許第 5,231,020）。

【００６８】 「変化した発現」とは、トランスジェニック生物における遺伝子産物の産生が
、野生型生物からの相当する組織（生物型および分化型）における活性から量ま
たは比率で有意に異なることを意味する。

【００６９】 「成熟」蛋白質とは、翻訳後プロセッシングを受けたポリペプチド、すなわち
一次翻訳産物中に存在するプレまたはプロペプチドが除去されたポリペプチドを
意味する。「プレカーサー」蛋白質とはｍＲＮＡの翻訳の一次産物すなわちプレ
またはプロペプチドがまだ存在する産物を意味する。プレおよびプロペプチドは
、それらに限定されるものではないが細胞内の局在シグナルであってもよい。

【００７０】 「葉緑体トランジットペプチド」は、蛋白質と接合して翻訳されその蛋白質を
葉緑体またはその蛋白質が作成された細胞内に存在する他のプラスチド型に向け
るアミノ酸配列である。「葉緑体トランジット配列」は葉緑体トランジットペプ
チドをコードするヌクレオチド配列を意味する。「シグナルペプチド」は蛋白質
と接合して翻訳されその蛋白質を分泌系に向けるアミノ酸配列である（Chrispee
ls, J.J., 1991, Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol. 42: 21-53）。蛋白質が
液胞に向けられる場合は、液胞ターゲティングシグナル（上述）をさらに付加さ
せ、小胞体に向けられる場合は、小胞体維持シグナル（上述）が付加される。蛋
白質が核へ向けられる場合は、存在するシグナルペプチドをすべて除去し、代わ
りに核局在シグナルを包含させる（Raikhel, 1992, Plant Phys. 100: 1627-163
2）。

【００７１】 「トランスフォーメーション」は核酸フラグメントの宿主生物のゲノムへのト
ランスファーを意味し、遺伝的に安定な素因が生じる。トランスフォームされた
核酸フラグメントを含有する宿主生物は「トランスジェニック」生物と呼ばれる
。イネ、トウモロコシおよび他の単子葉植物の好ましい細胞トランスフォーメー
ション方法には、粒子加速もしくは「遺伝子ガン」トランスフォーメーション技
術（Kleinら, 1987, Nature (London) 327: 70-73; 米国特許 4,945,050）また
は導入遺伝子を含有する適当なＴi プラスミドを用いるアグロバクテリウム-媒
介法（Ishida,Y.ら, 1996, Nature Biotech. 14: 745-750）の使用がある。

【００７２】 本発明で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は本技術分
野において周知であり、Sambrook,J., Fritsch,E.F. & Maniatis,T., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold
Spring Harbor, 1989（以下 Sambrook という）にさらに詳細に記載されている
。

【００７３】 「ＰＣＲ」もしくは「ポリメラーゼ連鎖反応」は一連の反復サイクルから構成
される（Perkin Elmer Cetus Instruments, CT）大量の特異的ＤＮＡセグメント
を合成するための技術である。通常二本鎖ＤＮＡを加熱して変性させ、標的セグ
メントの３′境界に相補性の２つのプライマーを低温でアニーリングし、ついで
中間温度で伸長させる。この３つの連続工程の１セットを１サイクルとする。

【００７４】 本明細書で用いられる「発現構築体」とは、本発明の任意の単離核酸フラグメ
ントからなり、本明細書で論じたように単独でまたは互いに組み合わせて用いら
れ、さらにベクターまたはそのサブフラグメントと接合して使用することもでき
る。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、本技術分野の熟練者には周知
のように宿主植物のトランスフォーメーションに使用する方法に依存する。たと
えば、プラスミドベクターを使用できる。本発明の単離核酸フラグメントからな
る宿主細胞を有効にトランスフォーム、選択および増殖させるためにベクター上
に存在しなければならない遺伝子エレメントは熟練者には周知である。また異な
る独立のトランスフォーメーション現象は異なる発現レベルおよび発現パターン
で起こること（Jonesら, 1985, EMBO J 4: 2411-2418; De Almeidaら, 1989, Mo
l.Gen.Genetics 218: 78-86）、したがって、所望の発現レベルおよびパターン
を示す系統を得るためには多くの現象をスクリーニングしなければならないこと
は熟練者には周知の通りである。このようなスクリーニングはＤＮＡのサザン分
析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、蛋白質発現のウエスタン分析または表現型分
析によって行われる。「発現構築体」および「組換え発現構築体」なる語は本明
細書においては同義に使用される。

【００７５】 本発明は、真菌病原体によって引き起こされる疾患に対するＰｉ−ｔａ抵抗性
遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメントに関し、この場合、上記核
酸フラグメントは配列番号：１もしくは６８に掲げたヌクレオチド配列またはそ
の機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当する。 これらの単離核酸フラグメントが適当な調節配列に操作性に連結してなる遺伝
子、このような遺伝子をそれらのゲノム中に有する植物、およびこのような植物
の種子にも興味がある。たとえば、このような遺伝子はネイティブまたはキメラ
である。 他の態様においては、本発明は植物に真菌病原体によって引き起こされる疾患
に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する方法において、上述の
いずれかの遺伝子を植物のゲノムに導入する方法に関する。

【００７６】 さらに他の態様においては、本発明は植物に抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与
する方法において（１）真菌病原体によって引き起こされる疾患に対するＰｉ−
ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメントであり、上記核
酸フラグメントは配列番号：１もしくは６８に示すヌクレオチド配列またはその
機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するフラグメント、ならびに（
２）配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド配列またはそれと機能的に均
等なサブフラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメント
からなる組換え発現構築体で植物をトランスフォームすることからなり、上記核
酸フラグメントは感染部位で発現するように調節配列に操作性に連結し、さらに
上記構築体は感染部位に真菌病原体により引き起こされる疾患に対する抵抗性遺
伝子仲介防御応答を植物に付与する方法に関する。

【００７７】 さらに他の態様においては、本発明は（１）真菌病原体によって引き起こされ
る疾患に対してＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグ
メントであり、上記核酸フラグメントは配列番号：１もしくは６８に示すヌクレ
オチド配列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するフラ
グメント、および（２）配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド配列また
はそれと機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−Pita 単
離核酸フラグメントからなり、上記核酸フラグメントは調節配列に操作性に連結
している、感染部位において真菌病原体によって引き起こされる疾患に対する抵
抗性遺伝子仲介防御応答を植物に付与する組換え発現構築体に関する。このよう
な発現構築体でトランスフォームされた植物およびこのようなトランスフォーム
された植物から得られる種子にも興味がある。

【００７８】 クローン化されたＲ−遺伝子は、病原体に抵抗性のある穀類植物の構築を促進
するために使用できる。とくに、トランスフォーメーション方法は、典型的品種
改良方法によりトランスファーした遺伝子に伴うゲノム配列に連結することなく
多重単一遺伝子を耕種学的生殖細胞質に一次記憶させるために用いることができ
る。クローン化Ｒ−遺伝子はまた典型的な品種改良による植物種間の疾患抵抗性
遺伝子のトランスファーが可能でないことを克服するために使用することができ
る。

【００７９】 本発明は、イネに真菌 Magnaporthe grisea によって引き起こされるイネいも
ち病を制御するために有用性がある単離核酸フラグメントを提供する。本発明の
単離核酸フラグメントは病原体が配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド
配列またはそれと機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−
Pita 単離核酸フラグメントからなる場合に有効である。また真菌病原体により
引き起こされる疾患に対してＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する本
発明の単離核酸フラグメントは、配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド
配列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−Pi
ta 無毒性核酸フラグメントが、プロモーターに操作性に連結され、ＡＶＲ−Pit
a 核酸フラグメントを感染部位に発現する異種核酸フラグメントとして宿主植物
のゲノムに導入された場合に有効である。

【００８０】 以下に述べるように、M.grisea の他のサブ集団は、イネにＰｉ−ｔａ特異的
防御応答を誘導する株に含有される遺伝子と相同なＡＶＲ−遺伝子を所有する。
Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を誘発するＡＶＲ−遺伝子が、M.grisea
イネ病原体サブ集団Ｉ、Digitaria 病原体サブ集団II、および Pennisetum 病原
体のサブ集団IIIに存在できることの証明は、この真菌により感染されたイネ科
の広範囲の宿主での M.grisea の制御におけるこの遺伝子の広い有用性を支持す
るものである。

【００８１】 すなわち、本発明の単離核酸フラグメントは、それらに限定されるものではな
いが、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シコクビエおよびトウジンビエを包含
する他の穀類に対して M.grisea により引き起こされる疾患の制御にも有用性を
もつものと考えられる。

【００８２】 イネＰｉ−ｔａ抵抗性核酸フラグメントは、以下に記載するような本技術分野
の熟練者にはよく知られているマップベースのクローニング戦略によってクロー
ン化された。感受性のイネへの、クローン化したＰｉ−ｔａ核酸フラグメントの
導入は、病原体株にＰｉ−ｔａ抵抗性核酸フラグメントに期待されるのと一致し
た様式で抵抗性を付与することを示している。

【００８３】 Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子産物は、既知クラスのすべての抵抗性遺伝子産物と比
べて新規な構造を有する。Ｐｉ−ｔａ蛋白質は細胞外ＬＲＲをもつ膜係留蛋白質
のクラスとは類似性がない。Ｐｉ−ｔａ遺伝子産物は細胞質ＬＲＲをもつＲ−遺
伝子産物たとえば Arabidopsis Ｒ−遺伝子ＲＰＳ2（Bentら, 1994, Science 26
5: 1856-1860; Mindrinosら, 1994, Cell 78: 1089-1099）およびＲＰＭ1（Gran
tら, 1995, Science269: 843-846）と一部共通の特徴をもつが、このクラスのＲ
−遺伝子産物に特徴的なＬＲＲ構造を欠いている。Ｐｉ−ｔａ蛋白質はまた、Ｒ
−遺伝子産物の細胞質ＬＲＲクラスをさらに細分割するロイシンジッパーモチー
フまたは Toll/Interleukin-1 受容体モチーフのいずれかを欠いている（Jones
& Jones, 1997, Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plant Pathol. 24: 89-167）。すなわ
ち、Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子産物はそれまでに同定された他のＲ−遺伝子産物と
は異なるクラスに分類される。

【００８４】 日本産イネ品種 Yashiro-mochi（Yamadaら, 1976, Ann.Phytopath.Soc.Japan
42: 216）およびＫ1（Kiyosawa, 1984, Rice Genetics Newsletter 1: 95）は、
いもち病抵抗性遺伝子Ｐｉ−ｔａについて検定用イネ品種として指定されている
。品種Ｋ1 におけるＰｉ−ｔａ遺伝子はインディカ産イネ品種 Tadukan から日
本産の背景に浸透させたものであるが Yashiro-mochi のＰｉ−ｔａの起源は Ok
aine と呼ばれる高地イネ品種であるように思われる（Rybkaら, 1997, Mol.Plan
t MicrobeInteract. 10: 517-524 およびそれに引用された文献参照）。品種 Ta
dukan に由来する他のもう一つの抵抗性遺伝子、Ｐｉ−ｔａ²遺伝子はＰｉ−ｔ
ａの対立遺伝子であるかまたはＰｉ−ｔａに緊密に連結していると思われるが、
Ｐｉ−ｔａとＰｉ−ｔａ²間の関係は独立した対立遺伝子Ｒ−遺伝子ペアに期待
される以上に複雑であるように思われる（Kiyosawa, 1967, Japan, J. Breeding
17: 165-172; Kiyosawa, 1971, JARQ 6: 73-80）。ＩＲＲＩ ＮＩＬの検定イネ
品種におけるＰｉ−６(ｔ)と命名されたＲ−遺伝子は緊密にＰｉ−ｔａ遺伝子に
連結しているかまたは実際にＰｉ−ｔａ遺伝子である可能性もある（Inukaiら,
1994, Phytopathology 84: 1278-1283）。さらに、Ｐｉ−ｔａを有する染色体 1
2 のセントロメア領域は他の抵抗性遺伝子、主要Ｒ−遺伝子 Pi-6(t)（Abadassi
ら, 1990, Rice Genetics II, IRRI, Los Banos,the Philippines, 746-748）、
いもち病ＱＴＬ（Wangら, 1994, Genetics 136: 1421-1434）ならびにウイルス
および昆虫Ｒ−遺伝子を含有すると思われる。

【００８５】 ＰＷＬ２遺伝子、weeping lovegrass において宿主種特異性を抑制するＡＶＲ
−遺伝子を同定した遺伝子交配（交配 4360）（Sweigardら, 1995, The Plant C
ell 7; 1221）は、また、イネ品種 Yashiro-mochiに感染するイネ病原体の能力
を決定する付加的な真菌遺伝子について分離された。この第二のＡＶＲ−遺伝子
、ＡＶＲ−Pita（以前には Yashiro-mochi に対して、ＡＶＲ2-ＹＡＭＯと呼ば
れた）は親株、4224-7-8 から受け継がれ、中国の野生単離体Ｏ−137に由来した
（1995年に China National Rice Tesearch Institutein Hangzhou で収集され
た）。交配 4360 に由来する５つの完全な四分染色体のそれぞれで、８個の子襄
胞子の子孫中４個が Yashiro-mochi に感染可能であり、他は感染できなかった
。交配 4360 およびそれに続く交配のランダム胞子分析でＡＶＲ−Pita の分断
が確認された。交配 4360 からの無毒性子孫は、しばしば数個の完全な病理学的
病変を Yashiro-mochi に産生させた。これらの稀な病変はＡＶＲ−Pita 遺伝子
座に起こる自然突然変異によるものと推察された。ＡＶＲ− Pita の機能を失っ
た突然変異体は Sweigardら（1995, The Plant Cell 7:1221）の記載のようにし
て単離された。Yashiro-mochi に対して今や完全に毒性であるこれらの突然変異
体は、推定される親の多型および稔性特性ならびにＭＧＲ586 ＤＮＡフィンガー
プリンティングトプロファイルを維持していた。他のＲ−遺伝子をもつイネ品種
に対する突然変異体の宿主特異性は変化しなかった。

【００８６】 M.grisea のように、一倍体の真菌が支配的な遺伝子の優性を評価することは
容易ではないが、毒性突然変異体の出現は、遺伝子対遺伝子仮説から予測される
ように、このＡＶＲ−遺伝子の発現型は Yashiro-mochi の感染を停止させるよ
うに機能することを示唆した。ＡＶＲ−Pita 遺伝子の遺伝的不安定性はそのク
ローニングに助けとなった。ＡＶＲ−遺伝子は、交配 4360 から産生された M.g
riseaＲＦＬＰマップにおける連結グループの末端でテロメアリピート配列を含
む生理的マーカーのクラスターで共分断されることが見いだされた（Sweigardら
, 1993,Genetic Maps, S.J.O'Brien 編, Cold Spring Harbor Laboratory, pp 3
.112-3.117）。Yashiro-mochi イネに対して毒性になった自然突然変異体は無毒
性遺伝子でマッピングされたテロメア制限フラグメントに構造的な変化を示し、
遺伝子が染色体の先端１〜２kb以内にあることを示唆した（Valent & Chumley,
1994,The Rice Blast Disease, ed. by Zeigler, Leong & Teng, CAB Internati
onal,Wallingford）。野生型無毒性株および染色体の末端に後天的欠失を有する
自然突然変異体からのＤＮＡゲノムのサザン分析によって、各種の制限酵素によ
るゲノムＤＮＡの消化により産生した末端染色体フラグメントのサイズが同定さ
れた。この分析は、染色体末端に相当するテロメアの６.５kb Ｂgl IIフラグメ
ントの内部にＡＶＲ−遺伝子が存在することを示唆した。相当するテロメアのフ
ラグメントをクローンニングすると、それは、イネ栽培種 Yashiro-mochi の毒
性病原体を Yashiro-mochi の無毒性株にトランスフォームする機能を有するＡ
ＶＲ−Pita遺伝子を実際、含有することの証明を可能にした。

【００８７】 本発明のＡＶＲ−Pita 核酸フラグメントは中国のイネ病原体Ｏ−１３７から
単離され、223 のアミノ酸（配列番号：５）を有する蛋白質をコードする。アミ
ノ酸173-182 は中性亜鉛メタロプロテイナーゼの特徴的モチーフを形成し、モチ
ーフ残基の天然またはインビトロ突然変異はＡＶＲ−遺伝子活性を破壊し、すな
わちそれはもはや病原体の毒性株をイネ品種 Yashiro-mochi の無毒性株にトラ
ンスフォームすることはない。推定アミノ酸配列は真菌から特徴づけられる他の
メタロプロテイナーゼ（Genbank 受入番号 L37524 および S16547）とのホモロ
ジーのレベルは低い。特徴が最もよく解明されている分泌された真菌メタロプロ
テイナーゼ、Aspergillus oryzae からのＮp IIは１７７アミノ酸の成熟領域に
先立って１７５アミノ酸のプレプロ領域を含有する（Tatsumiら, 1991, Mol.Gen
.Genet.228: 97-103）。推定ＡＶＲ−Pita アミノ酸配列はＮp IIと３５％のホ
モロジーおよび２９％の同一性を示し、最も有意なホモロジーはＮp IIの成熟１
７７アミノ酸型に限定した場合にみられる。さらにＡＶＲ−Pita およびＮp II
のアミノ酸配列のアラインメントは成熟Ｎp II蛋白質のジスルフィド結合に関与
するシステインの保存を示した。ＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメントは１７６
のアミノ酸を含有する成熟メタロプロテイナーゼにプロセッシングされるプレプ
ロ蛋白質をコードすると予想される。この推測に基づき、ＡＶＲ−Pita₁₇₆発現
構築体を操作して直接、推定成熟プロテアーゼを産生させ、機能性分析に付した
。

【００８８】 M.grisea イネ病原体は実験室または野外の条件における適合性にＡＶＲ−Pit
a遺伝子を要求しないように思われる。たとえばソース株Ｏ−137 と同時に収集
され、特性が十分解明された中国産野生単離体Ｏ−135（Valentら, 1991, Genet
ics127: 87-101）は、このＡＶＲ−核酸フラグメントとのホモロジーを欠いてい
る。Ｏ−135 のようなイネ病原体は、それらがＰｉ−ｔａ含有イネに応答を誘発
しないので、現在はＰｉ−ｔａ仲介防御応答によって影響されない。

【００８９】 機能性ＡＶＲ−Pita 核酸フラグメントは、サブ集団IIIからの Digitaria 病
原体（ＪＰ34, 日本で単離）、およびサブ集団IVからの Pennisetum 病原体（Ｂ
Ｆ17, Burkina Fasoで単離）を含むサブ集団Ｉａのイネ病原体と遠い関係にある
イネ以外の宿主植物に感染する M.grisea 株からクローン化された。Digitaria
病原体からクローン化されたＡＶＲ−Pita の核酸フラグメント（配列番号：７
，Ｇ-213 ＡＶＲ配列）は、University of Wisconnsin Computer Group のパッ
ケージ９.１の Bestfit アルゴリズム（Devereuxら,1984, Proc Natl Acad Sci
USA 12:387-395）により比較した場合、Ｏ−137 ＡＶＲ−Pita アミノ酸配列と
類似性８７.９％および同一性８７.４％をもつ翻訳アミノ酸配列に相当する。Ｇ
-213ＡＶＲ−Pita（無毒性）核酸フラグメントは毒性イネ病原体をＰｉ−ｔａ抵
抗性遺伝子仲介防御応答を誘発する無毒性株にトランスフォームする能力を維持
することが確認される最も多様な配列を有する。異なる草本種に感染する遠い関
係の M.grisea 株の間でのＡＶＲ−遺伝子機能の保存は、クローン化Ｐｉ−ｔａ
抵抗性遺伝子がイネ以外の他の宿主植物におけるいもち病真菌の制御にも有効で
あることを示唆するものである。

【００９０】 本発明はまた、真菌病原体によって引き起こされる疾患に対するＰｉ−ｔａ抵
抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメントからなる遺伝子に関し
、この場合、上記核酸フラグメントは配列番号：１もしくは６８に示すヌクレオ
チドコード配列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当し、
このフラグメントは適当な調節配列に操作性に連結している。このような遺伝子
は、単離されたネイティブな遺伝子またはキメラ遺伝子であってもよい。キメラ
遺伝子は本技術分野で周知の技術を用いて構築することができる。たとえば、配
列番号：６８に示すネイティブなＰｉ−ｔａプロモーターフラグメントに操作性
に連結した配列番号：６８のヌクレオチド配列のコード配列（ヌクレオチド 1-2
425）からなるキメラ遺伝子を作成することができる。

【００９１】 真菌病原体に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を装備できるトラン
スジェニック植物を作成することができる。本明細書に記載したように単離され
たネイティブな遺伝子またはキメラ遺伝子でトランスフォームできる植物の例に
はそれらに限定されるものではないが、単子葉植物が包含される。好ましくは単
子葉植物は穀類である。とくに好ましくは、単子葉植物はイネ、コムギ、オオム
ギ、トウモロコシ、シコクビエまたはトウジンビエである。このようなトランス
ジェニック植物の種子も興味がある。

【００９２】 すなわち、本発明はまた、本明細書に記載した本発明の任意の遺伝子を植物に
導入することからなる、真菌病原体によって引き起こされる疾患に対するＰｉ−
ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を植物に付与する方法に関する。Ｐｉ−ｔａ仲介
防御は、真菌病原体によって発現されるネイティブなＡＶＲ−遺伝子または病原
体に応答して植物によって発現されるキメラＡＶＲ−導入遺伝子のいずれかのＡ
ＶＲ−Pita無毒性遺伝子の発現に応答して穀類植物中に発生する。

【００９３】 他の態様においては、本発明はまた（１）真菌病原体によって引き起こされる
疾患に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメ
ントであり、上記核酸フラグメントは配列番号：１もしくは６８に示すヌクレオ
チド配列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するフラグ
メント、および（２）配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド配列または
それと機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−Pita 単離
核酸フラグメントからなる組換え発現構築体で植物をトランスフォームすること
からなる方法であり、上記核酸フラグメントは調節配列に操作性に連結し、さら
に上記発現構築体は真菌病原体によって感染部位に引き起こされる疾患に対する
抵抗性遺伝子仲介防御応答を植物に付与する方法に関する。

【００９４】 さらに他の態様においては、本発明は（１）真菌病原体によって引き起こされ
る疾患に対するＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグ
メントであり、上記遺伝子フラグメントは配列番号：１もしくは 68 に示すヌク
レオチド配列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するフ
ラグメント、および（２）配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド配列ま
たはそれと機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当する核酸フラグメン
トからなり、上記核酸フラグメントは調節配列に操作性に連結している、感染部
位に真菌病原体によって引き起こされる疾患に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答
を植物に付与する組換え発現構築体に関する。

【００９５】 また、このような組換え発現構築体でトランスフォームされた植物およびこの
ような植物から得られる種子にも興味がある。このような発現構築体は、上述の
ように本技術分野の熟練者に周知の技術を用いて製造することができる。植物へ
の導入遺伝子の導入、すなわちトランスフォーメーションは本技術分野の熟練者
には周知である。植物細胞トランスフォーメーションの好ましい方法は粒子加速
または「遺伝子ガン」トランスフォーメーション技術（Kleinら, 1978, Nature(
London) 327: 70-73; 米国特許 4,945,050）の使用である。このような組換え発
現構築体でトランスフォームできる植物の例には、それらに限定されるものでは
ないが、単子葉植物がある。好ましくは単子葉植物は穀類である。最も好ましく
は、単子葉植物はイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シコクビエまたはト
ウジンビエである。

【００９６】

【実施例】

本発明を以下の実施例によりさらに明らかにする。以上の記載およびこれらの
実施例により、本技術分野の熟練者は、本発明の本質的な特徴を確認することが
可能であり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明を様々な用途
および条件に適合させるため、本発明に様々な変更および修飾を行うことができ
るものと確信する。

【００９７】 とくに他の記載のない限り、すべての部および百分率は重量部および重量百分
率であり、温度は摂氏で表示する。分子生物学における技術は通常 Sambrook,J.
,Fritsch,E.F. & Maniatis,T. 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manua
l,2^nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yo
rkの記載のように実施した。

【００９８】実施例１ 相当するＲ−遺伝子の同定のための病原体株の育成 病原体の無毒性単離体は宿主抵抗性遺伝子の同定に必要であり、新しい病原体
株の使用はこれまで検出を逃れてきた抵抗性遺伝子を同定できる可能性がある。
特定のＲ−遺伝子をもつイネの品種に対して毒性を示す（すなわち、それらはＲ
−遺伝子仲介防御応答を誘発しない）２種の真菌株は相当する機能性ＡＶＲ−遺
伝子を欠くものと考えられる。しかしながら、相当するＡＶＲ−遺伝子をもつ無
毒性真菌株は宿主抵抗性遺伝子の同定に必要であるが、２種の株が特定のイネ品
種に対して無毒性である場合には、それらは同じＡＶＲ−遺伝子、または異なる
Ｒ−遺伝子仲介防御応答を誘発する異なるＡＶＲ−遺伝子をもつはずである。新
しいまたは特性が解明されていない真菌株の使用はまだ同定されていないＲ−遺
伝子を同定できる可能性がある。この注意は、野外単離体イネ病原体たとえばＡ
ＶＲ−Pita 遺伝子のソース、O-137 を取り扱う場合、とくに要求される。さら
に、イネいもち病感染アッセイは、環境条件とくにイネの品種がいもち病にある
程度のレベルの一般的抵抗性をもつかどうか、また用いた病原体が病原性および
形態学的性質で不安定であるかどうかにより著しく感受性である。したがって、
完全に特性が解明された病原体株の使用が成功の鍵である。

【００９９】 ＡＶＲ−Pita 遺伝子を分断する遺伝子集団を含有する多重病原体リソースは
、Ｒ−遺伝子のクローニングを容易にした。4360-Ｒ-17、4360-Ｒ-27、4360-Ｒ-
30 のような子孫株、および以後の世代の株 4375-R-26 （Sweigardら, 1995, Th
e Plant Cell 7: 1221）はこれらの研究のために性質が改善された。これらの実
験におけるイネの交配は、少なくとも２種のＲ-遺伝子Ｐｉ−ｔａおよびＰｉ−
ｋｍに分断させたため、および病原体交配 4360 が両者とも既知のＲ−遺伝子に
相当するＡＶＲ−遺伝子に分断されたため、単一ＡＶＲ−遺伝子をもつ遺伝的に
特徴のある病原体株を得る必要性があった。このような株は病変の発生に対する
各Ｒ−遺伝子／ＡＶＲ遺伝子の相互作用の影響を同定するために必要であった。
またマッピング集団のイネ子孫中における抵抗性表現型の正確な評点を保証する
ために抵抗性および感受性相互作用の間の表現型の差を最大にする必要があった
。２８の子孫株が交配 4360から得られ、これらはＡＶＲ-Pita を含有していた
がＡＶＲ1-ＴＳＵＹは含有していなかった。ＡＶＲ1-ＴＳＵＹは日本産品種 Tsu
yuake におけるいもち病抵抗性遺伝子 Pi-km に相当するＡＶＲ−遺伝子と考え
られる。これらの 28 種の子孫を、一方の親のイネ品種に完全に感受性な疾患症
状（４型〜５型病変）および他のイネ品種に典型的な抵抗性応答（０型〜１型病
変）を生じる安定な能力についてスクリーニングした（Valentら, 1991, Geneti
cs 127: 87）。M.grisea の単離体 4360-Ｒ-62 をＡＶＲ-Pita のみを含有する
試験株として選択した。さらにスクリーニングした９株から、ＡＶＲ1-ＴＳＵＹ
のみを含む優れた病原体として 4360-Ｒ-67 を選択した。以下に記載する大部分
のＲ−遺伝子のマッピングは、これらの２つの真菌株で行った。

【０１００】 さらに、ＡＶＲ−遺伝子機能を失った突然変異体は、それらが由来する親株と
の比較に有用である。たとえば、株ＣＰ987 は自然毒性突然変異体の単離により
株 4360-Ｒ-17 から誘導された。ＣＰ987 におけるＡＶＲ-Pita 遺伝子は小さな
欠失によって不活性化された。毒性突然変異体は Sweigardら, 1995, The Plant
Cell 7: 1221 の記載のように無毒性野生単離体または実験室株から容易に得る
ことができる。病原体の性質を逆の方向に変えるためには Yashiro-mochi に対
して毒性の野生単離体 Guy 11 をクローン化ＡＶＲ-Pita 遺伝子によりトランス
フォームしてＣＰ3285 を産生させるとこの宿主は無毒性になった。イネいもち
病系における真菌のトランスフォーメーションは Sweigardら, 1995, The Plant
Cell 7: 1221 の記載のようにして定常的に実施される。

【０１０１】実施例２ 植物の感染および評価 感染アッセイは以前に記載されたように実施した（Valentら, 1991, Genetics
127: 87）。分生子をオートミールアガールプレート上で生育させた培養体から
滅菌０.２５％ゼラチン溶液で洗浄して収集した。それぞれのイネ品種から４な
いし５の個体を生育チャンバーのプラスチックポット内の Metro-Mix（登録商標
）鉢植え用メジウム中に播いた。植物は明時１日14時間のサイクルにおいて２８
℃、相対湿度７０〜８５％で生育させた。夜の条件は22℃、相対湿度85％とした
。２週齢の植物が入ったポットを病原体の浸透に必要な相対湿度９５〜１００％
に維持するためプラスチックバッグに移し、病原体株たとえば実施例１記載の 4
360-Ｒ-62 または 4360-Ｒ-67 を接種した。2.5×10⁵/ml の分生子を含有する水
懸濁液 4 ml を、絵画用エアブラシ（Pasha, サイズ 1）を用いて植物上にスプ
レーした。接種した植物を含むプラスチックバッグをついでツイストタイで密閉
し、低照明条件、室温で２４時間インキュベートした。２４時間後、植物をバッ
グから取り出し、生育チャンバーに戻した。感染型すなわち病変症状に対して接
種７日後に評点を付した。感染表現型を明瞭にするため０〜５の評点を使用した
（Valentら, 1991,Genetics 127: 87-101）。病変０および１は抵抗性として、
病変３〜５は感受性として評価された。

【０１０２】実施例３ イネいもち病ＡＶＲ−遺伝子に相当するＲ−遺伝子の同定およびマッピング コメマッピング集団の発生：Ｒ−遺伝子に連結した物理的マーカーを同定する
ために２種の植物集団を用いた。第一に、発明者らによる使用のためにＣＩＡＴ
（Centro Internacional de Agricultura Tropical; Apdo aereo 6713, Cali,
Columbia）で二重半数体（ＤＨ）集団を発生させた。日本産品種とインディカ品
種の間の交配で起こることが知られている分断の歪みによる問題（Wangら, 1994
,Genetics 136: 1421-1434）を最小限にするため、２つの日本産の品種 Yashiro
-mochi（Ｒ−遺伝子Ｐｉ−ｔａを有する）および Tsuyuake（Ｒ−遺伝子Ｐｉ−
ｋｍを有する）の間の交配を用いることに決定した。２つの日本産品種の間に存
在する多型のレベルは全イネゲノムをマッピングする目的では低すぎるが、Pi-t
a 遺伝子はインディカ種のイネに起源を有するので、このＲ−遺伝子領域には疾
患抵抗性の特性のマッピングを可能にする十分な多型が存在すると推論された。
この交配の結果の集合分断分析は、以下に記載するように、ゲノムの特定の領域
についてのマッピングの努力に集中された。

【０１０３】 ＤＨイネ系統の製造は本技術分野の熟練者に標準の技術によって実施された。
第一に、イネ品種 Yashiro-mochi と Tsuyuake の間の相互の交配に由来するＦ1
植物の花粉から半数体カルスを得た。ついでイネ植物をこのカルスから再生した
。この操作で誘導された稔性植物は、半数体ゲノムの自然二倍体化を受けた。相
互交配からの個々の植物を７代の自己発生に付し計４２９の独立のＤＨ系統を産
生させた。これらの中から１１９の系統をこの研究の最初のマッピング集団とし
て使用した。

【０１０４】 微細な構造マッピングには、DuPont においてＦ2 集団を２つのＤＨ系統、品
種 Yashiro-mochi からの活性なＰｉ−ｔａ Ｒ−遺伝子を含有するＹＴ4 および
その遺伝子を含まないＹＴ10 の交配により育成した。Ｆ２分析の方法は本技術
分野の熟練者には周知である。

【０１０５】 ＡＶＲ-Pita に相当するＲ−遺伝子を同定する分断分析：２種の真菌株 4360-
Ｒ-62 および 4360-Ｒ-67 に対する 119ＤＨ系統の反応は次の通りであった。す
なわち、３５は両株に対して抵抗性、２４は 4360-Ｒ-62に対して抵抗性、２９
は4360-Ｒ-67 に対して抵抗性および３１は両株に対して感受性であった。これ
ら４表現型クラスにおける子孫は期待された 1:1:1:1 の比に適合し（χ²＝２.
２０；Ｐ＞０.５０）、Ｐｉ−ｔａおよびＰｉ−ｋｍが期待通り独立にＲ−遺伝
子を分断したことを指示した。さらに１１５のＤＨ系統を株 4360-Ｒ-62 単独で
接種した。その中６２系統が抵抗型、５３系統が感受性型を示した。すなわち株
4360-Ｒ-62 に対する抵抗性と感受性系統の総比は 126:108 であり、これはχ² 試験に基づき期待される１：１の比から偏位していなかった（χ²＝１.３８; Ｐ
＞０.２０）。

【０１０６】 イネ系統ＹＴ10 およびＹＴ4 の間の微細構造マッピング交配からのＦ１およ
びＦ２子孫の分析は、さらに病原体におけるＡＶＲ-Pita 無毒性遺伝子に相当す
る優性Ｒ−遺伝子の分断が支持された。Ｒ−遺伝子表現型が推定されたように優
性またはセミ優性であるか否かを決定するため、４個のＦ1 ハイブリッドを 436
0-Ｒ-62で感染させた。Ｆ1 ハイブリッドはすべて０型または１型の反応を示し
、抵抗性の親と同じで、イネでは、いもち病抵抗性の対立遺伝子は感受性の対立
遺伝子に対して優性であることを指示した。７２０のＦ２子孫も 4360-Ｒ-62 で
感染させた。Ｆ２集団の感染アッセイにおいては、植物をプラスチックトレー中
に、トレーあたり60植物で播き、接種を１×１０⁵／ml分生子に減少させた以外
は実施例２の記載と本質的に同様とした。約３０mlの分生子懸濁液を各トレーに
適用した。Ｆ２植物は、５４１が抵抗性、１７９が感受性として分断され、ほぼ
完全に３：１の比にフィットし（０.００７; Ｐ＞０.９０）、単一優性遺伝子で
あることを指示した。将来の微細構造マッピング研究に使用するためには、この
分析からの植物を注意深くトリムして疾患組織を除き、新鮮な鉢植え用メジウム
中に植え変えた。

【０１０７】 Ｒ−遺伝子に連結したＤＮＡマーカーを同定するためのＲＡＰＤスクリーニン グ ：Ｒ−遺伝子に連結した物理的マーカーを同定するために、マッピングの初期
段階において Random Amplified Polymorphic DNA（ＲＡＰＤ）マーカーを採用
した（Williamsら, 1990, Nucleic Acids Research 18: 6531-6535）。多型、一
つの親からで他からではない増幅したＤＮＡセグメントを、任意のヌクレオチド
配列の単一プライマーでランダムＤＮＡセグメントの増幅に基づいて検出する。
Ｒ−遺伝子に連結したマーカー上に焦点を当てるために、集合分断分析を使用し
た。これは、一方は、すべてが興味ある遺伝子を有する個体、他方は、興味ある
遺伝子をもたない個体の２つのプールの個体間の多型をアッセイする方法である
（Michelmoreら, 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88: 9828-9832）。連結してい
ないＤＮＡセグメントは両プールで等しいようにみえるが、連結しているＤＮＡ
セグメントは一方のプールに現れ、他方にはない。イネの総ゲノムＤＮＡは以前
に記載された方法（Dellaportaら, 1983, Plant Mol.Biol.Reporter 1: 19-21）
を用いて個々のＤＨ系統から単離された。ゲル中電気泳動によってＤＮＡ濃度を
標準量に対して評価したのち、4360-Ｒ-62 に対して抵抗性の10ＤＨ系統からの
ＤＮＡアリコートおよび 4360-Ｒ-62 に対して感受性の10ＤＨ系統からのＤＮＡ
のアリコートを合して２セットの「集合」ＤＮＡを形成させた。集合ＤＮＡを鋳
型として用い、ＲＡＰＤマーカーの増幅を評価した。ＲＡＰＤ反応は、８０mMの
Tris-ＨＣｌ（pH ９.０）；０.２mM(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄；２.５mM ＭｇＣｌ₂；１００
μMの各ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ；０.２μMのプライマー；１
０ngのＤＮＡ；ならびに１単位の Taq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetu
s）を含有する容量 20μl 中で実施した。この操作により増幅されたＤＮＡフラ
グメントを２％アガロース（New England BioLabs）ゲル上１×ＴＡＥ緩衝液中
で５時間分離した。抵抗性および感受性プール中に存在するかまたは存在しない
多型フラグメントを、両親、抵抗性および感受性プール、ならびに２つのプール
を形成するそれぞれの個体からのＤＮＡ鋳型を用いてさらに確認した。

【０１０８】 抵抗性または感受性系統いずれかからプールしたＤＮＡを鋳型として使用して
、1440 ＲＡＰＤプライマーをスクリーニングした。95％以上のプライマーが１
または２以上の増幅産物を生じた。プライマーあたり分離したバンドの平均数は
約８であった。これらの増幅から、ＲＡＰＤプライマー、ＳＰ1Ｂ8、ＳＰ2Ｃ12
、ＳＰ3Ｆ4、ＳＰ3Ｇ6、ＳＰ4Ａ5、ＳＰ4Ｂ9、ＳＰ6Ｃ2、ＳＰ6Ｇ10、ＳＰ7Ｃ3
、ＳＰ7Ｈ8、ＳＰ8Ｂ8、ＳＰ8Ｃ6、ＳＰ8Ｅ2、ＳＰ8Ｆ1、ＳＰ9Ｆ3 およびＳＰ1
5Ｂ12（配列番号：９〜２４）にＡＶＲ-Pita に相当するＲ−遺伝子に連結した
多型が同定された。

【０１０９】 ＳＰ1Ｂ8： 5′-TCAGCGCCT-3′ （配列番号：９） ＳＰ2Ｃ12： 5′-CCAATCGGAC-3′ （配列番号：10） ＳＰ3Ｆ4： 5′-TAATGGGCGG-3′ （配列番号：11） ＳＰ3Ｇ6： 5′-GTCGCTACTG-3′ （配列番号：12） ＳＰ4Ａ5： 5′-ACAGCGCCTT-3′ （配列番号：13） ＳＰ4Ｂ9： 5′-AGGCGTCTTC-3′ （配列番号：14） ＳＰ6Ｃ2： 5′-TAGCCAGACC-3′ （配列番号：15） ＳＰ6Ｇ10： 5′-TCTATGCCCC-3′ （配列番号：16） ＳＰ7Ｃ3： 5′-ATGGCAGATG-3′ （配列番号：17） ＳＰ7Ｈ8： 5′-CGAGTCAACT-3′ （配列番号：18） ＳＰ8Ｂ8： 5′-GTAGAAGCCT-3′ （配列番号：19） ＳＰ8Ｃ6： 5′-TCATGCGGAG-3′ （配列番号：20） ＳＰ8Ｅ2： 5′-CCATTTCCGT-3′ （配列番号：21） ＳＰ8Ｆ1： 5′-GGGAGGACTT-3′ （配列番号：22） ＳＰ9Ｆ3： 5′-AAAGGCAGTG-3′ （配列番号：23） ＳＰ15Ｂ12： 5′-TGTGCAACGG-3′ （配列番号：24）

【０１１０】 Ｒ−遺伝子に連結したマーカーの初期マッピング：連結したＲＡＰＤ分子マー
カーの分断を各ＤＨイネ系統について評点を付した。これらのＲＡＰＤマーカー
およびＲ−遺伝子の間の連結分析はコンピュータープログラムＭＡＰＭＡＫＥＲ
（バージョン 2.0）（Konieczny & Ausubel,1993, The Plant Journal 4: 403）
によって実施した。ＬＯＤ評点＞３をＲＡＰＤマーカーおよびＲ−遺伝子の間の
連結の確立に使用した。

【０１１１】 ２点分析により、同定されたＲＡＰＤマーカー間ならびにこれらのマーカーと
ＤＨ集団中のＲ−遺伝子間の強力な連結が明らかにされた。Ｒ−遺伝子に関連す
るこれらのマーカーの順序は多重点分析により決定した。組換えなしにＲ−遺伝
子に最も近くマッピングされたＳＰ7Ｃ3、ＳＰ7Ｈ8およびＳＰ8Ｃ6 は 119 の子
孫中に観察され、一方マッピング領域の遠位端にマッピングされたＳＰ8Ｂ8 お
よびＳＰ3Ｇ6 はそれぞれＲ−遺伝子から８.３および７.３ｃＭの遺伝子距離に
あった。これらのマーカーの最も可能性の高い順序は図１Ａに示す。しかしなが
ら、多数のマーカーの順序は、どの特定の順序の確率もこの集団サイズに基づく
他の別の順序に関して１００：１より大きくないので、明白に決定できなかった
。

【０１１２】 Ｒ−遺伝子の微細構造マッピング：マッピングの解像度の上昇は、Ｒ−遺伝子
と連結マーカーの分断をより大きなマッピング集団で評価することによって達成
された。さらにＤＨイネ系統を包含させてマッピング集団中の系統を総計２７０
にした。さらに、ＤＨ系統ＹＴ4 とＹＴ10 の間の遺伝的交配からの７２０のＦ
２子孫をこの分析に包含させた。記載したように、７２０のＦ２植物はいずれが
相当するＲ-遺伝子を含有するかを決定するために、真菌株 4360-Ｒ-62（ＡＶＲ
−Pitaのみを含む）を接種した。この分析からの感受性植物は疾患組織の除去に
よって再生し、新鮮な鉢植え用メジウムに植え変えた。十分理解されるようにＲ
ＡＰＤマーカーのＦ２分断分析は、これらのマーカーの優性がヘテロ接合とホモ
接合子孫の間の識別を妨害するので複雑である。この困難性はＲＡＰＤマーカー
から共優性のマーカーを単離することにより、場合によっては克服することがで
きる。たとえば、ＲＡＰＤマーカーからのＲＦＬＰマーカーの単離は実施例４に
記載する。ヘテロ接合とホモ接合Ｆ２イネ系統の他の判別は、Ｆ３世代における
抵抗性表現型の分断をチェックすることによって達成された。この研究で作成さ
れた微細構造マップを図１Ｂに示す。

【０１１３】実施例４ ＡＶＲ−Pita を認識するＲ-遺伝子は Pi-ta でることの証拠 クローン化された無毒性遺伝子に相当するＲ−遺伝子は以前にＰｉ−ｔａとし
て同定されたいもち病抵抗性遺伝子であることの３つの系統の証拠が得られた。 いもち病抵抗性遺伝子のイネ染色体１２へのマッピング：１９２の個体の組換
え近交系（ＲＩ）集団（系統ＬＨ422 および9024の交配によって作成；Xiaoら,
1995, Genetics 140: 745）を、Ｒ−遺伝子領域のそのイネ染色体座へのマッピ
ングに使用した。Ｒ−遺伝子は多型ＲＡＰＤマーカーから誘導された隣接ＲＦＬ
Ｐマーカーを用いて間接的にマッピングした。ＲＡＰＤフラグメントはゲルから
溶出し、Geneclean II（Bio 101, San Diego, CA）を用いて清浄化し、ＴＡクロ
ーニングベクター（Invitrogen, San Diego, CA）にサブクローニングした。こ
のサブクローニングされたＤＮＡ挿入体を、Ｔ7（配列番号：27）およびＳＰ6（
配列番号：28）プロモータープライマーを用いて増幅し、マッピング集団の２つ
の親を検査するためにプローブとして用いた。プローブ、Ｐ4Ａ5，Ｐ1Ｂ8，Ｐ7
Ｃ3およびＰ8Ｃ6 はそれぞれ、制限酵素ＸbaＩ、ＥcoＲＩ、ＥcoＲＶおよびＤra
Ｉと多型を示した。４つのＲＦＬＰマーカーの対立遺伝子パターンはＲＩ集団メ
ンバーについて評価し、ＭＡＰＭＡＫＥＲ（バージョン 2.0）プログラムを用い
てマッピングした。マーカーはすべて３より大きいＬＯＤ評点で判定された。２
点分析によりすべてのこれらのマーカーは染色体１２上でＲＦＬＰマーカーのメ
ンバーに連結していることが確立された。多重点分析では、Ｐ7Ｃ3 およびＰ8Ｇ
6 はＲＧ341 およびＲＺ670 の間隔内にそれぞれ１.３ｃＭおよび３.２ｃＭの遺
伝子距離で位置した（Causseら, 1994, Genetics 138: 1251-1274）。マーカー
、Ｐ1Ｂ8 およびＰ4Ａ5 はＲＧ9 およびＲＧ869 の間にマッピングされた。すな
わち、ＡＶＲ−Pita に相当するＲ-遺伝子はＰｉ−ｔａ遺伝子と同じ染色体領域
にマッピングされる。

【０１１４】 ＡＶＲ−Pita 突然変異体および分断子孫は Pi-ta を含有することが報告され た他のイネ品種に対して同一の特異性を示す ：Ｒ−遺伝子はＰｉ−ｔａ抵抗性遺
伝子を含有する染色体領域にマッピングされたが、それは依然として未知の遺伝
子であるか、またはこの同じ領域にマッピングされる他のＲ−遺伝子の一つかも
しれない。ＡＶＲ−Pita 遺伝子のソースである中国の野生単離体Ｏ−137；ＡＶ
Ｒ−遺伝子を含有する交配４３６０の子孫、4360-Ｒ-17 および 4360-Ｒ-27；Ａ
ＶＲ-遺伝子を含まない交配４３６０の子孫、4360-Ｒ-30；ならびにＡＶＲ−遺
伝子機能が失われた突然変異体、ＣＰ987 およびＣＰ983 を含む一連の病原体株
が同定された。これらの病原体の単離体は、Ｐｉ−ｔａ遺伝子、とくに Tadukan
およびＫ1 を含有する他のイネ品種に対する感染アッセイに使用された。Yashi
ro-mochi, Ｋ1および Tadukan についてこれらの病原体株により示された同一の
無毒性スペクトル（表３）はＡＶＲ−Pita に相当するＲ−遺伝子が以前に同定
されたＰｉ−ｔａ遺伝子であることを示唆する。Ｐｉ−ｔａ遺伝子を欠くイネ品
種 Sariceltik はこれらのすべての病原体株に対し感受性である。

【０１１５】

【表３】

【０１１６】 日本産検定病原体株による感染は特異性を確認する：最後に、日本産病原体株
、Ken 60-19, Ken 54-12, Ina 72, Ina 168, Ken 54-04（Kiyosawa, 1976, SABR
AOJournal 8: 53-67; Yamadaら, 1976, Ann.Phytopath.Soc.Japan 42: 216）で
接種を実施した。これらの株は、Pi-ta を含めてイネの各種いもち病抵抗性遺伝
子の同定に使用した。これらの株をＤＨ子孫イネ系統およびこの研究で得られた
株4360-Ｒ-62 および 4360-Ｒ-67 とともに検定イネ品種に対して接種した。こ
れらの野生単離体は、ina 168 を除いて、Pi-ta Ｒ−遺伝子を含むことが知られ
ている両検定イネ品種およびＡＶＲ-Pita に相当するＲ−遺伝子を含有するＤＨ
子孫イネ系統に無毒性であり、したがって、Ｒ-遺伝子はＰｉ−ｔａであること
と一致する感染および疾患特異性が証明される。

【０１１７】実施例５ ＢＡＣライブラリーの構築 大きな挿入体ライブラリーの構築方法は、今日では本技術に通暁している研究
者にとって定常的な作業である（Wangら, 1995, The Plant Journal 7: 525）。
Ｒ−遺伝子をもつＤＨイネ系統ＹＴ14 の葉のプロトプラストからのゲノムＤＮ
Ａを用いる細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーの構築には標準技術を使用
した。プロトプラストは以前に記載されたように、若い葉および葉鞘から単離し
た（Wu & Tanksley, 1993, Plant Mol.Biol. 23: 243）。ＤＮＡはアガロースプ
ラグ中Ｈind IIIにより部分消化し、ＣＨＥＦゲル上で分画した。１００〜１５
０kbの範囲のＤＮＡフラグメントを溶出し、小さな分子を除去すために第二のサ
イズ選択に付した。サイズ選択されたＤＮＡをついでＧＥＬアーゼ（Epicentre
Tech）によって処理してアガロースから回収して、ｐBeloＢＡＣ IIベクターの
Ｈind III部位にライゲートした（Shizuyaら, 1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
9: 8794）。大腸菌ＤＨ10Ｂ細胞のトランスフォーメーションは、Cell Porator
Electroporation System Ｉ（ＢＲＬ）を用いるエレクトロポレーションで実施
した。ＢＡＣコロニーをＬＢプレート上１２.５μg／mlのクロラムフェニコール
で選択した。総計２０,１６０の独立のコロニーを酸洗浄して、１００μlの Ｌ
Ｂを含有する９６-ウエルマイクロタイタープレートをクロラムフェニコールお
よび１０％グリセロールとともに保存した。ライブラリーへのクローンの平均挿
入体サイズは２８個のランダムに選択したコロニーの分析に基づき１１０kbであ
る。ライブラリーはイネＤＮＡに約５の半数体ゲノム均等体を含有する。

【０１１８】実施例６ 染色体歩行および Pi-ta Ｒ−遺伝子候補ＰＲＧ2 の同定 ２１０のマイクロタイタープレートに含まれるＢＡＣライブラリーを Biomek
ロボット（Beckman Instruments）を用いて高密度フィルター上にスポットした
。全ライブラリーをフィルターあたりスポットした１６プレートの密度で、１４
個のフィルター上にアレイした。フィルターのセットを、実施例３に記載のＲＡ
ＰＤマーカーＳＰ7Ｃ3 から得られた単一コピーのＲＦＬＰプローブで探査した
。全ＤＨおよびＦ2 マッピング集団においてこのマーカーはＰｉ−ｔａ遺伝子を
共分断した。このハイブリダイゼーションにおいて、４つの重複ＢＡＣクローン
、5Ｃ1、22Ｈ9、136Ｆ8 および 179Ｇ5（図２参照）が同定された。出発時点の
これらの物質および情報により、ＢＡＣイネ挿入体の末端からプローブを単離す
るために２つの方法を使用し、これらのプローブを再度、ライブラリーフィルタ
ーのスクリーニングに用いた。標準アルカリ分解プラスミド精製方法（Sambrook
）に基づくミディ-プレップ操作を用いてＢＡＣ ＤＮＡを単離した。ベクターの
一端の挿入体境界配列を単離するための方法は、挿入体ＤＮＡの大部分を除去す
るため、ＢamＨＩもしくはＳphＩのいずれかによるＤＮＡの消化を包含した。残
りのベクターのを再ライゲートし、Ｍ13-20（配列番号：２５）および逆（配列
番号：２６）プライマーまたはＴ7（配列番号：２７）およびＳＰ6（配列番号：
２８）プライマーのいずれかを用いるＰＣＲにより単離した。

【０１１９】 Ｍ13-20： 5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′ （配列番号：25） Ｍ13-ＲＥＶ： 5′-GGAAACAGCTATGACCATG-3′ （配列番号：26） Ｔ7： 5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′ （配列番号：27） ＳＰ6： 5′-ATTTAGGTGACACTATAG-3′ （配列番号：28）

【０１２０】 反対の境界フラグメントは２つの方法の一つによって単離した。第一の方法で
は、ゲノム挿入体ＤＮＡの大部分を欠失させるＳcaＩによってＢＡＣクローンを
消化した。ＢＡＣクローンの残部を再ライゲートし、挿入体の残部をＴ7（配列
番号：27）および Belo840（配列番号：２９）プライマーを用いるＰＣＲによっ
て増幅した。第二の方法はＢＡＣクローンのＢamＨＩによる消化および再ライゲ
ート後の逆ＰＣＲ技術（Sambrook; Ochman H.ら, 1988, Genetics 120: 621-623
）を包含し、これにより反対の境界フラグメントはプライマーＩＢＡＣ1（配列
番号：３０）およびＩＢＡＣ2（配列番号：３１）を用いるＰＣＲによって増幅
された。ＰＣＲによって得られた境界フラグメントをアガロースゲルからサブク
ローニングし、重複ＢＡＣクローンを単離するプローブとして使用した。

【０１２１】 Belo840： 5′-TTTGTGATGGCTTCCATGTC-3′ （配列番号：29） ＩＢＡＣ1： 5′-GTCGACTCTAGAGGATCC-3′ （配列番号：30） ＩＢＡＣ2： 5′-CTGCAGGCATGCAAGCTT-3′ （配列番号：31）

【０１２２】 左側への一歩歩行は左側組換え境界を定義する：179Ｇ5Ｒと命名されたＢＡＣ
クローン 179Ｇ5 の一方の挿入体境界フラグメントはサザンゲルブロット分析を
用いて単一コピー配列であるように思われ、ＰＢＣライブラリーフィルターをプ
ローブするために使用された。このフラグメントから、以前に同定された４つの
ＢＡＣクローン、5Ｃ1、22Ｈ9、136Ｆ8 および 179Ｇ5 ならびに新しい３つのク
ローン、31Ｈ3、107Ｆ10 および 157Ａ9（図２）が同定された。31Ｈ3Ｒと命名
された挿入体末端フラグメントは新規ＢＡＣクローン 70Ｆ1 および 147Ｇ7 に
ハイブリダイズした。重複イネＢＡＣクローン 31Ｈ3，107Ｆ10，157Ａ9，70Ｆ1
および 147Ｇ7 は、続いてＲ−遺伝子領域の一方の境界を定義するＲＡＰＤマー
カーＳＰ4Ｂ9 に相当するＤＮＡ配列を含有することが示された（組換えは試験
した全マッピング集団からの一つの子孫イネ系統においてＳＰ4Ｂ9 と Pi-ta 遺
伝子の間で起こった）。ＳＰ4Ｂ9 配列は、アガロースゲルからの連結ＳＰ4Ｂ9
ＰＣＲフラグメントをサブクローニングおよび配列決定して製造された特異的な
ＰＣＲプライマーＧＢ24 およびＧＢ25（配列番号：３２および３３）を用いて
、ＢＡＣコンティグ中のこの位置に存在することが示された。この結果は、図２
のＢＡＣコンティグにおける左側の境界を定義し、Ｒ−遺伝子はこの図の右に位
置することを示していた。

【０１２３】 ＧＢ24： 5′-AGGCGTCTTCAGTTTTGTAATA-3′ （配列番号：32） ＧＢ25： 5′-AGGCGTCTTCCGGAAAGCAGCG-3′ （配列番号：33）

【０１２４】 右への歩行：Ｇ179Ｇ5Ｌと呼ばれるＢＡＣクローン 179Ｇ5 の反対側の末端か
らの境界フラグメントは、ＢＡＣライブラリーフィルター上それ自体、ならびに
新しいＢＡＣクローン 34Ｈ9、50Ｅ12、108Ｅ4 および 158Ｃ2 にハイブリダイ
ズした。ＢＡＣ末端フラグメント 158Ｃ2Ｌは 158Ｃ2 ならびに新しいＢＡＣク
ローン 35Ｂ3、41Ｆ2 および 77Ｄ8 にハイブリダイズした。77Ｄ8 の右および
左境界フラグメントの両者が反復ＤＮＡ配列を含有するので、77Ｄ8-12 と呼ば
れるＢＡＣ挿入体の内部単一コピーフラグメントをアガロースゲルからクローン
化し、ＢＡＣライブラリーを探査するために用いた。このフラグメントは 77Ｄ8
および 41Ｆ2 ならびに新しいＢＡＣクローン 18Ｄ1，6Ｄ5 および 142Ｅ8 を同
定した。

【０１２５】 Ｒ−遺伝子候補を同定するためのＢＡＣ挿入体のランダムゲノム配列決定：重
複ＢＡＣクローン 31Ｈ3，179Ｇ5，34Ｈ9，77Ｄ8 および 142Ｅ8 は反応チャン
バー（Nebulization tube, order #4207, IPI Medical Product, Chicago）中、
窒素ガスでの高圧処理（２０psi）によって９０秒間ネブライズした。末端を一
様に刈込み、再沈殿させたＤＮＡフラグメントを、高い適合性を有するＤＮＡポ
リメラーゼ（PFU, Stratagene）により誘導される補充反応によってブラント末
端化した。QIAEX IIゲル抽出キット（Qiagen, Chatsworth, CA）を用い、サイズ
範囲 1000〜2000 bp でＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから単離し、ｐＵ
Ｃ18 のＳmaＩ部位にサブクローニングし、エレクトロポレーションによってＤ
Ｈ10Ｂ中にトランスフォームした。ＢＡＣ ＤＮＡ挿入体を含むクローンを、ユ
ニバーサル逆方向プライマーを用いて一方向に配列決定した。それから配列を得
て、クローンのセットに含有するすべての遺伝子を同定する合理的な機会がある
ように、それぞれのＢＡＣについて約 300〜400 のクローンを配列決定した。同
様の研究を、ＢlastＸプログラム（Gish,W. & States,D.J,, 1993, Nature Gene
tics 3: 266-272）を用いて行った。便宜上、ＢＬＡＳＴによって計算され、探
索されたデータベースに単に偶然含まれた配列に対する配列のマッチの観察のＰ
-値（確率）を、ここに報告されたＰ-値の対数のマイナスで表される「ｐＬog」
値として報告する。したがって、ｐＬog が大きいほど、その配列とＢＬＡＳＴ
の「ヒット」は同じ蛋白質を表す可能性が大きい。クローンは３つの群に分割し
た。すなわち、高度に有意なヒット（ｐＬog＞１０）、低度に有意なヒット［１
≦（最高のｐＬog）≦１０］およびヒットなし（ｐＬog＜１）である。たとえば
、３７０の配列がＲＢ142Ｅ8 から得られ、６０（１６.２％）は高度に有意なク
ラスに、７１（１９.２％）は低度に有意なクラスに、２３９（６４.６％）はヒ
ットなしのクラスに分類された。既にクローン化されている抵抗性遺伝子、植物
受容体遺伝子、または植物防御遺伝子にホモロジーを有する配列はさらに検討し
た。詳細に検討した５つの候補中ＰＲＧ2 と呼ばれる一つがＰｉ−ｔａ遺伝子と
して最も有望であった。

【０１２６】 ＰＲＧ2 は低度に有意なヒットの分類中の３つの配列によって同定された。た
とえば 586 bp ＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列は、トマ
トにおけるＲ−遺伝子機能に要求される（Salmeronら, 1996, Cell 86: 123-133
）蛋白質ＰＲＦ（GeneBank 受付番号 U653391）に中等度の類似性（ｐＬog＝5.8
0）を有する bac142e8.pk0001.f12（配列番号：３４；図３中の “ｆ１２"）中
で配列決定された。それはまた Arabidopsis Ｒ−遺伝子ＲＰＭ1（Ｘ87851；Gra
ntら, 1995,Science 269: 843-846）によりコードされるアミノ酸配列に類似す
る（ｐＬog＝５.４３）。bac142e8.pk0001.b7（配列番号：３５；図３中の “ｂ
７"）から配列決定された５９８bpはＰＲＦ遺伝子および Arabidopsis ミオシン
重鎖ホモロー（Ｕ 19619）を同定し、bac142e8.pk0001.f8（配列番号：３６；図
３の “ｆ８"）の６０５bp挿入体はＲＰＭ1 およびＰＲＦの領域を含有するＰ-
ループにホモロジーを有する４４アミノ酸領域を示した。これらのゲノムクロー
ンからのプライマーは、以下に記載する抵抗性イネ品種 Yashiro-mochi からの
この領域を、さらにゲノム配列決定するために作成された。配列決定が進行する
に従い、有意なヒットを示さなかった元のセットの 239 ＢＡＣフラグメントか
らさらに重複サブクローンが同定された（図３）。

【０１２７】実施例７ Ｐｉ−ｔａ候補遺伝子のためのゲノムおよびｃＤＮＡクローンの単離 推定 Pi-ta 遺伝子座からなると実施例６に記載のＢＡＣ 142Ｅ8 からサブク
ローニングされた核酸フラグメントを、完全長の遺伝子をクローニングする戦略
を設計するため、正確に配列決定した。とくに、bac142e8.pk0001.f8 中のイネ
ゲノムフラグメントは、サイズ 2 kb であり、開始コドンの前に１２５５bpのプ
ロモーター配列を含有した（図３）。クローン bac142e8.pk0001.b7 および bac
142e8.pk0001.f12 からのアガロースゲル精製イネ挿入体フラグメントを用いた
Yashiro-mochi ゲノムＤＮＡおよびＢＡＣ142Ｅ8 のサザン分析は、ＢＡＣ ＲＢ
142Ｅ8 がＰＲＧ2 の単一コピーを含有することを示した。この分析はまた遺伝
子の残部と約 2 kb の３′−非翻訳領域を含有する 142Ｅ8 から 5.3 kb ＢamＨ
Ｉフラグメントを同定した。この 5.3 kb ＢamＨＩフラグメントをＢＡＣ ＤＮ
Ａからベクター ｐＢluescript II ＳＫ＋（Stratagene）にサブクローニングし
、クローン＃７と命名された（図３）。bac142e8.pk0001.f8 およびクローン＃
７の両者をＥcoＲＩで消化し、クローン＃７からの５.３kb ＥcoＲＩフラグメン
トをbac142e8.pk0001.f8 における小ＥcoＲＩフラグメントの代わりにライゲー
トして、全遺伝子をアセンブルした（図４）。得られたベクターｐＣＢ1641 は
２.７kbのベクター中にイネＤＮＡの７.５kb挿入体を含有した。このイネクロー
ンは完全長ＰＲＧ2 コード配列とともに１２５５bpのプロモーター配列および約
２kbの３′非翻訳配列を包含した。ｐＣＢ1641 中、5757 bp のゲノムクローン
のＤＮＡ配列（配列番号：１；全５′配列、コード配列およびイントロンならび
に停止コドン後 246 bp を包含）を、DyeDeoxy ターミネーターサイクル配列決
定システムおよび 377Ａ型ＤＮＡ配列決定システム（Applied Biosystems, Fost
erCity, CA）を使用してプライマー歩行法により両鎖について測定した。使用し
た一部のプライマーの相対的位置を図５に示す（配列番号：37〜64）。

【０１２８】 Ｆ8-2： 5′-CCATCGGTGACCATGGG-3′ （配列番号：37） 1641-1： 5′-CCCTCTCCGTTGTTCCCATGG-3′ （配列番号：38） Ｆ8-4： 5′-GGGTTGGAGAATGCATGG-3′ （配列番号：39） 1641-2： 5′-CCATGCATTCTCCAACCC-3′ （配列番号：40） Ｆ8-3： 5′-CATGGATGGAGACCTCTGC-3′ （配列番号：41） Ｆ8-5： 5′-TCCTCAGAGGCGATCTCC-3′ （配列番号：42） Ｆ8-1： 5′-GAACAGGGTGACCTCGTCG-3′ （配列番号：43） Ｆ12-1： 5′-GTGGCTTCCATTGTTGGATC-3′ （配列番号：44） Ｆ12-5： 5′-CGAACGGCGCATCCAACC-3′ （配列番号：45） Ｆ12-6： 5′-GTGTCCTCTATTAGTAAATAC-3′ （配列番号：46） Ｆ12-7： 5′-GTATTTACTAATAGAGGACAC-3′ （配列番号：47） 1641-3： 5′-GGGCCTCCCTTGTTCGG-3′ （配列番号：48） 1641-4： 5′-CCGAACAAGGGAGGCCC-3′ （配列番号：49） Ｆ12-4： 5′-CCTACAGATCTGTAGCCAGC-3′ （配列番号：50） Ｆ12-3： 5′-GCTGGCTACAGATCTGTAGG-3′ （配列番号：51） Ｆ12-2： 5′-GCTGGCTACAGATCTGTAGG-3′ （配列番号：52）

【０１２９】 Ｂ7-1： 5′-GCTGGCTACAGATCTGTAGG-3′ （配列番号：53） Ｂ7-3： 5′-GTGATTCCATTGCTGCATTCC-3′ （配列番号：54） Ｂ7-4： 5′-CATGTGTAGTGCACCACATGG-3′ （配列番号：55） Ｂ7-2： 5′-CTGTCGTCTGAGAATGATCC-3′ （配列番号：56） Ｃ10-1： 5′-CCAAGGACTACAACACTTGC-3′ （配列番号：57） 173Ｃ12-5： 5′-GCATCCCCAAATGGACTGG-3′ （配列番号：58） 1641-5： 5′-CCAGTCCATTTGGGGATGC-3′ （配列番号：59） 173-6： 5′-CAAGCATCCGACGCCGAGC-3′ （配列番号：60） 173-7： 5′-TTGTATATCAACCATAAGAGTGC-3′ （配列番号：61） 1641-6： 5′-GTTCTTTGATCCAAGTGTTAGG-3′ （配列番号：62） ＧＢ46： 5′-CATTAAAGTCGACCTCAAACAATCATCAAGTCAGGT-3′(配列番号:63) ＧＢ47： 5′-AATGCAGAATTCACAACACCACTAGCAGGTTTG-3′ (配列番号:64)

【０１３０】 ｐＣＢ1641 中にサブクローニングしたイネゲノムフラグメント（配列番号：
１；5757 ヌクレオチド）のＤＮＡ配列分析により、ヌクレオチド 1256 に始ま
り、ヌクレオチド 2199 と 3663 の間が１個の１４６３bpのイントロンで中断さ
れている 2748 ヌクレオチドのオープンリーデフィングフレームが同定された。
コード配列は９２８アミノ酸を有する推定ポリペプチドに相当する（図６）。推
定蛋白質は相対分子量１０５kＤaを有し、ｐＩは７.０５である。Ｎ−グリコシ
ル化コンセンサス［ＮＸ(Ｓ／Ｔ)，ＸはＰではない］にマッチする４つのアミノ
酸配列（Kornfeldら, 1985, Ann.Rev.Biochem. 54: 631）が、ＰＲＧ2 蛋白質中
に存在する。

【０１３１】 ＰＲＧ2 がイネゲノム中、単一コピー内または多重コピー内に存在するのかを
決定するため、総ゲノムイネＤＮＡのブロットを、遺伝子のアミノ末端部分（プ
ライマーＦ8-5 およびＦ12-5 によって増幅した６３９bpフラグメント）または
カルボキシ末端部分（プライマーＧＢ47 およびＧＢ46 によって増幅したヌクレ
オチド 4477〜5503）のいずれかにコードされる核酸フラグメントを用いて探査
した。ブロットを低緊縮ハイブリダイゼーションについては、０.１％ＳＤＳ含
有 2×ＳＳＰＥ中 50〜55℃で、および高緊縮ハイブリダイゼーションについて
は、０.１％ＳＤＳを含む０.１×ＳＳＰＥ中６５℃で洗浄した。高緊縮条件下で
も、Ｎ-末端プローブ（塩基１４０１〜２０４０からなる核酸フラグメント）に
よりバックグランドハイブリダイゼーションの一般的スミアに対して単一コピー
が同定された。全く同じブロットをＣ-末端核酸フラグメント（ｐＢＣ1645 とし
てサブクローニング、以下に記載）でプロービングするとバックグランドスミア
のない一つのコピーが同定された。ＰＲＧ2 は単一コピー遺伝子であるが、イネ
ゲノムには類似の遺伝子が存在すると結論された。

【０１３２】 単一コピーＣ-末端プローブをハイブリダイゼーションプローブとして使用す
るためにサブクローニングした。プライマーＧＢ47 をヌクレオチド 4465〜4497
からのこの領域の配列に基づき合成し、残基 4471〜4476 はＥcoＲＩ制限部位が
導入されるように修飾した。同様に、プライマーＧＢ46 はヌクレオチド 5512〜
5506 に相当する残基をＳalＩ制限部位が導入されるように修飾したほかは、逆
相補性のヌクレオチド 5519〜5484 であった。プライマーＧＢ46 およびＧＢ47
は遺伝子フラグメントを増幅するために使用した。実施例６に記載のようにアガ
ロースゲルから精製し、指示した酵素で消化したのち、核酸フラグメントをベク
ターｐＢＤ-ＧＡＬ4 Ｃam（Stratagene）のＥcoＲＩ/ＳalＩ部位にサブクローニ
ングしてプラスミドｐＣＢ1645（図４Ｂ）を調製した。サブクローニングしたフ
ラグメントはその構造を確認するために配列決定した。

【０１３３】 完全長 Pi-ta ｃＤＮＡフラグメントを、逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲおよびサ
ブクローニングを用いてクローン化した。このアプローチには、ＣaＭＶ35Ｓプ
ロモーターに操作性に連結したゲノムＰｉ−ｔａ核酸フラグメントからなる導入
遺伝子（実施例10、発現構築体３）を含有し、ノーザンブロットで Pi-ta の過
剰発現を示したトランスジェニック Nipponbare 系統 27-4-8-1 からのｍＲＮＡ
の単離を包含した。第一鎖ｃＤＮＡは、鋳型として単離ｍＲＮＡ分画、プライマ
ーとしてオリゴヌクレオチドＧＢ67（配列番号：６５）を用いて合成した。 ＧＢ67： 5′-CCATTAAGCTTGGTTTCAAACAATC-3′ （配列番号：６５）

【０１３４】 部分 Pi-ta ｃＤＮＡ（2.1 kb）を、プライマーＦ12-1（配列番号：44）およ
びＧＢ67（配列番号：６５）を用いて第一鎖ｃＤＮＡから増幅した。これをつい
でＢamＨＩ（Pi-ta 核酸フラグメント中に制限部位が存在する）ならびにＨindI
II（ＧＢ67 配列中に制限部位が存在する）クローニング部位を用いてｐＳＬ118
0（Pharmacia）にクローン化した。完全長の合成ｃＤＮＡを得るために、Pi-ta
コード配列の５′末端を含有する 706 bp ＮcoＩ-ＢamＨＩフラグメントをｐＣ
Ｂ1649 から単離し、2090 bp ＢamＨＩ−Ｈind III部分 Pi-ta ｃＤＮＡフラグ
メントの上流のＮcoＩ-ＢamＨＩ部位にクローン化して、完全長の、プロモータ
ーのない Pi-ta ｃＤＮＡを創製した。ＤＮＡ配列分析により、コドン 796 に存
在する2 bp の欠失があり（多分ＰＣＲアーチファクトであろう）推定 Pi-ta 蛋
白質を119 アミノ酸で先端を切断され、フレームシフト突然変異を生じたことが
確認された。これは、1400 bp ＳphＩ-Ｂgl IIフラグメントを、正しい配列を含
有するｐＣＢ1649 からの相当するフラグメントで置換することによって補正さ
れ、ｐＣＢ1906 が創製された。ＤＮＡ配列分析でも推定イントロンはこの合成
ＤＮＡ中に正確にスプライスされたことが測定された。ネイティブなＰｉ−ｔａ
プロモーターフラグメント（2425 bp）はｐＣＢ1649 からの 3173 bp ＥcoＲＩ
フラグメントをｐＣＢ1906 のＥcoＲＩ部位にクローニングすることにより付加
し、最終的な Pi-ta ｃＤＮＡ構築体を含むプラスミドｐＣＢ1926（図７Ｃ）が
生成した。

【０１３５】実施例８ 感受性イネ品種 Tsuyuake からのＰｉ−ｔａ候補遺伝子のクローニングならびに 抵抗性および感受性対立遺伝子の比較のための配列分析 イネゲノムライブラリーは、感受性品種 Tsuyuake からのＤＮＡを用いてバク
テリオファージλ中に構築した（Sambrook）。ゲノムＤＮＡは、Dellaportaら,
1983, Plant Mol.Biology Reporter 1: 19-27 によって記載された操作を用いて
調製された。ゲノムＤＮＡは制限酵素Ｔsp5091（５′−AATT-３′を切断）で部
分消化した。サイズ範囲７〜１０kbのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから
精製して、ベクターλＺap II（Stratagene）のＥcoＲＩ部位にサブクローニン
グした。ｐＣＢ1641 のＤＮＡ挿入体とのハイブリダイゼーションによる Tsuyua
ke ライブラリーのスクリーニングではＰＲＧ2 に類似の配列で８個の重複クロ
ーンが同定された。１kb重複し、全コード配列を含む２つのクローン Ｔ2-9 お
よびＴ2-2 を図５におけるプライマーを用いて配列決定した。Tsuyuake からの
クローン化ゲノムフラグメントの配列は感受性ＤＨイネ系統ＹＴ16 のＰＣＲ増
幅ゲノムＤＮＡから得られた配列と同一であった。

【０１３６】 多重イネ系統からの抵抗性および感受性対立遺伝子の比較：抵抗性の Yashiro
-mochi イネからの機能性Ｐｉ−ｔａコード配列（配列番号：１および６８に含
まれる）は感受性 Tsuyuake イネ（配列番号：３中に含まれる）からの非機能性
コード配列と７ヌクレオチド異なっている。コード領域における７塩基ペアの置
換は２つの蛋白質の間に５アミノ酸の違いを生じる（図６）。さらに６個の塩基
ペアの変化がイントロン配列中に起こる。コード領域におけるヌクレオチドの違
いの大部分はＰ−ループモチーフの前の領域に起こる。いずれの遺伝子も同じＮ
ＢＳモチーフならびに４個のＮ−グリコシル化部位の可能性を位置 339, 556, 6
54 および 838 にもつ蛋白質をコードする。

【０１３７】 ポリＡ⁺-ＲＮＡによるＲＮＡゲルブロット分析で測定して、Yashiro-mochi か
らのＰｉ−ｔａ遺伝子および Tsuyuake からの感受性対立遺伝子はいずれも、推
定転写サイズ３.３kbで転写される。さらに、ＲＮＡブロット分析では、両対立
遺伝子とも構成的に発現されることが証明される。この分析はポリＡ⁺−ＲＮＡ
ブロットをｐＣＢ1645 中にクローン化されたＣ末端Ｐｉ−ｔａフラグメントで
プロービングすることにより行った。ポリＡ⁺-ｍＲＮＡは抵抗性イネ品種ＹＴ14
または感受性イネ品種ＹＴ16 の２週齢の葉から Perry & Francki（1992, J.Ge
n.Virol.73: 2105-2114）の方法によって調製した。ＲＮＡゲルブロット分析は
Ausubelら（1987, Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley an
d Sons）の方法により実施した。

【０１３８】 Ｐｉ−ｔａ遺伝子の抵抗性対感受性型において核酸配列の差異が保存されてい
るか否かを明らかにするため、さらに他のイネの品種からのＰｉ−ｔａ核酸フラ
グメントのゲノムクローンの配列を得た。図５に掲げたプライマーを用いて、抵
抗性品種 Tadukan およびＫ１からＰｉ−ｔａ遺伝子のＰＣＲ産物を配列決定し
た。これらの品種は、Yashiro-mochi における遺伝子の存在を生じた様式とは独
立に、後天的に Pi-ta 抵抗性遺伝子を有するものと考えられている。さらに他
の感受性の日本産イネ品種、Nipponbare および無関係な感受性品種、Saricelti
k からの核酸フラグメントの配列決定に同じＰＣＲプライマーを使用した。配列
の差が日本産対インディカの間の対立遺伝子の差によるのか否かを決定するため
に、感受性インディカ品種Ｃ101Ａ51 からの核酸フラグメントを配列決定した。
結果は、核酸配列とＡＶＲ−Pita を含有するイネいもち病病原体の株に対する
抵抗性の間の強い相関を示して、配列決定した領域を越えて Tadukan およびＫ
１は Yashiro-mochi からのＰｉ−ｔａと同一の配列を有し（表４）、Nipponbar
e と Sariceltik からの遺伝子は Tsuyuake からの感受性ｐｉ−ｔａ遺伝子と同
一の配列を有する。インディカＣ101Ａ51 対立遺伝子のヌクレオチド配列は単一
アミノ酸の差、位置918 におけるアラニン対セリンがＰｉ−ｔａ機能の特異性を
決定することを示唆している。

【０１３９】

【表４】

【０１４０】実施例９ イネにおける一過性発現によるＰｉ−ｔａ機能の同定 本技術分野の熟練者には標準的実務であるように、興味ある組換え発現構築体
で被覆した粒子による植物組織の高速バイオリスティックボンバードメントは、
導入されたプラスミドからの核酸フラグメントの一過性発現を生じる。疾患抵抗
性遺伝子の機能は、過敏性細胞死抵抗性応答を誘発するためにアッセイすべきレ
ポーター遺伝子発現を用いる一過性の葉ボンバードメント実験で証明することが
できる。このようなアッセイは、抵抗性応答の誘発に必要な相当するＡＶＲ−遺
伝子が細菌病原体による植物組織の均一な浸潤によって供給できるので、細菌病
原体に対するＲ−遺伝子の有用性を実証した（Mindrinosら, 1994, Cell 78:108
9-1099）。均一な病原体浸潤は、植物キューティクルを通して直接浸透し浸透し
た点に局限された病変を生じる M.grisea のような真菌病原体では不可能である
。

【０１４１】 真菌ＡＶＲ−遺伝子の植物組織内への均一な導入の障害を克服するためＡＶＲ
−Pita 発現構築体の導入をＧＵＳレポーター遺伝子とともにコボンバードメン
トによって試験した。とくに構築体を、植物細胞における構成的発現のための35
Ｓプロモーターの制御下に推定成熟プロテアーゼ（ＡＶＲ−Pita₁₇₆）を発現す
るように操作した。まず、ｐＭＬ63（図７Ｂ）をＮcoＩで切断し、Ｓ１ヌクレア
ーゼでブラント末端にした。ＧＵＳ核酸フラグメントをついでＡsp718 でさらに
消化して除去した。プライマーＭＬ132（配列番号：６９）およびＭＬ133（配列
番号：７０）で発生させたリンカーフラグメントをブラント末端にしたＮcoＩお
よびＡsp718 部位にクローン化し、ｐＭＬ135 を調製した。 ＭＬ132： 5′-CACGTGGAATTCCCCGGGG-3′ （配列番号：69） ＭＬ133： 5′-GTACCCCCGGGGAATTCCACGTG-3′ （配列番号：70）

【０１４２】 ｐＭＬ135 をＰmlＩおよびＡsp718 で消化し、トウモロコシゲノムＤＮＡから
プライマーＭＬ111（配列番号：７１）ならびにＭＬ135（配列番号：７２）を用
いてＰＣＲによって増幅したＡdh1-6 イントロンをＭＬ135 にクローン化してｐ
ＭＬ141 を調製した。 ＭＬ111：5′-CCCGGGGAATTCCTGCAGAAGGTGCAAGGATTGCTGGAGCG-3′ (配列番号：71) ＭＬ135：5′-TTTAAAGGTACCCCATGGCACGTGCCGGCTTGTTGTGGTCTTTTGGGTTCAC-3′ (配列番号：72) ｐＭＬ142 はｐＭＬ141 をＢamＨＩおよびＮcoＩで消化し、ｐＭＬ141 からの
35Ｓ/Ａdh1-6 配列を含む１.９kbフラグメントをｐＭＬ63 のＢamＨＩ/ＮcoＩ部
位にクローニングして最終的に創製した。

【０１４３】 推定成熟プロテアーゼと１個の付加的Ｎ末端アミノ酸（ＡＶＲ−Pita₁₇₇，プ
レプロ蛋白質のＩle-47 で開始する）をコードするＡＶＲ−Pita 核酸フラグメ
ント（配列番号：５）のヌクレオチド 139-672 を含むプラスミドｐＡＶＲ3 お
よび開始コドン met を、ベクターｐＭＬ142 中 35Ｓ／Ａdh1-6 プロモーターに
融合した。ＡＶＲ−Pita 核酸フラグメント（配列番号：５）をプライマーＡＶ1
（配列番号：７３）およびＡＶ3（配列番号：７４）を用いてＡＶＲ−Pita ｃＤ
ＮＡからＰＣＲによって増幅し、ＰmlＩおよびＫpnＩで消化し、クレノウポリメ
ラーゼでブラント末端化し、予めＰmlＩおよびＫpnＩで切断し、クレノウポリメ
ラーゼでブラント末端化したｐＭＬ142 にクローン化するとｐＡＶＲ3 が生成し
た。 ＡＶ1： 5′-GCCGGCACGTGCCATGATTGAACGCTATTCCCAATG-3′(配列番号：73) ＡＶ3： 5′-GCCGGGATCCCCCTCTATTGTTAGATTGAC-3′ (配列番号：74)

【０１４４】 推定成熟プロテアーゼのコード配列（プレプロ蛋白質のＧlu-48 で開始する）
は、プラスミドｐＡＶＲ3 中のＡＶＲ−Pita 核酸フラグメント（配列番号：５
）から、インフレームＮcoＩ部位（配列番号：６６）およびＹＬ37（配列番号：
６７）を含むオリゴヌクレオチドＹＬ30 を用いＰＣＲ増幅によって得られた。
ＰＣＲフラグメントをｐＭＬ142 中ＮcoＩ／ＫpnＩにクローン化しベクターｐＣ
Ｂ1947を得た。これはｐＡＶＲ3 中のＩle-47 コドン（att）を除去するために
行い、ＡＶＲ−Pita₁₇₆を発生させた。その他の詳細は図７Ａの図の説明に記載
する。 ＹＬ30： 5′-ACAACAAGCCGGCACGTGCCATGGAACGCT-3′ (配列番号：66) ＹＬ31： 5′-TCCTTCTTTAGGTACCGCTCTCTC-3′ (配列番号：67)

【０１４５】 ＡＶＲ−Pita₁₇₆を Pi-ta 含有植物に導入した場合その構築体の発現がＰｉ−
ｔａ仲介防御応答を誘導するか否かを決定するために、Ｐｉ−ｔａ植物（Yashir
o-mochi およびＹＴ14）およびＰｉ−ｔａを欠く植物（Nipponbare およびＹＴ1
6）からの実生を、35Ｓ／Ａdh1-6::ＡＶＲ−Pita₁₇₆遺伝子構築体および 35Ｓ::
ＧＵＳレポーター遺伝子でコボンバードメントに付した（図７）。種子を葉のア
ッセイメジウム、１００mgのカゼイン加水分解物および０.５％アガロースを補
充した１／２濃度のＭＳメジウム上、２５℃で４８時間、１００μＥｍ-2s-1の
冷白色光の12時間明期で、インキュベーター中に１週間置き発芽させた。２葉の
実生を外科用レーザーでアガロースメジウムから切除し、予め湿らせたフィルタ
ーペーパーを含むペトリ皿中に置いた。植物を同定のために、永久マーカーでベ
ースにおいてラベルした。実生のバイオリスティックボンバードメントは、Bio-
Rad PDS-1000/He 装置および１１５０−psi破裂皿を用いて実施した。金粒子（
直径０.６μm）を製造業者により提供された指示書によって調製した。各ボンバ
ードメントごとに 1μg の金粒子を 1.5μg の 35Ｓ／ＧＵＳおよび 1μg の他
のプラスミドで被覆した。ボンバードメント後に、実生を予め湿らせたフィルタ
ーペーパーを含むペトリ皿中に25℃で４８時間維持した。葉を７０％エタノール
中で清浄化して、β-グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）活性を５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルグルクロナイド（Ｘ-glu）を基質として用いて組織学的にア
ッセイした（Jefferson, 1987, Plant Mol.Bio.Rep. 5: 387-405）。

【０１４６】 機能性ＡＶＲ−Pita₁₇₆発現構築体では内因性 Pi-ta 遺伝子を含む葉にＧＵＳ
構築体をコボンバードメントした場合に、ＧＵＳ発現の著しい減少が誘導された
（発現に先立つ細胞死が示唆される）。予期されたように、ＡＶＲ−Pita₁₇₆発
現構築体は、完全長のＡＶＲ−Pita コード配列を含有する類似の発現構築体よ
りも有意に高い活性を示した。初期の実験では、無傷の Yashiro-mochi の葉の
ボンバードメントに際して、典型的なI型壊死病変およびＧＵＳ発現の減少の観
察に基づく過敏症様の応答が明らかにされたが、壊死病変の形成はＧＵＳ活性の
減少ほど再現性はなかった。無毒性を付与しないＡＶＲ−Pita₁₇₆の突然変異型
では、ＧＵＳ発現の減少も起こらない。内因性のＰｉ−ｔａ遺伝子を欠くイネ品
種ではその作用は見られない。すなわち、ＡＶＲ−Pita コード配列の発現は内
因性Ｐｉ−ｔａ遺伝子を含有するイネの葉に直接導入した場合に、イネ防御応答
を誘導する。

【０１４７】 一過性発現アッセイでの内因性Ｐｉ−ｔａ遺伝子の代わりのＰＲＧ2 機能：抵
抗性（ＹＴ14）および感受性（ＹＴ16）イネの葉を、外因的に供給したＰＲＧ2
が内因性 Pi-ta 機能を補足できるか否かを見るために、ＡＶＲ−Pita₁₇₆（ｐＣ
Ｂ 1947；図７Ａ）、ＧＵＳ（ｐＭＬ63；図７Ｂ）および Pi-ta ｃＤＮＡ（ｐＣ
Ｂ 1926；図７Ｃ）発現構築体によるコボンバードメントに付した。このアッセ
イからの典型的な葉を図８に示す。ＧＵＳ発現レベルの低下はＰｉ−ｔａ発現構
築体がＡＶＲ−Pita₁₇₆ およびＧＵＳとコボンバードメントされていてもされて
いなくても抵抗性（ＹＴ14）の葉に観察された。感受性（ＹＴ16）イネの葉では
しかしながら、Ｐｉ−ｔａ発現構築体がＡＶＲ−Pita₁₇₆ およびＧＵＳとコボン
バードメントされた場合にのみ、ＧＵＳ発現の著しい減少が記録された。すなわ
ちＰＲＧ2 は内因性Ｐｉ−ｔａ遺伝子の代わりにＡＶＲ−Pita₁₇₆ の認識および
局在する細胞死を誘導する機能を示す。ＡＶＲ−Pita₁₇₆ およびＧＵＳのみでシ
ョットした感受性ＹＴ16 実生の対照の葉では高レベルのＧＵＳが発現した。Ｐ
ｉ−ｔａからの単一アミノ酸で相違する品種Ｃ101Ａ51 からの感受性対立遺伝子
は、ＡＶＲ−Pita₁₇₆およびＧＵＳでコボンバードメントを行った場合、ＧＵＳ
発現の減少は起こらないで、このアッセイの特異性が維持されていることを指示
した。これらの実験はＰＲＧ2 が実際 Pi-taであるとする結論に一致する。

【０１４８】実施例１０ 推定Ｒ−遺伝子を含有するトランスジェニックイネの産生 分子植物病理学における標準実務によれば、Ｒ−遺伝子機能の同定は、感受性
植物への導入遺伝子の安定な導入（すなわちトランスフォーメーション）および
この遺伝子が以前には感受性の特徴を示した宿主植物に抵抗性表現型を付与する
ことの証明を包含する。本技術分野の熟練者に利用できる、ＤＮＡを高級植物の
真核細胞にトランスフォームする方法の一つは、興味ある核酸構築体で被覆され
た金属粒子を使用する高速ボーリスティックボンバードメントである（Kleinら,
1987, Nature (London) 327: 70-73 参照；およびＵＳ特許 4,945,050 参照）。
これらの実験には、バイオリスティック PDS-1000／He（Bio-Rad Laboratories,
Hercules, CA）を使用した。推定Ｐｉ−ｔａ核酸フラグメントを含有する４つ
の異なる発現構築体で感受性イネ品種 Nipponbare をトランスフォームするため
には粒子ボンバードメント技術を使用した。

【０１４９】 １）ｐＣＢ1641−1255 bp のネイティブなプロモーター領域を包含する７kb P
i-ta 核酸フラグメント含有プラスミド（図４Ａ，配列番号：１）。 ２）ｐＣＢ1649−３kbのネイティブなプロモーターを包含する８.４kb Pi-ta
核酸フラグメント含有プラスミド。このベクターはそれがより長いプロモーター
領域を含有するほかは、ｐＣＢ1641 と同じである。ｐＣＢ1649 の作成には、ｐ
ＣＢ1641 をＨind III／Ｓac IIで切断して１.５８kbフラグメントを除去した。
これをＢＡＣ142Ｅ8 の４.９８kb Ｈind III／Ｓac IIサブクローンで置換し、
ｐＣＢ1649を創製した。このクローニング工程では、本質的に、ｐＣＢ1641 中
の１２５５bpプロモーターをより長い４６５６bpのプロモーターフラグメントで
置換した。 ３）35Ｓ／Pi-ta−１.９kbの修飾 35Ｓプロモーターフラグメントに操作性に
連結した５.３kb Pi-ta 核酸フラグメント含有プラスミド。このベクターはｐＣ
Ｂ1641 からの５.３６kb ＮcoＩ／ＫpnＩフラグメントを、35Ｓプロモーターフ
ラグメントを含有するプラスミドｐＭＬ63 のＮcoＩ／ＫpnＩ部位にクローニン
グして構築された。 ４）ｐＣＢ1926−Pi-ta ｃＤＮＡ核酸フラグメントおよび図７Ｃ、配列番号：
６８に記載の２４２５bpのネイティブプロモーター領域含有プラスミド。

【０１５０】 抗生物質に対する抵抗性を付与する Streptomyces hygroscopicus からの細菌
ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（Ｈpt II）遺伝子をイネトラン
スフォーメーションの選択可能なマーカーとして使用した。ベクター中にはｐＭ
Ｌ18 を使用し、Ｈpt II遺伝子を、カリフラワーモザイクウイルスからの 35Ｓ
プロモーターならびに Agrobacterium tumefaciens のオクトパインシンターゼ
からの停止およびポリアデニル化シグナルで操作した。ｐＭＬ18 は 1997年12月
18日に公開されたＷＯ97/47731 に記載されている。この開示は参照により本明
細書に組み入れる。

【０１５１】 発芽した Nipponbare の種子の胚盤に由来する体細胞胚増殖カルスはトランス
フォーメーション実験のソース材料として役立つ。この材料はカルス開始メジウ
ム（ＭＳ塩、Nitsch and Nitsch vitamins, １.０mg／Ｌの２,４−Ｄおよび１０
μＭ ＡgＮＯ₃）上、暗所、２７〜２８℃で滅菌イネ種子を発芽させることによ
り発生させた。胚の胚盤から増殖する体細胞胚増殖カルスをＣＭメジウム（Ｎ6
塩、Nitschand Nitsch vitamins, １mg／l の 2,4−Ｄ，Chuら, 1985, Sci. Sin
ica 18: 659-668）に移した。カルスの培養はＣＭ上２週間隔の定常的な植え継
ぎによって維持し、開始１０週以内に使用した。

【０１５２】 カルスは、ＣＭメジウム上に置いた環状の Whatman ＃541 ろ紙の中央、直径
約４cmの環状領域に約１mm離れて配置した０.５〜１.０mmの小片を継代培養して
トランスフォーメーション用に調製した。カルスを置いたプレートを暗所、27〜
28℃で３〜５日間インキュベートした。ボンバートメントに先立ち、カルスを置
いたろ紙を、暗所の０.２５Ｍマンニトールおよび０.２５Ｍソルビトールを補充
したＣＭに３時間移した。ついで滅菌フード中でペトリ皿の蓋を２０〜４５分間
少し開いて組織上の湿気を消散させた。

【０１５３】 ２つの異なるプラスミド、たとえばイネのトランスフォーメーションの選択可
能なマーカーを含むｐＭＬ18 および推定Ｒ−遺伝子を含むｐＣＢ1641 からの環
状プラスミドＤＮＡを金粒子上に共沈殿させた。これを達成するためには、総計
10μg のＤＮＡを、形質：選択可能マーカーＤＮＡの比２：１で、濃度６０mg／
mlに再懸濁した金粒子の５０μlアリコートに加えた。ついで塩化カルシウム（
２.５Ｍ溶液の５０μl）およびスペルミジン（０.１Ｍ溶液の２０μl）を金-Ｄ
ＮＡ懸濁液に、チューブを３分間ボルテックス撹拌しながら加えた。金粒子をミ
クロフュージで１秒間遠心分離し、上清を除去した。ついで金粒子を２回 1 ml
の無水エタノールで洗浄し、ついで５０μl の無水エタノールに再懸濁し、１秒
間超音波処理（バスソニケーター）して金粒子を分散させた。金懸濁液を−７０
℃で５分間インキュベートし、粒子を分散させる必要があれば超音波処理（バス
ソニケーター）した。ついで６μl のＤＮＡ-被覆金粒子をマイラーのマクロキ
ャリヤーディスク上に負荷してエタノールを蒸発させた。

【０１５４】 乾燥の終了時に、組織を含むペトリ皿をＰＤＳ-1000Ｈeのチャンバー内に置い
た。ついでチャンバー内の空気を除き、２８〜２９inch Hgの真空にした。ショ
ックチューブ内のＨeの圧力が 1080〜1100 psi に達したときに破裂する破裂膜
を用いてヘリウムショック波でマクロキャリヤーを加速した。組織を停止スクリ
ーンから約８cm離してに置き、カルスを２回ボンバートメントに付した。組織の
５〜７プレートがこの方法によりＤＮＡ−被覆金粒子でボンバートメントされた
。ボンバートメント後、カルス組織をソルビトールまたはマンニトーを補充しな
いＣＭメジウムに移した。

【０１５５】 ボンバートメント後３〜５日以内にカルス組織をＳＭメジウム（５０mg／mlの
ハイグロマイシンを含有するＣＭメジウム）に移した。これを達成するには、カ
ルス組織をプレートから滅菌した５０mlのコニカル管に移して秤量した。４０℃
で溶融したトップ−アガールを、２.５mlトップ−アガール／１００mgカルスで
用いて添加した。１０mlのピペットを通して繰り返し分配して、カルスの塊を２
mm 未満のフラグメントにほぐした。カルス懸濁液の３mlアリコートを新鮮なＳ
Ｍメジウム上に置き、プレートを暗所で４週間、２７〜２８℃でインキュベート
した。４週後、トランスジェニックカルス現象を確認し、新鮮なＳＭプレートに
移し、さらに２週間、暗所、２７〜２８℃で生育させた。

【０１５６】 生育中のカルスをＲＭ１メジウム（ＭＳ塩、Nitsch and Nitsch vitamins, ２
％スクロース、３％ソルビトール、０.４％ゲルライト＋５０ppm hygＢ）中暗所
２５℃に２週間移した。２週後カルスをＲＭ２メジウム（ＭＳ塩、Nitsch and N
itsch vitamins, ３％スクロース、０.４％ゲルライト＋５０ppm hygＢ）に移し
、冷白色光（〜４０μＥm^-2s^-1）下、１２時間明期、２５℃、湿度３０〜４０％
に置いた。２〜４週間光の下に置くと、カルスは組織化および苗条の形成を開始
した。苗条を周囲のカルス／メジウムから除き、植物トレー（Sigma Chemical C
o., St. Louis, MO）中ＲＭ３メジウム（1／2×ＭＳ塩、Nitsch and Nitsch vit
amins, １％スクロース＋５０ppmハイグロマイシンＢ）に移し、前工程の記載と
同じ条件を用いてインキュベーションを続けた。

【０１５７】 ２〜３週後、十分な根および苗条の成長が起こったとき、植物をＲＭ３から、
Metro mix 350 を含有する４″ポットに移した。植物は、１２時間／１２時間明
暗サイクル、および〜３０／１８℃昼夜温度条件を用いて成長させた。

【０１５８】実施例１１ トランスジェニックイネにおける機能補足によるＰｉ−ｔａの同定 トランスフォーマントの分子分析：Ｒ−遺伝子配列の存在についてトランスフ
ォーマントの分析には、対立遺伝子特異的ＰＣＲならびにＤＮＡゲルブロットを
使用した。高緊縮ＤＮＡゲルブロット分析は、ハイブリダイゼーションプローブ
としてｐＣＢ1645からのＰＲＧ2 ＤＮＡ挿入体を用いて、実施例７に記載のよう
にして実施した。図９は、ｐＣＢ1641中のＰＲＧ２単離核酸フラグメントで生成
させたトランスフォーマントの分析からの典型的な結果を示す。推定Pi-ta遺伝
子の単一コピーの挿入から複合多重コピーの挿入までの範囲に及ぶ現象が認めら
れた。

【０１５９】 抵抗性表現型の獲得のアッセイ：ＡＶＲ−遺伝子含有病原体株 4360-Ｒ-62ま
たはＯ−137を用いて、獲得された抵抗性機能を試験するために、実施例２に記
載したように病原性のアッセイを行った。表５は、ｐＣＢ1641 および Hyg^Rプラ
スミド（ｐＭＬ18）でのコボンバードメントによって生成された一次トランスフ
ォーマントについて実施したアッセイからの結果を示す。

【０１６０】

【表５】

【０１６１】 構築体ｐＣＢ1641 については、アッセイした４２個のトランスフォーマント
中７つが抵抗性、42中13が中間型であった。中間型抵抗性の特徴は、均一に少な
い数の、またＡＶＲ-Pita を欠く真菌株によって生じるよりも少ない病変である
。35Ｓプロモーターに操作性に連結したＰＲＧ2 コード配列をもつ構築体につい
ては、41中の４つが中間型抵抗性を示した。Ｐｉ−ｔａ導入遺伝子を含有する一
次トランスフォーマント（ｐＣＢ1641）の 22／42 が感受性であったことは驚く
べきことではない。これはバイオリスティックな植物トランスフォーメーション
に影響する３つの異なる問題の結果から、ありそうに思われた。多くのインテグ
レーションの結果は Pi-ta 導入遺伝子の多重コピーを含有し（図９）、その一
部は分断された遺伝子を含む可能性がある。これは遺伝子サイレンシング現象に
おいて生じることがある。第二に、一部のインテグレーション現象では、導入遺
伝子が遺伝子発現に好ましくない染色体領域に挿入されることがある。第三の可
能性がある因子は、導入遺伝子における小さな欠失またはフレームシフト突然変
異による遺伝子の不活性化であり、これはサザンブロットで検出できる。

【０１６２】 単一Ｒ0 トランスフォーマントから誘導されるＲ1 実生を２セットに分割し、
抵抗性表現型が減数分裂を通じて安定であったか否か、および抵抗性が Pi-ta
抵抗性遺伝子の特異的な特性をもっていたかを決定するために、無毒性株 Ｏ−1
37または Ｏ−137 由来の毒性突然変異体（ＣＰ3337）のいずれかを接種した。
たとえば、Ｒ１実生ファミリー 22-6-10-1 のＤＮＡゲルブロット分析（図10）
では、Pi-ta 特異的抵抗性に相関する導入遺伝子の安定な遺伝を示している。Ｒ
1 分析の結果は、ＰＲＧ2 がＰｉ−ｔａ遺伝子の特異的特徴を有する抵抗性を付
与して、この抵抗性は安定に受け継がれることが証明された。すなわち、配列番
号：１はＰｉ−ｔａ抵抗性遺伝子に相当すると結論された。

【０１６３】実施例１２ Ｐｉ−ｔａ抵抗性遺伝子産物の特性 現在 Genebank で利用可能な Pi−ｂ遺伝子配列候補のコードポリペプチド（
アクセス番号 AB013448）は配列番号：２に示す Pi-ta ポリペプチドのアミノ酸
残基２００〜６８０に実質的に相当するサブフラグメントと３０％の同一性（４
９％の類似性）を示す。ＢＥＳＴＦＩＴ（Smith & Waterman, 1981, Advances i
n Applied Mathematics 2: 482-489）を用いて、アミノ酸残基２０８〜５２７か
らの翻訳 Pi-taポリペプチド配列はＲＰＭ1 タンパク質のアミノ酸配列に対して
、３０.３％の同一性（４４.３％の類似性）を示すことが見出された（Grantら,
1995, Science 269: 843-846）。同じ領域が疾患抵抗性シグナル伝達経路（Sal
meronら, 1996, Cell 86: 123-133）に関係するトマトＰＲＦタンパク質と ２７
.４％の同一性（３８.８％の類似性）を示し、Arabidopsis Ｒ−遺伝子ＲＰＳ２
の産物に対して２４.５％の同一性（３８％の類似性）を示した（Bentら, 1994,
Science 265: 1856-1860; Mindrinosら, 1994, Cell 78: 1089-1099）。これら
の以前にクローン化されたＲ−遺伝子産物のいずれのロイシンの豊富な領域に対
しても有意な類似性は見られなかった。

【０１６４】 Ｐｉ−ｔａ遺伝子産物の際立った特徴は多くのＡＴＰおよびＧＴＰ結合タンパ
ク質のＮＢＳモチーフ特性である（Traut, 1994, Eur.J.Biochem. 229: 9-19）
。アミノ酸２３６〜２４４はリン酸結合（Ｐ）ループに対する全般性コンセンサ
ス ＧＸＧＸＸＧ(Ｒ／ｋ)Ｖにマッチする。多分コンパニオンキナーゼドメイン
はアミノ酸３１４〜３２３（キナーゼドメイン２ａ）、およびアミノ酸３４２〜
３５３（キナーゼドメイン３ａ）の周辺に存在する。２つのサブクラスの細胞質
Ｒ−遺伝子産物中に見いだされる保存された内部疎水性ドメイン（Jones & Jone
s, 1997, Adv.Bot.Res.Incorp.Adv.Plant Pathol. 24: 89-167）は部分的にアミ
ノ酸 407〜415 の間に存在する。しかしながら、２つのＲ−遺伝子サブクラスは
、Ｐｉ−ｔａ中には見いだされない。第一に、Ｐｉ−ｔａ遺伝子産物はユニーク
なアミノ末端を有し、ＲＰＳ２遺伝子産物サブファミリーのロイシンジッパーモ
チーフの可能性（Bentら, 1994, Science 265: 1856-1860; Mindrinosら, 1994,
Cell 78: 1089-1099）、あるいはＮ遺伝子サブファミリーによってコードされ
るToll／Interleukin−１受容体ホモロジー（Whitmanら, 1994, Cell 78: 1101-
1115）のいずれかを欠いている。多分最も重要な点は、Pi-ta 遺伝子産物のカル
ボキシ末端部分はロイシンに富んでいるが、それはＲ−遺伝子産物について報告
されたロイシンの豊富なリピートに対するいずれのコンセンサス配列にも適合し
ないことである（Jones & Jones, 1997, Adv.Bot. Res.Incorp.Adv.Plant Patho
l. 24: 89-167）。

【０１６５】

【表６】

【０１６６】

【表７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｒ−遺伝子を含有する染色体領域の分子マップ。

【図２】 Ｐｉ−ｔａのポジショナルクローニング。

【図３】 ＢＡＣ ＲＢ142Ｅ8 のランダムゲノム配列決定により得られた最初の３つのサ
ブクローン（破線）の位置を示すＲ−遺伝子の制限マップ。

【図４Ａ】 プラスミドｐＣＢ1641の構築。

【図４Ｂ】 プラスミドｐＣＢ1645 の構築。

【図５】 プラスミドｐＣＢ1641 中に含まれるＰＲＧ２核酸フラグメントにおける相対
的なプライマー位置。

【図６】 推定Ｐｉ−ｔａタンパク質配列。

【図７】 プラスミドｐＣＢ1947、ｐＭＬ63 およびｐＣＢ1926 における構築の図解。

【図８】 イネ植物におけるＰｉ−ｔａ機能の粒子ボンバードメント一過性アッセイ。

【図９】 無傷のＰｉ−ｔａ核酸フラグメントの存在を測定するための一次トランスフォ
ーマントのＤＮＡゲルブロット分析。

【図１０】 無傷のＰｉ−ｔａ核酸フラグメントの存在を測定するための中間抵抗性一次ト
ランスフォーマント 22-6-10-1 からの１１のハイグロマイシン抵抗性Ｒ１個体
のＤＮＡゲルブロット分析。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CD03 CD07 CD10 CD13 CD17 4B024 AA08 CA04 DA01 EA04 EA10 FA02 GA11 HA20 4B065 AA89X AA89Y AA99Y AB01 AC20 BA02 CA53

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 真菌病原体によって引き起こされる疾患に対するＰｉ−ｔａ
   抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する単離核酸フラグメントであり、上記核酸フ
   ラグメントは配列番号：１もしくは６８に示すヌクレオチド配列またはその機能
   的に均等なサブフラグメントに実質的に相当する核酸フラグメント。
2. 【請求項２】 適当な調節配列に作動的に連結した請求項１記載の核酸フラ
   グメントからなる遺伝子。
3. 【請求項３】 遺伝子はキメラである請求項２記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 ネイティブなプロモーターに連結した請求項１記載の核酸フ
   ラグメントをそのゲノム中に有する植物。
5. 【請求項５】 請求項２または３記載の遺伝子をそのゲノム中に有する植物
   。
6. 【請求項６】 植物は単子葉植物である請求項４記載の植物。
7. 【請求項７】 植物は単子葉植物である請求項５記載の植物。
8. 【請求項８】 植物は穀類である請求項４記載の植物。
9. 【請求項９】 植物は穀類である請求項５記載の植物。
10. 【請求項１０】 穀類はイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シコクビ
    エおよびトウジンビエからなる群より選択される請求項８記載の植物。
11. 【請求項１１】 植物は Magnaporthe grisea の天然宿主である請求項４記
    載の植物。
12. 【請求項１２】 植物は Magnaporthe grisea の天然宿主である請求項５記
    載の植物。
13. 【請求項１３】 請求項４、６、８、１０または１１のいずれかに記載の植
    物の種子。
14. 【請求項１４】 請求項５記載の植物の種子。
15. 【請求項１５】 請求項７記載の植物の種子。
16. 【請求項１６】 請求項９記載の植物の種子。
17. 【請求項１７】 請求項１２記載の植物の種子。
18. 【請求項１８】 フラグメントはイネいもち病真菌に対する抵抗性を付与す
    る請求項１記載の核酸フラグメント。
19. 【請求項１９】 フラグメントは、配列番号：５もしくは７に掲げたヌクレ
    オチド配列、またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に相当するＡ
    ＶＲ−Pita 単離核酸フラグメントからなる、真菌病原体に対して抵抗性を付与
    する請求項１記載の核酸フラグメント。
20. 【請求項２０】 適当な調節配列に作動的に連結した請求項１記載の核酸フ
    ラグメントからなる発現構築体によって植物をトランスフォームすることからな
    る植物に抵抗性遺伝子仲介防御応答を付与する方法。
21. 【請求項２１】 （１）請求項１記載の核酸フラグメントおよび（２）配列
    番号：５もしくは７に掲げたヌクレオチド配列またはその機能的に均等なサブフ
    ラグメントに実質的に相当するＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメントからなる組
    換え発現構築体で植物をトランスフォームすることからなる植物に抵抗性遺伝子
    仲介防御応答を付与する方法において、上記核酸フラグメントは調節配列に作動
    的に連結し、さらに上記構築体は真菌病原体により感染部位に引き起こされる疾
    患に対する抵抗性遺伝子仲介防御応答を植物に付与する方法。
22. 【請求項２２】 イネいもち病真菌に対する抵抗性を付与する請求項２０ま
    たは２１記載の方法。
23. 【請求項２３】 植物は単子葉植物である請求項２０または２１記載の方法
    。
24. 【請求項２４】 植物は穀類である請求項２０または２１記載の方法。
25. 【請求項２５】 穀類はイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シコクビ
    エおよびトウジンビエからなる群より選ばれる請求項２０または２１記載の方法
    。
26. 【請求項２６】 植物は Magnaporthe grisea の天然宿主である請求項２０
    または２１記載の方法。
27. 【請求項２７】 真菌病原体によって感染部位に引き起こされる疾患に対す
    る抵抗性遺伝子仲介防御応答を植物に付与する組換え発現構築体であって、（１
    ）請求項１記載の単離核酸フラグメントおよび（２）配列番号：５もしくは７に
    掲げたヌクレオチド配列またはその機能的に均等なサブフラグメントに実質的に
    相当するＡＶＲ−Pita 単離核酸フラグメントからなり、上記核酸フラグメント
    は調節配列に作動的に連結している組換え発現構築体。
28. 【請求項２８】 上記構築体は、イネいもち病真菌に対する抵抗性を付与す
    る請求項２７記載の組換え発現構築体。
29. 【請求項２９】 請求項２７または２８記載の発現構築体をそのゲノム中に
    含有する植物。
30. 【請求項３０】 植物は単子葉植物である請求項２９記載の植物。
31. 【請求項３１】 植物は穀類である請求項３０記載の植物。
32. 【請求項３２】 穀類はイネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シコクビ
    エおよびトウジンビエからなる群より選択される請求項３１記載の植物。
33. 【請求項３３】 植物は Magnaporthe grisea の天然宿主である請求項２９
    記載の植物。
34. 【請求項３４】 請求項２９記載の植物の種子。
35. 【請求項３５】 請求項３０〜３３のいずれかに記載の植物の種子。