CN105907884B

CN105907884B - 水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用

Info

Publication number: CN105907884B
Application number: CN201610517576.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡海亚; 徐得泽; 游艾青; 周雷; 焦春海
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Priority date: 2016-07-04
Filing date: 2016-07-04
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2036-07-04
Also published as: CN105907884A

Abstract

本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用。申请人通过将携带不同Pita等位基因的水稻品种测序及序列比对在Pita编码区内含子鉴定到一个Pita特异性位点并开发了一套鉴定该目标位点的分子标记引物，分别为：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT；RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。利用该引物对水稻种质资源DNA进行PCR扩增，可快速判断待测试水稻Pita的基因型，从而将携带抗性等位基因的材料应用于生产。方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pita基因型鉴定。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用，本发明提供的Pita特异性分子标记引物适用于在水稻育种中针对Pita基因型的分子标记辅助选择，实现对现有栽培稻品种稻瘟病抗性的改良；以及从水稻种质资源中鉴定、筛选新的Pita抗性基因应用于水稻育种与生产，增强栽培稻稻瘟病抗性。

技术背景

水稻稻瘟病是危害水稻生产的最严重的病害，同时也是可以利用抗性基因进行有效控制的病害。稻瘟病每年都会对水稻生产造成巨大的损失，目前主要通过化学药剂进行防控，不但增加了生产成本，也对环境造成了污染。利用稻瘟病抗性基因选育具有稻瘟病抗性的水稻品种具有生产成本低、抗性效果强、环境友好等一系列优点，适于大面积推广种植。但是目前水稻育种中对稻瘟病抗性的筛选还是利用表型鉴定，通过筛选大田中自然诱发的群体获得抗病品种。由于不同年份和地区稻瘟病发病程度不一，不得不通过多年、多点试验进行抗性筛选，因此该方法效率低下，成本高，并且筛选到的单株抗性表型不准确，不宜在生产中推广利用。分子标记辅助选择是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期进行无损检测的一种技术，通过分子标记筛选可直接将已知的抗性基因导入感病品种，改良稻瘟病抗性。

Pita位于水稻12号染色体，是一个具有对稻瘟病生理小种具有广谱抗性的基因，该基因编码区包含2个外显子和1个内含子，编码蛋白长度928aa，因此通过开发Pita特异性分子标记，利用分子标记辅助选择将Pita抗性等位基因导入到栽培稻品种，对栽培稻稻瘟病抗性的改良将具有重要的意义。

与传统的利用单个碱基的差异即SNP位点与PCR-CTPP方法设计的引物相比，我们开发的标记在两条内引物的3’有4个碱基的差异，而传统方法只有1个碱基差异，因此这套标记特异性更强，不会出现传统方法的由于非特异性结合产生的假阳性和弱阳性条带，并且该方法更稳定、结果更准确，并且简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或水稻资源中对Pita基因型鉴定、筛选的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供了鉴定水稻抗稻瘟病基因Pita的特异性分子标记引物，包括：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT；RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。引物特异性好，扩增效率高，方法简便易行，可广泛应用于水稻抗稻瘟病基因Pita的基因型鉴定。

本发明的另一个目的是提供了一种水稻抗稻瘟病基因Pita的特异性分子标记引物在水稻种质资源中Pita基因型鉴定或水稻抗稻瘟病基因Pita的分子育种中的应用，利用该引物可以有效的对水稻资源中抗、感稻瘟病等位基因Pita进行基因型鉴定，通过鉴定、筛选新的Pita抗性基因应用于水稻育种与生产，增强现有栽培稻品种稻瘟病抗性。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术措施：

本发明技术方案采取以下思路：Pita位于水稻12号染色体，编码区包含2个外显子和1个内含子，编码蛋白长度928aa，通过对已知的分别包含Pita抗病等位基因与感病等位基因的水稻品种的Pita编码区进行PCR扩增、测序与序列比对(图1，表1)，在编码区的+2001bp即内含子中鉴定到一处特异性编码序列(图2A)，其中抗病等位基因的核苷酸序列为GCC，而对应感病等位基因序列为CTAT，因此，通过设计特异性引物对该目标位点特异性扩增即可实现Pita等位基因的鉴定。

引物设计原理如下(图2B)：在设计抗病等位基因鉴定引物时，首先以鉴定到的抗病等位基因特异性序列GCC作为反向引物的3’端设计反向引物RR，在上游设计正向引物RF，因此，RR的3’端无法与感病等位基因的对应序列CTAT结合，从而只能扩增抗病等位基因，获得一条104bp的条带；在设计感病等位基因鉴定引物时，则以目标特异性序列CTAT作为正向引物的3’端设计正向引物SF，在下游设计反向引物SR，因此，SF的3’端无法与感病等位基因的对应序列GCC结合，从而只能扩增感病等位基因，获得一条179bp的条带；两对引物等量混合扩增便可实现对水稻Pita抗感基因型的鉴定，并且两种基因型均有一个240bp的共有条带，此外，该标记还是共显性标记，杂合基因型将扩增出104bp、179bp和240bp共3条条带。4条引物名称、序列、Tm值及扩增片段长度见表2所示。

鉴定水稻抗稻瘟病基因Pita的特异性分子标记引物，包括：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT；RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。

水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：

1)水稻DNA的提取

2)合成表2所示的引物序列。

3)PCR扩增

PCR反应体系为20μL，含2.0μL 10×Buffer，1.0μL dNTPs(10mmol/L),4条引物均为0.2μM，0.2μL Taq酶(5U/μL)，2.0μL模板DNA，双蒸水补足余量；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物在3％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

4.结果判断

4条引物SF、SR、RF与RR等量混合扩增，根据扩增条带类型判断基因型，含有抗病纯合Pita等位基因类型水稻品种扩增出104bp和240bp条带，感病等位基因类型品种扩增条带为179bp和240bp条带，杂合型品种的扩增条带为104bp、179bp和240bp条带。

表1 Pita基因组编码区测序引物及相关参数

表2 Pita特异性分子标记引物序列及相关参数

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本申请在Pita基因组编码区设计了3对覆盖编码区的重叠引物S1、S2和S3(图2A)，引物序列见表1，利用这3对引物测序以及序列比对在Pita内含子+2001bp处(图1，图2A)鉴定到一个Pita基因特异性位点(该位点处Pita抗病等位基因序列为GCC，感病等位基因序列为CTAT)，利用两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法开发出鉴定该目标位点的共显性标记，如图2B所示，在特异性位点的上游104bp、下游179bp设计两条外引物RF和SR，以目标特异性位点的4个差异碱基作为引物3’端分别设计两条内引物SF和RR，将4条引物等量混合并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带类型鉴定Pita基因型，抗病纯合Pita等位基因扩增出104bp和240bp条带，感病等位基因类型扩增条带为179bp和240bp条带，杂合型的扩增条带为104bp、179bp和240bp条带。由于该位点在编码区内部，因此与传统的利用连锁标记鉴定的方法相比结果更加精确。

2.与传统的利用单个碱基的差异即SNP位点与PCR-CTPP方法设计的引物相比，我们开发的标记在两条内引物的3’有4个碱基的差异，而传统方法只有1个碱基差异，因此这套标记特异性更强，更容易区分两种不同的基因型，不会出现传统方法中利用SNP位点设计的引物中由于非特异性结合产生的假阳性和弱阳性条带，因此该方法更稳定、结果更准确。

3.与传统的利用大田诱发或温室接种鉴定稻瘟病抗性等位基因不同，本发明利用基因编码区的特异性序列，通过设计引物开发出仅利用PCR电泳技术即可鉴定亲本及F2子代Pita基因型的共显性分子标记。

4.在利用Pita基因对水稻稻瘟病抗性改良时，利用本发明的方法可准确实现子代基因型检测，筛选携带目的基因的个体连续回交后自交纯合从而完成品种改良；因此，该方法具有简单、准确、成本低并可以在水稻生长早期进行非破坏性检测等一系列优点，适于在育种中对Pita基因型的大量筛选以及对于水稻种质资源中Pita等位基因型鉴定。

附图说明

图1利用已知的包含抗病与感病Pita等位基因的水稻品种对Pita基因组编码区序列扩增、比对图示。

其中9311和日本晴为已知的含有感病Pita等位基因的水稻品种，IRBLta-CP1、IRBLta-CT2、IRBLta-K1、F-128-1为已知的含有抗病Pita等位基因的水稻品种。(IRBLta-CP1、IRBLta-CT2、IRBLta-K1、F-128-1均为国际水稻研究所构建的稻瘟病单基因系)

图2Pita基因组编码区结构示意图及利用Pita基因组特异性序列对水稻Pita抗、感基因型扩增示意图。

图3为利用本发明开发的Pita分子标记引物检测具有不同等位基因亲本的电泳图。

M：DL500DNA marker；如图所示，泳道1-17对应水稻品种依次分别为：霸王鞭1、白壳花螺、洞庭晚籼、南雄早油、旱麻稻、细白粘、中农4号、红谷、三颗寸、三磅七十箩、齐头白谷、紫米、鸡血糯、泽谷、麻谷糯、马尾粘、寸谷糯；基因型的R与S分别表示对应水稻品种包含抗病等位基因或者感病等位基因，其中泳道4、13、14对应水稻品种含有抗病Pita等位基因，其余均含感病Pita等位基因。

图4为利用本发明开发的Pita分子标记引物检测目标位点分离的F2群体电泳图。

M：DL500DNA marker；泳道1、2为目标位点分别为含有Pita抗病等位基因的亲本IRBL ta-CP1与含有Pita感病等位基因的亲本Nipponbare，泳道3-24为利用两亲本构建的随机选取的部分F2单株，各材料所属基因型标注于对应泳道下方，S代表感病等位基因类型，R代表抗病等位基因类型，H代表杂合类型。

具体实施方式

本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本申请所用Taq酶及dNTP产自上海博彩生物科技有限公司，其余均为常规生化试剂。

实施例1：

一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pita的特异性分子标记引物，包括：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT和RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。

实施例2：

水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物的应用：

1)生物材料

从143份水稻微核心种质材料中随机选取了17份材料，对应图3泳道1-17依次分别为：霸王鞭1、白壳花螺、洞庭晚籼、南雄早油、旱麻稻、细白粘、中农4号、红谷、三颗寸、三磅七十箩、齐头白谷、紫米、鸡血糯、泽谷、麻谷糯、马尾粘、寸谷糯。(17份水稻品种信息见文献：Zhang,H.,Zhang,D.,Wang,M.,Sun,J.,A core collection and mini corecollection of Oryza sativa L.in China,Theor Appl Genet.,2011,vol.122,no.1,pp.49-61.)

2)水稻DNA提取及引物合成

CTAB方法提取上述材料的DNA，合成表2所示的引物序列，具体为：

SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT

SR：GCCAAATAGCCAATTCATA

RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT

RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。

3)PCR

4)结果分析

如图3结果表明，所有水稻品种都扩增出一条240bp的共有条带，其中泳道4、13、14对应水稻品种扩增出104bp的抗病Pita等位基因特异性条带，其余泳道对应品种扩增出179bp的含感病Pita等位基因特异性条带；为了验证我们的结论，我们将这17个品种目标编码区均进行了测序比对，结果表明，分子标记检测结果与测序结果一致。通过温室稻瘟病单孢接种鉴定，我们也验证了泳道4、13、14对应水稻品种含有抗病Pita等位基因，其余均为感病Pita等位基因。

本发明提供的引物，可用于有效的对抗稻瘟病基因Pita进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定。

实施例3：

本实施例是对水稻抗稻瘟病基因Pita F2群体的单基因分离的检测

1)生物材料

如图4所示，泳道1、2为目标位点分别为含有纯合Pita抗病等位基因的亲本IRBLta-CP1与含有纯合Pita感病等位基因的亲本Nipponbare，泳道3-24为利用两亲本构建的随机选取的部分F2单株，各材料所属基因型标注于对应泳道下方，S代表感病等位基因类型，R代表抗病等位基因类型，H代表杂合类型。

3)PCR

PCR体系同实施例2。

1)结果分析

利用亲本IRBLta-CP1(Pita抗病等位基因)与Nipponbare(Pita感病等位基因)杂交构建了F2群体，并对96个单株的基因型进行了检测，结果表明，3种不同基因型的分离比为24SS：52H：20RR，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ²＝1<χ² _0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离(见图4)。

本发明提供的引物，可用于有效的对抗稻瘟病基因Pita进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻抗稻瘟病基因Pita的分子育种。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用

<130> 水稻抗稻瘟病基因Pita特异性分子标记引物及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaggttata agctagctat 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccaaatagc caattcata 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caagagagag tatttgctta ggagt 25

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctatatctc tttaaaatat gtttggc 27

Claims

1.水稻抗稻瘟病基因Pita基因型鉴定的特异性分子标记引物，包括：SF：GCAGGTTATAAGCTAGCTAT；SR：GCCAAATAGCCAATTCATA；RF：CAAGAGAGAGTATTTGCTTAGGAGT和RR：CCTATATCTCTTTAAAATATGTTTGGC。

2.权利要求1所述的分子标记引物在水稻抗稻瘟病分子育种中的应用。

3.权利要求1所述的分子标记引物在对水稻资源的Pita基因型鉴定或筛选中的应用。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其应用过程包括PCR反应：

PCR反应体系为20µL，含2.0µL 10×Buffer，1.0µL 10 mmol/L 的dNTPs,4条引物均为0.2µM，0.2µL 5U/µL 的Taq酶，2.0µL模板DNA，双蒸水补足余量；

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物在3%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。