CN105506152A - 一种高效检测水稻抗性基因Pita的特异性引物、分子标记及其检测方法 - Google Patents

一种高效检测水稻抗性基因Pita的特异性引物、分子标记及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物、分子标记及其检测方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。所述特异性引物是由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，前后引物所包含的两个可变核苷酸位点在大样本群体中的连锁比率达到99.31％，表明该引物对在水稻中具有广泛的适用性。本发明设计的引物配合筛选出的专用PCR反应体系和反应条件，极大地增加了扩增的准确性和特异性，有效地解决了前人所使用的引物在检测过程中的假阳性问题。利用本发明设计的特异性引物及其分子标记检测水稻Pita基因的抗/感病类型时，只需要进行一次PCR扩增，此方法具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中快速筛选、分析具抗病基因型的个体和品种。

Description

一种高效检测水稻抗性基因Pita的特异性引物、分子标记及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物、分子标记及其检测方法，属于水稻遗传改良与农业生物技术应用领域。
技术背景
稻瘟病是造成水稻严重减产的主要病害之一，每年因稻瘟病导致的生产损失约占总产量的10～15％。目前，发掘广谱稻瘟病抗性基因，通过育种培育广谱持久抗病的水稻品种是控制稻瘟病的主要措施。因此，稻瘟病抗性基因的检测以及稻瘟病抗性水稻种质筛选就显得尤为重要。
抗病基因相关的分子标记在遗传育种方面具有重要的意义，分子标记辅助育种(marker-assistedselection,MAS)对于幼苗的筛选和基因型的确定具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中筛选、分析具抗性基因的个体和品种。
水稻对稻瘟病的抗性符合基因对基因学说。目前在基因对基因学说中水稻的抗性基因Pita和稻瘟菌的无毒基因AVR-Pita是研究得最为详尽的一对互作关系。AVR-Pita编码223个氨基酸的金属蛋白酶，能与抗性基因Pita产物直接作用。Pita是第一个被克隆的抗性基因。Pita基因编码一个长度为928氨基酸的细胞质膜受体蛋白，该蛋白含核苷酸结合位点结构域(NBS)和富亮氨酸结构域(LRD)。
Pita基因抗病/感病两种基因型的编码产物仅有一个氨基酸的差异，即第918氨基酸由抗病型的丙氨酸突变为感病型的丝氨酸，抗病型的Pita基因编码产物的LRD(包含918氨基酸位点)能与稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita编码产物相互作用，引起水稻防卫响应和细胞程序性死亡，从而免受稻瘟病菌侵染。而感病型的Pita基因编码产物则不能与AVR-Pita编码产物相互作用，导致感病(Bryanetal.,2000；Jiaetal.,2000)。
Pita918氨基酸的改变是由于Pita基因DNA序列的6640位点(GenBankNo.AF207842)的突变引起的，当该位点核苷酸为G时，所在密码子编码丙氨酸，抗病；当该位点为T时，所在密码子编码丝氨酸，感病(Jiaetal.,2003)。这种由DNA碱基的一个差异所造成抗/感病差异，为使用PCR引物进行带有抗病位点的品种的筛选提供了有利条件，是分子标记辅助育种的经典应用。
Jia等人曾根据Pita基因DNA位点的变异以及6640位点与6276位点的连锁，设计了检测6640位点核苷酸变异的特异性引物(YL100/YL102)(Jiaetal.,2002)。但是发明人也发现原设计特异性引物识别具有假阳性的现象，也就是说有时候不管6640位点是G还是T，该引物都能扩增出相应的DNA片段，这就导致该分子标记不具有严格的特异性，要进一步确认6640位点的状况还需要通过DNA测序的方式进行确认,显得耗时、耗力、昂贵；此外，Jia等人的引物所基于的两个变异位点(6640和6272)在世界范围内其它地区水稻样本中连锁率很低，导致他们的引物不可用于其它地区水稻的Pita抗性基因型检测。
因此，为了更加准确和更加广泛地利用特异性引物检测Pita基因关键抗病位点6640的变异，本发明拟通过大规模实验筛选和数据分析，对识别该位点的特异性PCR引物、实验反应体系和实验反应条件进行设计、实验和优选，提供一种快速、准确、特异性强的检测Pita基因抗病基因型的专用引物。
参考文献：
BryanGT,WuKS,FarrallL,JiaY,HersheyHP,McAdamsSA,FaulkKN,DonaldsonGK,TarchiniR,ValentB.(2000)AsingleaminoaciddifferencedistinguishesresistantandsusceptibleallelesofthericeblastresistancegenePi-ta.PlantCell.12(11):2033-2046.
LeeS,CostanzoS,JiaY,OlsenKM,CaicedoAL.(2009)EvolutionarydynamicsofthegenomicregionaroundtheblastresistancegenePi-tainAAgenomeOryzaspecies.Genetics.183(4):1315-1325.
JiaY,BryanGT,FarrallL,ValentB.(2003)NaturalVariationatthePi-taRiceBlastResistanceLocus.Phytopathology.93(11):1452-1459.
JiaY,McAdamsSA,BryanGT,HersheyHP,ValentB.(2000)DirectInteractionofResistanceGeneandAvirulenceGeneProductsConfersRiceBlastResistance.EmboJournal19,4004-4014.
JiaY,WangZ,andSinghP.(2002)DevelopmentofDominantRiceBlastPi-taResistanceGeneMarkers.CropSci42:2145-2149.
发明内容
针对上述技术问题，本发明意在克服现有检测技术中出现假阳性、耗时、昂贵以及不具有广泛适用性等缺陷。其目的是提供一种快速、准确、特异性强的检测Pita基因抗病基因型的特异性专用引物、分子标记和检测方法。
为解决上述技术问题和实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物，所述引物由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，所述的引物序列：
前引物6640F：5’-GTGGCTTCTATCTTTACCTG-3’
后引物7415R：5’-CGAACTCCTTCGCATACTCA-3’
一种高效检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的分子标记，所述的分子标记为根据权利要求1所述的特异性引物在Pita基因序列及其3'端调控区扩增出来的核苷酸序列，核苷酸序列长度为814bp。
一种利用分子标记检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的方法，包括以下步骤：
(1)待测样品水稻植株基因组DNA提取；
(2)以步骤(1)中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用权利要求1所述特异性引物进行PCR扩增；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，当PCR产物为阳性时，也即能获得条带长度为814bp的PCR产物，该水稻品种对稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有抗性；反之，当PCR产物为阴性时，即不能获得条带长度为814bp的PCR产物，该水稻品种对稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有感病性。
优选地，所述的专用PCR反应体系为:10×PCR反应缓冲液2.8μl；2.5mMdNTP1.0μl；BSA1.0μl；前引物0.8μl；后引物0.8μl；r-taq酶0.25μl；～20ng/μlDNA为1.0μl；加水至总体积为25μl。
优选地，所述的专用PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，53℃～60℃退火30sec，72℃延伸1min，共运行33个循环，72℃后延伸10min
本发明的原理：
基于不同突变位点的连锁情况，选择适合特异性引物设计的位点(6640和7415)。根据引物3'末端需高度匹配的特点，设计区分6640位点抗/感病的特异性引物，利用该引物PCR扩增产物作为分子标记检测水稻Pita基因6640位点抗/感病分布情况。即以水稻样本DNA为模版进行PCR扩增，若获得条带长度为814bp的PCR产物，则说明该水稻品种对于稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有抗性；若未获得相应的PCR产物带，则说明该水稻品种感病。
本发明的有益效果：
1.本发明具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中筛选、分析具抗性基因型的个体和品种。
2.本发明特异性专用引物的特异性强，检测结果更为准确，正确率可达100％。
3.本发明利用基于特异性引物的分子标记检测水稻抗性基因Pita的关键抗病位点时，只需要进行一次PCR扩增，可提高Pita基因的检测效率，适合用于水稻改良分离群体的分子标记辅助育种，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。
附图说明
图1为鉴定抗病位点的特异性引物应用设计流程图；
图2为Pita基因关键抗病位点区域DNA序列比对图；
图3为特异性引物退火温度筛选电泳图；其中第1和18泳道为DNAMarker2000，第2，3，6，7，10，11，14，15泳道为Pita抗性位点6640G，第4，5，8，9，12，13，16，17泳道为Pita感病位点6640T，其中图(A)本发明利用Pita基因6640与7415位点连锁设计特异性引物，退火温度依次为第2-5泳道60℃，第6-9泳道58℃，第10-13泳道55℃，第14-17泳道53℃；图(B)为已有发明引物的退火梯度，退火温度依次为第2-5泳道64.5℃，第6-9泳道60℃，第10-13泳道58℃，第14-17泳道55℃；
图4为水稻总DNA凝胶电泳检测图；其中第1泳道为空白对照，第2-11泳道为水稻幼苗DNA提取检测图，第12泳道为DNAMarker(Trans2KPlusDNAMarker)，从上到下的条带依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp；
图5为扩增水稻Pita抗病基因型电泳检测图，目的是大样本量验证特异性引物的可靠性，其中第1和22泳道为DNAMarker2000，第2-11泳道为含Pita感病位点6640T的水稻样本，第12-21泳道为含Pita抗性位点6640G的水稻样本。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物的设计和分子标记
引物设计的流程如图1所示，具体如下：
(一)Pita基因关键抗病位点区域的序列测定和变异位点分析：
1.育苗：本发明选择云南德宏地方水稻品种(137个云南德宏地方水稻品种)进行种子收集，5月对种子进行消毒(消毒方法：10％次氯酸钠溶液消毒5分钟后，用灭菌水洗涤种子10次以上)；然后在培养箱内30℃水培发芽；随后移植到温室内的育苗盆中以土壤(水稻土、腐殖土、草木灰的混合)为基质进行种植约20天(三叶一心期)；
2.采样：采集142份三叶一心期的水稻幼苗植株置于15ml灭菌的离心管中，放入液氮中速冻后于-80度超低温冰箱中储存。
3.DNA提取及质检：
3.1水稻基因组DNA提取。使用基因组DNA纯化试剂盒(Promega,A1120)，材料为上述储存于超低温冰箱中的水稻幼苗，根据操作说明执行。
3.2DNA完整性检测：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性(实验使用电泳仪电源和电泳槽厂家为北京六一，使用电压120V，时间30分钟)，基因组DNA条带单一，无拖带，代表基因组DNA完整性良好，如图4所示，可以看出总DNA无弥散条带，DNA完整性好，无降解。
4.PCR扩增Pita基因3'端序列：利用引物对P918-2-F/P918-2-R和引物对P6737-F/P7852R分别对Pita3'端5613-6878片段和6737-7852片段位置进行PCR扩增。
4.1采用的反应体系为：10×PCR反应缓冲液2.8μl；2.5mMdNTP1.0μl；BSA1.0μl；前引物0.8μl；后引物0.8μl；r-taq酶0.25μl；～20ng/μlDNA为1.0μl；加水至总体积为25μl。将PCR反应体系瞬时离心，放入PCR仪(厂家：美国ABI，型号：veriti96)中。
4.2PCR程序为：①94℃预变性3min；②94℃变性30s；③60℃退火30s；④72℃延伸1min；②-④循环33次；⑤72℃后延伸10min。
4.3扩增结束后，将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，120V恒定电压下电泳30分钟，关闭电源，凝胶成像系统拍照并对带型进行分析。引物对P918-2-F/P918-2-R和引物对P6737-F/P7852R扩增出的产物均为条带单一的PCR产物，有产物的送样测序。
5.纯化、测序：对PCR产物进行纯化、测序，共计测序137个品种(包括142个个体，284条序列)。测序引物分别为：引物P918-2-F/P918-2-R的产物采用的测序引物为P918-1-R；引物P6737-F/P7852R的产物采用的测序引物为P6737-F(见表1)。
表1.PCR扩增引物及测序引物
6.序列比对：所测样本(包括142个个体，284条序列)采用Lasergenev7.1.0序列比对软件进行拼接和比对(图2)，统计比对差异。同样方法对别人已发表的该片段序列(148条)进行比对，统计比对差异(见表2)。
表2Pita关键抗病位点区域不同基因型之间变异位点的统计
Pita变异位点统计 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
3 3 5 6 6 7 8 8 8 8 9 9 9 9 9 0 0 1 1 1 2 2 2 3 4 4 4 5 5 5 5 5 5 6 6 6
1 5 9 7 9 8 4 5 8 9 1 2 2 4 5 0 6 8 8 9 0 7 7 8 5 7 8 0 0 4 4 6 7 3 8 9
4 4 7 8 2 2 6 3 0 8 6 1 4 3 1 9 1 0 2 3 0 0 6 5 4 5 0 5 8 4 5 2 1 4 9 1
GQ918419.seq G G G G T T A C A G C G C G C A A A C G G C G C C C C C C C C T G A C G
GQ918475.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T T . . C . . . A
DH-1.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
LTH.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
GQ984160.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918489.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918488.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918487.seq . . A . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
GQ918486.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918485.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918484.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918483.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918482.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918481.seq . . . . . . G . . . . . . A . . . . . A . . . . T . . T . . . C . . . A
GQ918480.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918479.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918478.seq . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . . T . . . C . . . A
GQ918477.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918476.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . T . . . C . . . A
GQ918474.seq . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . . T . . . C . . . A
GQ918473.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
GQ918472.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
GQ918471.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
GQ918470.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
GQ918469.seq . . . . . G . . T . . . . . . . . . . . . T . . . . T T . . . C . . . A
GQ918468.seq . . . . . . G . . . . . . A . . . . . A . . . . T . . T . . . C . . . A
GQ918467.seq . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . T . . . C . . . A
(部分显示)
7.连锁位点统计：根据6640与其周围突变位点的统计情况，对相应的突变位点进行连锁分析。突变位点统计共计290条序列，统计连锁百分比。如表3所示，该表表明6640位点与6276位点的连锁百分比以及6640位点与7415位点的连锁百分比，通过数据比较，可以看出6640位点与7415位点的连锁更为密切。
表3.特异性引物设计基于的SNPs连锁情况
(二)设计和筛选高效检测Pita抗病基因型的特异性引物：
基于6640和其它不同突变位点的连锁情况，选择特异性引物设计的位点(6640和7415)，根据引物3'端高度匹配的特点进行设计并合成引物。经过对一系列引物组合的实验、摸索、优化和筛选，最终优选出的引物是由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，该引物序列如下：
前引物6640F：5’-GTGGCTTCTATCTTTACCTG-3’
后引物7415R：5’-CGAACTCCTTCGCATACTCA-3’
(三)Pita抗病基因型分子标记的PCR扩增：
优选出的特异性引物在Pita基因序列及其3'端调控区序列扩增出来的核苷酸序列长度为814bp，也即检测水稻抗性基因Pita的关键抗病位点的分子标记。
实施例2检测Pita抗病基因型的特异性引物退火温度和特异性验证
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
通过将本发明的引物和已有发明的引物分别以53℃，55℃，58℃，60℃，64.5℃为退火温度进行PCR扩增，筛选合适的退火温度，如图3(A,B)所示，其中第1和18泳道为DNAMarker2000，第2，3，6，7，10，11，14，15泳道为Pita抗性位点6640G，第4，5，8，9，12，13，16，17泳道为Pita感病位点6640T。(A)本发明利用Pita基因6640与7415位点连锁设计特异性引物，退火温度依次为60℃(第2-5泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)，58℃(第6-9泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)，55℃(第10-13泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)，53℃(第14-17泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)。(B)为已有发明引物的退火梯度，退火温度依次为64.5℃(第2-5泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)，60℃(第6-9泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)，58℃(第10-13泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)，55℃(第14-17泳道，前两个为抗性品种，后两个为感病品种)。PCR产物的电泳图谱清晰的表明本发明的引物具有退火温度低、特异性好的特点。
通常高的温度可以降低非特异性，而原发明引物在相对较高的退火温度60℃下，仍有明显的非特异性扩增条带，而本发明的引物在53℃-60℃的常用退火温度范围内均是条带单一(产物长度为814bp)，没有非特异性扩增，无杂带，充分说明了本发明引物对退火温度的要求低，特异性好，可以准确区分6640抗/感病位点，抗病基因型有清晰条带，感病基因型无条带。
经过对不同PCR反应体系的筛选和优化，最优PCR反应体系为10×PCR反应缓冲液2.8μl；2.5mMdNTP1.0μl；BSA1.0μl；前引物0.8μl；后引物0.8μl；r-taq酶0.25μl；～20ng/μlDNA为1.0μl；加水至总体积为25μl。
经过对不同PCR反应条件的筛选和优化，最优反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，53-60℃30sec，72℃1min共运行33个循环，72℃再延伸10min,16℃hold。
经过对不同PCR反应中退火温度的筛选和优化，所述的步骤2中的PCR反应条件中的最优退火温度为60℃。
实施例3一种利用该分子标记检测水稻抗性基因Pita的关键抗病位点的方法及大样本量验证
利用该分子标记检测水稻抗性基因Pita的关键抗病位点的方法包括以下步骤：
(1)待测样品水稻植株基因组DNA提取；
(2)以步骤(1)中得到的样品DNA为模板，构建PCR反应体系；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，当PCR产物为阳性时，也即获得条带长度为814bp的PCR产物，表明抗性基因Pita6640位点的碱基为G，水稻品种对稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有抗性；反之，当PCR产物为阴性时，即不能获得条带长度为814bp的PCR产物，表明6640位点的碱基为T，水稻品种对稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有感病性。
具体实施过程如下：
1.水稻DNA提取：3叶1心期水稻幼苗采集放入液氮中速冻，然后置于-80℃超低温冰箱中储存。水稻基因组DNA提取使用基因组DNA纯化试剂盒(Promega,A1120)，根据操作说明执行。DNA完整性检测：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性(实验使用电泳仪电源和电泳槽厂家为北京六一，使用电压120V，时间30分钟)，基因组DNA条带单一，无弥散条带，代表基因组DNA完整性良好，如图4所示。
2.特异性引物PCR扩增:利用特异性引物对所选水稻DNA进行PCR扩增，所述的特异性引物为：
前引物6640F：GTGGCTTCTATCTTTACCTG，
后引物7415R：CGAACTCCTTCGCATACTCA。
3.电泳检测分子标记：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带(实验使用电泳仪电源和电泳槽厂家为北京六一，使用电压120V，时间30分钟)，凝胶成像系统显示PCR产物的扩增情况。若有一条清晰的约814bp的PCR产物条带，表示为阳性，则证明该水稻品种Pita基因6640位点为G，对稻瘟病菌(含Avr-Pita)的侵染具有抗性。若PCR扩增没有产物条带，表示为阴性，则说明该水稻品种Pita基因6640位点为T，对稻瘟病菌(含Avr-Pita)的侵染表现为感病。如图5所示，第12-21泳道为含Pita抗性位点6640G的水稻样本，第2-11泳道为含Pita感病位点6640T的水稻样本。
本发明利用设计的特异性引物和筛选到的反应体系进行所有德宏地方水稻品种(137个品种，142个个体)DNA的PCR扩增，退火温度为53～60℃。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物条带，如图5所示。电泳检测结果与6640位点的DNA测序结果相比较，其一致性达到100％。即6640位点为G抗性位点时，特异性引物的PCR结果为阳性，有814bp的条带(38个品种，38个个体)；6640位点为T感病位点时，特异性引物的PCR结果为阴性，无814bp的条带(99个品种，104个个体，其中一个特殊单倍型品种有3个个体)。
本发明的特异性引物与原发明(Jiaetal.,2002)的对比信息见表4。
表4.本发明和原发明特异性引物信息差异
从表4可以看出，原有引物利用Pita基因6276位点和6640位点的连锁设计特异性引物的，而本发明利用6640位点和7415位点的连锁设计特异性引物，两者在连锁关系上具有显著的差别(如表3所示)，原有特异性引物6276位点和6640位点在所有序列(共计290条)的连锁百分比仅有36.55％，而本发明基于的连锁位点的连锁百分比达到了99.31％。
本发明中基于的连锁位点连锁百分比是附近突变位点中与关键抗病位点连锁百分比最高的；对样本检测的正确率可达100％。本发明开始也尝试基于其它变异位点设计了一些引物组合，例如以6640位点与6808位点组合设计的引物，在样本的检测中也有很高的成功率，但在后来更广泛的大样本实验中发现，有一些水稻个体6640位点变异与6808位点变异并不严格连锁，在这样的个体中，基于6640和6808位点开发的引物就出现了假阳性条带，影响检测效率的准确性。因此发明人才在Pita基因上测定了更长的序列，涵盖了更多的测序样本，最终发现了与6640变异位点严格连锁的7415变异位点，基于这两个严格连锁的位点开发出的引物对世界范围内的水稻个体都具有很好的适用性，可以快速检测Pita基因的抗病单倍型。
本发明筛选出的反应体系能保证严格的特异性，正确率可达100％。而原发明(Jiaetal.,2002)的引物在常用退火温度下具有非特异性扩增，并且，在检测过程中容易出现假阳性的结果，还需要进一步DNA测序才能分辨抗/感病类型。
综上实施例，本发明特异性引物检测准确性高，利用该引物检测水稻抗性基因Pita的关键抗病位点时，只需要进行一次PCR扩增，此方法具有简单、快捷、经济节约的优点，适合在大样本中筛选、分析具抗病基因型的个体和品种。综合以上指标本发明无疑是最优的。
SEQUENCELISTING
<110>云南农业大学
<120>一种高效检测水稻抗性基因Pita的特异性引物、分子标记及其检测方法
<130>1
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gtggcttctatctttacctg20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cgaactccttcgcatactca20

Claims (5)

1.一种高效检测水稻抗性基因Pita关键抗病位点的特异性引物，其特征在于：所述引物由前引物(6640F)和后引物(7415R)组成，所述的引物序列：
前引物6640F：5’-GTGGCTTCTATCTTTACCTG-3’
后引物7415R：5’-CGAACTCCTTCGCATACTCA-3’
2.一种高效检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的分子标记，其特征在于：所述的分子标记为根据权利要求1所述的特异性引物在Pita基因序列及其3'端调控区扩增出来的核苷酸序列，核苷酸序列长度为814bp。
3.一种利用分子标记检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的方法，包括以下步骤：
(1)待测样品水稻植株基因组DNA提取；
(2)以步骤(1)中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用权利要求1所述特异性引物进行PCR扩增；
(3)利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，当PCR产物为阳性时，也即能获得条带长度为814bp的PCR产物，该水稻品种对稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有抗性；反之，当PCR产物为阴性时，即不能获得条带长度为814bp的PCR产物，该水稻品种对稻瘟病菌(含AVR-Pita)具有感病性。
4.根据权利要求3所述的利用分子标记检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的方法，其特征在于：所述的专用PCR反应体系为:10×PCR反应缓冲液2.8μl；2.5mMdNTP1.0μl；BSA1.0μl；前引物0.8μl；后引物0.8μl；r-taq酶0.25μl；～20ng/μlDNA为1.0μl；加水至总体积为25μl。
5.根据权利要求3或4所述的利用分子标记检测水稻抗性基因Pita抗病基因型的方法，其特征在于：所述的专用PCR反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，53℃～60℃退火30sec，72℃延伸1min，共运行33个循环，72℃后延伸10min。
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