JPH11100398A

JPH11100398A - 耐病性植物

Info

Publication number: JPH11100398A
Application number: JP10096691A
Authority: JP
Inventors: Yuichi Tada; 雄一多田; Yasushi Sakamoto; 康司阪本; F Wittea Robert; エフ．ウイッティアロバート
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-25
Publication date: 1999-04-13

Abstract

(57)【要約】【課題】植物に耐病性、特に獲得抵抗性を付与するタ
ンパク質およびその遺伝子を単離することを課題とす
る。また、該遺伝子を導入することにより耐病性植物体
を作出することを課題とする。さらに、該遺伝子の発現
を指標とした植物に耐病性を付与する化合物のスクリー
ニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤で処理
をした植物に発現するmRNAと該処理を行わない植物に発
現するmRNAをディファレンシャルディスプレイ法によっ
て比較し、薬剤処理をした植物にのみ特異的に発現する
遺伝子「RPR1」を単離し、「RPR1」遺伝子の発現と植物
の耐病性との間に顕著な相関関係が認められること、お
よび「RPR1」遺伝子を導入した植物体が実際に耐病性を
示すことを見いだした。さらに、「RPR1」遺伝子と高い
相同性を有する遺伝子「RPR1h」を単離することに成功
した。また、これら遺伝子の発現の誘導を指標に、植物
に耐病性を付与する化合物のスクリーニングを行うこと
ができることを見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物に耐病性、特
に獲得抵抗性を付与するタンパク質、該タンパク質をコ
ードするDNA、該DNAを含むベクター、該DNAを発現可能
に保持する形質転換細胞、該形質転換細胞を含む形質転
換植物体、該タンパク質に結合する抗体、および植物に
耐病性を付与する活性を有する化合物のスクリーニング
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は様々な病気に対する抵抗遺伝子を
もつ。しかし、ある一つの耐病性遺伝子はその遺伝子に
対する非親和性遺伝子をもつ特定の病原菌の種類（レー
ス）に対してのみ抵抗性を示し、これを遺伝子対遺伝子
説（Flor 1971 Ann. Rev. Phytopathol. 9:275）と呼
ぶ。最近では、トマトから「Pseudomonas syringae pv
tomato」の非親和性遺伝子「avrPTO」に対する耐性遺伝
子「PTO」（Martin et al.1993 Science262:1432）と、
「Cladosporium fulvum」の非親和性遺伝子「Avr9」に
対する抵抗性遺伝子「Cf-9」（Jones et al. 1994 Scie
nce 266:789) が単離されている。また、シロイヌナズ
ナでは「Pseudomonas syringae pv tomato」の非親和性
遺伝子「avrRpt2」に対する耐性遺伝子「RPS2」（Bent
et al. 1994Science 265:1856）、「Pseudomonas syrin
gae pv tomato」の非親和性遺伝子「avrRpm1」および
「avrB」に対する耐性遺伝子「RPM1」（Grant et al. 1
995 Science 269:843）などが単離されている。また、
非親和性遺伝子が不明であるがタバコでタバコモザイク
ウイルスに対する抵抗性遺伝子「N」（Whitham et al.
1994 Cell 78:1101）が、イネで「Xanthomonas campest
ris pv oryzae」に対する抵抗性遺伝子「Xa21」（Song
et al. 1995 Science 270:1804）が、亜麻で「Melampso
ra lini」に対する抵抗性遺伝子「L6」（Lawrence et a
l. 1995 Plant Cell 7:1195）などが単離された。しか
しながら、これらの抵抗性遺伝子（真性抵抗性遺伝子）
は非親和性遺伝子をもたない病原菌に対しては抵抗性を
示さない。また、真性抵抗性は病原菌の変異によって容
易に崩壊してしまうことが知られている。従って、これ
らの真性抵抗性遺伝子はそのままでは利用範囲は広くな
い。

【０００３】一方で、植物では獲得抵抗性という動物の
免疫にたとえられる現象が知られている（Chester 1933
Q Rev. Biol. 8:275、Ryals et al. 1994 Plant Physi
ol.104:1109）。これは、植物が病原菌に感染した場合
に、それ以後その植物の感染していない組織が比較的長
期間にわたり、広い種類の病原菌に対して抵抗性を示す
現象である。また、サリチル酸（White 1979 Virology
99:410）、2,6-ジクロロイソニコチン酸(INA)（Ward et
al. 1991 Plant Cell 3:1085）、ベンゾチアジアゾー
ル（benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothionic acid S-
methyl ester(BTH)(Friedrich et al. 1996 Plant Jour
nal 10:61)）などの化合物が植物に獲得抵抗性を誘導す
ることが知られており、サリチル酸は獲得抵抗性のシグ
ナル分子であると考えられている。3-アリルオキシ-1,2
-ベンゾイソチアゾール/1,1-ジオキシド（プロベナゾー
ル、商品名オリゼメート、明治製菓株式会社）もイネの
いもち病、白葉枯病、もみ枯細菌病やその他のいくつか
の野菜の病気に対する獲得抵抗性を誘導する薬剤（殺菌
剤）として認可され、使用されている。これらの化合物
の散布によって植物は自身の持つ潜在的な耐病性機構を
発動させ、獲得抵抗性を得ると考えられる。獲得抵抗性
による耐病性は広い種類の病原菌に対して有効であり、
病原菌の変異によって崩壊することもないために非常に
応用範囲が広い。

【０００４】しかしながら、獲得抵抗性のメカニズムに
ついてはほとんど解明されていないのが現状である。Wa
rdら（1991 Plant Cell 3:1085）は植物の獲得抵抗性を
誘導する薬剤であるサリチル酸や2,6-ジクロロイソニコ
チン酸処理により発現が誘導される遺伝子として「PR-
1」、「PR-2」、「PR-4」、「PR-5」、「キチナー
ゼ」、「グルカナーゼ」、「PR-Q'」、「SAR8.2」など
の遺伝子を報告しているが、これらは獲得抵抗性の引き
金になる遺伝子ではなく、単にウイルスなどに感染する
だけでも誘導される「Pathogenesis related protein
（感染特異的タンパク質）」の遺伝子（PR遺伝子）であ
った。また、実際「PR-1」や「PR-5」をタバコに過剰発
現させた場合にも、該タバコはタバコモザイクウイルス
に対する耐性を示さなかった（Cutt et al. 1989 Viro
l. 173:89;Linyhorest et al. 1989 PlantCell 1:28
5）。また、ベンゾチアジアゾール処理によっても同様
な遺伝子の発現が誘導されることが報告されている（Fr
iedrich et al. 1996 Plant Journal 10:61 ）。さら
に、プロベナゾール処理によって誘導される遺伝子がイ
ネから単離されたが、これもPR遺伝子であった（Midoh
and Iwata 1996 Plant Cell Physiol.37:9）。最近にな
って獲得抵抗性と真性抵抗性のシグナル伝達系の遺伝子
NPR1（Cao et al. 1997 Cell 10:57）またはNIM1（Ryal
s et al. 1997 Plant Cell 9:425）が単離されたが、こ
れらは抵抗性のシグナル伝達系の下流に位置すると考え
られている（Ryals et al. 1996 Plant Cell 8:180
9）。即ち、植物に獲得抵抗性を付与する遺伝子はいま
だ単離されていないのが現状である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物に耐病
性、特に獲得抵抗性を付与するタンパク質およびその遺
伝子を単離することを課題とする。また、本発明は、該
遺伝子を導入することにより耐病性植物体を作出するこ
とを課題とする。さらに、本発明は、該遺伝子の発現を
指標とした植物に耐病性を付与する化合物のスクリーニ
ング方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行い、植物の獲得抵抗性を
誘導する薬剤で処理をした植物に発現するmRNAと該処理
を行わない植物に発現するmRNAをディファレンシャルデ
ィスプレイ法（Liang and Pardee 1992 Science 257:96
7）によって比較し、薬剤処理をした植物にのみ特異的
に発現する遺伝子「RPR1」を単離することに成功した。
本発明者らは、さらに、「RPR1」遺伝子につき解析をす
すめた結果、「RPR1」遺伝子の発現と植物の耐病性との
間に顕著な相関関係が認められること、および「RPR1」
遺伝子を導入した植物体が実際に耐病性を示すことを見
いだした。さらに、本発明者らは、「RPR1」遺伝子と高
い相同性を有する遺伝子「RPR1h」を単離することに成
功した。

【０００７】また、本発明者らは、大腸菌に発現させて
精製した「RPR1」タンパク質を基にこれに対する抗体を
調製し、各種化合物で処理した植物において該抗体によ
る「RPR1」タンパク質の検出および耐病性の検定を行っ
た。その結果、化合物による「RPR1」遺伝子の発現の誘
導と耐病性との間に密接な関係が存在することを見出し
た。これにより本発明者らは単離したこれら遺伝子の発
現の誘導を指標に、植物に耐病性を付与する化合物のス
クリーニングを行うことができることを見出した。

【０００８】即ち、本発明は、植物の獲得抵抗性を誘導
する薬剤により誘導され、植物に耐病性を付与する遺伝
子およびそのタンパク質、並びにこれらを利用した耐病
性植物の作出および植物に耐病性を付与する化合物のス
クリーニングに関し、より具体的には、（１）配列番
号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、また
は該タンパク質中のアミノ酸配列において１若しくは複
数のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸
配列を有し、植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤により発
現が誘導されるタンパク質、（２）配列番号：１４に
記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または該タン
パク質中のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミ
ノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有
し、植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤により発現が誘導
されるタンパク質、（３）配列番号：２に記載の塩基
配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAがコードする
タンパク質であって、植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤
により発現が誘導されるタンパク質、（４）配列番
号：１５に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイ
ズするDNAがコードするタンパク質であって、植物の獲
得抵抗性を誘導する薬剤により発現が誘導されるタンパ
ク質、（５）植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤がプロ
ベナゾール、サリチル酸、またはベンゾチアジアゾール
である、（１）から（４）のいずれかに記載のタンパク
質、（６）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からな
るタンパク質、または該タンパク質中のアミノ酸配列に
おいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若しく
は付加したアミノ酸配列を有し、植物に耐病性を付与す
る活性を有するタンパク質、（７）配列番号：１４に
記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または該タン
パク質中のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミ
ノ酸が置換、欠失、若しくは付加したアミノ酸配列を有
し、植物に耐病性を付与する活性を有するタンパク質、
（８）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAと
ハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であっ
て、植物に耐病性を付与する活性を有するタンパク質、
（９）配列番号：１５に記載の塩基配列からなるDNA
とハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質であ
って、植物に耐病性を付与する活性を有するタンパク
質、（１０）耐病性がいもち病または白葉枯れ病に対
する耐性である、（６）から（９）のいずれかに記載の
タンパク質、（１１）（１）から（１０）に記載のタ
ンパク質をコードするDNA、（１２）（１１）に記載
のDNAを含むベクター、（１３）（１１）に記載のDNA
を誘導的に発現させるプロモーターを含む、（１２）に
記載のベクター、（１４）（１１）に記載のDNAを誘
導的に発現させるプロモーターがイネキチナーゼ遺伝子
のプロモーターである、（１３）に記載のベクター、
（１５）（１１）に記載のDNAを発現可能に保持する
形質転換細胞、（１６）植物細胞である（１５）に記
載の形質転換細胞、（１７）イネ細胞である（１６）
に記載の形質転換細胞、（１８）（１６）に記載の形
質転換細胞を含む形質転換植物体、（１９）（１７）
に記載の形質転換細胞を含むイネ形質転換植物体、（２
０）（１）から（１０）のいずれかに記載のタンパク
質に結合する抗体、に関する。

【０００９】なお、本発明において、「獲得抵抗性」と
は、病原菌の感染によって過敏感反応による壊死斑の形
成が起こり、その周辺組織もしくは全身的に病原菌の再
接種に対し抵抗的となる現象および薬剤処理によって全
身的に病原菌の接種に対し抵抗的となる現象を指す。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、植物の獲得抵抗性を誘
導する薬剤により発現が誘導され、植物に耐病性を付与
するタンパク質に関する。本発明のタンパク質に含まれ
る「RPR1」タンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号：
１に、「RPR1」cDNAの塩基配列を配列番号：２に示す。
「RPR1」タンパク質は、植物の獲得抵抗性を誘導する薬
剤であるプロベナゾールなどの処理を行ったイネから単
離された遺伝子であり、これら薬剤による処理を行った
植物体に特異的に発現する遺伝子である。本発明者ら
は、「RPR1」遺伝子の発現とイネいもち病および白葉枯
れ病との関係につき解析を行った結果、これらの間に相
関関係が存在することを見出した（実施例６および
７）。また、本発明者らは「RPR1」遺伝子を導入したイ
ネ植物体を実際に作出し、そのいもち病に対する耐性に
つき検討を行ったところ、該植物体が実際にいもち病に
対し耐性を示すことを見出した（実施例９）。これら事
実は「RPR1」タンパク質が、植物に耐病性を付与する活
性を有するタンパク質の１つであることを示す。また、
同じく本発明のタンパク質に含まれる「RPR1h」タンパ
ク質の推定アミノ酸配列を配列番号：１４に、「RPR1
h」cDNAの塩基配列を配列番号：１５に示す。「RPR1h」
cDNAの塩基配列と「RPR1」cDNAの塩基配列を比較する
と、コード領域における相違は8塩基であり、推定アミ
ノ酸配列のレベルで比較すると両者の相違はわずか3ア
ミノ酸である。このように両遺伝子が極めて高い相同性
を有するという事実は、これら遺伝子が同様の機能を有
することを示すものである。

【００１１】本発明のタンパク質は、当業者に公知の方
法により、天然のタンパク質としての他、遺伝子組み換
え技術を利用して調製した組み換えタンパク質として調
製することができる。天然のタンパク質は、例えば、下
記の方法により調製された組み換えタンパク質をウサギ
などの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体（CNBr
活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合さ
せてカラムを作製し、得られたカラムを利用してイネの
葉のタンパク質抽出液を精製することにより調製するこ
とが可能である。

【００１２】一方、組み換えタンパク質は、常法、例え
ば、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現
ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、
該形質転換細胞から精製することにより調製することが
可能である。組み換えタンパク質を生産するために用い
られる細胞としては、例えば、植物細胞、大腸菌、酵
母、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。また、細胞
内で組み換えタンパク質を発現させるためのベクターと
しては、例えば、植物、酵母細胞用にはプラスミド「pB
I121」や「pBI101」（Clontech社製）、大腸菌用にはプ
ラスミド「pET Expression system」（Stratagene社
製）や「GST gene fusion Vectors」（Pharmacia社
製）、ほ乳類細胞用にはプラスミド「pMAM」（Clontech
社製）、昆虫細胞用にはプラスミド「pBacPAK8.9」（Cl
ontech社製）などが挙げられる。ベクターへのDNAの挿
入は、常法、例えば、Molecular Cloning（Maniatis et
al. Cold Spring harbor Laboratry Press）に記載の
方法により行うことができる。また、宿主細胞へのベク
ターの導入は、常法により宿主細胞に応じてエレクトロ
ポレーション法、マイクロインジェクション法、パーテ
ィクルガン法などの方法で行うことが可能である。得ら
れた形質転換細胞からの本発明の組み換えタンパク質の
精製は、タンパク質の性質に応じ、塩析や有機溶媒によ
る沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクトマ
トグラフィー、ゲルろ過、SDS電気泳動、等電点電気泳
動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。ま
た、本発明の組み換えタンパク質をグルタチオンS-トラ
ンスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発
現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロ
マトグラフィーなどにより精製することも可能である。

【００１３】また、当業者であれば、公知の方法によ
り、天然型のタンパク質（例えば、配列番号：１からな
る「RPR1」タンパク質または配列番号：１４に記載のア
ミノ酸配列からなる「RPR1h」タンパク質）中のアミノ
酸を適宜置換などして、これと実質的に同一の機能を有
する改変タンパク質を調製することが可能である。ま
た、アミノ酸の変異は自然界において生じることもあ
る。本発明のタンパク質には、このように天然型のタン
パク質のアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ
酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有し、
天然型のタンパク質と実質的に同一の機能を有するタン
パク質も含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改変
は、通常、全アミノ酸の50アミノ酸以内であり、好まし
くは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ
酸以内であり、さらに好ましくは3アミノ酸以内であ
る。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば
「Transformer Site-directed Mutagenesis Kit」や「E
xSite PCR-Based Site-directed Mutagenesis Kit」（C
lontech社製）を用いて行うことが可能であり、また、
欠失であれば「Quantum leap Nested Deletion Kit」
（Clontech社製）などを用いて行うことが可能である。
単離したタンパク質が天然型のタンパク質と「実質的に
同一の機能を有する」とは、タンパク質が植物の獲得抵
抗性を誘導する薬剤により発現が誘導される性質を有す
ること、および／または植物に少なくとも１つの病気に
対する耐性を付与する性質を有することを意味する。

【００１４】植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤として
は、例えば、3-アリルオキシ-1,2-ベンゾイソチアゾー
ル/1,1-ジオキシド（プロベナゾール、商品名オリゼメ
ート、明治製菓株式会社）、サリチル酸（White 1979 V
irology 99:410）、ベンゾチアジアゾール（BTH）（Fri
edrich et al. 1996 Plant Journal 10:61）、2,6-ジク
ロロイソニコチン酸(INA)（Ward et al. 1991 Plant Ce
ll 3:1085）などが知られている。植物に獲得抵抗性を
付与する薬剤による遺伝子の発現の誘導は、それぞれの
薬剤に適した処理方法で処理した植物（対照として無処
理の植物）からRNAを抽出して、各種遺伝子をプローブ
としたノーザンハイブリダイゼーション法（Alwine et
al. 1977 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5350、Mania
tis et al.Molecular Cloning Cold Spring harbor La
boratry Press）や、タンパク質を抽出してELISA法やウ
ェスタンブロティング法により検出することが可能であ
る。また、植物の獲得抵抗性の検定は、用いる植物と病
原の組み合わせに応じて、当業者に公知の方法より行う
ことが可能である。例えば、イネいもち病の場合には、
特定のイネ品種にその品種に罹病性のイネいもち病菌の
レースを接種した場合の過敏感反応の有無や病斑形成の
程度を無処理の獲得抵抗性を示さない植物と比較するこ
とによって検定することが可能である。また、タバコの
タバコモザイクウイルス（TMV）病の場合には、抵抗性
遺伝子「N」を持たないタバコの品種にTMVを接種した場
合の過敏感反応の有無やウイルスの増殖の程度を無処理
の獲得抵抗性を示さない植物と比較することによって検
定することが可能である。

【００１５】また、植物の耐病性としては、例えば、い
もち病、白葉枯れ病に対する耐性が挙げられるが、これ
らに制限されない。イネにおけるいもち病は、Magnapor
thegriseaという糸状菌によって引き起こされる病気で
ある。いもち病は、イネ以外にもヒエなどの単子葉植物
にも見られるが、植物により寄生する菌の系統は異な
る。イネにおける白葉枯れ病は、Xanthomonas oryzaeと
いう細菌により引き起こされる病気である。同じく、Xa
nthomonas属の細菌により引き起こされる病気として
は、イネ条斑細菌病、キャベツ黒腐病、ダイズ葉焼病、
モモ穿孔病、トマト斑点細菌病などが挙げられる。

【００１６】単離したタンパク質と実質的に同一の機能
を有するタンパク質を単離するための、当業者によく知
られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術
（Southern 1975 J. Mol. Biol. 98:503、Maniatis et
al. Molecular Cloning Cold Spring harbor Laboratr
y Press）が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ハ
イブリダイゼーション技術を用いて、「RPR1」遺伝子の
塩基配列（配列番号：２）や「RPR1h」遺伝子の塩基配
列（配列番号：１５）もしくはその一部をプローブとし
て、これと高い相同性を有するDNAを単離して、該DNAか
ら「RPR1」タンパク質や「RPR1h」タンパク質と実質的
に同一の機能を有するタンパク質を得ることは通常行い
うることである。このようにハイブリダイズ技術により
単離された「RPR1」タンパク質や「RPR1h」タンパク質
と実質的に同一の機能を有するタンパク質もまた本発明
のタンパク質に含まれる。ここで「実質的に同一の機能
を有する」とは、上記と同様に、タンパク質が植物の獲
得抵抗性を誘導する薬剤により発現が誘導される性質を
有すること、および／またはタンパク質が植物に少なく
とも１つの病気に対する耐性を付与する性質を有するこ
とを意味する。ハイブリダイズ技術により得られるタン
パク質は、機能的観点から、「RPR1」タンパク質や「RP
R1h」タンパク質とアミノ酸配列において45％以上の相
同性を有することが好ましく、60％以上の相同性を有す
ることがさらに好ましく、75％以上の相同性を有するこ
とがさらに好ましく、90％以上の相同性を有することが
さらに好ましい。また、耐病性遺伝子に特徴的な配列で
ある、ロイシンリッチリピート様構造（Kobe and deise
nhofer 1994 Trends Biochem. Sci. 19:415）やヌクレ
オチド結合部位（Traut 1994 Eur. J. Biochem 222:9）
を有すると、機能上好ましいと考えられる。このような
タンパク質には、例えば、後述する実施例８における
「RPR1」遺伝子をプローブとしたサザンブロット解析に
より検出された遺伝子（イネの各品種の他、トウモロコ
シ、オオムギ、トマト、アラビドプシス由来の遺伝子）
がコードするタンパク質が含まれる。

【００１７】また、本発明は、上記本発明のタンパク質
をコードするDNAに関する。本発明のDNAは、本発明のタ
ンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、
cDNAの他、ゲノミックDNA、および化学合成DNAなどが含
まれる。ゲノムDNAは、例えば、文献（Rogers and Bend
ich, Plant Mol. Biol. 5:69 (1985)）記載の方法に従
って調製したゲノムDNAを鋳型として、本発明のDNAの塩
基配列（例えば、配列番号：２または配列番号：１５に
記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてPC
R（Saiki et al. Science 239:487(1988)）を行うこと
により調製することが可能である。また、cDNAであれ
ば、常法（Maniatis et al. Molecular Cloning Cold
Spring harbor Laboratry Press）により植物からmRNA
を調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマー
を用いてPCRを行うことにより調製することが可能であ
る。また、ゲノムDNAやcDNAは、常法によりゲノムDNAラ
イブラリーまたはcDNAライブラリーを作製し、このライ
ブラリーに対し、例えば本発明のDNAの塩基配列（例え
ば、配列番号：２または配列番号：１５に記載の「RPR
1」遺伝子または「RPR1h」遺伝子の塩基配列）を基に合
成したプローブを用いてスクリーニングすることによっ
ても調製することが可能である。なお、得られたDNAの
塩基配列は、例えば「シークエンサーModel373」（ABI
社製）を利用することにより容易に決定することが可能
である。

【００１８】また、本発明は、本発明のDNAが挿入され
たベクターに関する。本発明のベクターとしては、組み
換えタンパク質の生産に用いる上記ベクターの他に、形
質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のタンパ
ク質を発現させるためのベクターも含まれる。このよう
なベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモータ
ー配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーショ
ン部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制
限されず、例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI22
1」、「pBI101」（いずれもClontech社製）などが挙げ
られる。本発明のベクターは、本発明のタンパク質を恒
常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含
有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとし
ては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプ
ロモーター（Odell et al. 1985 Nature 313:810）、イ
ネのアクチンプロモーター（Zhang et al. 1991 Plant
Cell 3:1155）、トウモロコシのユビキチンプロモータ
ー（Cornejo et al. 1993 PlantMol. Biol. 23:567）な
どが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロ
モーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感
染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化
合物の散布などの外因によって発現することが知られて
いるプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモ
ーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感
染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロ
モーター（Xu et al. 1996 Plant Mol．Biol．30：38
7）やタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター（Ohs
hima et al. 1990 Plant Cell 2:95）、低温によって誘
導されるイネの「lip19」遺伝子のプロモーター（Aguan
etal. 1993 Mol. Gen Genet. 240:1）、高温によって
誘導されるイネの「hsp80」遺伝子と「hsp72」遺伝子の
プロモーター（Van Breusegem et al. 1994 Planta193:
57）、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「rab1
6」遺伝子のプロモーター（Nundy et al. 1990 Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 87:1406）、紫外線の照射によっ
て誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモ
ーター（Schulze-Lefert et al. 1989 EMBO J. 8:65
1）、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et
al. 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624）など
が挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモー
ターとタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーターはサ
リチル酸などの特定の化合物によって、「rab16」は植
物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導され
る。

【００１９】また、本発明は、本発明のベクターが導入
された形質転換細胞に関する。本発明のベクターが導入
される細胞には、組み換えタンパク質の生産に用いる上
記した細胞の他に、形質転換植物体作製のための植物細
胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はないが、植
物体への再分化の系が確立されている、例えば、イネ、
トウモロコシ、ジャガイモ、タバコなどの細胞が好まし
い。なお、本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物
体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原
基、多芽体、毛状根も含まれる。

【００２０】植物細胞へのベクターの導入は、例えば、
アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood et al.
1993 Transgenic Res. 2:218、Hiei et al. 1994 Plant
J.6:271）、エレクトロポレーション法（Tada et al.
1990 Theor. Appl. Genet 80:475）、ポリエチレングリ
コール法（Lazzeri et al. 1991 Theor. Appl. Genet 8
1:437）、パーティクルガン法（Sanford et al. 1987
J. Part. Sci. tech.5:27）などの方法を用いることが
可能である。

【００２１】形質転換された植物細胞は、再分化させる
ことにより植物体を再生させることが可能である。再分
化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イ
ネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett.
2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであれ
ばShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法
やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げら
れ、ジャガイモであればVisserら（Theor. Appl. Genet
78:594 (1989)）の方法が挙げられ、タバコであればNa
gataとTakebe（Planta 99:12(1971)）の方法が挙げられ
る。これにより得られた形質転換植物体は、各種病原菌
に対する抵抗性を有するために生産性の向上と収量の安
定化、農薬使用量の低減化とそれによる生産コストと労
働時間の低減化や環境に対する負荷の削減に効果がある
と期待される。また、耐病性であるために有機栽培農法
や農薬使用が困難な発展途上国においても高い収量が確
保できると考えられる。

【００２２】また、本発明は、上記本発明のタンパク質
に結合する抗体に関する。本発明の抗体には、ポリクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。本発
明の抗体の調製は当業者に公知の方法（例えば、Molecu
lar cloning(Maniatis et al.cold Spring harbor Labo
ratry Press)に記載の方法）により行うことができる。
本発明の抗体の調製を行う場合には、本発明のタンパク
質全体を免疫する方法の他に、部分ペプチドを免疫して
調製することも可能である。本発明の抗体は、本発明の
タンパク質の精製や検出の他、後述する植物に耐病性を
付与する化合物のスクリーニングに用いることが可能で
ある。

【００２３】また、本発明は、植物に耐病性を付与する
活性を有する化合物をスクリーニングする方法に関す
る。本発明のスクリーニング方法の一つの態様は、
（ａ）植物を被検化合物で処理する工程、（ｂ）被検化
合物で処理した植物からタンパク質を抽出する工程、
（ｃ）抽出したタンパク質において、本発明のタンパク
質量を検出し、被検化合物がこれらタンパク質の発現を
誘導するか否かを判定する工程、（ｄ）本発明のタンパ
ク質の発現を誘導すると判定された化合物を選択する工
程、を含む。用いられる被検化合物としては、特に制限
はなく、人工的に合成されたものであっても、天然由来
であってもよい。被検化合物を用いた植物の処理は、例
えば、水などの液体に被検化合物を希釈して散布する方
法、粉剤として鉱物等と混合して散布する方法、粒剤と
して土壌や水に散布して経根吸収させる方法などがあげ
られるが、被検化合物を植物に吸収させることができれ
ば特に制限はない。被検化合物処理した植物からタンパ
ク質を抽出する方法としては、種々の方法が考えられる
が、例えば、Protein purification（Scopes ed.Spring
er-Verlag）などの方法が挙げられる。植物から抽出し
たタンパク質における本発明のタンパク質の検出は、通
常、本発明のタンパク質に結合する抗体を用いて行う。
具体的な方法としては、ウエスタンブロット法やELISA
法などが挙げられるが、これらに制限されない。検出の
結果、本発明のタンパク質の存在が有意に検出されれ
ば、用いた化合物は、植物に耐病性を付与する活性を有
する化合物の候補であると判定される。本発明のタンパ
ク質の発現を誘導したか否かの判定においては、被検化
合物非処理の対照と比較すると好ましい。

【００２４】植物に耐病性を付与する活性を有する化合
物のスクリーニングには、上記のように本発明のタンパ
ク質を検出してスクリーニングする方法の他に、mRNAの
発現を検出してスクリーニングする方法を適用すること
も可能である。従って、本発明のスクリーニング方法の
他の一つの態様は、（ａ）植物を被検化合物で処理する
工程、（ｂ）被検化合物で処理した植物からmRNAを抽出
する工程、（ｃ）抽出したmRNAにおいて、本発明のタン
パク質をコードするmRNAの量を検出し、被検化合物が該
mRNAの発現を誘導するか否かを判定する工程、（ｄ）該
mRNAの発現を誘導すると判定された化合物を選択する工
程、を含む。mRNAの検出は、本発明のタンパク質をコー
ドするDNAをプローブとしたノーザンブロッティング法
により検出することも可能であり、また、逆転写反応に
よりmRNAからcDNAを合成してサザンブロッティング法に
より検出することも可能である。逆転写したcDNAをポリ
メラーゼ連鎖反応により増幅した増副産物を検出するこ
とも可能である。mRNAの抽出や検出などの一般的な操作
は、例えば、Molecular cloning(Maniatis et al.cold
Spring harbor Laboratry Press)の記載に従って行うこ
とが可能である。

【００２５】以下、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるもので
はない。

【００２６】

【実施例】

[実施例１] 植物材料の育成といもち病抵抗性の検定イネの品種愛知旭を自然光下の温室（25℃）においてポ
ット栽培し、第4または第5葉が形成された時期にプロベ
ナゾール（商品名オリゼメート粒剤、農林水産省登録13
243号、明治製菓社製）を3〜5kg/aの割合で散布するポ
ットと散布しないポットを設けた。散布後0、1、3、6、
9、12日後にそれぞれのポットから葉を採取し、液体窒
素で凍結してRNA調製用にサンプルとした。

【００２７】また、それぞれの採取日にプロベナゾール
処理または未処理の別のポットのイネに愛知旭に罹病性
のいもち菌レース003を接種し、いもち病抵抗性の程度
を検定した。15x10⁴/mlに懸濁したいもち菌15mlを各1ポ
ットに噴霧し、24℃、100％湿度下に24時間置き、温室
に戻して1週間後に過敏感反応の有無と病斑の広がりか
ら抵抗性程度を判定した。なお、過敏感反応とは病原菌
が侵入した細胞の周りの細胞が褐変死して病原菌を封じ
込め、更なる病原菌の増殖、病斑の拡大を抑える現象
で、植物が抵抗性を示す場合にこの反応が起きる。表1
に示すようにプロベナゾール処理したイネでは処理後6
日目から耐病性が誘導された。なお、表中の「−」は抵
抗性を示さないもの、「＋」は抵抗性を示すもの、「＋
＋」は強い抵抗性を示すものを示す。

【００２８】

【表１】 [実施例２] RNAの抽出とディファレンシャルディスプ
レイ採集した葉のサンプル各約2gから「Extract-A Plant RN
A Isolation Kit」（Clontech社製）を用いて全RNAを単
離した。さらに、ディファレンシャルディスプレイ法に
用いる6日目のサンプルは「Message Clean Kit」（Genh
unter社製）を用いたDNase処理を行い、混入するDNAを
除去した。

【００２９】ディファレンシャルディスプレイ法は、
「RNA Inage Kit」（Genhunter社製）を用いて行った。
即ち、プロベナゾール処理後6日目の2種のRNAサンプル
を用いて添付のプロトコールに従って逆転写反応、キッ
トに含まれる3種の3’プライマー（H-T11A、H-T11C、H-
T11G）と13塩基からなる80種の5’任意プライマーの組
み合わせによる240通りのポリメラーゼチェインリアク
ション（PCR）増幅、電気泳動による増幅断片の分離と
検出を行った。また、対照としてプロベナゾール無処理
のものを用いた。すなわち、逆転写反応は、9.4μlの
水、4μlの5xRT buffer、1.6μlの250μM dNTP、2μl
のRNA（濃度は0.1μg/μl)、2μlの2μM 3’プライマ
ーを入れ、混合後65℃に5分間保った。次に、37℃に10
分間保った後、1μl（50U/l）のMMLV逆転写酵素を加
え、さらに50分間保った後、75℃で5分間処理して逆転
写反応液とした。

【００３０】PCR反応は9.2μlの水、2μlの10XPCR buff
er、1.6μlの25μM dNTP、2μlの各5’任意プライマー
プライマー（2μM）、2μlの3’プライマー(2μM)、2μ
lの逆転写反応液、1μlの[α-³⁵S]dATP(1200Ci/mmol
e)、0.2μl(1U）のAmpliTaq(Perkin-Elmer社製)を入れ
て混ぜた後、PCR反応サイクルを行った。PCR反応サイク
ルは、1サイクルが94℃で30秒間、40℃で2分間、72℃で
30秒間で行い、合計40サイクル行った。なお、この反応
は「Perkin-Elmer's 9600」を使い行った。電気泳動に
よるフラグメントの分離は5％ポリアクリルアミドゲル
を用いた。

【００３１】ディファレンシャルディスプレイの結果、
2種のサンプル間で増幅に差の認められた断片55個を「R
NA Inage Kit」（Genhunter社製）のプロトコールに従
ってゲルから回収した。

【００３２】回収した断片はディファレンシャルディス
プレイに用いたプライマーと同じプライマーを用いたPC
Rによって再増幅した。この断片をアガロースゲル電気
泳動で確認後、「QIA Quick Gel Extraction Kit」（QI
AGEN社製）を用いて回収した。

【００３３】[実施例３] 増幅断片をプローブとしたノ
ーザンブロット解析回収断片が実際にプロベナゾール処理によって特異的に
誘導される遺伝子に由来することを確認するために、こ
の断片をプローブとしてノーザンブロット解析を行っ
た。プロベナゾール処理後または未処理のイネ由来の全
RNA各20μgを1％アガロース・ホルムアミドゲルで電気
泳動し、「HybondN+メンブラン」（アマシャム社製）に
転写した。ハイブリダイゼーションと洗浄の条件は、
「HybondN+」のプロトコールに従った。即ち、ハイブリ
ダイゼーションは5xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDS中
で0.02mg/mlサケ精子DNA中で65℃で一晩行った。洗浄は
0.1xSSC、0.1%SDS液中で20分x2回、65℃で行った。回収
断片は「BcaBESTlabeling Kit」（宝酒造社製）と[α-
³²P]dCTPを用いてラベルした。シグナルの検出はイメー
ジアナライザー（富士写真フィルム社製）を用いた。こ
の結果、3’プライマーとして「H-T11G」、5’プライマ
ーとして「H-AP44(AAGCTTCTCCGGA)」（配列番号：3）を
用いて増幅された約270bpの断片（クローンNo.50）をプ
ローブとした場合に、プロベナゾールで誘導される約3.
0kbのシグナルが検出された（図1）。クローンNo.50は
「TA Cloning Kit」（Invitrogen社製）を用いてプラス
ミドにクローニングし、「シークエンサーModel373」
（ABI社製）で塩基配列を決定した。決定した塩基配列
を配列番号：4に示す。1番目から13番目までが用いた
「H-AP44」プライマーに相当し、250番目から261番目ま
でが「H-T11G」プライマーに相当する。

【００３４】[実施例４] 全長cDNAの増幅と塩基配列の
決定クローンNo.50の全長cDNAを得るために、「Marathon cD
NA Amplification kit」（Clontech社製）を用いてクロ
ーンNo.50の5'側と3'側を増幅した。本方法はmRNAからc
DNAを合成し、両端にアダプター配列を付加した後に、
内部の既知の配列とアダプター配列をプライマーとした
PCRによって既知配列の両側の未知のcDNA配列を増幅す
るものである。5'側を増幅するための既知プライマーと
しては「GGCTTGAGAGCTTCCCAATA」（No.50（配列番号：
4）の223番目から204番目）（配列番号：5）を用い、3'
側を増幅するためのプライマーとしては「ACCCTAGTGGCA
CTTGGAAT」（No.50（配列番号：4）の13番目から32番
目）（配列番号：6）を用いた。いずれの場合もアダプ
タープライマーとしては付属の「Marathon cDNA Adapto
r（CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGG
T）」（配列番号：7）を用い、鋳型としては、プロベナ
ゾール処理6日後の愛知旭のRNAを用いた。すべての反応
条件はキットのマニュアルに記載の方法で行った。増幅
された約1.9kbの5'側断片と約1.3kbの3'側断片をそれぞ
れ「TA Cloning Kit」を用いてプラスミドにクローニン
グし、塩基配列を決定した。配列番号：2に両配列を結
合した「RPR1」遺伝子のcDNAの全塩基配列を示す。10番
目から12番目までの「ATG」が翻訳開始コドンである。

【００３５】さらに、5'側のプライマーとして「ATGGAG
GCTGTAATCCTCGCTGTCTCA」（配列番号：2の10番目から36
番目）（配列番号：8）と3'側のプライマーとして「CTA
GTCCTTGACATGCAGCTCTGGAAC」（配列番号：2の2751番目
から2689番目）（配列番号：9）を用いたPCRによってcD
NAのコーディング領域の全長を一つの断片として再増幅
した。鋳型としては、上記の「Marathon cDNA Amplific
ation kit」を利用して合成した逆転写反応産物を用
い、PCRの反応条件は「94℃で30秒、60℃で30秒、72℃
で4分」を30サイクルで行った。増幅産物は「TA Clonin
g Kit」を用いてプラスミドにクローニングした。な
お、クローニングした遺伝子を「rice probenazol resp
onsible 1」（RPR1）遺伝子と命名した。また、このプ
ラスミドを「RPRR1」と命名した。

【００３６】なお、「RPR1」遺伝子を基に推定したアミ
ノ酸配列には、他の耐病性遺伝子等と共通なロイシンリ
ッチリピート構造（556番目から879番目のアミノ酸まで
不完全な23アミノ酸X13回）やヌクレオチド結合部位（1
96番目から204番目：kinase1a、282番目から286番目：k
inase2、293番目から298番目：kinase3a）が認められ
た。また、ホモロジー検索ソフト「blastn(www.ncbi.nl
m.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-brast?Jform=0)」による
解析から、「RPR1」はアラビドプシスの耐病性遺伝子
「RPM1」や「RPS2」と相同性（それぞれスコア264と11
7）を有することが判明した。

【００３７】[実施例5] 種々の植物の獲得抵抗性を誘
導する薬剤による「RPR1」の発現プロベナゾールと同様に植物の獲得抵抗性を誘導する薬
剤である、サリチル酸（SA）またはベンゾチアジアゾー
ル（benzo(1,2,3)thiadiazole-7-carbothionicacid S-m
ethyl ester(BTH)（Friedrich et al.1996））を、実施
例1の場合と同様にして育てたイネに、それぞれ50mMま
たは300μMの濃度でスプレーした。ベンゾチアジアゾー
ルを溶解する場合は、終溶の0.5％容量のアセトンに溶
解した後に水で希釈した。いずれの場合も数滴のTween2
0を展着剤として添加した。散布後0、1、3、6日後にそ
れぞれのポットから葉を採取し、液体窒素で凍結してRN
A調製用サンプルとした。採集した葉のサンプル各約2g
から「Extract-A Plant RNA Isolation Kit」（Clontec
h社製）を用いて全RNAを単離した。得られたRNAを用い
て実施例3と同様にして「RPR1」をプローブとしたノー
ザンブロット解析を行った。図2に示すように、サリチ
ル酸とベンゾチアジアゾールでも「RPR1」は弱く誘導さ
れた。このことから「RPR1」は獲得抵抗性を付与する薬
剤によって特異的に誘導されることが示された。

【００３８】[実施例6] 「RPR1」の発現といもち病抵
抗性プロベナゾール、サリチル酸またはベンゾチアジアゾー
ルで処理したイネ品種愛知旭に、罹病性いもち菌003を
実施例1と同様にして接種して抵抗性の程度を検定し
た。結果を表2に示す。なお、表中の「−」は抵抗性を
示さないもの、「＋」は弱い抵抗性を示すもの、「＋
＋」は抵抗性を示すもの、「＋＋＋」は強い抵抗性を示
すものを示す。

【００３９】

【表２】また、いもち病菌接種5日後に各処理したイネから葉を
採取し、RNAの抽出と「RPR1」遺伝子をプローブとした
ノーザンブロット解析を行った。この結果を図3に示
す。「RPR1」はプロベナゾール、サリチル酸、ベンゾチ
アジアゾールで処理したイネでいもち病菌の接種によっ
てさらに発現量が増大し、かつ、「RPR1」の発現量とい
もち病抵抗性の程度には顕著な相関関係が認められた。
即ち、「RPR1」の発現量の多いプロベナゾールで処理し
たイネでは強いいもち病抵抗性が認められ、次に「RPR
1」の発現量の多いベンゾチアジアゾールで処理したイ
ネではやや強い抵抗性が認められ、「RPR1」の発現量の
少ないサリチル酸処理したイネでは弱い抵抗性が認めら
れた。一方、薬剤処理してないイネでは、「RPR1」遺伝
子の発現もいもち病抵抗性も認められなかった。

【００４０】[実施例7] 「RPR1」の発現と白葉枯れ病
抵抗性プロベナゾールで処理したイネ品種愛知旭に、罹病性白
葉枯れ病菌レースIIを剪葉接種して抵抗性の程度を検定
した。すなわち、第４葉が展開したイネにプロベナゾー
ル処理したポットと処理しないポットを設け、７日後に
白葉枯れ病菌レースIIを10⁸個/mlに懸濁した液に浸けた
はさみで葉の先端から約3cmを切除した。接種５日後
に、各処理を行ったイネの葉からRNAを抽出して「RPR
1」遺伝子をプローブとしたノーザンブロット解析を行
った。結果を図4に示す。プロベナゾール処理をしたイ
ネでは「RPR1」の発現が誘導され、プロベナゾール処理
後に白葉枯れ病菌を接種したイネでは抵抗性反応が起こ
るとともに、「RPR1」の発現量がさらに増大していた。
一方、プロベナゾール処理していないイネでは、白葉枯
れ病菌を接種しても「RPR1」の発現も抵抗性も認められ
なかった。

【００４１】[実施例8] 「RPR1」遺伝子のサザンブロ
ット解析植物からのDNAの抽出はCTAB法（Rogers and Bendich 19
85 Plant Mol. Biol.5:69）で行った。各種DNAは制限酵
素で消化後、1％アガロースゲル電気泳動し、「HybondN
＋メンブラン」（アマシャム社製）に転写した。ハイブ
リダイゼションおよび洗浄の条件は、実施例3と同様に
「HybondN＋」のプロトコールに従った。プローブとし
て「RPR1」遺伝子を「BcaBEST labeling Kit」（宝酒造
社製）と[α-³²P]dCTPを用いてラベルした。シグナルの
検出は実施例3と同様にイメージアナライザー（富士写
真フィルム社製）を用いて行った。

【００４２】愛知旭ゲノムDNAを各種制限酵素で消化し
て「RPR1」をプローブとしたサザンブロット解析を行っ
た（図5）。ほとんどの制限酵素の場合に強いシグナル
が1つ検出されれたことから、「RPR1」は愛知旭のゲノ
ムの中に1コピー存在すると推定された。また、洗浄条
件を弱くすると他にいくつかのシグナルが検出されるこ
とから、愛知旭は相同性のある遺伝子をいくつか持って
いると考えられた。なお、洗浄は、強い洗浄条件として
「0.1xSSC,0.1％SDS,65℃；2x15分」、弱い洗浄条件と
して「1xSSC,0.1％SDS,65℃；2x15分」で行った。

【００４３】イネの品種愛知旭、とりで1号、日本晴、
キヌヒカリ、IR24、IR36、IR8、（各DNA3μg）とトウモ
ロコシのピーターコーン（DNA15μg）、オオムギのはる
な二条（DNA15μg）、トマト（DNA3μg）、アラビドプ
シスの「Wassilewskija（WS）」系統（DNA1μg）を用い
て「RPR1」をプローブとしたサザンブロット解析を行っ
た（図6）。この結果、被検植物のすべてで「RPR1」と
相同性を示す遺伝子のバンドが検出されたが、特にイネ
の愛知旭、日本晴、IR36において「RPR1」または「RPR
1」と極めて高い相同性を示す遺伝子のバンドが検出さ
れた。この事実からイネにおいては品種間で耐病性遺伝
子の構造に差異があることが示唆された。プロベナゾー
ルの効果は品種によらないことが知られているため、植
物への獲得抵抗性の付与には「RPR1」を含めたいくつか
の抵抗性誘導遺伝子の発現が関与していると考えられ
る。また、イネ以外にも調べたトウモロコシ、オオム
ギ、トマト、アラビドプシスのすべてで「RPR1」と相同
性を示すと考えられる遺伝子のバンドが検出されたた
め、「RPR1」遺伝子またはその類似遺伝子は広く植物界
に分布している可能性が示唆された。

【００４４】次に、愛知旭、とりで1号、日本晴、キヌ
ヒカリ、IR24、IR36でのプロベナゾール処理による「RP
R1」の発現をノーザンブロッド解析によって調べた（図
7）。この結果、サザンブロッド解析によって「RPR1」
遺伝子の存在が確認された日本晴、IR36でも愛知旭と同
様にプロベナゾールによるシグナルの誘導が確認され
た。「RPR1」とは多少構造が異なる遺伝子を持つと推測
されたIR36では弱いシグナルが検出された。また、「RP
R1」は根ではプロベナゾール処理した場合でも発現が誘
導されないことが示された。

【００４５】[実施例9] 単離遺伝子のイネへの誘導と
解析「RPR1」をCaMV35Sプロモーターにつなぎ、恒常的に発
現させるためのプラスミドを構築した。すなわち、カリ
フラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを含むプラ
スミド「pBI121」（Clontech社製）を制限酵素Xbalで処
理し、「DNA blunting Kit」で、平滑末端化した。これ
に、EcoRIで切り出し、「DNA bluntingKit」で平滑末端
化した「RPRR1」由来の「RPR1」遺伝子を「DNA ligatio
n Kit」（宝酒造社製）でつないだ。さらに、SacIとBam
HIで処理してGUS遺伝子を除いた後に、「DNA blunting
Kit」で、平滑末端化し、「DNA ligation Kit」でセル
フライゲーションを行わせて発現プラスミド「pKOME1」
（図8）を構築した。

【００４６】「RPR1」を誘導的に発現させるために、病
原菌の感染などによって発現が誘導されるイネのキチナ
ーゼ遺伝子のプロモーターを単離した。イナキチナーゼ
プロモーターはXuら（Plant Mol．Biol．30：387(199
6)）の塩基性キチナーゼ遺伝子の配列を基に合成したプ
ライマー「GCATTGTTAGATCTACGG」（Plant Mol．Biol．3
0：391 Fig.1記載の塩基配列の-895から-878番目）（配
列番号：10）と「GGAGTTAGCTTGCTTGCTGC」（同+36から+
17番目）（配列番号：11）を用いて、愛知旭のゲノムDN
Aを鋳型にしたPCR法によって約900bpを増幅した。PCRの
反応条件は「94℃で10秒、60℃で30秒、72℃で30秒」を
40サイクルで行った。増幅されたプロモーター部位はTA
クローニングキットを用いてクローニングし、プラスミ
ド「pCRChi」を得た。別に、カリフラワーモザイクウイ
ルス35Sプロモーターを含むプラスミドpBI121を制限酵
素XbalとBamHIで処理し、これにXbalとBamHI処理した
「RPRR1」由来の「RPR1」遺伝子を「DNA ligation Ki
t」でつないだ。さらに、SacIとBamHIで処理してGUS遺
伝子を除いた後に、「DNA blunting Kit」で平滑末端化
し、「DNA ligation Kit」でセルフライゲーションを行
わせて「p35S50」を構築した。これをHindIIIとXbalで
処理してカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモータ
ーを除き、HindIIIとXbalでpCRChiから切り出したキチ
ナーゼプロモーターを挿入した。さらにこれをPstIで部
分分解してベクター由来のATG配列を除いた後に、「DNA
ligation Kit」でセルフライゲーションを行わせて発
現プラスミド「pKOME2」（図9）を構築した。

【００４７】これらのプラスミドをアグロバクテリウム
法（Hiei et al．(1994) Plant J．6：271）によってイ
ネ（愛知旭、キヌヒカリ）に導入して形質転換植物体を
得た。アグロバクテリウムは「EHA105」（Hood et al.
1993 Transgenic Res. 2:218）を用いた。選択薬剤とし
ては「G418」（50μg/ml）を用いた。

【００４８】得られたG418耐性イネが導入遺伝子を持つ
ことを確認するために、常法によりDNAを単離し、サザ
ンブロット解析によりプラスミド「p35S50」または「pK
OME2」が導入されていることを確認した。これらの組換
えイネのうち、キヌヒカリに「p35S50」または「pKOME
2」を導入した個体にキヌヒカリに罹病性のイネいもち
病菌レース005を噴霧法と葉鞘検定法により接種して抵
抗性検定を行った。その結果、表3に示すように、「p35
S50」を導入した組換えイネの中から噴霧接種による病
斑が小さい個体が1個体見いだされた。また、「pKOME
2」を導入した2個体は、噴霧接種による抵抗性反応であ
る褐点が認められた。これらの2個体は、葉鞘検定では
抵抗性の場合にのみ見られる過敏感反応による細胞の褐
変が認められた。このことからRPR1遺伝子を導入したイ
ネではいもち病抵抗性が付与されたと考えられた。噴霧
接種による判定は、「0」無病斑、「1」褐点、「2」褐
点中に1mm以下の壊死部、「3」褐点中に2mm以下の壊死
部、「4」4mm以下の病斑、「5」5mm以上の病斑を示す。
葉鞘検定の「-」は過敏感反応（抵抗性反応）なし、
「+」過敏感反応あり、を示す。

【００４９】

【表３】 [実施例10] IR36からのRPR1相同遺伝子の単離実施例8でRPR1と相同性が高いと考えられる遺伝子を持
つことが示唆されたイネ品種IR36から相同遺伝子を単離
するために、RPR1遺伝子の配列をもとに合成したプライ
マーと「Marathon cDNA Amplification kit」（Clontec
h社製）を用いて実施例４と同様にしてcDNA（RPR1ｈ）
を単離した。すなわち、相同遺伝子を３つの部分に分け
て増幅するために、5'側を増幅するためのプライマーと
して「CACAGGTTTGCCCTTCCATCCATATGA」（（配列番号：
2）の1579番目から1605番目）（配列番号：12）と付属
の「Marathon cDNA Adaptor（CTAATACGACTCACTATAGGGCT
CGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT）」（配列番号：7）を用い、真
ん中を増幅するためのプライマーとしては「TGGATGGAAG
GGCAAACCTGTG」（配列番号：2の1584番目から1605番
目）（配列番号：13）と「CTAGTCCTTGACATGCAGCTCTGGAA
C」（配列番号：2の2751番目から2689番目）（配列番
号：9）を用い、３'側を増幅するためのプライマーとし
て「TGGGCAGCTAGGACACTTGAGTAC」（（配列番号：2の226
3番目から2286番目）（配列番5）と付属の「Marathon c
DNA Adaptor（CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCG
GGCAGGT）」（配列番号：7）を用いて実施例４の条件で
PCRを行った。鋳型としては、プロベナゾール処理6日後
のIR36のRNAから「Marathon cDNA Amplification kit」
を利用して合成した逆転写反応産物を用いた。増幅され
た約1.8kbの5'側断片と約1.1kbの中間断片と約0.7kbの
3'側断片は、それぞれ「TA Cloning Kit」を用いてプラ
スミドにクローニングし、塩基配列を決定した。配列番
号：15に各配列を結合した「RPR1h」遺伝子のcDNAの全
塩基配列を、配列番号：14に「RPR1h」タンパク質の推
定アミノ酸配列を示す。

【００５０】さらに、5'側のプライマーとして「ATGGAG
GCTGTAATCCTCGCTGTCTCA」（配列番号：2の10番目から36
番目）（配列番号：8）と3'側のプライマーとして「CTA
GTCCTTGACATGCAGCTCTGGAAC」（配列番号：2の2751番目
から2689番目）（配列番号：9）を用いたPCRによってcD
NAのコーディング領域の全長を一つの断片として再増幅
した。増幅産物は「TA Cloning Kit」を用いてプラスミ
ドにクローニングし、塩基配列を確認した。鋳型として
は、上記の逆転写反応産物を用い、PCRの反応条件は「9
4℃で30秒、60℃で30秒、72℃で4分」を30サイクルで行
った。

【００５１】なお、「RPR1h」遺伝子と「RPR1」遺伝子
の塩基配列の比較を行った結果、「RPR1h」遺伝子は「R
PR1」遺伝子と8塩基の違いが認められた。配列番号：2
の411番目のG、438番目のT、441番目のA、630番目のT、
1149番目のA、1630番目のC、1839番目のA、2726番目のA
が、配列番号：15では、それぞれC、C、C、C、T、A、
C、Tであった。「RPR1h」遺伝子を基に推定したアミノ
酸配列は、「RPR1」と3アミノ酸の違いが認められた。
配列番号：1の134番目のMet、144番目のGln、380番目の
Glnが、配列番号：14では、それぞれIle、His、Hisであ
った。ロイシンリッチリピート構造（542番目から864番
目のアミノ酸まで不完全な23アミノ酸X13回）やヌクレ
オチド結合部位（196番目から204番目：kinase1a、282
番目から286番目：kinase2、293番目から298番目：kina
se3a）は「RPR1h」と「RPR1」で違いは認められなかっ
た。

【００５２】[実施例11] とりで１号からのRPR1相同遺
伝子の単離イネ品種とりで１号からRPR1相同遺伝子を単離するため
に、とりで１号のDNAをSau3AIで部分分解し、「Lambda
DASHII Vector」（Stratagene社）と「GigapackIII Gol
d Packaging kit」（Stratagene社）を用いて取り扱い
説明書に従ってファージゲノミックライブラリーを作成
した。このゲノミックライブラリーを「RPR1」をプロー
ブとしてスクリーニングした。すなわち、説明書にした
がってファージを大腸菌に感染させ、寒天プレート上に
プラークを形成させ、「HybondN+メンブラン」（アマシ
ャム社製）に転写した。このメンブランに対して、「Bc
aBEST labeling Kit」（宝酒造社製）と[α-³²P]dCTPを
用いてラベルした「RPR1」遺伝子をプローブとして「Hy
bondN+メンブラン」の説明書にしたがってプラークハイ
ブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション
は5xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDS中で0.02mg/mlサケ
精子DNA中で65℃で一晩行い、洗浄は弱い条件である1xS
SC、0.1%SDS液中で20分x2回、65℃で行った。その結
果、3つのポジティブクローンを得た。

【００５３】[実施例12] RPR1タンパク質の大腸菌での
生産と抗体作成実施例４で得られたRPR1のコーディング領域全長を含む
プラスミドRPRR1をEcoRIで消化してRPR1のコーディング
領域全長を切り出した。これを「GST gene fusion Vect
ors」（Pharmacia社製）のpGEX-4T-2のEcoRI部位に挿入
することでGSTとRPR1の融合タンパク質の発現ベクター
「pGEXR1-49」を構築した。このプラスミドを大腸菌JM1
09に導入し、「GST gene fusion Vectors」の説明書に
従って融合タンパク質を大腸菌で発現させた。すなわ
ち、pGEXR1-49を持つ大腸菌JM109を100μg/mlのアンピ
シリンを含む100mlのLＢ培地で一晩、37℃で振盪培養
し、これを100μg/mlのアンピシリンを含む900mlのLＢ
培地に加えて3時間、37℃で振盪培養した。0.1mMのIPTG
を添加してさらに3時間培養した。遠心により菌体を集
めた後、これを1％のN-ラウロイルサルコシンナトリウ
ム塩（N-Lauroylsarcosinesodium salt）を含む50mlの
リン酸塩緩衝液（PBS）に懸濁し、温和な超音波処理に
より可溶化した。さらに1％になるようにTritonX-100
を加え、遠心により上澄みを分離した。また、泳動後の
タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、GST Detect
ion Module（Pharmacia社製）を用いて融合タンパク質
を検出した。その結果、約129kDaの融合タンパク質に相
当する位置に強いシグナルが検出されたことから、RPR1
遺伝子産物がGSTとの融合タンパク質として発現してい
ることが確認された。

【００５４】また、RPR1タンパク質の139番目から158番
目までに相当するペプチド（配列番号:16）のN末端にシ
ステインを付加したペプチドに対する抗体を作製した。
ペプチド合成と抗体作製は、日本バイオテスト（東京）
に依頼した。

【００５５】[実施例13] RPR1の抗体を用いた化合物の
スクリーニング RPR1の抗体を用いてRPR1を誘導する化合物のスクリーニ
ングを行った。すなわち、播種後２週間のイネ品種愛知
旭に水、プロベナゾール（商品名オリゼメート粒剤、明
治製菓社製、5kg/a）、フジワン粒剤（日本農薬社製の
いもち病殺菌剤、5kg/a）またはトレボン（三井東圧化
学社製の殺虫剤、5kg/a）を処理した。また、別のイネ
は、50mMのサリチル酸を噴霧処理した。処理７日後の各
処理した葉からマイクロチューブ内でプラスチック棒で
おし潰してPBS可溶蛋白を抽出し、SDS-ポリアクリルア
ミド電気泳動を行った。これをニトロセルロースフィル
ターに転写し、常法によりRPR1抗血清を用いてRPR1蛋白
を検出した。RPR1抗血清は500倍希釈とした。その結
果、プロベナゾール処理したサンプルにおいて103kDa付
近にシグナルが認められた。サリチル酸を処理したサン
プルでも弱いシグナルが認められた。各処理をした残り
のイネにいもち菌レース003を噴霧接種していもち病抵
抗性の程度を検定したところ、プロベナゾール、サリチ
ル酸、フジワンで処理したイネでは病斑形成が抑制され
た。フジワンによる病斑形成の抑制はその殺菌作用によ
ることが考えられた。プロベナゾール、サリチル酸は、
イネ抵抗性を誘導することが知られておりこの場合も獲
得抵抗性を付与していると考えられた。この結果からRP
R1蛋白の発現を指標にして、植物に抵抗性を付与する能
力のある化合物をスクリーニングすることが可能である
ことが示された。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、植物に獲得抵抗性を付与
する薬剤により誘導され、植物に耐病性を付与するタン
パク質、該タンパク質をコードするDNA、該DNAを含むベ
クター、該ベクターを保持する植物細胞、該植物細胞を
含む植物体、該タンパク質に対する抗体、および植物に
耐病性を付与する化合物のスクリーニング方法が提供さ
れた。

【００５７】本発明によれば、広い種類の病原菌に対す
る抵抗性を植物に付与することも可能であり、例えば、
生産性の向上と収量の安定化、農薬使用量の低減化とそ
れによる生産コストと労働時間の低減化や環境に対する
負荷の削減に効果があると期待される。また、耐病性で
あるために有機栽培農法や農薬使用が困難な発展途上国
においても高い収量が確保できると考えられる。また、
本発明は、殺菌活性を持たず、耐性菌ができにくい薬剤
の開発を可能にすると考えられる。

【００５８】

【配列表】（１）出願人氏名又は名称：株式会社三井業際植物バイオ研究所：三井化学株式会社（２）発明の名称：耐病性植物（３）整理番号：Ｍ２−９０２ＤＰ１（４）出願番号：（５）出願日：（６）優先権のもととなった出願をした国名及び出願の番号：日本国平成９年特許願第０９４７９３号（７）優先日：１９９７年３月２７日（８）配列の数：１６配列番号 : 1 配列の長さ : 901 配列の型 : アミノ酸トポロジー : 直鎖状配列の種類 : タンパク質配列 Met Glu Ala Val Ile Leu Ala Val Ser Lys Ile Gly Ser Val 1 5 10 Leu Val Glu Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ile Thr Lys Leu Ser Glu Lys 15 20 25 30 Ala Thr Asn Leu Lys Glu Leu Pro Ser Lys Val Glu Glu Ile Glu Asp 35 40 45 Glu Leu Lys Thr Met Asn Asn Val Ile Lys Gln Met Ser Thr Thr Asn 50 55 60 Leu Thr Asp Glu Val Val Lys Gly Trp Ile Ala Glu Val Arg Gly Leu 65 70 75 Ala His Arg Val Gln Asp Ile Met Asp Lys Tyr Ser Tyr His Ala Leu 80 85 90 Lys Leu Glu Glu Glu Asn Ser Val Lys Lys Leu Phe Thr Thr Pro Asn 95 100 105 110 Tyr Val Thr Val Phe Ser Glu Ile Ala Glu Glu Ile Ser Lys Ile Glu 115 120 125 Lys Lys Ile Glu Asn Val Ala Met Arg Lys Lys Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 Ser Gln His Thr Pro Asn Pro Leu Ala Asp Ile Glu Arg Lys Arg Ser 145 150 155 Gln Asp Cys Leu Leu Ala Pro Asp Asp Leu Val Gly Ile Glu Asp Asn 160 165 170 Arg Lys Leu Leu Thr Asp Trp Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Asp Asn Thr 175 180 185 190 Ile Ile Thr Val Ser Gly Met Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Val 195 200 205 Asn Asn Val Tyr Glu Arg Glu Lys Asn Asn Phe Glu Val Ser Thr Trp 210 215 220 Ile Val Val Ser Gln Ser Tyr Asp Val Val Asp Leu Leu Arg Lys Leu 225 230 235 Leu Arg Lys Ile Val Pro Asp Asp Gln Thr Gln Leu Leu Asp Leu Asp 240 245 250 Ala His Asp Leu Lys Ile Arg Ile Lys Glu Lys Leu Lys Asp Glu Asn 255 260 265 270 Phe Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Arg Glu Ala Tyr Thr Gln 275 280 285 Ile Ala Asp Ala Phe Pro Asn Phe Gln Ala Ser Arg Ile Ile Ile Thr 290 295 300 Thr Arg Gln Gly Asp Val Ala Thr Leu Ala Gln Ser Ala Arg Gln Leu 305 310 315 Lys Leu Asn Pro Leu Glu His Thr Asp Ala Leu Glu Leu Phe Cys Arg 320 325 330 Arg Ala Phe Tyr Arg Asn Cys Lys Cys Pro Gln Asn Leu Glu Lys Leu 335 340 345 350 Thr Asn Asp Ile Val Val Arg Cys Gln Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val 355 360 365 Ser Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ser Leu Pro Pro Glu Asn Gln Val Trp 370 375 380 Asn Glu Thr Tyr Lys Gln Leu Arg Ser Glu Leu Thr Lys Asn Asn Asn 385 390 395 Val Gln Ala Ile Leu Asn Met Ser Tyr His Asp Leu Pro Gly Asp Leu 400 405 410 Arg Asn Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Leu Phe Pro Glu Asp His Glu Leu 415 420 425 430 Ser Arg Glu Thr Val Val Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Ala Val 435 440 445 Gln Asn Glu Glu Asn Thr Pro Glu Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Arg 450 455 460 Glu Leu Ile Gln Arg Asn Met Leu Glu Val Leu Gly Asn Asp Glu Leu 465 470 475 Gly Arg Val Ser Thr Phe Lys Met His Asp Leu Val Arg Asp Leu Ala 480 485 490 Leu Ser Ile Ala Lys Glu Glu Lys Phe Gly Ser Ala Asn Asn Tyr Asp 495 500 505 510 Thr Met Glu Arg Met Asp Lys Glu Val Arg Arg Leu Ser Ser Tyr Gly 515 520 525 Trp Lys Gly Lys Pro Val Leu Gln Val Lys Phe Met Arg Leu Arg Thr 530 535 540 Leu Val Ala Leu Gly Met Lys Thr Pro Ser Arg His Met Leu Ser Ser 545 550 555 Ile Leu Ser Glu Ser Asn Tyr Leu Thr Val Leu Glu Leu Gln Asp Ser 560 565 570 Glu Ile Thr Glu Val Pro Ala Ser Ile Gly Glu Leu Phe Asn Leu Arg 575 580 585 590 Tyr Ile Gly Leu Gln Arg Thr Arg Val Lys Ser Leu Pro Glu Ser Ile 595 600 605 Gly Lys Leu Ser Ser Leu Leu Thr Leu Asn Ile Lys Gln Thr Lys Ile 610 615 620 Gln Lys Leu Pro Gln Ser Ile Val Lys Ile Lys Lys Leu Arg His Leu 625 630 635 Leu Ala Asp Arg Tyr Glu Asp Glu Lys Gln Ser Ala Phe Arg Tyr Phe 640 645 650 Ile Gly Met Gln Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Leu Gln 655 660 665 670 Thr Leu Glu Thr Val Glu Ala Ser Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Met 675 680 685 Lys Leu Met Gln Leu Arg Ser Val Trp Ile Asp Asn Ile Arg Thr Asp 690 695 700 Asp Cys Ala Asn Leu Phe Ala Thr Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Ser 705 710 715 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ser His Glu Asn Glu Thr Leu Cys Leu Glu 720 725 730 Ala Leu Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu His Arg Leu Ile Val Arg Gly 735 740 745 750 Cys Trp Ala Ala Arg Thr Leu Glu Tyr Pro Ile Phe Arg Asp His Gly 755 760 765 Lys Asn Ile Lys Tyr Leu Ala Ile Ser Trp Cys Arg Leu Gln Glu Asp 770 775 780 Pro Leu Leu Leu Leu Ala Pro Tyr Val Pro Asn Leu Val Phe Leu Ser 785 790 795 Leu Asn Arg Val Asn Ser Ala Ser Thr Leu Val Leu Ser Ala Asp Cys 800 805 810 Phe Pro Gln Leu Lys Thr Leu Val Leu Lys Arg Met Pro Asp Val Asn 815 820 825 830 His Leu Glu Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gln His Ile Glu Gly Leu Tyr 835 840 845 Val Val Ser Leu Pro Lys Leu Asp Asn Val Pro Gln Gly Ile Glu Ser 850 855 860 Leu Arg Tyr Leu Lys Lys Leu Trp Leu Leu Gly Leu His Lys Asn Phe 865 870 875 Arg Ser Gln Trp Gln Lys Asn Gly Met His Gln Lys Met Gln His Val 880 885 890 Pro Glu Leu His Val Lys Asp 895 900 配列番号 : 2 配列の長さ : 2996 配列の型 : 核酸鎖の数 : 二本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 10 .. 2712 特徴を決定した方法 : E 配列 TCAGCACAC ATG GAG GCT GTA ATC CTC GCT GTC TCA AAG ATT GGT TCT GTT 51 Met Glu Ala Val Ile Leu Ala Val Ser Lys Ile Gly Ser Val 1 5 10 TTA GTG GAG GAA GCC ACC AAA GCT GCT ATA ACC AAG CTA TCT GAA AAA 99 Leu Val Glu Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ile Thr Lys Leu Ser Glu Lys 15 20 25 30 GCT ACA AAT CTT AAG GAA CTG CCA TCA AAG GTT GAG GAA ATA GAG GAT 147 Ala Thr Asn Leu Lys Glu Leu Pro Ser Lys Val Glu Glu Ile Glu Asp 35 40 45 GAA CTG AAG ACG ATG AAC AAT GTT ATA AAA CAG ATG AGT ACA ACA AAT 195 Glu Leu Lys Thr Met Asn Asn Val Ile Lys Gln Met Ser Thr Thr Asn 50 55 60 CTT ACA GAC GAG GTT GTC AAG GGT TGG ATT GCA GAG GTG CGA GGT CTG 243 Leu Thr Asp Glu Val Val Lys Gly Trp Ile Ala Glu Val Arg Gly Leu 65 70 75 GCC CAC CGT GTT CAG GAC ATA ATG GAC AAA TAT TCA TAC CAT GCT CTT 291 Ala His Arg Val Gln Asp Ile Met Asp Lys Tyr Ser Tyr His Ala Leu 80 85 90 AAA TTG GAA GAA GAA AAT TCT GTC AAG AAA CTC TTC ACC ACA CCG AAT 339 Lys Leu Glu Glu Glu Asn Ser Val Lys Lys Leu Phe Thr Thr Pro Asn 95 100 105 110 TAT GTC ACG GTT TTC AGT GAA ATT GCT GAA GAG ATT AGC AAG ATA GAG 387 Tyr Val Thr Val Phe Ser Glu Ile Ala Glu Glu Ile Ser Lys Ile Glu 115 120 125 AAA AAA ATT GAA AAT GTT GCA ATG CGG AAA AAA CGG TGG CAG CAG CAG 435 Lys Lys Ile Glu Asn Val Ala Met Arg Lys Lys Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 TCT CAA CAC ACT CCC AAT CCG CTT GCA GAT ATT GAA AGG AAA CGG TCC 483 Ser Gln His Thr Pro Asn Pro Leu Ala Asp Ile Glu Arg Lys Arg Ser 145 150 155 CAA GAC TGC CTT CTA GCT CCA GAT GAT CTA GTT GGG ATA GAA GAC AAC 531 Gln Asp Cys Leu Leu Ala Pro Asp Asp Leu Val Gly Ile Glu Asp Asn 160 165 170 AGG AAA CTG TTG ACT GAC TGG TTG TAC TCC AAA GAG CAA GAT AAC ACA 579 Arg Lys Leu Leu Thr Asp Trp Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Asp Asn Thr 175 180 185 190 ATA ATA ACA GTA TCT GGT ATG GGT GGA TTG GGG AAA ACC ACC CTG GTC 627 Ile Ile Thr Val Ser Gly Met Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Val 195 200 205 AAT AAT GTA TAT GAG CGG GAG AAG AAC AAT TTC GAA GTT AGT ACT TGG 675 Asn Asn Val Tyr Glu Arg Glu Lys Asn Asn Phe Glu Val Ser Thr Trp 210 215 220 ATT GTC GTG TCA CAG TCA TAT GAT GTC GTT GAT TTG CTG AGG AAA TTG 723 Ile Val Val Ser Gln Ser Tyr Asp Val Val Asp Leu Leu Arg Lys Leu 225 230 235 CTT AGG AAG ATT GTG CCT GAT GAT CAA ACA CAG CTA TTA GAT TTG GAT 771 Leu Arg Lys Ile Val Pro Asp Asp Gln Thr Gln Leu Leu Asp Leu Asp 240 245 250 GCT CAT GAC TTG AAA ATT AGA ATA AAG GAA AAG CTT AAG GAT GAA AAT 819 Ala His Asp Leu Lys Ile Arg Ile Lys Glu Lys Leu Lys Asp Glu Asn 255 260 265 270 TTT CTA ATT GTA TTG GAT GAT GTC TGG AAC CGA GAA GCA TAC ACT CAA 867 Phe Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Arg Glu Ala Tyr Thr Gln 275 280 285 ATA GCA GAT GCA TTC CCA AAC TTC CAA GCA AGT CGC ATA ATC ATC ACA 915 Ile Ala Asp Ala Phe Pro Asn Phe Gln Ala Ser Arg Ile Ile Ile Thr 290 295 300 ACA CGA CAG GGT GAT GTA GCA ACT CTT GCT CAG TCA GCA CGC CAA CTC 963 Thr Arg Gln Gly Asp Val Ala Thr Leu Ala Gln Ser Ala Arg Gln Leu 305 310 315 AAA CTC AAC CCA TTG GAG CAC ACT GAC GCG CTT GAA CTC TTC TGT AGA 1011 Lys Leu Asn Pro Leu Glu His Thr Asp Ala Leu Glu Leu Phe Cys Arg 320 325 330 AGG GCT TTC TAC AGA AAC TGC AAG TGT CCA CAG AAC CTT GAG AAA CTG 1059 Arg Ala Phe Tyr Arg Asn Cys Lys Cys Pro Gln Asn Leu Glu Lys Leu 335 340 345 350 ACT AAT GAT ATA GTA GTT AGG TGC CAA GGT CTG CCA CTG GCA ATC GTA 1107 Thr Asn Asp Ile Val Val Arg Cys Gln Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val 355 360 365 TCT ATA GGT GGC CTA TTG TCT TCA TTG CCA CCA GAG AAT CAA GTC TGG 1155 Ser Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ser Leu Pro Pro Glu Asn Gln Val Trp 370 375 380 AAT GAA ACA TAC AAG CAA CTT CGA AGT GAG CTC ACA AAA AAC AAT AAT 1203 Asn Glu Thr Tyr Lys Gln Leu Arg Ser Glu Leu Thr Lys Asn Asn Asn 385 390 395 GTT CAA GCA ATT CTA AAT ATG AGC TAT CAT GAC TTA CCG GGA GAT CTT 1251 Val Gln Ala Ile Leu Asn Met Ser Tyr His Asp Leu Pro Gly Asp Leu 400 405 410 AGA AAC TGC TTC TTG TAT TGT AGC CTG TTC CCC GAA GAT CAT GAA TTA 1299 Arg Asn Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Leu Phe Pro Glu Asp His Glu Leu 415 420 425 430 TCA CGT GAG ACC GTT GTA CGG TTG TGG GTC GCA GAA GGG TTT GCA GTA 1347 Ser Arg Glu Thr Val Val Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Ala Val 435 440 445 CAA AAT GAA GAA AAC ACA CCA GAG GAG GTG GCT GAA AAA TAT CTT CGT 1395 Gln Asn Glu Glu Asn Thr Pro Glu Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Arg 450 455 460 GAA TTG ATA CAA AGG AAT ATG TTG GAA GTT CTT GGA AAT GAT GAG CTA 1443 Glu Leu Ile Gln Arg Asn Met Leu Glu Val Leu Gly Asn Asp Glu Leu 465 470 475 GGC AGG GTT AGT ACC TTT AAG ATG CAT GAC CTC GTG CGG GAC CTG GCT 1491 Gly Arg Val Ser Thr Phe Lys Met His Asp Leu Val Arg Asp Leu Ala 480 485 490 CTT TCT ATT GCT AAA GAG GAG AAG TTC GGC TCT GCA AAT AAT TAT GAC 1539 Leu Ser Ile Ala Lys Glu Glu Lys Phe Gly Ser Ala Asn Asn Tyr Asp 495 500 505 510 ACT ATG GAG AGG ATG GAT AAG GAA GTT CGT CGC TTG TCA TCA TAT GGA 1587 Thr Met Glu Arg Met Asp Lys Glu Val Arg Arg Leu Ser Ser Tyr Gly 515 520 525 TGG AAG GGC AAA CCT GTG TTG CAA GTT AAA TTC ATG CGT CTC CGG ACC 1635 Trp Lys Gly Lys Pro Val Leu Gln Val Lys Phe Met Arg Leu Arg Thr 530 535 540 CTA GTG GCA CTT GGA ATG AAA ACA CCC TCT CGT CAC ATG TTA TCC TCA 1683 Leu Val Ala Leu Gly Met Lys Thr Pro Ser Arg His Met Leu Ser Ser 545 550 555 ATT TTG TCT GAA TCC AAC TAT CTT ACT GTT CTC GAG TTG CAA GAT TCT 1731 Ile Leu Ser Glu Ser Asn Tyr Leu Thr Val Leu Glu Leu Gln Asp Ser 560 565 570 GAA ATA ACT GAA GTG CCA GCA TCC ATA GGA GAG CTA TTT AAT CTA CGC 1779 Glu Ile Thr Glu Val Pro Ala Ser Ile Gly Glu Leu Phe Asn Leu Arg 575 580 585 590 TAC ATC GGC CTG CAG CGC ACT AGA GTC AAA TCA CTT CCA GAA TCT ATT 1827 Tyr Ile Gly Leu Gln Arg Thr Arg Val Lys Ser Leu Pro Glu Ser Ile 595 600 605 GGG AAG CTC TCA AGC CTC CTG ACT CTC AAC ATC AAG CAA ACC AAA ATA 1875 Gly Lys Leu Ser Ser Leu Leu Thr Leu Asn Ile Lys Gln Thr Lys Ile 610 615 620 CAA AAG CTA CCA CAA AGC ATT GTT AAG ATT AAG AAG CTG AGG CAC CTT 1923 Gln Lys Leu Pro Gln Ser Ile Val Lys Ile Lys Lys Leu Arg His Leu 625 630 635 CTA GCT GAC AGA TAT GAA GAC GAG AAG CAG TCA GCG TTT CGC TAT TTC 1971 Leu Ala Asp Arg Tyr Glu Asp Glu Lys Gln Ser Ala Phe Arg Tyr Phe 640 645 650 ATT GGA ATG CAA GCA CCC AAA GAG CTA TCC AAC TTG GAA GAA CTC CAG 2019 Ile Gly Met Gln Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Leu Gln 655 660 665 670 ACC CTT GAG ACT GTG GAA GCC AGC AAA GAA TTG GCT GAG CAG TTG ATG 2067 Thr Leu Glu Thr Val Glu Ala Ser Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Met 675 680 685 AAA CTT ATG CAA CTA CGG AGC GTG TGG ATT GAC AAC ATA AGA ACT GAT 2115 Lys Leu Met Gln Leu Arg Ser Val Trp Ile Asp Asn Ile Arg Thr Asp 690 695 700 GAT TGT GCA AAT CTT TTT GCT ACA CTA TCA AAG ATG CCA CTT CTT TCC 2163 Asp Cys Ala Asn Leu Phe Ala Thr Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Ser 705 710 715 AGC TTG CTT CTA TCT GCA AGT CAT GAA AAC GAG ACA CTT TGC TTG GAA 2211 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ser His Glu Asn Glu Thr Leu Cys Leu Glu 720 725 730 GCT CTC AAA CCA GAA TCA GAG GAG CTT CAT AGG CTG ATT GTC AGA GGG 2259 Ala Leu Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu His Arg Leu Ile Val Arg Gly 735 740 745 750 TGC TGG GCA GCT AGG ACA CTT GAG TAC CCA ATA TTT CGT GAC CAT GGG 2307 Cys Trp Ala Ala Arg Thr Leu Glu Tyr Pro Ile Phe Arg Asp His Gly 755 760 765 AAA AAT ATC AAG TAT CTG GCC ATA AGC TGG TGC CGT CTT CAG GAA GAT 2355 Lys Asn Ile Lys Tyr Leu Ala Ile Ser Trp Cys Arg Leu Gln Glu Asp 770 775 780 CCT CTA CTC CTC CTT GCA CCC TAT GTG CCA AAC CTT GTC TTT CTT AGC 2403 Pro Leu Leu Leu Leu Ala Pro Tyr Val Pro Asn Leu Val Phe Leu Ser 785 790 795 CTT AAC AGG GTG AAT AGT GCA AGC ACC TTG GTT CTT TCT GCA GAT TGC 2451 Leu Asn Arg Val Asn Ser Ala Ser Thr Leu Val Leu Ser Ala Asp Cys 800 805 810 TTC CCT CAG CTG AAG ACA CTT GTC TTG AAG CGT ATG CCT GAT GTA AAC 2499 Phe Pro Gln Leu Lys Thr Leu Val Leu Lys Arg Met Pro Asp Val Asn 815 820 825 830 CAC TTG GAG ATT ATA GGC GGT GCC CTC CAA CAC ATT GAA GGT TTA TAT 2547 His Leu Glu Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gln His Ile Glu Gly Leu Tyr 835 840 845 GTT GTG TCA TTG CCA AAG TTG GAC AAT GTC CCT CAA GGC ATT GAG TCT 2595 Val Val Ser Leu Pro Lys Leu Asp Asn Val Pro Gln Gly Ile Glu Ser 850 855 860 CTT AGG TAT CTG AAG AAG CTG TGG CTC TTG GGT CTG CAT AAG AAT TTC 2643 Leu Arg Tyr Leu Lys Lys Leu Trp Leu Leu Gly Leu His Lys Asn Phe 865 870 875 AGG TCT CAG TGG CAA AAA AAT GGA ATG CAC CAA AAG ATG CAA CAT GTT 2691 Arg Ser Gln Trp Gln Lys Asn Gly Met His Gln Lys Met Gln His Val 880 885 890 CCA GAG CTG CAT GTC AAG GAC TAGAAACTTT GCTAACTTTT GCAGTATTAT 2742 Pro Glu Leu His Val Lys Asp 895 900 TTCTGTCTGG TGATTATGGG CTCAGCCACA TTATGCATTT AGTCTTTTCC AACAAATGAT 2802 CAGTTTATGA CAGATGAGCT AGCGGCACCA CTACATCGCA ACCTCGTTAT TGGAAATAAG 2862 TCCTGAAATA TTGGCTTTCA TGGCCATCAG GAAACTACTT TGTCATATGT CCTATTGTTT 2922 TTGCTTCACA ACTTTGCAGA ATTTATGAAA CTGGTCCTTT TATTGTTGAT AAAAAAAAAA 2982 AAAAAAAAAA AAAA 2996 配列番号 : 3 配列の長さ : 13 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 AAGCTTCTCC GGA 13 配列番号 : 4 配列の長さ : 264 配列の型 : 核酸鎖の数 : 二本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : cDNA to mRNA 配列 AAGCTTCTCC GGACCCTAGT GGCACTTGGA ATGAAAACAC CCTCTCGTCA CATGTTATCC 60 TCAATTTTGT CTGAATCCAA CTATCTTACT GTTCTCGAGT TGCAAGATTC TGAAATAACT 120 GAAGTGCCAG CATCCATAGG AGAGCTATTT AATCTACGCT ACATCGGCCT GCAGCGCACT 180 AGAGTCAAAT CACTTCCAGA ATCTATTGGG AAGCTCTCAA GCCTCCTGAC TCTCAACATC 240 AAGCAAACCA AAAAAAAAAA GCTT 264 配列番号 : 5 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 GGCTTGAGAG CTTCCCAATA 20 配列番号 : 6 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 ACCCTAGTGG CACTTGGAAT 20 配列番号 : 7 配列の長さ : 44 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT 44 配列番号 : 8 配列の長さ : 27 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 ATGGAGGCTG TAATCCTCGC TGTCTCA 27 配列番号 : 9 配列の長さ : 27 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 CTAGTCCTTG ACATGCAGCT CTGGAAC 27 配列番号 : 10 配列の長さ : 18 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 GCATTGTTAG ATCTACGG 18 配列番号 : 11 配列の長さ : 20 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 GGAGTTAGCT TGCTTGCTGC 20 配列番号 : 12 配列の長さ : 27 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 CACAGGTTTG CCCTTCCATC CATATGA 27 配列番号 : 13 配列の長さ : 22 配列の型 : 核酸鎖の数 : 一本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : 他の核酸合成DNA 配列 TGGATGGAAG GGCAAACCTG TG 22 配列番号 : 14 配列の長さ : 901 配列の型 : アミノ酸トポロジー : 直鎖状配列の種類 : タンパク質配列 Met Glu Ala Val Ile Leu Ala Val Ser Lys Ile Gly Ser Val 1 5 10 Leu Val Glu Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ile Thr Lys Leu Ser Glu Lys 15 20 25 30 Ala Thr Asn Leu Lys Glu Leu Pro Ser Lys Val Glu Glu Ile Glu Asp 35 40 45 Glu Leu Lys Thr Met Asn Asn Val Ile Lys Gln Met Ser Thr Thr Asn 50 55 60 Leu Thr Asp Glu Val Val Lys Gly Trp Ile Ala Glu Val Arg Gly Leu 65 70 75 Ala His Arg Val Gln Asp Ile Met Asp Lys Tyr Ser Tyr His Ala Leu 80 85 90 Lys Leu Glu Glu Glu Asn Ser Val Lys Lys Leu Phe Thr Thr Pro Asn 95 100 105 110 Tyr Val Thr Val Phe Ser Glu Ile Ala Glu Glu Ile Ser Lys Ile Glu 115 120 125 Lys Lys Ile Glu Asn Val Ala Thr Arg Lys Lys Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 Ser His His Thr Pro Asn Pro Leu Ala Asp Ile Glu Arg Lys Arg Ser 145 150 155 Gln Asp Cys Leu Leu Ala Pro Asp Asp Leu Val Gly Ile Glu Asp Asn 160 165 170 Arg Lys Leu Leu Thr Asp Trp Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Asp Asn Thr 175 180 185 190 Ile Ile Thr Val Ser Gly Met Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Val 195 200 205 Asn Asn Val Tyr Glu Arg Glu Lys Asn Asn Phe Glu Val Ser Thr Trp 210 215 220 Ile Val Val Ser Gln Ser Tyr Asp Val Val Asp Leu Leu Arg Lys Leu 225 230 235 Leu Arg Lys Ile Val Pro Asp Asp Gln Thr Gln Leu Leu Asp Leu Asp 240 245 250 Ala His Asp Leu Lys Ile Arg Ile Lys Glu Lys Leu Lys Asp Glu Asn 255 260 265 270 Phe Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Arg Glu Ala Tyr Thr Gln 275 280 285 Ile Ala Asp Ala Phe Pro Asn Phe Gln Ala Ser Arg Ile Ile Ile Thr 290 295 300 Thr Arg Gln Gly Asp Val Ala Thr Leu Ala Gln Ser Ala Arg Gln Leu 305 310 315 Lys Leu Asn Pro Leu Glu His Thr Asp Ala Leu Glu Leu Phe Cys Arg 320 325 330 Arg Ala Phe Tyr Arg Asn Cys Lys Cys Pro Gln Asn Leu Glu Lys Leu 335 340 345 350 Thr Asn Asp Ile Val Val Arg Cys Gln Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val 355 360 365 Ser Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ser Leu Pro Pro Glu Asn His Val Trp 370 375 380 Asn Glu Thr Tyr Lys Gln Leu Arg Ser Glu Leu Thr Lys Asn Asn Asn 385 390 395 Val Gln Ala Ile Leu Asn Met Ser Tyr His Asp Leu Pro Gly Asp Leu 400 405 410 Arg Asn Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Leu Phe Pro Glu Asp His Glu Leu 415 420 425 430 Ser Arg Glu Thr Val Val Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Ala Val 435 440 445 Gln Asn Glu Glu Asn Thr Pro Glu Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Arg 450 455 460 Glu Leu Ile Gln Arg Asn Met Leu Glu Val Leu Gly Asn Asp Glu Leu 465 470 475 Gly Arg Val Ser Thr Phe Lys Met His Asp Leu Val Arg Asp Leu Ala 480 485 490 Leu Ser Ile Ala Lys Glu Glu Lys Phe Gly Ser Ala Asn Asn Tyr Asp 495 500 505 510 Thr Met Glu Arg Met Asp Lys Glu Val Arg Arg Leu Ser Ser Tyr Gly 515 520 525 Trp Lys Gly Lys Pro Val Leu Gln Val Lys Phe Met Arg Leu Arg Thr 530 535 540 Leu Val Ala Leu Gly Met Lys Thr Pro Ser Arg His Met Leu Ser Ser 545 550 555 Ile Leu Ser Glu Ser Asn Tyr Leu Thr Val Leu Glu Leu Gln Asp Ser 560 565 570 Glu Ile Thr Glu Val Pro Ala Ser Ile Gly Glu Leu Phe Asn Leu Arg 575 580 585 590 Tyr Ile Gly Leu Gln Arg Thr Arg Val Lys Ser Leu Pro Glu Ser Ile 595 600 605 Gly Lys Leu Ser Ser Leu Leu Thr Leu Asn Ile Lys Gln Thr Lys Ile 610 615 620 Gln Lys Leu Pro Gln Ser Ile Val Lys Ile Lys Lys Leu Arg His Leu 625 630 635 Leu Ala Asp Arg Tyr Glu Asp Glu Lys Gln Ser Ala Phe Arg Tyr Phe 640 645 650 Ile Gly Met Gln Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Leu Gln 655 660 665 670 Thr Leu Glu Thr Val Glu Ala Ser Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Met 675 680 685 Lys Leu Met Gln Leu Arg Ser Val Trp Ile Asp Asn Ile Arg Thr Asp 690 695 700 Asp Cys Ala Asn Leu Phe Ala Thr Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Ser 705 710 715 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ser His Glu Asn Glu Thr Leu Cys Leu Glu 720 725 730 Ala Leu Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu His Arg Leu Ile Val Arg Gly 735 740 745 750 Cys Trp Ala Ala Arg Thr Leu Glu Tyr Pro Ile Phe Arg Asp His Gly 755 760 765 Lys Asn Ile Lys Tyr Leu Ala Ile Ser Trp Cys Arg Leu Gln Glu Asp 770 775 780 Pro Leu Leu Leu Leu Ala Pro Tyr Val Pro Asn Leu Val Phe Leu Ser 785 790 795 Leu Asn Arg Val Asn Ser Ala Ser Thr Leu Val Leu Ser Ala Asp Cys 800 805 810 Phe Pro Gln Leu Lys Thr Leu Val Leu Lys Arg Met Pro Asp Val Asn 815 820 825 830 His Leu Glu Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gln His Ile Glu Gly Leu Tyr 835 840 845 Val Val Ser Leu Pro Lys Leu Asp Asn Val Pro Gln Gly Ile Glu Ser 850 855 860 Leu Arg Tyr Leu Lys Lys Leu Trp Leu Leu Gly Leu His Lys Asn Phe 865 870 875 Arg Ser Gln Trp Gln Lys Asn Gly Met His Gln Lys Met Gln His Val 880 885 890 Pro Glu Leu His Val Lys Asp 895 900 配列番号 : 15 配列の長さ : 2996 配列の型 : 核酸鎖の数 : 二本鎖トポロジー : 直鎖状配列の種類 : cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号 : CDS 存在位置 : 10 .. 2712 特徴を決定した方法 : E 配列 TCAGCACAC ATG GAG GCT GTA ATC CTC GCT GTC TCA AAG ATT GGT TCT GTT 51 Met Glu Ala Val Ile Leu Ala Val Ser Lys Ile Gly Ser Val 1 5 10 TTA GTG GAG GAA GCC ACC AAA GCT GCT ATA ACC AAG CTA TCT GAA AAA 99 Leu Val Glu Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ile Thr Lys Leu Ser Glu Lys 15 20 25 30 GCT ACA AAT CTT AAG GAA CTG CCA TCA AAG GTT GAG GAA ATA GAG GAT 147 Ala Thr Asn Leu Lys Glu Leu Pro Ser Lys Val Glu Glu Ile Glu Asp 35 40 45 GAA CTG AAG ACG ATG AAC AAT GTT ATA AAA CAG ATG AGT ACA ACA AAT 195 Glu Leu Lys Thr Met Asn Asn Val Ile Lys Gln Met Ser Thr Thr Asn 50 55 60 CTT ACA GAC GAG GTT GTC AAG GGT TGG ATT GCA GAG GTG CGA GGT CTG 243 Leu Thr Asp Glu Val Val Lys Gly Trp Ile Ala Glu Val Arg Gly Leu 65 70 75 GCC CAC CGT GTT CAG GAC ATA ATG GAC AAA TAT TCA TAC CAT GCT CTT 291 Ala His Arg Val Gln Asp Ile Met Asp Lys Tyr Ser Tyr His Ala Leu 80 85 90 AAA TTG GAA GAA GAA AAT TCT GTC AAG AAA CTC TTC ACC ACA CCG AAT 339 Lys Leu Glu Glu Glu Asn Ser Val Lys Lys Leu Phe Thr Thr Pro Asn 95 100 105 110 TAT GTC ACG GTT TTC AGT GAA ATT GCT GAA GAG ATT AGC AAG ATA GAG 387 Tyr Val Thr Val Phe Ser Glu Ile Ala Glu Glu Ile Ser Lys Ile Glu 115 120 125 AAA AAA ATT GAA AAT GTT GCA ACG CGG AAA AAA CGG TGG CAG CAG CAG 435 Lys Lys Ile Glu Asn Val Ala Thr Arg Lys Lys Arg Trp Gln Gln Gln 130 135 140 TCC CAC CAC ACT CCC AAT CCG CTT GCA GAT ATT GAA AGG AAA CGG TCC 483 Ser His His Thr Pro Asn Pro Leu Ala Asp Ile Glu Arg Lys Arg Ser 145 150 155 CAA GAC TGC CTT CTA GCT CCA GAT GAT CTA GTT GGG ATA GAA GAC AAC 531 Gln Asp Cys Leu Leu Ala Pro Asp Asp Leu Val Gly Ile Glu Asp Asn 160 165 170 AGG AAA CTG TTG ACT GAC TGG TTG TAC TCC AAA GAG CAA GAT AAC ACA 579 Arg Lys Leu Leu Thr Asp Trp Leu Tyr Ser Lys Glu Gln Asp Asn Thr 175 180 185 190 ATA ATA ACA GTA TCT GGT ATG GGT GGA TTG GGG AAA ACC ACC CTG GTC 627 Ile Ile Thr Val Ser Gly Met Gly Gly Leu Gly Lys Thr Thr Leu Val 195 200 205 AAC AAT GTA TAT GAG CGG GAG AAG AAC AAT TTC GAA GTT AGT ACT TGG 675 Asn Asn Val Tyr Glu Arg Glu Lys Asn Asn Phe Glu Val Ser Thr Trp 210 215 220 ATT GTC GTG TCA CAG TCA TAT GAT GTC GTT GAT TTG CTG AGG AAA TTG 723 Ile Val Val Ser Gln Ser Tyr Asp Val Val Asp Leu Leu Arg Lys Leu 225 230 235 CTT AGG AAG ATT GTG CCT GAT GAT CAA ACA CAG CTA TTA GAT TTG GAT 771 Leu Arg Lys Ile Val Pro Asp Asp Gln Thr Gln Leu Leu Asp Leu Asp 240 245 250 GCT CAT GAC TTG AAA ATT AGA ATA AAG GAA AAG CTT AAG GAT GAA AAT 819 Ala His Asp Leu Lys Ile Arg Ile Lys Glu Lys Leu Lys Asp Glu Asn 255 260 265 270 TTT CTA ATT GTA TTG GAT GAT GTC TGG AAC CGA GAA GCA TAC ACT CAA 867 Phe Leu Ile Val Leu Asp Asp Val Trp Asn Arg Glu Ala Tyr Thr Gln 275 280 285 ATA GCA GAT GCA TTC CCA AAC TTC CAA GCA AGT CGC ATA ATC ATC ACA 915 Ile Ala Asp Ala Phe Pro Asn Phe Gln Ala Ser Arg Ile Ile Ile Thr 290 295 300 ACA CGA CAG GGT GAT GTA GCA ACT CTT GCT CAG TCA GCA CGC CAA CTC 963 Thr Arg Gln Gly Asp Val Ala Thr Leu Ala Gln Ser Ala Arg Gln Leu 305 310 315 AAA CTC AAC CCA TTG GAG CAC ACT GAC GCG CTT GAA CTC TTC TGT AGA 1011 Lys Leu Asn Pro Leu Glu His Thr Asp Ala Leu Glu Leu Phe Cys Arg 320 325 330 AGG GCT TTC TAC AGA AAC TGC AAG TGT CCA CAG AAC CTT GAG AAA CTG 1059 Arg Ala Phe Tyr Arg Asn Cys Lys Cys Pro Gln Asn Leu Glu Lys Leu 335 340 345 350 ACT AAT GAT ATA GTA GTT AGG TGC CAA GGT CTG CCA CTG GCA ATC GTA 1107 Thr Asn Asp Ile Val Val Arg Cys Gln Gly Leu Pro Leu Ala Ile Val 355 360 365 TCT ATA GGT GGC CTA TTG TCT TCA TTG CCA CCA GAG AAT CAT GTC TGG 1155 Ser Ile Gly Gly Leu Leu Ser Ser Leu Pro Pro Glu Asn His Val Trp 370 375 380 AAT GAA ACA TAC AAG CAA CTT CGA AGT GAG CTC ACA AAA AAC AAT AAT 1203 Asn Glu Thr Tyr Lys Gln Leu Arg Ser Glu Leu Thr Lys Asn Asn Asn 385 390 395 GTT CAA GCA ATT CTA AAT ATG AGC TAT CAT GAC TTA CCG GGA GAT CTT 1251 Val Gln Ala Ile Leu Asn Met Ser Tyr His Asp Leu Pro Gly Asp Leu 400 405 410 AGA AAC TGC TTC TTG TAT TGT AGC CTG TTC CCC GAA GAT CAT GAA TTA 1299 Arg Asn Cys Phe Leu Tyr Cys Ser Leu Phe Pro Glu Asp His Glu Leu 415 420 425 430 TCA CGT GAG ACC GTT GTA CGG TTG TGG GTC GCA GAA GGG TTT GCA GTA 1347 Ser Arg Glu Thr Val Val Arg Leu Trp Val Ala Glu Gly Phe Ala Val 435 440 445 CAA AAT GAA GAA AAC ACA CCA GAG GAG GTG GCT GAA AAA TAT CTT CGT 1395 Gln Asn Glu Glu Asn Thr Pro Glu Glu Val Ala Glu Lys Tyr Leu Arg 450 455 460 GAA TTG ATA CAA AGG AAT ATG TTG GAA GTT CTT GGA AAT GAT GAG CTA 1443 Glu Leu Ile Gln Arg Asn Met Leu Glu Val Leu Gly Asn Asp Glu Leu 465 470 475 GGC AGG GTT AGT ACC TTT AAG ATG CAT GAC CTC GTG CGG GAC CTG GCT 1491 Gly Arg Val Ser Thr Phe Lys Met His Asp Leu Val Arg Asp Leu Ala 480 485 490 CTT TCT ATT GCT AAA GAG GAG AAG TTC GGC TCT GCA AAT AAT TAT GAC 1539 Leu Ser Ile Ala Lys Glu Glu Lys Phe Gly Ser Ala Asn Asn Tyr Asp 495 500 505 510 ACT ATG GAG AGG ATG GAT AAG GAA GTT CGT CGC TTG TCA TCA TAT GGA 1587 Thr Met Glu Arg Met Asp Lys Glu Val Arg Arg Leu Ser Ser Tyr Gly 515 520 525 TGG AAG GGC AAA CCT GTG TTG CAA GTT AAA TTC ATG CGT CTC AGG ACC 1635 Trp Lys Gly Lys Pro Val Leu Gln Val Lys Phe Met Arg Leu Arg Thr 530 535 540 CTA GTG GCA CTT GGA ATG AAA ACA CCC TCT CGT CAC ATG TTA TCC TCA 1683 Leu Val Ala Leu Gly Met Lys Thr Pro Ser Arg His Met Leu Ser Ser 545 550 555 ATT TTG TCT GAA TCC AAC TAT CTT ACT GTT CTC GAG TTG CAA GAT TCT 1731 Ile Leu Ser Glu Ser Asn Tyr Leu Thr Val Leu Glu Leu Gln Asp Ser 560 565 570 GAA ATA ACT GAA GTG CCA GCA TCC ATA GGA GAG CTA TTT AAT CTA CGC 1779 Glu Ile Thr Glu Val Pro Ala Ser Ile Gly Glu Leu Phe Asn Leu Arg 575 580 585 590 TAC ATC GGC CTG CAG CGC ACT AGA GTC AAA TCA CTT CCA GAA TCT ATT 1827 Tyr Ile Gly Leu Gln Arg Thr Arg Val Lys Ser Leu Pro Glu Ser Ile 595 600 605 GGG AAG CTC TCC AGC CTC CTG ACT CTC AAC ATC AAG CAA ACC AAA ATA 1875 Gly Lys Leu Ser Ser Leu Leu Thr Leu Asn Ile Lys Gln Thr Lys Ile 610 615 620 CAA AAG CTA CCA CAA AGC ATT GTT AAG ATT AAG AAG CTG AGG CAC CTT 1923 Gln Lys Leu Pro Gln Ser Ile Val Lys Ile Lys Lys Leu Arg His Leu 625 630 635 CTA GCT GAC AGA TAT GAA GAC GAG AAG CAG TCA GCG TTT CGC TAT TTC 1971 Leu Ala Asp Arg Tyr Glu Asp Glu Lys Gln Ser Ala Phe Arg Tyr Phe 640 645 650 ATT GGA ATG CAA GCA CCC AAA GAG CTA TCC AAC TTG GAA GAA CTC CAG 2019 Ile Gly Met Gln Ala Pro Lys Glu Leu Ser Asn Leu Glu Glu Leu Gln 655 660 665 670 ACC CTT GAG ACT GTG GAA GCC AGC AAA GAA TTG GCT GAG CAG TTG ATG 2067 Thr Leu Glu Thr Val Glu Ala Ser Lys Glu Leu Ala Glu Gln Leu Met 675 680 685 AAA CTT ATG CAA CTA CGG AGC GTG TGG ATT GAC AAC ATA AGA ACT GAT 2115 Lys Leu Met Gln Leu Arg Ser Val Trp Ile Asp Asn Ile Arg Thr Asp 690 695 700 GAT TGT GCA AAT CTT TTT GCT ACA CTA TCA AAG ATG CCA CTT CTT TCC 2163 Asp Cys Ala Asn Leu Phe Ala Thr Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Ser 705 710 715 AGC TTG CTT CTA TCT GCA AGT CAT GAA AAC GAG ACA CTT TGC TTG GAA 2211 Ser Leu Leu Leu Ser Ala Ser His Glu Asn Glu Thr Leu Cys Leu Glu 720 725 730 GCT CTC AAA CCA GAA TCA GAG GAG CTT CAT AGG CTG ATT GTC AGA GGG 2259 Ala Leu Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu His Arg Leu Ile Val Arg Gly 735 740 745 750 TGC TGG GCA GCT AGG ACA CTT GAG TAC CCA ATA TTT CGT GAC CAT GGG 2307 Cys Trp Ala Ala Arg Thr Leu Glu Tyr Pro Ile Phe Arg Asp His Gly 755 760 765 AAA AAT ATC AAG TAT CTG GCC ATA AGC TGG TGC CGT CTT CAG GAA GAT 2355 Lys Asn Ile Lys Tyr Leu Ala Ile Ser Trp Cys Arg Leu Gln Glu Asp 770 775 780 CCT CTA CTC CTC CTT GCA CCC TAT GTG CCA AAC CTT GTC TTT CTT AGC 2403 Pro Leu Leu Leu Leu Ala Pro Tyr Val Pro Asn Leu Val Phe Leu Ser 785 790 795 CTT AAC AGG GTG AAT AGT GCA AGC ACC TTG GTT CTT TCT GCA GAT TGC 2451 Leu Asn Arg Val Asn Ser Ala Ser Thr Leu Val Leu Ser Ala Asp Cys 800 805 810 TTC CCT CAG CTG AAG ACA CTT GTC TTG AAG CGT ATG CCT GAT GTA AAC 2499 Phe Pro Gln Leu Lys Thr Leu Val Leu Lys Arg Met Pro Asp Val Asn 815 820 825 830 CAC TTG GAG ATT ATA GGC GGT GCC CTC CAA CAC ATT GAA GGT TTA TAT 2547 His Leu Glu Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gln His Ile Glu Gly Leu Tyr 835 840 845 GTT GTG TCA TTG CCA AAG TTG GAC AAT GTC CCT CAA GGC ATT GAG TCT 2595 Val Val Ser Leu Pro Lys Leu Asp Asn Val Pro Gln Gly Ile Glu Ser 850 855 860 CTT AGG TAT CTG AAG AAG CTG TGG CTC TTG GGT CTG CAT AAG AAT TTC 2643 Leu Arg Tyr Leu Lys Lys Leu Trp Leu Leu Gly Leu His Lys Asn Phe 865 870 875 AGG TCT CAG TGG CAA AAA AAT GGA ATG CAC CAA AAG ATG CAA CAT GTT 2691 Arg Ser Gln Trp Gln Lys Asn Gly Met His Gln Lys Met Gln His Val 880 885 890 CCA GAG CTG CAT GTC AAG GAC TAGAAACTTT GCTTACTTTT GCAGTATTAT 2742 Pro Glu Leu His Val Lys Asp 895 900 TTCTGTCTGG TGATTATGGG CTCAGCCACA TTATGCATTT AGTCTTTTCC AACAAATGAT 2802 CAGTTTATGA CAGATGAGCT AGCGGCACCA CTACATCGCA ACCTCGTTAT TGGAAATAAG 2862 TCCTGAAATA TTGGCTTTCA TGGCCATCAG GAAACTACTT TGTCATATGT CCTATTGTTT 2922 TTGCTTCACA ACTTTGCAGA ATTTATGAAA CTGGTCCTTT TATTGTTGAT AAAAAAAAAA 2982 AAAAAAAAAA AAAA 2996 配列番号 : 16 配列の長さ : 20 配列の型 : アミノ酸トポロジー : 直鎖状配列の種類 : ペプチド配列 Trp Gln Gln Gln Ser Gln His Thr Pro Asn Pro Leu Ala Asp Ile Glu 1 5 10 15 Arg Lys Arg Ser 20

【図面の簡単な説明】

【図１】プロベナゾール処理による「RPR１」の発現を
ノーザンブロティングにより解析した結果を示すイメー
ジングアナライザーの像である。

【図２】サリチル酸（SA）およびベンゾチアゾール(BT
H)処理による「RPR1」の発現をノーザンブロッティング
により解析した結果を示すイメージングアナライザーの
像である。

【図３】プロベナゾール（PB）、サリチル酸（SA）およ
びベンゾチアゾール(BTH)処理による「RPR1」の発現、
並びにさらにいもち病菌を接種した場合における「RPR
1」の発現をノーザンブロッティングにより解析した結
果を示すイメージングアナライザーの像である。

【図４】プロベナゾール処理と白葉枯れ病の接種による
「RPR1」遺伝子の発現をノーザンブロッティングにより
解析した結果を示すイメージングアナライザーの像であ
る。

【図５】「RPR1」をプローブとしたサザンブロッティン
グの結果を示すイメージングアナライザーの像である。

【図６】各種イネ品種、トウモロコシ、オオムギ、トマ
ト、アラビドプシスを用いて「RPR1」をプローブとした
サザンブロッティングの結果を示すイメージングアナラ
イザーの像である。

【図７】各種イネ品種におけるプロベナゾール処理によ
る「RPR1」の発現をノーザンブロッティングにより検出
した結果を示すイメージングアナライザーの像である。

【図８】「RPR1」を恒常的に発現させるためのプラスミ
ド「pKOME1」を示す図である。

【図９】「RPR1」を誘導的に発現させるためのプラスミ
ド「pKOME2」を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ 33/577 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者阪本康司茨城県つくば市千現２−１−６つくば研究支援センターＡ−１株式会社三井業際植物バイオ研究所内 (72)発明者ロバートエフ．ウイッティア茨城県土浦市桜ヶ丘町31−14

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１に記載のアミノ酸配列から
なるタンパク質、または該タンパク質中のアミノ酸配列
において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若し
くは付加したアミノ酸配列を有し、植物の獲得抵抗性を
誘導する薬剤により発現が誘導されるタンパク質。
【請求項２】配列番号：１４に記載のアミノ酸配列か
らなるタンパク質、または該タンパク質中のアミノ酸配
列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若
しくは付加したアミノ酸配列を有し、植物の獲得抵抗性
を誘導する薬剤により発現が誘導されるタンパク質。
【請求項３】配列番号：２に記載の塩基配列からなる
DNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質で
あって、植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤により発現が
誘導されるタンパク質。
【請求項４】配列番号：１５に記載の塩基配列からな
るDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質
であって、植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤により発現
が誘導されるタンパク質。
【請求項５】植物の獲得抵抗性を誘導する薬剤がプロ
ベナゾール、サリチル酸、またはベンゾチアジアゾール
である、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク
質。
【請求項６】配列番号：１に記載のアミノ酸配列から
なるタンパク質、または該タンパク質中のアミノ酸配列
において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若し
くは付加したアミノ酸配列を有し、植物に耐病性を付与
する活性を有するタンパク質。
【請求項７】配列番号：１４に記載のアミノ酸配列か
らなるタンパク質、または該タンパク質中のアミノ酸配
列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、若
しくは付加したアミノ酸配列を有し、植物に耐病性を付
与する活性を有するタンパク質。
【請求項８】配列番号：２に記載の塩基配列からなる
DNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質で
あって、植物に耐病性を付与する活性を有するタンパク
質。
【請求項９】配列番号：１５に記載の塩基配列からな
るDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパク質
であって、植物に耐病性を付与する活性を有するタンパ
ク質。
【請求項１０】耐病性がいもち病または白葉枯れ病に
対する耐性である、請求項６から９のいずれかに記載の
タンパク質。
【請求項１１】請求項１から１０に記載のタンパク質
をコードするDNA。
【請求項１２】請求項１１に記載のDNAを含むベクタ
ー。
【請求項１３】請求項１１に記載のDNAを誘導的に発
現させるプロモーターを含む、請求項１２に記載のベク
ター。
【請求項１４】請求項１１に記載のDNAを誘導的に発
現させるプロモーターがイネキチナーゼ遺伝子のプロモ
ーターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】請求項１１に記載のDNAを発現可能に
保持する形質転換細胞。
【請求項１６】植物細胞である請求項１５に記載の形
質転換細胞。
【請求項１７】イネ細胞である請求項１６に記載の形
質転換細胞。
【請求項１８】請求項１６に記載の形質転換細胞を含
む形質転換植物体。
【請求項１９】請求項１７に記載の形質転換細胞を含
むイネ形質転換植物体。
【請求項２０】請求項１から１０のいずれかに記載の
タンパク質に結合する抗体。