JP2002502225A - Ｒｐｓ遺伝子ファミリー、プライマー、プローブおよび検出方法 - Google Patents

Ｒｐｓ遺伝子ファミリー、プライマー、プローブおよび検出方法

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JP2002502225A JP52709695A JP52709695A JP2002502225A JP 2002502225 A JP2002502225 A JP 2002502225A JP 52709695 A JP52709695 A JP 52709695A JP 52709695 A JP52709695 A JP 52709695A JP 2002502225 A JP2002502225 A JP 2002502225A
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Abstract

(57)【要約】 シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のRps2ポリペプチドをコードする、実質的に純粋なDNA；実質的に純粋なRps2ポリペプチド；および遺伝子導入植物に病原体に対する病害抵抗性を提供するため、植物細胞や全植物体でRps2ポリペプチドを発現させるために、該DNAを用いる方法が開示される。また、RPSファミリーの特徴である保存領域、およびRPS病害抵抗性遺伝子を同定して単離するためのプライマーとプローブも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＲＰＳ遺伝子ファミリー、プライマー、プローブおよび検出方法 連邦政府によって後援された研究である旨の記述 本発明は、一部、政府の基金によって行われたものであるため、本発明におい て、政府は一定の権利を有する。 発明の背景 本発明は、組み換え植物の核酸およびポリペプチドに関し、また、病原体に対 する抵抗性を遺伝子導入植物に付与するためのそれらの使用に関する。 植物は、病原体と戦うためにさまざまな防御方法を用いる。防御反応の一つで ある、いわゆる過敏感反応(HR)は、感染組織における速やかな局所的壊死反応を 伴う。いくつかの宿主-病原体相互作用において、特定の抵抗性遺伝子をもつ宿 主の中で、HRを誘導する非病原性病原体の特定の非病原性(avr)造伝子の間に遺 伝子対遺伝子の関係があることが、遺伝子分析によって明らかになった。 発明の概要 本発明は、概して、以下に定義されるRpsポリペプチドをコードする、実質的 に純粋なDNA(例えば、ゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA)を特徴とする。関連する 局面において、本発明はまた、Rpsポリペプチドをコードする実質的に純粋なDNA を含むベクター、細胞(例えば、植物細胞)、およびそれらの遺伝子導入植物ない し種子を特徴とする。 好ましい態様において、RPS2遺伝子は、アラビドプシス(Arabidopsis)属の植 物のRPS2遺伝子である。さまざまな好ましい態様において、細胞は、遺伝子導入 植物細胞に由来する、形質転換された植物細胞である。関連する局面において、 本発明は、非病原性遺伝子avrRpt2を発現する病原体、またはRpsポリペプチドに よって同様に認識される非病原性シグナルを発現する病原体による感染に対して 感受性を示す植物組織の中で発現されるRpsポリペプチドをコードするトランス 遺伝子を含む遺伝子導入植物を特徴とする。 第二の局面において、本発明は、非病原性遺伝子avrRpt2を発現する病原細菌 による感染に対して感受性を持つ植物組織において、RPS遺伝子を発現できるプ ロモーターを含む、実質的に純粋なDNAを特徴とする。 好ましい態様において、プロモーターは、RPS2遺伝子本来のプロモーターであ る。さらに好ましくは、転写および翻訳の調節領域も、RPS遺伝子本来のもので ある。 本発明の遺伝子導入植物は、好ましくは非病原性遺伝子、好ましくは非病原性 遺伝子avrRpt2を発現する病原体の感染に感受性の植物である。好ましい態様に おいて、遺伝子導入植物は、アラビドプシス、トマト、ダイズ、インゲンマメ、 トウモロコシ、コムギおよびイネからなる群より選ばれる植物であるが、これら に限定されるものではない。 別の局面において、本発明は、病原体に対する植物の抵抗性を提供する方法で あって、(a)トランス遺伝子が遺伝子導入植物のゲノムに組み込まれ、植物細胞 で発現するような位置にある、Rps2ポリペプチドをコードするトランス遺伝子を もつ遺伝子導入植物細胞を作出し、(b)遺伝子導入植物細胞から、RPS2トランス 遺伝子を発現する遺伝子導入植物を育成することを含む方法を特徴とする。 別の局面において、本発明は、植物細胞における抵抗性遺伝子を検出する方法 であって、(a)Rps2ポリペプチドをコードする図2のDNA配列に約50％以上一致す るDNA配列を検出できるようなハイブリダイゼーション条件の下で、9塩基以上、 好ましくは18塩基数以上の長さを持つRPS2遺伝子ないしその一部と、該植物細胞 由来のゲノムDNAの調製物とを接触させることに関する方法を特徴とする。 別の局面において、本発明は、Rps2ポリペプチドを産生する方法であって、(a )細胞の中で発現できるような位置にある、Rps2ポリペプチドをコードするDNAで 形質転換した細胞を提供し、(b)DNAを発現させる条件下で形質転換細胞を培養し 、(c)Rps2ポリペプチドを単離することを含む方法を特徴とする。 別の局面において、本発明は実質的に純粋なRps2ポリペプチドを特徴とする。 好ましくは、ポリペプチドは、図2のオープン・リーディング・フレーム「a」に 示されたアミノ酸配列の50個以上と実質上一致する、50個以上のアミノ酸配列を 含む。最も好ましくは、ポリペプチドは、シロイヌナズナ(Arabidopsis thalian a)のRps2ポリペプチドである。 別の局面において、本発明は、非病原性遺伝子avrRpt2を持たない病原体によ る感染に対する抵抗性を、遺伝子導入植物において提供する方法であって、(a)R ps2ポリペプチドとavrRpt2遺伝子産物をコードするトランス遺伝子をもつ遺伝子 導入植物細胞であって、トランス遺伝子が遺伝子導入植物のゲノムに組み込まれ 、植物細胞で発現するような位置にあり、avrRpt2トランス遺伝子、および必要 な場合にはRPS2遺伝子を遺伝子発現を調節するのに適した調節配列の調節下にお いた遺伝子導入植物細胞を作出し、(b)遺伝子導入植物細胞から、RPS2およびavr Rpt2トランス遺伝子が発現する遺伝子導入植物を育成することを含む方法を特徴 とする。 別の局面において、本発明は、病原体において非病原性遺伝子の発現のない病 原体による感染に対する抵抗性を、遺伝子導入植物において提供する方法であっ て、(a)RPS2遺伝子を構成的に発現させるプロモーターの制御下にあるRPS2遺伝 子を含むトランス遺伝子をゲノム中に組み込んだ遺伝子導入植物細胞を作出する し、(b)遺伝子導入植物細胞から、RPS2トランス遺伝子が構成的に発現する遺伝 子導入植物を育成することを含む方法を特徴とする。 別の局面において、本発明は、病原体において非病原性遺伝子の発現のない病 原体による感染に対する制御可能な抵抗性を、遺伝子導入植物において提供する 方法であって、(a)RPS2遺伝子を制御して発現させることができるプロモーター の制御下にあるRPS2遺伝子を含むトランス遺伝子をゲノム中に組み込んだ遺伝子 導入植物細胞を作出し、(b)遺伝子導入植物細胞から、RPS2トランス遺伝子が制 御可能な発現をする遺伝子導入植物を育成することを含む方法を特徴とする。好 ましい態様において、RPS2トランス遺伝子は、組織特異的な、または細胞型特異 的なプロモーターを用いて発現するか、化学的シグナルや化学薬品などの外部的 なシグナルまたは薬晶を導入して活性化されるプロモーターによって発現させら れる。 他の局面において、本発明は、一つまたは一組の配列含む、実質的に純粋なヌ クレオチドを特徴とする。 5’GGNATGGGNGGNNTNGGNAARACNAC 3'[配列番号:158]（ここで、NはA、T、G、ま たはCであり、RはAまたはGである）、 5’NARNGGNARNCC 3'[配列番号:169]（ここで、NはA、T、G、またはCであり、R はAまたはGである）、 5’NCGNGWNGTNAKDAWNCGNA 3'[配列番号:159]（ここで、NはA、T、G、またはC であり、WはAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、KはGまたはTである。） 5’GGWNTBGGWAARACHAC 3'[配列番号:160]（ここで、NはA、T、G、またはCであ り、RはGまたはAであり、BはC、G、またはTであり、HはA、CまたはTであり、Wは AまたはTである）、 5’TYGAYGAYRTBRA 3'[配列番号:163]（ここで、RはAまたはGであり、BはC、G 、またはTであり、DはA、G、またはTであり、YはTまたはCであり、KはGまたはT である）、 5’TYCCAVAYRTCRTCNA 3'[配列番号:164]（ここで、NはA、T、G、またはCであ り、RはAまたはGであり、VはG、C、またはAであり、YはTまたはCである）、 5’GGWYTBCCWYTBGCHYT 3'[配列番号:170]（ここで、BはC、G、またはTであり 、HはA、CまたはTであり、WはAまたはTであり、YはTまたはCである）、 5’ARDGCVARWGGVARNCC 3'[配列番号:171]（ここで、NはA、T、G、またはCであ り、RはAまたはGであり、WはAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、VはG、 C、またはAである）、および 5’ARRTTRTCRTADSWRAWYTT 3'[配列番号:174]（ここで、RはAまたはGであり、W はAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、SはGまたはAであり、YはCまたはT である）。 他の局面において、本発明は、DNA配列の一つまたは一組を含む組み換え植物 遺伝子を特徴とする。 5’GGNATGGGNGGNNTNGGNAARACNAC 3'[配列番号:162]（ここで、NはA、T、G、ま たはCであり、RはAまたはGである）、 5’NARNGGNARNCC 3'[配列番号:169]（ここで、ＮはA、T、G、またはCであり、 RはAまたはGである）、 5’NCGNGWNGTNAKDWNCGNGA 3’[配列番号:167]（ここで、NはA、T、G、またはC であり、WはAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、KはGまたはTである）。 別の局面において、本発明は、アミノ酸配列の一つまたは一組を含む、実質的 に純粋な植物のポリペプチドを特徴とする。 Gly Xaa1 Xaa2 Gly Xaa3 Gly Lys Thr Thr Xaa4 Xaa5［配列番号:191］(ここ で、Xaa1はMetまたはProであり、Xaa2はGlyまたはProであり、Xaa3はIle、Leuま たはValであり、Xaa4はIle、LeuまたはThrであり、Xaa5はAlaまたはMetである) 、 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Leu Xaa4 Xaa5 Xaa6 Asp Asp Xaa7 Xaa8［配列番号:192］(こ こで、Xaa1はPheまたはLysであり、Xaa2はArgまたはLysであり、Xaa3はIle、Val またはPheであり、Xaa4はIle、LeuまたはValであり、Xaa5はIleまたはLeuであり 、Xaa6はIleまたはValであり、Xaa7はIle、LeuまたはValであり、Xaa8はAspまた はTrpである)、 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Thr Xaa6 Arg［配列番号:193］(ここで、Xaa1はSe rまたはCysであり、Xaa2はArgまたはLysであり、Xaa3はPhe、IleまたはValであ り、Xaa4はIle、またはMetであり、Xaa5はIle、LeuまたはPheであり、Xaa6はSer 、CysまたはThrである)、 Gly Leu Pro Leu Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4［配列番号:194］(ここで、Xaa1はThr 、AlaまたはSerであり、Xaa2はLeuまたはValであり、Xaa3はIle、ValまたはLys であり、Xaa4はValまたはThrである)、および Xaa1 Xaa2 Ser Tyr Xaa3 Xaa4 Leu［配列番号:195］(ここで、Xaa1はLysまた はGlyであり、Xaa2はIleまたはPheであり、Xaa3はAspまたはLysであり、Xaa4はA la、GlyまたはAsnである)。 別の局面において、本発明は、植物細胞から病害抵抗性遺伝子ないしその断片 を単離する方法を特徴とし、(a)植物細胞のDNAサンプルを提供し、(b)RPS病害抵 抗性遺伝子の保存領域に配列相同性をもつオリゴヌクレオチドの組み合わせを提 供し、(c)ポリメラーゼ連鎖反応によるDNA増幅に適した条件下で、一組のオリゴ ヌクレオチドを植物細胞DNAサンプルと組み合わせ、(d)増幅された病害抵抗性遺 伝子ないしその断片を単離することが含まれる。 好ましい態様において、例えば、RACE法などの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を 用いて増幅する。 別の局面において、本発明は、植物細胞において、植物の病害抵抗性遺伝子を 同定する方法を特徴とし、(a)植物細胞のDNA(例えば、植物のゲノムから)の調製 物を提供し、(b)RPS病害抵抗性遺伝子の保存領域に配列相同性をもち、検出可能 に標識したDNA配列(例えば、本発明の方法によって調製した)を提供し、(c)50％ 以上の配列相同性をもつ遺伝子を検出できるようなハイブリダイゼーションの条 件下で、植物細胞DNAの調製物を検出可能に標識したDNA配列と接触させ、(d)検 出可能な標識との結合によって病害抵抗性遺伝子を同定することが含まれる。 別の局面において、本発明は、組み換え植物細胞ライブラリーから病害抵抗性 遺伝子を単離する方法を特徴とし、(a)組み換え植物細胞ライブラリーを提供し 、(b)50％以上の配列相同性をもつ遺伝子を検出できるハイブリダイゼーション 条件下で、組み換え植物細胞ライブラリーを本発明のPCR法によって作製された 検出可能に標識した遺伝子断片と接触させ、(c)検出可能な標識との結合によっ て病害抵抗性遺伝子を単離することが含まれる。 別の局面において、本発明は、組み換え植物細胞ライブラリーから病害抵抗性 遺伝子を単離する方法を特徴とし、(a)組み換え植物細胞ライブラリーを提供し 、(b)50％以上の配列相同性をもつ遺伝子を検出できるハイブリダイゼーション 条件下で、組み換え植物細胞ライブラリーを本発明の検出可能に標識したRPSオ リゴヌクレオチドと接触させ、(c)検出可能な標識との結合によって病害抵抗性 遺伝子を単離することが含まれる。 別の局面において、本発明は、P-ループドメインまたはヌクレオチド結合部位 ドメインを含む、病害抵抗性を付与することができる組み換え植物ポリペプチド を特徴とする。好ましくは、ポリペプチドには、ロイシンリッチ・リピートドメ インが含まれている。 別の局面において、本発明は、病害抵抗性を付与することができる組み換え植 物ポリペプチドで、ロイシンリッチ・リピートドメインを含む植物ポリペプチド を特徴とする。 別の局面において、本発明は、(a)植物細胞のDNAサンプルを提供し、(b)RPS病 害抵抗性遺伝子の保存領域に配列相同性をもつオリゴヌクレオチドの組み合わせ を提供し、(c)ポリメラーゼ連鎖反応によるDNA増幅に適した条件下で、一組のオ リゴヌクレオチドを植物細胞DNAサンプルと組み合わせ、(d)増幅された病害抵抗 性遺伝子ないしその断片を単離することを含む方法によって単離された植物の病 害抵抗性遺伝子を特徴とする。 別の局面において、本発明は、(a)植物細胞のDNAの調製物を提供し、(b)RPS病 害抵抗性遺伝子の保存領域に配列相同性をもち、検出可能に標識されたDNA配列 を提供し、(c)50％以上の配列相同性をもつ遺伝子を検出できるようなハイブリ ダイゼーション条件下で、植物細胞DNAの調製物を、検出可能に標識したDNA配列 と接触させ、(d)検出可能な標識との結合によって病害抵抗性遺伝子を同定する ことを含む方法にしたがって単離された植物の病害抵抗性遺伝子を特徴とする。 別の局面において、本発明は、(a)組み換え植物細胞ライブラリーを提供し、( b)50％以上の相同性をもつ遺伝子の検出を提供するハイブリダイゼーション条件 下で、組み換え植物細胞ライブラリーを、本発明の方法によって作出し検出可能 に標識したRPS遺伝子断片と接触させ、(c)検出用標識との結合によって病害抵抗 性遺伝子を単離することを含む方法による植物の病害抵抗性遺伝子を特徴とする 。 別の局面において、本発明は、(a)植物細胞組織試料を提供し、(b)バイオリス ティックによる形質転換法で、植物組織試料の中に植物の病害抵抗性遺伝子の候 補を導入し、(c)植物組織試料の中で、植物の病害抵抗性遺伝子候補を発現させ 、(d)植物組織試料が、その反応によって植物病害抵抗性遺伝子があることを確 認する、病害抵抗性反応を示すか否かを決定することを含む、植物の病害抵抗性 遺伝子を同定する方法を特徴とする。 好ましくは、植物組織試料は、葉、根、花、果実または茎組織のいずれかであ り、植物病害抵抗性遺伝子の候補は、cDNA発現ライブラリーから採り、また病害 抵抗性反応は過敏反応である。 別の局面において、本発明は、(a)植物細胞組織試料を提供し、(b)バイオリス ティックによる形質転換法で、植物組織試料の中に植物の病害抵抗性遺伝子の候 補を導入し、(c)植物組織試料の中で、植物の病害抵抗性遺伝子候補を発現させ 、(d)植物組織試料が、その反応によって植物病害抵抗性遺伝子があることを確 認する病害抵抗性反応を示すか否かを決定することを含む方法に従って単離され た植物病害抵抗性遺伝子を特徴とする。 別の局面において、本発明は、rpsファミリー蛋白質に特異的に結合する精製 抗体を特徴とする。このような抗体は、RPSポリペプチドを同定するための、標 準的な免疫検出法において用いられよう。 別の局面において、本発明は、図12に示されたDNA配列に実質的に一致するDNA 配列を特徴とする。 別の局面において、本発明は、図5(AまたはB)に示されたPrfアミノ酸配列に実 質的に一致する配列をもつ実質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。 「病害抵抗性遺伝子」とは、植物細胞ないし組織において、植物の防御反応を 開始させることができるポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。RPS遺伝 子は、図2のRPS2配列またはその一部に50％以上の相同性をもつ病害抵抗性遺伝 子である。遺伝子RPS2は、シロイヌナズナからのRps2病害抵抗性ポリペプチドを コードする病害抵抗性遺伝子である。 「ポリペプチド」とは、長さや翻訳後修飾(例えば、グリコシル化やリン酸化) に関わらず、あらゆるアミノ酸鎖を意味する。 「実質的に同一な」とは、参照するアミノ酸ないし塩基配列に対して、少なく とも50％の、より好ましくは85％の、さらに好ましくは90％の、最も好ましくは 95％の相同性を示すポリペプチドないし塩基配列を意味する。ポリペプチドにつ いて、比較する配列の長さは、一般的には16アミノ酸以上であり、好ましくは20 アミノ酸以上、より好ましくは25アミノ酸以上、もっとも好ましくは35アミノ酸 である。塩基配列については、比較する配列の長さは、一般的には50塩基以上で あり、好ましくは60塩基以上、より好ましくは75塩基以上、もっとも好ましくは 110塩基である。 配列の相同性は、典型的には配列解析用ソフトウエア(例えば、ジェネティク ス・コンピューター・グループの配列解析ソフトパッケージ、ウィスコンシン大 学バイオテクノロジー・センター、ユニバーシティー・アベニュー1710、マジソ ン、ウィスコンシン州53705)を用いて判定する。このようなソフトウエアは、さ まざまな置換や欠失、その他の修飾に対する相同性の程度を指定することによっ て、類似配列を比較する。保存的置換には、以下の各グループ内での置換が、典 型的には含まれる。グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；ア スパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン ；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。 「実質的に純粋なポリペプチド」とは、自然な状態では一緒に存在する構成成 分から分離されたRps2ポリペプチドを意味する。典型的には、自然状態では結合 している蛋白質や天然有機分子から重量にして少なくとも60％分離しているとき に、ポリペプチドは実質的に純粋である。好ましくは、調製物は、重量にして少 なくとも75％、さらに好ましくは90％以上、最も好ましくは99％以上がRps2ポリ ペプチドである。実質的に純粋なRps２ポリペプチドは、例えば、天然の材料(例 えば、植物細胞)から抽出するか、Rps2ポリペプチドをコードする組み換え核酸 を発現させるか、または蛋白質を化学的に合成することによって得ることができ る。精製度は、例えば、カラム・クロマトグラフィーやポリアクリルアミド電気 泳動で説明される方法やHPLC分析などの適当な方法によって測定することができ る。 蛋白質は、自然な状態において一緒に存在する混成物から分離されたとき、自 然に結合している成分から実質的に分離されたという。このように、化学的に合 成されたか、その蛋白質が本来産生される細胞とは異なる細胞系で産生された蛋 白質は、自然状態で結合している成分から実質的に分離されている。したがって 、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物に由来するポリペプチドと、大腸 菌や他の原核生物で合成されたポリペプチドが含まれる。 「実質的に純粋なDNA」とは、本発明のDNAが由来する生物の、自然状態で存在 するゲノムの中で、遺伝子の横にある(他の)遺伝子から分離されたDNAを意味す る。このため、例えばこの語には、ベクターの中や自律複製するプラスミドやウ イルスの中、原核生物や真核生物のゲノムDNAの中などに組み込まれた組み換えD NA、または他の配列とは独立の別個の分子(例えば、cDNAや、PCRや制限酵素消化 によって作出されるゲノムDNA断片またはcDNA断片)として存在する組み換えDNA が含まれる。また、この語には、付加的ポリペプチド配列をコードするハイブリ ッド遺伝子の一部である組み換えDNAが含まれる。 「形質転換細胞」とは、組み換えDNA技術の手法によって、(本明細書において 用いられているように)Rps2ポリペプチドをコードするDNA分子が細胞(または祖 先細胞に)導入された細胞を意味する。 「発現するような位置にある」とは、DNA分子が、配列の転写および翻訳を指 示する(すなわち、例えば、Rps2ポリペプチドや組み換え蛋白質、RNA分子などの 産生を促進する)DNA配列の隣接した部位に配置されたという意味である。 「レポーター遺伝子」とは、その発現を測定しうる遺伝子を意味する。このよ うな遺伝子には、β-グルクロニダーゼ(GUS)、ルシフェラーゼ、クロラムフェニ コール・トランスアセチラーゼ(CAT)、およびβ-ガラクトシラーゼなどが含まれ るが、これらに限定されない。 「プロモーター」とは、転写を指令するのに十分で最短の配列という意味であ る。また、本発明においては、細胞型特異的ないし組織特異的に制御可能な、ま たは外部シグナルや薬剤によって誘導可能な、プロモーター依存的な遺伝子発現 を行うのに必要十分なプロモーター要素が含まれる。このような要素は、本来の 遺伝子の5'または3'領域に位置しているかもしれない。 「機能的に結合した」とは、適当な分子(例えば、転写活性化蛋白質)が制御配 列に結合すると遺伝子発現が行われるように、遺伝子と制御配列が結合されてい るという意味である。 「植物細胞」とは、半透性の膜により結合した自己増殖する細胞で、プラスチ ドを含むものを意味する。さらに増殖させたいのであれば、このような細胞には 細胞膜も必要になる。ここで用いられる植物細胞には、藻類、シアノバクテリア 、種子の懸濁培養、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、茎、配偶体、胞子 体、花粉、および小胞子が含まれるが、これらに限定されない。 「トランス遺伝子」とは、人為的に細胞に挿入されたDNA断片で、その細胞か ら発生する生物体のゲノムの一部になるものを意味する。このようなトランス遺 伝子は、遺伝子導入生物とは部分的にまたは全面的に異なる(すなわち、外来の) 遺伝子を含むかもしれないし、また、該生物に内在する遺伝子と相同な遺伝子を 相当するものかもしれない。 「遺伝子導入体」とは、細胞に人為的に挿入されて、その細胞から発生する生 物体のゲノムの一部になったDNA配列を含む細胞という意味である。本明細書に おいて用いられるように、遺伝子導入生物は、一般的に遺伝子導入植物で、DNA( トランス遺伝子)は、核またはプラスチドのゲノムに人為的に挿入されている。 「病原体」とは、生存能力がある植物組織の細胞に感染することによって、植 物の組織において病害反応を誘導する生物を意味する。 「RPS病害抵抗性造伝子」とは、植物の防御反応を開始でき、ここて説明され るRPSメンバー(すなわち、RPS2、L6、N、またはPrf遺伝子)の保存領域の一つに 、少なくとも20％、好ましくは30％、最も好ましくは50％のアミノ酸配列の相同 性をもつことを特徴とする植物遺伝子ファミリーのすべてのメンバーを意味する 。RPS遺伝子ファミリーの代表的なメンバーには、制約はないが、アラビドプシ スのrps2遺伝子、アマのL6遺伝子、トマトのPrf遺伝子、およびタバコのN遺伝子 が含まれる。 「保存領域」とは、RPS遺伝子ファミリーのメンバーであるRPS2、L6、N、また はPrfの中の2個以上のアミノ酸配列の間で、少なくとも30％、好ましくは50％、 最も好ましくは70％の相同性を示す、6個以上の連続したアミノ酸配列を意味す る。好ましい保存配列の例は、図5AおよびB、6、7および8に示されており(線で 囲まれているか命名されている配列)、制約はないが、ヌクレオチド結合部位ド メイン、ロイシンリッチ・リピート、ロイシンジッパー・ドメイン、およびP-ル ープドメインが含まれる。 「検出可能に標識した」とは、例えば、オリゴヌクレオチド・プローブまたは プライマー、遺伝子もしくはその断片、またはcDNA分子のように、分子の存在に 印を付けたり、確認したりするための手段を意味する。分子に検出できるように 標識する方法は、当業者によく知られており、これらに限定されるものではない が、放射活性標識(例えば、32Pまたは35Sなどの同位体)および非放射活性標識( 例えば、化学ルミネセンス標識またはフルオレセイン標識)が含まれる。 「バイオリスティック形質転換法」とは、速度で操作される、タングステンま たは金の粒子のようなミクロ発射物を用いて、外来分子を細胞の中に導入するた めの方法を意味する。このような、速度で操作される方法は、圧力をかけて破裂 させることに起源しており、ヘリウム作動、空気作動、および火薬作動技術が含 まれるが、これらに限定されるものではない。バイオリスティック形質転換法は 、細胞内オルガネラ(例えば、クロロプラストおよびミトコンドリア)、細菌、酵 母、菌類、藻類、花粉、動物組織、植物組織(例えば、葉、芽生え、胚、表皮、 花、分裂組織および根)、花粉、および培養細胞などを含むがこれらに限定はさ れない、さまざまな細胞型や元の組織の形質転換に応用することができよう。 「精製された抗体」とは、重量にして、少なくとも60％、蛋白質およびそれが 自然に結合している天然の有機分子から分離されていることを意味する。好まし くは、重量にして、調製物の少なくとも75％、より好ましくは90％、そして、最 も好ましくは99％が、例えばrps2特異的な抗体である。例えば、組み換えによっ て産生されたrps蛋白質や保存モチーフおよび標準的な技術を用いたアフィニテ ィー・クロマトグラフィーによって、精製されたrps抗体を得ることができよう 。 「特異的に結合する」とは、rps蛋白質を認識し、結合する抗体であるが、例 えばrps蛋白質を天然に含む生物試料などの試料中の他の分子を実質的には認識 せず、結合もしない抗体を意味する。 本発明のその他の特徴や利点は、次に説明する好ましい態様および請求の範囲 から明らかになるであろう。 詳細な説明 まず、図面について説明する。図面 図1A-1Fは、RPS2遺伝子座のクローニングをもたらした物理的解析およびRFLP 解析の概要図である。 図1Aは、「Lister and Dean.,(1993)Plant J．4:745-750」によって公表され た地図から取った、シロイヌナズナの第IV番染色体にある関連する部位の遺伝地 図およびRFLP地図の配列を示す線図である。RFLPマーカーL11F11は、YACクロー ンYUP11F11の左腕を表している。 図1Bは、RPS2遺伝子座の近傍にある、関連するYACの配列を示した図である。Y UP16G5、YUP18G9およびYUP11F11と名付けられたYAC構築物は、ペンシルバニア大 学のJ.エッカー（J.Ecker）によって提供されたものである。EW3H7、EW11D4、EW 11E4およびEW9C3と名付けられたYAC構築物は、チバ・ガイギー社のE.ウォード（ E.Ward）によって提供された。 図1Cは、RPS2遺伝子座の近傍にあるコスミド・クローンの配列を示す図である 。Hと名付けられたコスミド・クローンは、EW3H7 YACクローンに由来するクロー ンであり、Eと名付けられたコスミド・クローンは、EW11E4 YACクローンに由来 するクローンである。垂直な矢印は、生態型La-er植物体とrps2-101N植物体との 間にあるRFLPマーカーの相対的な位置を示している。RFLPマーカーは、対応する コスミド・クローンの全域または一部をプローブとして用いて、50以上の制限酵 素消化物を含むサザンブロットをスクリーニングして同定された。図1Cで説明さ れたコスミド・クローンは、J.ジロード（J.Giraudat）、（C.N.R.S.、Gif-sur- Yvette、フランス）によって提供された。 図1Dと1Eは、それぞれコスミドE4-4とE4-6のEcoRI制限酵素部位を示す地図で ある。RPS2遺伝子座の回りにある組み換え切断部位は、4.5kbと7.5kbのEcoRI制 限酵素断片の間に位置している。 図1Fは、ポリA+RNAブロット解析によって同定されているRNA転写物をコードす る遺伝子のおおよその位置を示す図である。転写物のサイズが各転写物の下にキ ロ塩基対で示されている。 図2[配列番号:1-104，196-201]は、RPS2遺伝子座を含むcDNA-4の完全な塩基配 列である。塩基配列の下に3つの読み枠が示されている。読み枠「a」の推定アミ ノ酸配列[配列番号:2-5]が提示され、909アミノ酸を含む。ATG開始コドンのメチ オニンを、図2の読み枠「a」に丸で囲った。ATG開始コドンのAは、図2の31番目 のヌクレオチドである。 図3[配列番号:105-106]は、avrRpt2遺伝子[配列番号:105]の塩基配列と、その 推定アミノ酸配列[配列番号:106]である。リボソーム結合可能部位を下線で示し た。読み枠の3'端に、水平な矢印で逆向き反復配列を示した。読み枠の塩基配列 の下に、推定アミノ酸配列が提示されている。 図4は、p4104とp4115(cDNA-4をコードする)に含まれるDNAが、以前にはRPS2病 害抵抗性活性がなかったシロイヌナズナ植物に、RPS2病害抵抗性活性を付与する 機能をもつことを確認できた相補性解析の概要図である。「ゲノム」の線上の短 い縦線は、制限酵素EcoRI認識部位を表していて、その結果できるDNA断片のサイ ズを、この線の上にキロ塩基対(kb)数で表している(図1Eも参照)。向かい側の「 cDNA」は、RNA転写物に対するコーディング配列のおおよその位置であり(図1Fも 参照)、矢印は、cDNA4、5および6についての転写産物の方向を示している。機能 的相補性実験のために、図示されたシロイヌナズナのゲノムDNA配列によってrps 2-201C/rps2-201C植物を遺伝的に形質転換した。これらの配列は、名前が示され たプラスミド(バイナリー・コスミドベクターに由来するpSLJ4541)に含まれてお り、アグロバクテリア仲介による形質転換法によって植物に導入された。その結 果できた形質転換体が、avrRpt2を発現するP.シリンゲ（P.Syringae）を接種し た後に示す病気抵抗性反応を「Sus」(感受性、抵抗性反応を示さない)または「R es」(病気抵抗性)で示した。 図5A[配列番号:107-136および142]は、アマのL-6蛋白質、タバコのN蛋白質、 トマトのPrf蛋白質、およびアラビドプシスのrps2蛋白質の中で、配列に類似性 がある領域を示している。 図5B[配列番号:107、108、137-140]は、N蛋白質およびL-6蛋白質の間にある配 列類似性を示す。 図6[配列番号:141および142]は、RPS2ポリペプチドの配列解析を示しており、 N-末端の疎水性領域とロイシンジッパー、NBSs(キナーゼ-1a、キナーゼ-2、およ びキナーゼ-3モチーフ)、および膜内在領域と推定される部分に相当するポリペ プチドの領域が示されている。 図7[配列番号:143-146]は、RPS2のLRR(アミノ酸505-867)のアミノ酸配列を示 す。一番上の線は、RPS2のLRRに関する保存配列を示している。「X」は、任意の アミノ酸配列を意味し、「a」は脂肪族アミノ酸残基を意味する。RPS2のLRRに関 する保存配列は、酵母のアデニル酸シクラーゼCYR1のLRR(PX Xa XXL XXL XXLXL XXNXaXXa)の保存配列によく似ている。保存配列に一致するアミノ酸残基は太字 で示されている。この図には14個のLRRが示されているが、LRRのC末端に近いと ころは保存配列にあまり適合していないため、LRRのC末側の境界はあまり明瞭で はない。 図8[配列番号:3]は、RPS2の配列を解析したものを示しており、ロイシンジッ パー、P-ループ、膜通過部、およびロイシンリッチ・リピート・モチーフに類似 性をもつ領域を示している。明らかになっている機能的なドメインに類似する領 域が、関連するアミノ酸の上に線で示されている。N-グリコシル化配列の可能性 があるところを点で示し、rps2-201が668番目のアミノ酸でThrからProへ突然変 異している位置を星印で示した。 図９は、一過的アッセイ法を示した概略図である。上の図は、このアッセイの 基本的な原理を示している。下の図は、実際のトランジェント・アッセイ法の概 略を示す。Psp NP53121が用いられているが、これは、Psp NP53121はアラビドプ シスの弱い病原菌であるが、非病原性遺伝子をもっているとHRを引き起こすこと ができるためである。HRを起こさなければ、NP53121の感染を受けた植物細胞の 損傷は最小限で済むが、HRが行われいる細胞におけるGUS蓄積は、HRが行われて いない細胞に比較すると、その差が増幅されていた。発射の前に、アラビドプシ スの葉の半分にp.シリンゲ（P．syringae）を浸透させ(葉に小班点が付いている 側)、葉の他の半分は非感染対照として、感染側に対する「内部的」対照とし、 形質転換効率を測るために用いられる。 図10のパネルA-Bは、バイオリスティック一過的発現アッセイ法を用いて、rps ２変異形質の相補を示した写真である。rps2-101C変異体の葉の左側にPsp 3121/ avrRpt2を浸透させた。浸透させた葉に、35S-uidAと△GUS(パネルA)、または35S -uidAと35S-RPS2(cDNA-2クローン4)(パネルB)のどちらかを一緒に撃ち込んだ。 パネルBにおいては、葉の感染した側の方が、非感染側に較べて低いGUS活性を示 したことから、感染側の形質転換された細胞ではHRが起きて、35S-RPS2が変異形 質を相補したことが示された(図9参照)。 図11は、pKEx4trの概略図であり、このcDNA発現ベクターの構造を示している 。便宜のために、マルチクローニング部位には、PmeIおよびNotIに対する8塩基 認識配列が含まれていて、T7およびT3プロモーターに隣接している。改変された 35Sプロモーターからノパリン合成酵素の3'側配列(nos 3')にわたる領域を、pUC 18のHindIII-EcoRI部位にクローニングした。この結果、EcoRI部位は失われた。 図12は、トマトのPrf遺伝子の核酸配列を示す。病原体に対する抵抗性の遺伝的基礎 植物宿主および病原微生物の間の相互作用について概説する。病原能力にある 病原体が植物に侵入すると、以下の結果に分けられるような範囲の結果を示しう る。すなわち、病原体が宿主の中でうまく増殖して、付随する病徴を発生させる か、宿主の防御によって増殖が停止する。いくつかの植物-病原体相互作用にお いて、積極的な防御反応の目に見える顕著な特徴は、いわゆる過敏反応すなわち 「HR」である。HRは、感染部位の近傍での急速な細胞の壊死反応を伴い、可視的 な褐色の乾いた病斑の形成を含む。所定の宿主でHRを誘引する病原体を、その宿 主に対して非病原性であると云い、その宿主を抵抗性であるという。そして、こ の宿主-病原体相互作用を非親和的であるという。特定の宿主で増殖して病気を 引き起こす菌株は病原性であるといわれ、このような場合の宿主を感受性である といい、またこの宿主-病原体相互作用を親和的という。 特定の菌類ないし細菌の病原体の一連の菌株(菌系)が、特定の宿主生物種の一 連の栽培品種(または異なった野生種の登録株)に対して病原性か非病原性である ときに関する植物-病原体認識の遺伝的基礎の解明に役立つよう、「古典的な」 遺伝子解析がうまく用いられてきた。このような場合の多くにおいて、宿主と病 原体双方の遺伝子解析を行うことによって、非病原性の菌類および細菌類の菌株 の多くが、宿主の「抵抗性」遺伝子に対応する非病原性(avr)遺伝子を一個以上 持っている点で、病原性の菌類および細菌類の菌株と区別されることが明らかに なった。この非病原性遺伝子-抵抗性遺伝子の関係が、「遺伝子対遺伝子」モデ ルと名付けられた(Crute，et al.，(1985)pp 197-309 in:Mechanisms of Resist ance to Plant Disease.R.S.S.Fraser,ed;Ellingboe，(1981)Annu．Rev．Phytop athol．19:125-143;Flor，(1971)Annu．Rev．Phytopathol.9:275-296;Keen and Staskawicsz，(1988)supra;and Keen et al.in:Application of Biotechnology to Plant Pthogen Control.I.Chet，ed.,John Wiley & Sons,1993,pp.65-88)。 このモデルを単純に定式化して述べると、植物の抵抗性遺伝子は、avr遺伝子に よって作られる分子シグナルに対する特異的なレセプターをコードしている。そ して、シグナル伝達経路によって、このシグナルが、HRおよび他の宿主の防御を 開始させる一連の標的遺伝子に運ばれる(Gabriel and Rolfe，(1990)Annu．Rev ．Phytopathol．28:365-391)。この単純な予測モデルがあるにもかかわらず、av r抵抗性遺伝子の作用の分子的基礎は、未だ分かっていない。 さまざまな細菌のavr遺伝子をクローニングすることによって、遺伝子対遺伝 子仮説の基本的な予測のひとつが、分子レベルで説得力をもって確証された(Inn es，et al.，(1993)J．Bacteriol．175:4859-4869;Dong，et al.，(1991)Plan t Cell 3:61-72;Whelan et al.，(1991)Plant Cell 3:49-59;Staskawicsz et al .，(1987)J.Bacteriol．169:5789-5794;Gabriel et al.，(1986)P.N.A.S.，USA 83:6415-6419;Keen and Staskawicz，(1988)Annu．Rev．Microbiol．42:421-440 ;Kobayashi etal.，(1990)Mol．Plant-Microbe Interact．3:94-102および(1990 )Mol．Plant-Microbe Interact．3:103-111)。これらのクローン化された非病原 性遺伝子の多くが、同種の宿主植物のそれぞれの抵抗性遺伝子に対応しているこ とが示され、病原性の菌株に移入されると非病原性の表現形質を付与できること も示されている。イネス（Innes）らによって、シュードモナス・シリンゲpv.ト マト(Pseudomonas syringae pv．Tomato)からavrRpt2遺伝子座が分離されて配列 決定された(Innes，R．et al．(1993)J．Bacteriol．175:4859-4869)。図3は、a vrRpt2遺伝子の塩基配列と、推定アミノ酸配列である。 病原体が感染したときに植物が反応するシグナルで知られている例には、軟腐 病菌(Erwinia)(Wei et al.(1992)Science 257:85-88)とシュードモナス菌(Hee e t al．(1993)Cell 73:1255-1266)からのハルピン（harpin）；クラドスポリウム （Cladosporium）からのavr4ペプチド(Joosten et al．(1994)Nature 367:384-3 86)およびavr9ペプチド(van den Ackerveken et al．(1992)Plant J．2:359-366 )；シュードモナス菌からのPopA1(Arlat et al．(1994)EMBO J．13:543-553)；a vrD生成リポ多糖(Midland et al．(1993)J．Org．Chem．58:2940-2945)；および リンコスポリウムRhynchosporium菌からのNIP1(Hahn et al．(1993)Mol．Plant- Microbe Interact．6:745-754)が含まれる。 avr遺伝子に較べると、avrを生成する特異的なシグナルに関連する、植物の抵 抗性遺伝子について知られていることはかなり少ない。植物の抵抗性遺伝子RPS2 (rpsはresistance to Pseudomonas syringaeから取られた)が、特異的なavr遺伝 子(avrRpt2)に対応する、それまでに未同定の種類の新しい、植物の病気抵抗性 遺伝子の最初のものである。RPS2のクローニングをもたらしたいくつかの研究に ついてが、ユら（Yu et al．(1993)，Molecular Plant-Microbe Interactions 6 :434-443）およびクンケルら（Kunkel，et al．(1993)Plant Cell 5:865-875） に述べられている。 植物病害抵抗性遺伝子Ptoに特異的に対応する、全く別の非病原性遺伝子がト マト(Lycopersicon esculentum)から単離された(Martin et al.，(1993)Science 262:1432-1436)。Pto遺伝子を発現しているトマトの植物体は、avrPto非病原性 遺伝子を発現するトマト青枯れ病（Pseudomonas syringae pv．tomato）の菌系 による感染に対して抵抗性である。Pto遺伝子のDNA配列から推定されるアミノ酸 配列は、セリン-スレオニン・プロテインキナーゼと強い類似性を示し、Ptoのシ グナル伝達への関与を示唆している。RPS2については、トマトPto遺伝子座にも 他の既知のプロテインキナーゼにも類似性が見つけられなかったため、RPS2が、 新しい種類の植物病害抵抗性遺伝子を代表するものであることが示唆されている 。 トウモロコシ(コーン)から、Hm1として知られる菌系特異的な抵抗性遺伝子が 単離されたことが報告された(Johal and Briggs（1992）Science 258:985-987) 。Hm1は、菌の毒素の分解を調節することによって、菌類の病原体コクリボナス ・カルボナム（Cochliobolus carbonum）の特定の菌系に対する抵抗性を付与す るが、この戦略は、RPS2-avrRpt2抵抗性機構における非病原性遺伝子特異的抵抗 性とは機構的に異なっている。 本発明でクローン化されたRPS2遺伝子は、特異的な病原体に抵抗性をもつ植物 の構築を容易にし、古典的な育種技術では、種間での病害抵抗性遺伝子の移入が できなかったことを克服するために用いることができる(Keen et al.，(1993)、 supra)。以下に、シロイヌナズナのRPS2遺伝子座、RPS2ゲノムDNAおよびRPS2 cD NAのクローニングと特性検定について説明する。avrRpt2遺伝子およびRPS2遺伝 子、ならびに変異体rps2-101C、rps2-102Cおよびrps2-201C(rps2-201とも名付け られている)について述べられている(Dong et al.,(1991)Plant Cell 3:61-72;Y u，et al(1993)supra;Kunkel et al.，(1993)、supra;Whalen et al.,(1991)、s upra;and Innes et al.，(1993)、supra)。rps2-101Nと名付けられた変異体も単 離されている。RPS2遺伝子の同定とクローニングについて以下で説明する。RPS2 はavrRpt2遺伝子をもつ病原体に対する感受性を克服させる 病原体の非病原性遺伝子と宿主の抵抗性遺伝子との間の造伝的な関係を明らか にするために、まず、非病原性遺伝子を単離することが必要であった。アラビド プシス属に関連のある作用植物の病原体として知られているシュードモナス菌株 をスクリーニングして、病原性の強い菌株P.シリンゲPV.マキュリラ(Psm)ES4326 （P．syringae pv．maculicola（Psm）ES4326）、P.シリンゲpv.トマト(Pst)DC3 000（P．syringae pv.tomato（Pst）DC3000）、および非病原性菌株Pst MM1065 を同定し、野生型のシロイヌナズナにおけるそれぞれの菌株の増殖能力を解析し た(Dong et al.,(1991)Plant Cell，3:61-72;Whalen et al.,(1991)Plant Cell ，3:49-59;MM1065は「Whalen et al」においてJL1065と名付けられた)。Psm ES4 326またはPst DC3000は、シロイヌナズナの葉で10,000倍に増殖することができ 、２日間で浸潤性の病斑が表れる原因となる。Pst MM1065は、シロイヌナズナの 葉で最大で10倍に増殖することができ、48時間後に僅かに黄化した乾燥病斑を引 き起こす。このように、病害抵抗性は病原菌の増殖の強い阻害と関連する。 「Dong et al.,(1991)Plant Cell，3:61-72」；「Whalen et al.,(1991)supra 」および「Innes et al.,(1993)supra」に述べられている標準的な技術を用いて 、Pst MM1065菌株の非病原性遺伝子(avr)をクローニングした。この菌株から分 離された非病原性遺伝子をavrRpt2と命名した。通常、病原性株Psm ES4326とPst DC3000は、上述のように48時間後に病徴を生じさせる。これに対して、Psm ES4 326/avrRpt2またはPst DC3000/avrRpt2は、野生型シロイヌナズナの葉で可視的 壊死過敏反応(HR)を16時間以内に誘導し、Psm ES4326またはPst DC3000に較べて 50分の1しか増殖しない(Dong et al.,(1993)supra;Whalen et al.,(1991)supra) 。このように、野生型のシロイヌナズナにおける病害抵抗性には、一部、病原体 の非病原性遺伝子または非病原性遺伝子によって生成されるシグナルが必要であ る。 avrRpt2遺伝子をもつ病原体に対する病害抵抗性に必要な宿主の遺伝子を見つ けるために、クローン化されたavrRpt2遺伝子を用いて、シロイヌナズナの病害 抵抗性変異体が４つ単離されたことが述べられている(Yu et al.，(1993)supra; Kukel et al.，(1993)supra)。４つのシロイヌナズナ変異体は、病害抵抗能力を 失った植物について予想されたように、Psm ES4326/avrRpt2またはPst DC3000/a vrRpt2侵入させてもHRを発生させることができなかった。これらの変異体の一つ の場合、エチルメタンスルホン酸(EMS)変異原によって作成した、5週齢から6 週齢の生態型コロンビア(Col-0植物)のM2植物体約3000個体にPsm ES4326/avrRpt 2を手で接種して、一個の変異体rps2-101Cが同定された(resistance to Pseudom onas syringae)(Yu et al.，(1993)supra)。 ２つ目の変異体は、HRを開始できない変異体を特異的に増加させる方法を用い て単離された(Yu et al.，(1993)supra)。ペトリ皿で育てた、10日目のシロイヌ ナズナの芽に、シュードモナス・シリンゲpv.ファセオリコラ（Pseudomonas syri ngae pv．phaseolicola）(Psp)NPS3121とPsp NPS3121/avrRpt2を侵入させたとこ ろ、Psp NPS3121を侵入させた植物の約90％は生き残ったが、Psp NPS3121/avrRp t2を侵入させた植物の90％-95％は枯れた。小さなシロイヌナズナの芽全体にPsp NPS3121/avrRpt2を真空浸透法で入れると、明らかに全身性のHRを誘導するため 、大抵の芽は枯れてしまう。これに対して、Psp NPS3121はシロイヌナズナにと って弱い病原体であるために、Psp NPS3121を浸透させた芽は生き残った。二番 目の病害抵抗性変異体は、4000個体のEMS変異原処理をしたコロンビアのM2発芽 体にPsp NPS3121/avrRpt2を浸透させて単離した。200個体の生き残り個体が得ら れた。これらを土に移植して、植物体が成熟したところで、再び手で接種してス クリーニングした。これら200の生き残り個体の中で1個の植物体がPsm ES4326/a vrRpt2を浸透させたときにHRを起こすことができなかった。この変異体をrps2-1 02Cと命名した(Yu et al.，(1993)supra)。 第三の変異体のrps2-201Cは、ジエポキシブタンで突然変異を起こさせたシロ イヌナズナのCol-0生態型の種子に由来する約7500個のM2植物をスクリーニング して単離された(Kunkel et al.，(1993)supra)。ロゼット状の葉全体を、Pst DC 3000/avrRpt2バクテリアと界面活性剤Silwet L-77を含んだ溶液に浸漬し(Whalen et al.，(1991)supra)、植物を人工気象培養器の中で3日から4日間インキュベ ートしてから、病徴の伸展を目で観察することにより植物を接種した。このスク リーニングによって4つの変異系統(rps2-201C、rps2-202C、rps2-203Cおよびrps 2-204Cという対立遺伝子)が見いだされ、rps2-201Cについてホモ接合の植物体を 主にさらなる実験の対象にした(Kunkel et al.，(1993)supra、および本出願)。 第四のrps2変異体であるrps2-101Nの単離は、まだ公表されていない。この第 四の分離株は、突然変異体かシロイヌナズナの感受性の生態型である。シロイヌ ナズナのノッセン（Nossen）生態型の種子にガンマ線を照射した後、平箱に種子 を厚く播いて発芽させ、ナイロン膜を通って生育させた。植物体が5から6週齢に なったとき、平箱を逆さまにして、Psm ES4326/avrRpt2の培養液を含むトレイの 中に植物を部分的に沈めた。そして、真空乾燥器の中で植物に真空浸透させた。 このようにして接種された植物は、24時間以内にHRを発現させる。この方法を用 いて、およそ40,000個体の植物をスクリーニングし、感受性植物を1個体同定し た。この後で行われたRFLP解析によると、この植物体はノッセンの変異体ではな く、むしろsm ES4326/avrRpt2に感受性の別のシロイヌナズナの生態型であると 考えられる。この植物をrps2-101Nと呼ぶことにする。rps2-101C、rps2-102C、r ps2-201C、およびrps2-101Nを「rps2変異体」と総称する。rps2 変異体はクローン化された非病原性遺伝子avrRpt2に特異的に反応すること ができない 非病原性遺伝子avrRpt2をもつ病原体に対する抵抗性には、RPS2遺伝子産物が 特異的に必要である。Rps2ポリペプチドの機能が失われるか低下するという変異 は、病原体を侵入させた際の過敏反応の消失として観察可能である。Psm ES4326 /avrRpt2、Pst DC3000/avrRpt2またはPsp NPS3121/avrRpt2をそれぞれ浸透させ たとき、rps2変異体は、病徴を示すかまたは全く反応を示さなかった。特に、HR 反応は誘導されなかったため、病原体にはavrRpt2遺伝子があるにも拘わらず、 植物体が感受性になって、病原体に対する抵抗性をなくしたことが分かった。 rps2変異体植物の葉における病原菌の増殖は、avrRpt2遺伝子があってもなく ても同様であった。rps2変異体におけるPsm ES4326およびPsm ES4326/avrRpt2の 増殖を比較すると、Psm ES4326が野生型のシロイヌナズナの葉で増殖するのと同 じ速さで、rps2変異体の中でどちらも同じように増殖することが分かった。rps2 変異体におけるPst DC3000とPst DC3000/avrRpt2の増殖についても同様の結果が 観察された。 別のavr遺伝子であるPsm ES4326/avrB、Pst DC3000/avrB、Psm ES4326/avrRpm 1、Pst DC3000/avrRpm1をもつシュードモナス菌の病原体を侵入させると、rps2 変異体はHRを示した。avrRpt2以外のavr遺伝子に対してHRを開始できたことから 、avrRpt2で選抜され分離されたrps2変異体はavrRpt2に対して特異的であること が分かる。RPS2 遺伝子のマッピングおよびクローニング rps2変異体、rps2-101C、rps2-102C、rps2-201C、およびrps2-101Nの遺伝子解 析によって、これらの遺伝子はすべて、1個のメンデル型遺伝子座に予想される ように分離する遺伝子に一致することが明らかになり、これらは4つともすべて 対立遺伝子である可能性がもっとも高いことが明らかになった。この4つのrps2 変異体は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づいたマーカーを用いた、標準的なR FLPマッピング方法を用いて、第IV染色体の底部にマップされた(Yu et al.，(19 93)、supra;Kunkel et al.，(1993)supra;Mindrinos，M.,未発表)。分離解析に よって、rps2-101Cとrps2-102Cは、PCRマーカーのPG11に緊密に連鎖しているこ とが明らかになったが、rps2-201C変異体の染色体上の位置を決めるためにRFLP マーカーが用いられた(図1A)(Yu et al.，(1993)、supra;Kunkel et al.，(1993 )、supra)。続いて、RPS2遺伝子は、PG11の動原体寄りの側にマップされた。 RPS2/rps2ヘテロ接合体植物は、野生型植物とrps2/rps2ホモ接合変異体植物が 示す防御反応の中間的な反応を示した(Yu et al.，(1993)supra;Kunkel et al. ，(1993)supra)。ヘテロ接合体植物は、Psm ES4326/avrRpt2またはPst DC3000/a vrRpt2の侵入に反応してHRを開始したが、野生型植物に較べると、反応の始まり が遅く、最小接種量を多く必要とした(Yu et al.，(1993)supra;Kunkel et al. ，(1993)supra)。RPS2 遺伝子の高解像度マッピングおよびRPS2cDNAの単離 マッピングに基づいたRPS2遺伝子のクローニングを行うために、rps2-101N/rp s2-101Nをランズベルグ・エレクタ（Landsberg erecta）のRPS2/RPS2と交配させ た。F1世代の植物を自家受粉(「セルフ」)させ、そのF2植物165個体をセルフさ せてF3集団を作成した。標準的なRFLPマッピング方法によって、rps2-101Nは、R FLPマーカーPG11の近傍の動原体寄りの側に位置することが分かった。より詳細 な地図上の位置を得るために、rps2-101N/rps2-101Nを、劣性突然変異cer2とap2 の２つのマーカーを持つランズベルグ・エレクタ（Landsberg erecta）系統と交 配させた。cer2とap2の間の遺伝的距離は、約15cMで、rps2遺伝子座はこの間に 位置している。CER2 ap2またはcer2 AP2の遺伝子型を示したF2植物を集めてセル フ させ、各F2につき少なくとも20個体のF3植物にPsm ES4326/avrRpt2を接種してRP S2のスコアを採った。また、各F2系統にランズベルグ・エレクタ（ついて約20個 体のF3植物をまとめたものからDNAを調製した。図1に示された染色体ウォーキン グを行うために、CER2 ap2とcer2 AP2の組み換え体を用いた。 図1に示されるように、RPS2は、コスミドクローンE4-4およびE4-6でカバーさ れる28-35kbの領域にマップされた。この領域には、検出可能な転写物を生み出 す遺伝子が少なくとも6個含まれている。RNAブロッティング解析によって測定し たところ、rps2変異体において、これらの転写物の大きさとその発現レベルに有 意な差異は見られなかった。これらの転写物のそれぞれのcDNAクローンを単離し て、それらのうちの5個について配列決定した。後に述べるように、これらの転 写物の一つのcDNA-4が、RPS2遺伝子座に一致することが分かった。この実験から 、生態型コロンビアの野生型植物のRPS2と一致する3個の独立したcDNAクローン( cDNA-4-4、cDNA-4-5、およびcDNA-4-11)が得られた。RNAブロッティング解析に よって測定したところ、RPS2転写物の見かけの大きさは3.8kbと3.1kbであった。 4つ目の独立したcDNA-4クローン(cDNA-4-2453)は、別の実験でマッピングに基 づくRPS2の単離を用いて得られたものである。RPS2領域の約900kbにわたるM600 領域から採ったシロイヌナズナCol-0生態型のゲノムDNAの挿入配列をもち、それ が連続してオーバーラップしている酵母人工染色体(YAC)クローンを同定した。 シロイヌナズナのYACライブラリーは、「J．Ecker and E．Ward,supra」、「E． Grill and Somerville（1991）Mol．Gen．Genet．226:484-490」から得た。「H 」および「E」と名付けたコスミドは、YAC挿入物に由来し、RPS2の単離に用いら れた(図1)。 物理的にマップされたRFLPマーカー、RAPD(ランダムに増幅された多型DNA)マ ーカーおよびCAPS(切断して増幅した多型配列)マーカーを用いて、RPS2の遺伝的 および物理的な位置をより正確に決定した。RPS2/RPS2遺伝子型(No-0野生型)とr ps2-201/rps2-201遺伝子型(Col-0遺伝的背景)の植物を交配させてできた分離集 団を遺伝子マッピングに用いた。17B7LE、PG11、M600、およびその他のマーカー を用いてRPS2遺伝子座をマップした。高解像度の遺伝子マッピングを行うために 、YACおよびコスミドクローンの挿入配列の末端断片を用いて、強く連鎖したRFL Pマーカーの組み合わせを作成した(図1)(Kunkel et al．(1993)supra;Konieczny and Ausubel（1993）Plant J．4:403-410;Chang et al．(1988)PNAS USA 85:68 56-6860)。次に、コスミドクローンE4-4およびE4-6を用いて、この領域から、cD NA-4-2453を含んだ発現転写物(図1FのcDNA-4、-5、-6、-7、-8と名付けた)を同 定した。RPS2 DNA の配列解析 野生型Col-0植物および変異体rps2-101C、rps2-102C、rps2-201Cおよびrps2-1 01Nから得たcDNA-4のDNA配列解析によって、cDNA-4がRPS2に一致することが示さ れた。rps2-101C、rps2-102C、およびrps2-201Cの配列解析によって、表1に示さ れているように野生型配列から変化が起きていることが明らかになった。表１の 番号付けの仕組みは、第一メチオニンをコードする開始コドンATGから始まり、 このAがヌクレオチド1になる。変異体rps2-102Cに相当するcDNA-4のDNA配列解析 によって、アミノ酸残基の476番目が野生型配列とは異なっていることが分かっ た。さらに、rps2-101NからのcDNA-4に相当するcDNAのDNA配列解析によって、ロ イシンリッチな反復配列に含まれる部位であるアミノ酸残基581で10bpの挿入が あり、そのためにRPS2の読み枠に変化がおきていることが分かった。変異体rps2 -101Cには、鎖を終結させるコドンを形成させるような突然変異が含まれている 。変異遺伝子rps2-201CのDNA配列から、ヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフ とも類似性のあるLRR領域部分中のアミノ酸が1個が変わる変異が起きていること が分かり、この座位をRPS2遺伝子と名付ける根拠をさらに提供した。DNAとアミ ノ酸配列が図2に示されている。 野生型Col-0植物のRPS2に一致するcDNA-4のDNA配列解析によって、2,751bpの 長さの読み枠(2つの終止コドンの間)があることが明らかになった。この読み枠 の第一メチオニンコドンと3'側の終止コドンの間は2,727bpで、909個の推定アミ ノ酸ポリペプチドに相当する(図2の読み枠「a」を参照)。このアミノ酸配列の相 対分子量は104,460で、pIは6.51である。 後に検討されるように、RPS2は新しい病害抵抗性遺伝子に分類される。Rps2ポ リペプチドの構造は、これより前にクローニングされ公表されていた唯一の非病 原性遺伝子特異的な植物病害抵抗性遺伝子で、プロテインキナーゼ・ドメインと 推定されるドメインをもつPtoの産物の蛋白質の構造に類似していない。推定ア ミノ酸配列の上記の解析から、RPS2は、真核生物と原核生物両方に由来するその 他の２つのタンパクで保存されていることが明らかな蛋白質ドメインをいくつか 含んでいる。これらのドメインには、ロイシン・リッチ・リピート(LRR)(Kobe a nd Deisenhofer，(1994)Nature 366:751-756)、核酸結合部位、例えばキナーゼ1 aモチーフ(P-ループ)(Saraste et al．(1990)Trends in Biological Sciences T IBS 15:430-434)、ヘリックス-ループ-ヘリックス(Murre et al．(1989)Cell 56 :777-783)、およびロイシンジッパー(Rodrigues and Park（1993）Mol．Cell Bi ol．13:6711-6722)が含まれるが、これらに限られない。Rps2のアミノ酸配列は 、LRRモチーフ(アミノ酸残基505からアミノ酸残基867までのLRRモチーフ)を含む が、このモチーフは既知の多くの蛋白質に存在し、蛋白質-蛋白質の相互作用に 関係すると考えられている。このため、植物の病害抵抗性に関係する他の蛋白質 と相互作用できるのかもしれない。Rps2ポリペプチドのN末部位のLRRは、例えば 、酵母(Saccharomyces cerevisiae)のアデニル酸シクラーゼCYR1のLRRと関連し ている。膜貫通部位ドメインと推定されている領域(Klein et al．(1985)Bioche m.，Biophys．Acta 815:468-476)が、LRRのN末部位のアミノ酸残基350からアミ ノ酸残基365のところに位置している。ATP/GTP結合部位モチーフ(P-ループ)がア ミノ酸残基177からアミノ酸残基194の間のこれらのアミノ酸を含む位置にある と推測されている。モチーフについては、後により詳細に検討する。 推定アミノ酸配列の上記の解析からすると、Rps2ポリペプチドは、N末端の細 胞外領域とC末端の細胞内領域とからなる膜受容体構造を持っているのかもしれ ない。または、Rps2のトポロジーはこの逆で、N末端が細胞内領域で、C末端が細 胞外領域になっているのかもしれない。多くの場合、LRRモチーフは細胞外にあ り、Rps2のLRRは、N-グリコシル化を受けうる部位を5つ含んでいる。機能的相補性によるRPS2の同定 rps2-201ホモ接合体がシロイヌナズナに対応するゲノムDNAで相補されたこと から、cDNA-4をコードするゲノム領域がRPS2活性をもつことが機能的に確証され た。図1および図4のYAC、EW11D4、EW9C3およびYUP11F1に含まれているRPS2領域 から、野生型シロイヌナズナの、オーバーラップしながら連続する配列を含むコ スミドを構築した。コスミドベクターは、アグロバクテリウムが媒介する形質転 換によって、挿入配列を植物ゲノムに取り込ませる配列(「バイナリーコスミド 」と名付けられている)を含むpSLJ4541(イングランド(England)のノリッジ(Norw ich)にあるサンズベリ研究所(Sainsbury Institute)のJ．ジョンズ(J.Jones)氏 から入手)から構築した。「H」および「E」コスミド(図1)を用いて、シロイヌナ ズナのゲノムのRPS2領域からのDNAをもっているクローンを同定した。 RPS2領域のDNA挿入を含んでいるバイナリーコスミド40個以上を用いて、アグ ロバクテリウム媒介による形質転換を利用して、rps2-201ホモ接合変異体の形質 転換を行なった(Chang et al.(1990)p.28,Abstracts of the Fourth Internatio nal Conference on Arabidopsis Research,Vienna,Austria)。感受性のまま(avr Rpt2とavrRpt2なしのPsp 3121をもつP.シリンゲpv.ファセオリコラ(P.syringae pv.phaseolicola)菌株3121に感染させた後HRが起こらないことを観察することを 含む方法によって判定される)の形質転換体は、挿入DNAに機能的なRPS2が含まれ ていないことを示している。これらのコスミドは、図4に示された「Sus.」すな わち感受性の表現形質を持つ。avrRpt2特異的な病害抵抗性(avrRpt2をもつPsp 3 121を接種したときには強い過敏反応(HR)を示すが、avrRpt2なしのPsp 3121を接 種した後にはHRが起こらないことの表示を含む方法によって判定される)を獲得 した形質転換体によって、図4に示した「Res.」すなわち抵抗性の表現形質 を付与できる機能的なRPS2遺伝子が、挿入DNAに含まれていることが示された。p D4バイナリーコスミドを用いて得られた形質転換体は、上述したように強い抵抗 性の表現形質を示した。形質転換体に挿入DNAが存在することを、古典的な遺伝 子解析(病害抵抗性形質と強い遺伝的連鎖関係にあり、共形質転換した選抜マー カーによって与えられるカナマイシン抵抗性形質)およびサザン解析により確認 した。これらの結果から、RPS2は、コスミドpD4に含まれるシロイヌナズナの18k bのゲノム領域の部分にコードされていることが示された(図4)。 RPS2遺伝子座の位置をさらに特定し、それがrps2-201ホモ接合変異体に抵抗性 の表現型を与えることができることを確認するために、部分的にオーバーラップ するゲノムDNA挿入配列をもつ6個のバイナリーコスミドのセットを調べた。RPS2 領域の5個のcDNAクローンに一致する転写物の位置に基づいて、オーバーラップ する挿入配列pD2、pD4、pD14、pD15、pD27およびpD47を選んだ(図4)。これらの 形質転換実験では、アグロバクテリウムに媒介される形質転換のために真空浸透 法を利用した(Bechtold et al.，(1993)C.R．Acad．Sci．Paris 316:1194-1199) 。コスミドpD2、pD14、pD15、pD39およびpD46によるアグロバクテリウム媒介の 形質転換は、根の形質転換/再分化プロトコールを用いて行なった(Valveekens e t al．(1988)，PNAS 85:5536-5540)。これらの形質転換体におけるRPS2活性を測 定する、病原菌の接種実験の結果が図4に示されている。 真空浸透法を修正して用いて、これらの実験をさらに確認した。特に、ベクト ールド(Bechtold)ら(supra)の方法を以下のように修正した。すなわち、植物を 、スクリーンで覆ったピート主体の鉢植え土で生育させ、一次花序を摘除し、二 次花序(長さ、約3-15cm)をつけた植物体を逆さまにして、そのまま浸透用培地に 入れて、浸透させてから、土から抜き去ることなしに、種子を収穫するまで生育 させた(詳細なプロトコールは、AAtDBコンピューターデータベース上で利用可能 (43))。最初のpD4形質転換体の中に、導入した配列が存在することを、pD4ベク ターおよび挿入配列を(別々に)プローブとして用いたDNAブロット解析によって 明らかにした。真空浸透プロトコールによって得られた形質転換体の中に期待し た配列が存在することもDNAブロットによって確認した。再生が容易なrps2-201/ rps2-201×No-0のマッピング集団を用いて、根の形質転換実験(19)を行なった 。pD4については植物体の形質転換によって、pD2、14、16、39および49について は根の形質転換によって、また、pD2、4、14、15、27および47については修正さ れた真空浸透によって形質転換体を得た。 補足的な形質転換実験では、cDNA-4またはcDNA-6のみにあたる、完全なコーデ ィング領域と1kb以上上流のゲノム配列をもつバイナリーコスミドを利用した。 真空浸透形質転換法を用いて、rps2-201Cホモ接合体の遺伝的背景(図4のpAD431) の中に野生型cDNA-6のゲノム領域をもつ、3個の別々の形質転換体を得た。これ らの植物で、avrRpt2依存的な病害抵抗性を示したものはなかった。rps2-201Cホ モ接合変異体を、野生型のゲノムcDNA-4(p4104およびp4115、これらは各々、cDN A-4の読み枠のすべてに相当するCol-0のゲノム配列および、約1.7kbの5'側の上 流配列と停止コドンから約0.3kb下流の3'側配列を持っている)で形質転換した。 これらp4104およびp4115形質転換体は、rps2が由来した野生型のRPS2ホモ接合体 と同じような病害抵抗性の表現型を示した。さらに別の変異体(rps2-101Nおよび rps2-101Cのホモ接合体)も、cDNA-4に相当するゲノム領域で形質転換したとき、 avrRpt2依存的な抵抗性を示した。RPS2 配列によって別の抵抗性遺伝子を検出できる RPS2のcDNAをプローブとして用いた、シロイヌナズナゲノムDNAのDNAブロット 解析から、シロイヌナズナには、RPS2またはその一部にハイブリダイズするDNA 配列がいくつか含まれていることが分かり、シロイヌナズナのゲノムにいくつか の関連の遺伝子が存在することが示唆された。 前記の説明と、図2に示された核酸配列[配列番号:1]から、RPS2遺伝子と約50 ％以上の配列同一性をもつ他の植物の病害抵抗性遺伝子を分離することができる 。9塩基長よりも長く、また、好ましくは約18塩基よりも長い、RPS2遺伝子また はその一部を含むオリゴヌクレオチドプローブによって、検出と単離を行うこと ができる。同じ構造上のドメインを持つ病害抵抗性遺伝子を単離する手段を提供 するので、プローブには、Rps2ポリペプチド[配列番号:2-5]を特に構造上特徴付 ける部分をコードする配列に対するものが好ましい。「Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John wiley & Sons(1989)」に記載されてい るような標準的な技術を用いて、ハイブリダイゼーションを行なった。 例えば、RPS2遺伝子を検出するための非常に厳密な条件では、約42℃で約50％ ホルムアミドでハイブリダイゼーションを行ない、最初の洗滌は約65℃、約2×S SCおよび約1％SDSで、その後約65℃、約0.1％SSCで2回目の洗滌を行なう。厳密 度の低い条件で、RPS2遺伝子に約50％配列が一致するRPS遺伝子を検出するには 、例えば、約42℃、ホルムアミドなしでハイブリダイゼーションを行ない、最初 の洗滌は約42℃、約6×SSCおよび約1％SDSで、2回目の洗滌を約50℃、約6×SSC および約1％SDSで行なう。RPS2のLRR領域の中間部位をコードしている、およそ3 50ヌクレオチドのDNAプローブを、上記の実施例のプローブとして用いた。厳密 度の低い条件下で、Rps2のLRRモチーフの中間部位をコードしているDNAにハイブ リダイズするのに十分な配列同一性をもつ配列として、BamHI消化したシロイヌ ナズナのゲノムDNAの中で、最低5本のDNAバンドを検出した。LRRモチーフの外側 にあり、RPS2のN末端をコードするRPS2遺伝子の300ヌクレオチドを含むプローブ を用いても同じ結果が得られた。 RPS2に配列同一性をもつ遺伝子中のオリゴヌクレオチドに隣接する配列のみを 増幅するよう設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、分子生物学の 分野における当業者によく知られたPCR増幅技術によって、他の病害抵抗性遺伝 子の単離が行われた。場合によっては、プライマーは、増幅産物を適当なベクタ ーにクローニングできるように設計される。 これらの配列から適切なオリゴヌクレオチドが、標準的な方法を用いることで設 計され、そして調製される。p−ループドメインを基本とするRPSオリゴヌクレオ チドの特定の例は以下に列挙したとおりである（Nは、A、C、T、またはGである ）。 オリゴヌクレオチドの設計に有用な他の共通RPSモチーフが以下に示されてい る。これらのモチーフも図5（AまたはB）の配列に示されている。 上記のモチーフと図5A及びBに設計されているモチーフから、適当なオリゴヌク レオチドが設計されて調製される。このようなRPSオリゴヌクレオチドの特定の 例は、以下に列挙したとおりである（Nは、A、T、C、またはGである）。 RPSファミリー遺伝子の候補をコードするクローンが一旦同定されると、次に 本明細書に記述した方法、または分子植物病理学の技術分野でよく知られた他の 方法を用いてその遺伝子が植物宿主に疾病抵抗性を付与できるか否かが決定され る。植物耐性遺伝子の同定のためのバイオリスティック一過性発現アッセイ 本発明者らは、植物細胞に疾病耐性を付与できる可能性について、遺伝子を同 定し実質的に特徴づけるための迅速で広く応用可能な方法を遂行することのでき る機能的な一過性発現システムを開発した。簡単に説明するとこのアッセイシス テムは、植物組織試料（例えば葉から得られる一片の組織）に植物疾病耐性の候 補となる遺伝子をバイオリスティックに形質転換することによって伝達する工程 と、続いて疾病−耐性応答（例えば過剰応答）が起こっているか起きていないか を明らかにすることによって組織内でのその遺伝子の発現性を評価する工程とを 含む。このアッセイは、遺伝子研究または形質転換研究で敏感に反応しないよう な疾病−耐性遺伝子などの、広範囲の種類の植物種から得られる疾病−耐性遺伝 子を同定する方法を提供する。 このアッセイの原理は、図9の上部に示されている。一般的には、問題となる 耐性遺伝子で突然変異が起こっている植物細胞が用いられる。バイオリスティッ クな形質転換を行う前に植物組織には、対応する無毒性の遺伝子を保持する植物 病原性の細菌を侵入させている。さらにこの耐性遺伝子活性についてアッセイが 行われるべき遺伝子は、バイオリスティックによってレポーター遺伝子とともに 導入される。共に侵入したリポーター遺伝子の発現は、形質転換された細胞が生 存していることの指標として作用する。両方の遺伝子は強力かつ組織的なプロモ ーターの調節の下で発現する。アッセイが行われる遺伝子が耐性遺伝子の機能を 相補しないならばその植物細胞は過敏反応（HR）を行わず、したがって生き残る （図9の上段の右参照）。この場合細胞は、大量のリポータ−遺伝子産物を蓄積 する。これに対してかりに耐性遺伝子が導入されていると、その植物細胞は無毒 性の遺伝子を運搬する細菌から生じるシグナルを認識し、そして発現した耐性遺 伝子産物がその機能を相補するため過敏反応を行う（図9の上段の左参照）。こ の場合その植物細胞は、大量のリポーター遺伝子産物を蓄積するのに充分な時間 がないため死滅してしまう。適切に調節する（例えば葉の半分の非感染の部分の ように）ことにより評価される形質転換効率が付与されると、リポータ遺伝子産 物の蓄積を測定することでアッセイの行われる遺伝子が耐性遺伝子の機能を相補 するかどうかを示すことができる。 ある作用実験例において本発明者らは、細菌性の無毒性遺伝子avrRpt2と対応 するシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）耐性遺伝子RPS2（図9の下段参照 ）とを用いて一過性発現アッセイをおこなった場合の効果をここで示している。 簡単に説明すると、avrRpt2を保持するP.シリンゲ（P．syringae）を用いて予め 感染させたrps2変異体の葉は、二つのプラスミドが一緒に導入されている。ここ でプラスミドの一つはRPS2遺伝子を含んでおり、またもう一つはβ−グルクロニ ダーゼ（GUS;Jefferson et al.，1986，supra参照）をコードする大腸菌（Esche richia coli）uidA遺伝子を含んでいる。RPS2遺伝子とuidA遺伝子との両方は、 カリフラワーモザイクウイルスから得られる強力な構成35S プロモーターの下 流に存在している（Odell et al.，infra参照）。35S−RPS2構築物がrps2変異を 相補するならば、形質転換された細胞はavrRpt2を保持するP.シリンゲ（P．syri ngae）に応答して予定された細胞死に急速に至り、GUS活性が蓄積することは比 較上ほとんどない。かりにrps2変異が相補されないならば、細胞死は起こらず、 GUS活性が高いレベルで蓄積される。GUS活性についてのこれらの相違は、組織化 学的に検出される。RPS2を同定するのに用いられるcDNAライブラリーは発現ベク ターpKEx4trで構築されているため、pKEx4tr内の35S−RPS2 cDNA構築物は一過性 のアッセイで直接用いることができる。図11に示すようにpKEx4trは、cDNA挿入 断片を非指向性で挿入できるようにデザインされている。挿入されたcDNAは、35 5カリフラワーモザイクウイルスプロモーターの調節下で発現する。 本発明者らが出した結果は、図9の下段に示されている。この実験において本 発明者らは、rps2変異体植物の葉の一方の側をavrRpt2を保持するP．syringae p v．phaseloicola 3121（Psp 3121/avrRpt2）を用いて感染した。Psp 3121はシロ イヌナズナ（A．thaliana）の弱い病原体であり、Psp 3121/AvrRpt2は耐性遺伝 子RPS2を運搬する植物（例えば、野生型の植物）での過剰反応（HR）を誘発する ことができる。5週間経過したアラビドプシス植物の葉に、記述されている（Don g et al.，supra）ような手で行う湿潤法によって2×108／mlの用量の適当な細 菌の懸濁液を湿潤させた。ある時間（通常は2−4時間）のインキュベートを行っ た後、その葉を感染してから2−4時間たった時点でバイオーラッド PDS−1000 ／He装置（1100psi）を用いて衝撃を与えた。金の粒子をメーカーの使用説明書 に従って作った。それぞれの衝撃（ボンバード）では、1．4μgのpKEx4tr−Gと 、0．1μgのテストするプラスミドと、0．5mgの1μm金粒子とが用いられた。衝 撃を与えた後その葉を過湿チャンバー内で22℃で1日間インキュベートし、続い て5−ブロモ−4−クロロ−3−インディリルグルクロニダーゼ（X−Gluc）を用い 、37℃で12時間かけて組織化学的なGUS染色を行った(Jefferson，1987，supra参 照）。X−glucを用いるこの染色方法では、GUS酵素を発現する細胞は青色に染色 される。形質転換の効果（即ち形質転換された細胞の密度）は一枚の葉ではその 両側で同じであるため、葉の感染されていない方の側は、この葉の形質転換の効 果についての対照として利用される。もし感染された側にある形質転換された細 胞が急速に死滅するのであれば、感染された側にある細胞の染色は、感染されて いない側にある細胞の染色よりも弱いであろう。耐性遺伝子RPS2が共に導入され た場合では、葉の感染された側にある形質転換された細胞は感染されていな い側にある細胞よりもずっと弱くしか染色されなかった（図10参照）。対照実験 では、関連のない遺伝子を共に導入した場合、感染された側にある形質転換され た細胞は感染されていない側の細胞と同程度の染色強度であることが示された（ 図10参照）。 したがって表2にまとめたように、35S−RPS4（cDNA−4）は、cDNA−5またはcD NA−6とは違ってrps2−101CのHR表現型と相補的である（図1参照）。 aGUS活性の減少が葉の湿潤された側で観察された場合、その応答を＋と評価 した（図10参照）。 RPS2 cDNA−4のクローン4及び11はいずれも、二つの大きさの異なるRPS2転写 物であって、rps2変異体の表現型と相補的であり、両転写物が機能的な産物をコ ードしていることを示している。さらに35S−RPS2は、変異体rps2−102C、rps2 −101N、及びrps2−201Cと相補的でもあり、またrps2−101C、rps2−102C、rps2 −201C、及びrps2−101N変異体がすべての対立遺伝子であることも確認した。簡 単に言うとクローニングされたRPS2遺伝子はこの一過性発現アッセイにおけるrp s2変異体と相補的であり、RPS2による相補性は4つの入手可能なrps2変異体菌株 すべてについて認められた。 次に本発明者らは一過性アッセイシステムを用いることによって、シグナルを 発生するavrRpt2に対するクローニングされたRPS2遺伝子の特異性（即ち、P.シ リンゲ(P．syringae)無毒性遺伝子と対応するシロイヌナズナ(A．thaliana)耐性 遺伝子（それぞれavrRpm1及びRPM1）の「遺伝子に対する遺伝子」なる特異性） をテストした。この実験では、avrRpt2を運搬するP.シリンゲ(P．syringae)また は関係のない無毒性の遺伝子avrRpm1を用いて攻撃した時にHRが開始できないよ うなrps2−101 rpm1二重突然変異体を使用している（「Debener et al.，Plant Journal 1:289-302，1991」参照）。表3にまとめたようにrps2変異体の表現型の 35S−RPS2による相補性は、avrRpt2によって発生するシグナルの存在に現れるだ けであって、RPS2が非特異的な様式で植物耐性応答を簡単に感作しないことを示 している。 aGUS活性の減少が葉の湿潤された側で観察された場合、その応答を＋と評価 した（図10のパネルＢ参照）。 b△GUSはuidA遺伝子内に内部欠失を含む35S−uidAである。 また表3にも示されているようにRPS2遺伝子は、葉がPsp 3121／avrRpm1ではな くPsp 3121avrRpt2で感染された場合に変異体の表現型と相補的であった。した がってRPS2遺伝子は、rps2突然変異だけに相補的であり、rpm1突然変異には相補 的でなかった。 本発明者らはまた、rps遺伝子ファミリーの遺伝子、例えばrps2（ただし他の 遺伝子ではない）の過剰発現が一過性のアッセイで明らかな細胞死を導き、クロ ーニングされた推定の耐性遺伝子に対応する無毒性の遺伝子を知る必要性を回避 できることも発見した。 このアッセイを用いると、植物疾病−耐性遺伝子はcDNA発現ライブラリーから 同定することができる。ある特定の例ではcDNAライブラリーは発現ベクターに構 築され、続いて本明細書に記述したように、植物栽培品種または問題の耐性遺伝 子を欠如するそれに対応する変異植物に導入される。好ましくはcDNAライブラリ ーは小さなプールに分割されて、それぞれのプールがリポーター遺伝子とともに 導入される。かりにあるプールが耐性遺伝子のクローンを含んでいる（即ち、そ のプールが耐性遺伝子機能に「相補的」である）ならば、その陽性プールをより 小さなプールに分割し、同様の工程を繰り返すことで一つの陽性クローンが最終 的に同定される。この方法によれば、遺伝的交雑または形質転換体の生成を行う ことなく問題の耐性遺伝子を容易にクローニングすることができる。 本発明者らはここで、RPS遺伝子ファミリーのもう一つの遺伝子、即ちトマト のPrf遺伝子のクローニングについて記述する。 Prf遺伝子のクローニングを行う際の最初の工程を、PrfがトマトのPto遺伝子 にしっかりと結合していることを示す従来の遺伝子分析を行うことから始めた（ Salmeron et al.，The Plant Cell 6:511-520,1994参照）。この工程は、Ptoの 座が含まれる長さ200kbのコスミドコンティグ（a cosmid contig）の構築を促し た。このコンティグから得られるDNAプローブを、材料源としてのavrPro無毒性 遺伝子を発現するPstを用いて感染させたトマトの葉の組織より構築されたトマ トのcDNAライブラリーをスクリーニングするのに用いた。二つのクラスのcDNAを 、クローンと行った交差ハイブリダイゼーションに基づいて同定した。一つのク ラスのcDNAはPto遺伝子ファミリーの一つに対応したが、これに対してもう一つ のクラスはPtoファミリーの遺伝子とハイブリダイゼーションしなかった。Prfが Pro遺伝子に非常に近接して存在すると仮定して（前述の遺伝子分析に基づいて ）、2番目のクラスのcDNAに対してPrfクローンとなる候補性について更に分析し た。これらのクローンを、ジエポキシブタン処理または高速の中性子処理を行う ことによって単離された6個の独立のprf突然変異ラインから得られるDNAを含む フィルターとハイブリダイゼーションした。高速中性子処理をした変異体の一つ では、cDNAプローブはゲノムのDNAに1．1kbの欠失が存在しており、そのことはc DNAクローンが実際にPrfを表現することを示している。この欠失部に対応する野 生型のDNAを、Prf／Prfトマトからクローニングした。5kbの領域が、p−ループ 及びロイシン含量の多い反復モチーフを含むタンパク質を潜在的にコードするよ うに配列されていた。このことはこのDNAがPrfをコードするのではないかという 仮説を支持している。対応するDNAを高速中性子による変異体植物からクローニ ングして配列した。このDNAの配列により、p−ループとロイシン含量の多い反復 コード領域の間でDNAを活性化する単純な1．1kbの欠失が生じる突然変異が起き ることが確認された。この遺伝子は、この領域からmRNAが転写されることを示す RT−PCR分析に基づいて発現した。クローニングされたDNAがPrf遺伝子であるか どうかの同定は、欠失を生じる突然変異が起きていることと予想されたタンパク 質配列が存在していることの両方に基づいており、それはアミノ末端の半分程度 にある他のクローニングされた疾病耐性遺伝子産物（ここに記述されているよう に）に非常に似たパッチ部を現している。Prf遺伝子の配列の一部を、図12に示 してある。トランスジェニック植物細胞および植物体におけるRPSの発現 Rps2ポリペプチドを発現させるRPS2遺伝子を含むDNA配列を植物体に導入する ことによって、avrRpt2を持っている病原菌に感受性の植物でRPS2遺伝子を発現 させることができた。植物細胞の安定した形質転換やトランスジェニック植物の 作製に適した多くのベクターが一般に入手可能である。このようなベクターは、 例えば「Pouwels et al.,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,Supp.198 7」、「Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Acade mic Press,1989」、および「Gelvin et al.,Plant Molecular Biology Manual,K luwer Academic Publishers,1990」に開示されている。典型的には、植物発現ベ クターには、（1）5'および3'の制御配列による転写制御下の一個以上のクロー ン化された植物遺伝子、および（2）優性の選択マーカーが含まれる。このよう な植物発現ベクターは、また、必要であればプロモーターの制御領域（例えば、 誘導性または構成性の、環境的または発生的に制御され、細胞または組織に特異 的な発現）、転写開始部位、リボソーム結合部位、RNAプロセシングシグナル、 転写終結部位、および/またはポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。 本発明による植物の病害抵抗性遺伝子を発現させるために用いることができる 、有用な植物プロモーターの例は、例えば、カリフラワー・モザイクウイルス（ CaMV）の35Sプロモーターである。これらのプロモーターは、ほとんどの植物組 織で高レベルの発現を可能にし、またこれらのプロモーター活性はウイルスにコ ードされる蛋白質に依存しない。35Sプロモーターも19Sプロモーターも、CaMVに 由来している。トランスジェニック植物のほとんどの組織において、CaMVの35S プロモーターは強いプロモーターである（「Odel et al.，Nature 313:810，(19 85)」参照）。また、CaMVのプロモーターは単子葉類でも高い活性をもつ（例え ば「Dekeyser et al.，Plant Cell 2:591，(1990)」、「Terada and Shimamoto ，Mol．Gen．Genet．220:389，(1990)」参照）。 他の有用な植物プロモーターには、ノパリン（nopaline）合成酵素プロモータ ー（An et al.，Plant Physiol．88:547，（1988））、およびオクトピン（octo pine）合成酵素プロモーター（Fromm et al.，Plant Cell 1:977，（1989））が 含まれるが、これらに限定されない。 一定の応用場面において、RPS2遺伝子産物またはavrRpt2遺伝子産物を、適当 な組織において、適当なレベルで、または適当な発生段階で産生させることが望 ましいかもしれない。したがって、環境、ホルモン、および／または発生上のサ インに応じて制御されることが分かっている、さまざまな遺伝子プロモーターが 存在し、それぞれの制御配列に具現した独自の特徴を持つ。これらは、以下の遺 伝子発現に関与する遺伝子プロモーターを含む。（1）熱制御による遺伝子発現 （例えば「Callis et al.，Plant Physiol．88:965，（1988）」参照）、（2） 光制御による遺伝子発現（例えば「Kuhlemeier et al.，Plant Cell 1:471，（1 989）」に開示されているエンドウのrbcS-3A、「Schaffner and Aheen，Plant C ell 3:997，（1991）」に開示されているトウモロコシのrbcSプロモーター、ま たは「Simpson et al.，EMBO J．4:2723，（1985）」に開示されているエンドウ で発見されたクロロフィルa/b結合蛋白質）、（3）ホルモン制御による遺伝子発 現（例えば「Marcotte et al.，Plant Cell 1:969，（1989）」に開示されてい るコムギのEm遺伝子由来のアブシジン酸応答配列）、（4）傷害誘導による遺伝 子発現（例えば「Siebertz et al.，Plant Cell 1:961，（1989）」に開示され ているwunI）、または（5）器官特異的遺伝子発現（例えば「Roshal et al.，EM BO J．6:1155，（1987）」に開示されている腫瘍特異的貯蔵蛋白質遺伝子、「Sh ernthaner et al.，EMBO J．7:1249，（1988）」に開示されているトウモロコシ の23-kDaのザイン遺伝子、または「Bustos et al.，Plant Cell 1:839，（1989 ）」に開示されているインゲンマメのβ-ファセオリン遺伝子）。 植物の発現ベクターはまた、場合によっては、例えばイントロンなどの、効率 的なRNA合成と蓄積に重要であることが示されている（Callis et al.，Genes an d Dev．1:1183，（1987））RNAプロセシング・シグナルを含んでいるかもしれな い。RNAスプライシング配列の位置は、植物におけるトランス遺伝子の発現レベ ルに影響を与える。この事実を考慮すると、遺伝子発現のレベルを修正するため に、トランス遺伝子の、Rps2ポリペプチドをコードする配列の上流か下流にイン トロンが位置してもよい。 前記の5'調節制御配列に加えて、発現ベクターは、植物遺伝子の3'領域に、一 般的に存在する調節制御配列を含んでいてもよい(Thornburg et al.,Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 84:744(1987)；An et al.，Plant Cell 1:115，（1989））。 例えば、mRNAの安定性を増すために、発現ベクターには3'終結領域が含まれてい てもよい。このような終結領域の一つは、ジャガイモのPI-II終結領域に由来す るものであってもよい。さらに、普遍的に用いられる、他の終結因子は、オクト ピンまたはノパリン合成酵素のシグナルに由来するものであってもよい。 植物発現ベクターはまた、典型的には、形質転換された細胞を同定するために 用いられる、優性の選抜マーカーを含んでいる。植物のシステムにとって有用な 選抜マーカー遺伝子は、例えばハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシ ン、G418、ストレプトマイシン、またはスペクチノマイシンに対する抵抗性をコ ードする遺伝子のような抗生物質抵抗性遺伝子をコードする遺伝子を含む。光合 成に必要な遺伝子もまた、光合成欠損系統における選抜マーカーとして用いられ うる。最後に、除草剤抵抗性をコードする遺伝子が選抜マーカーとして用いられ うるが、有用な除草剤抵抗性遺伝子には、広範性除草剤バスタ（Basta（登録商 標）（ヘキストAG（Hoechst AG）、フランクフルト（Frankfurt）、ドイツ（Ge rmany））に対する抵抗性を付与する酵素ホスフィノスリチン・アセチルトラン スフェラーゼをコードするbar遺伝子が含まれる。 特定の選抜用薬剤に対する植物細胞の感受性を決定し、形質転換された細胞の 全部でないにしても、そのほとんどを殺せる、この薬剤の濃度を決定することに よって、選抜マーカーの効率的な利用が促進される。タバコの形質転換に対する 抗生物質の有用な濃度には、例えば、75〜100μg/ml（カナマイシン）、20〜50 μg/ml（ハイグロマイシン）、または5〜10μg/ml（ブレオマイシン）が含まれ る。除草剤抵抗性について形質転換体を選抜するための有用な方法が、例えば、 「Vasil I.K.,Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Vol I,II,I II,Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press,New York, 1984」に述べられている。 遺伝子発現のレベルは、プロモーターとRNAプロセシング・シグナルと終結要 素との組み合わせによるだけでなく、どのようにこれらの要素を遺伝子発現のレ ベルを上昇させるために用いるかにもよることは、植物分子生物学の分野の当業 者にとっては自明のことであろう。 上記の例示的な方法は、RPSファミリーのどの遺伝子の発現にも使用されるで あろう。植物の形質転換 植物発現ベクターの構築にあたって、トランスジェニック植物を作製するため 、組み換え遺伝物質を宿主植物に導入するための標準的な方法がいくつか知られ ている。これらの方法には、(1)アグロバクテリウム媒介による形質転換(A．tum efaciens or A．rhizogenes)(例えば「Lichtenstein and Fuller In:Genetic En gineering,vol.6，PWJ Rigby，ed，Lonon，Academic Press，1987」および「Lic htenstein，C．P.，and Draper，J.,In DNA Cloning Vol II，D.M.Glover,ed,Ox ford,IRI Press,1985」参照)、(2)粒子輸送システム(例えば「Gorden-Kamm et a l.,Plant Cell 2:603，(1990)」または「BioRad Technical Bulletin 1687,supr a」参照)、(3)マイクロインジエクション・プロトコール(例えば「Green et al. ,Plant Tissue and Cell Culture,Academic Press,New York,1987」参照)、(4) ポリエチレングリコール(PEG)法(例えば「Draper et al.，Plant Cell Physiol .23:451,(1982)」または例えば「Zhang and Wu,Theor.Appl.Genet.76:835,(1988 )参照)、(5)リポソーム媒介のDNA導入法(例えば「Freeman et al.，Plant Cell Physiol.25:1353,(1984)」参照)、(6)エレクトロポレーション法(例えば「Gelvi n et al.supra;Dekeyser et al.supra」または「Fromm et al.，Nature 319:791 ，(1986)」参照)、および(7)撹拌法(例えば「Kindle,K.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U SA 87:1228,(1990)」参照)。 以下はアグロバクテリウム媒介による植物の形質転換の概要を示す実施例であ る。植物細胞のゲノムに導入される遺伝子を操作するための一般的な過程は、二 つの段階を経る。第一は、クローニングとDNA修飾のステップはすべて大腸菌の 中で行われ、目的の遺伝子構築物を含むプラスミドを、接合によってアグロバク テリウムの中に導入する。第二段階として、前の結果できたアグロバクテリウム の菌株を用いて植物細胞を形質転換する。このように、一般化した植物発現ベク ターとなるために、プラスミドにはアグロバクテリウムの中での複製が可能な複 製開始点および大腸菌の中で機能する多コピー数複製開始点が含まれている。こ のため、後で植物の中に導入するためにアグロバクテリウムへの導入を行なう前 に、大腸菌の中でトランス遺伝子を簡単に産生させて調べることができる。抵抗 性遺伝子をベクターに入れることができるが、一つは、例えばストレプトマイシ ンなどバクテリアで選抜するためのもので、もう一つは、例えばカナマイシン抵 抗性や除草剤抵抗性遺伝子のように植物で発現するものである。また、適当な調 節配列および方向性をもつT-DNAの境界配列に機能的に結合した、1個以上のトラ ンス遺伝子を付加するための制限酵素部位もある。境界配列は、アグロバクテリ ウムの移行機能によって認識されたとき、植物に移行する領域を定める配列であ る。 別の実施例において、クローン化されたDNAを沈着させたタングステンのミク ロ発射物を細胞の中に挿入して植物細胞を形質転換することができる。挿入に用 いるバイオリスティック装置(バイオラド社、ハーキュリーズ、カリフォルニア 州)の中で、火薬の充填(22口径のパワー・ピストン・ツール・チャージ)または 圧縮空気による発射によって銃身からプラスティックのマクロ発射物を打ち出す 。DNAが沈着したタングステン粒子懸濁液のアリコットをプラスティック製のマ クロ発射物の前に置く。後者を、マクロ発射物が通過できない小孔が開いた、ア クリル製の遮断板に向かって発射する。この結果、プラスティック製のマクロ発 射物は遮断板に当たって砕け、タングステンのミクロ発射物が、遮断板の穴を通 って標的に向かって進み続ける。本発明に関しては、標的はどんな植物の細胞や 組織や種子や胚でもよい。細胞に導入された、ミクロ発射物上のDNAは、核また は葉緑体のいずれかに取り込まれる。 植物細胞中のトランス遺伝子の導入と発現は、今や、当業者にとっては日常的 な操作になっている。これは、遺伝子発現実験を行なうための、また、農業上な いし商業上有益な、改良された植物品種を得るための主要な手段になっている。トランスジェニック植物の再生 植物発現ベクターで形質転換された植物細胞を、例えば、単一の細胞、カルス 組織、または葉ディスクから、標準的な植物組織培養技術によって再生すること ができる。ほとんどすべての植物について、さまざまな細胞、組織、または器官 をうまく培養して完全な植物体に再生できることは、当業者によく知られている 。そのような技術については、例えば「Vasil supra」、「Green et al.，supra 」、「Weissbach and Weissbach，supra」、および「Gelvin et al.,supra」に 記載されている。 可能な実施例の一つとして、選抜マーカー遺伝子(例えば、カナマイシン抵抗 性)、すなわち、自身のプロモーターおよびターミネーターの支配下、または必 要であれば、35SのCaMVプロモーターやノパリン合成酵素のターミネーターなど の外因性制御配列の支配下でクローン化されたRPS2遺伝子を有するベクターによ って、アグロバクテリウムを形質転換する。ベクターが入ったアグロバクテリウ ムによる葉組織の形質転換を、ホーシュら(Horsch et al.)の記述(Science 227: 1229，(1985))に従って行なった。数週間後(例えば、3から5週間後)、カナマイ シン(例えば、100μg/ml)を含む植物組織培養培地で、形質転換体と推定される ものを選抜する。次に、カナマイシン抵抗性の芽を、発根を開始させるホルモン を入れていない植物組織培養培地の上に置く。そして、温室で成長させるカナマ イシン抵抗性植物を選抜する。必要であれば、次に、自殖させたトランスジェニ ック植物からの種子を土を含まない培地に播いて、温室で育てることができる。 ホルモンなしでカナマイシン入りの培地に表面を殺菌した種子を播いて、カナマ イシン抵抗性の後代を選抜する。標準的な技術(例えば、「Ausubel et al.supra ;Gelvin et al.supra」)を用いて、トランス遺伝子の取り込みに関する解析を行 なう。 次に、トランス遺伝子DNAの伝達について、標準的な免疫ブロットおよびDNA/R NA検出技術によって、選抜マーカーを発現しているトランスジェニック植物をス クリーニングする。陽性のトランスジェニック植物およびそのトランスジェニッ ク植物の後代はそれぞれ、同じトランス遺伝子を用いて作製された他のトランス ジェニック植物と比較すると異なっている。トランス遺伝子DNAの植物ゲノムDNA への取り込みは殆どの場合無作為で、取り込まれた部位がトランス遺伝子の発現 のレベルならびに組織および成長パターンに大いに影響する。そのため、各トラ ンス遺伝子について、通常は、多数のトランスジェニック系統をスクリーニング し、最も適当な発現プロフィールをもつ植物の同定および選抜を行う。 トランス遺伝子の発現レベルについてトランスジェニック系統を評価する。発 現陽性植物の同定および定量を行うために、RNAレベルでの発現をまず測定する 。RNA解析のためには標準的な技術を用いる。標準的な技術には、トランス遺伝 子のRNAテンプレートだけを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド・プ ライマーを用いたPCR増幅アッセイと、トランス遺伝子に特異的なプローブを用 いた溶液ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば「Ausubel et al.,supra」参 照)が含まれる。次に、Rps2ポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタン免 疫ブロット解析を用いて、蛋白質発現についてRNA陽性植物体を解析する(例えば 「Ausubel et al.,supra」参照)。さらに、トランスジェニック組織の中での発 現部位の位置を決めるために、それぞれトランス遺伝子特異的なヌクレオチドプ ローブと抗体を用いて、標準的なプロトコールにしたがったインサイチュー・ハ イブリダイゼーションおよび免疫細胞化学を行なうことができる。 いずれかの細胞またはトランスジェニック植物でRps2ポリペプチドが発現され ると(例えば、上記のように)、例えば、アフィニティー・クロマトグラフィーな どの標準的な技術を用いてRps2ポリペプチドを分離することができる。一つの実 施例において、抗Rps2抗体(例えば「Ausubel et al.,supra」に述べられている 通りに作成されたか、標準的な技術によって作成されたもの)をカラムに結合さ せ、ポリペプチドを分離するために用いてもよい。アフィニティー・クロマトグ ラフィーに先立ち、標準的な方法によって、Rps2産生細胞の溶解と分画を行なっ てもよい(例えば「Ausubel et al.,supra」参照)。一旦分離されたなら、必要が あれば、例えば高性能液体クロマトグラフィー(例えば「Fisher,Laboratory Tec hniques In Biochemistry And Molecular Biology,Work and Burdon,eds.,Elsvi er,1980」参照)によって、組み換えポリペプチドをさらに精製することができる 。 これら、ポリペプチドの発現と精製のための一般的な技術を、有用なRps2断片 ないし類似体を産生および分離するために用いることもできる。抗体の産生 前述したポリペプチド（例えば、組換えタンパク質、または理論的に導き出し たアミノ酸配列に基づいて化学的に合成したRPSペプチド）を用いることでRPSポ リペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を標準的な手法（例えば、「 Ausubel et al.，supra」参照）を用いて産生することができ、さらに例えばペ プチド抗原親和性クロマトグラフィーを続いて行うことで単離できる。またモノ クローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ手法（例えば、「e．g.，Kohler et al.，Nature 256:495，1975」、「Kohler et al.，Eur．J．IEunol．6:292,197 6」、「Hammerling et al.，in Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas ，Elsevier，N．Y.，1981」、及び「Ausubel et al.，supra」参照）を用いても 調製することができる。 一旦生成してからポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、ウエスタ ーンブロット法または免疫沈降分析法によって特異的RSPポリペプチド認識性に ついてテストされる（「Ausubel et al.，supra」に記載された方法による）。R PSポリペプチドを特異的に認識する抗体は本発明において有用であると考えられ 、このような抗体は例えば、「Ausubel et al.，supra」に記載された組換え体 発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。抗体産生のた めの代表的なペプチド（Rpsから誘導される）は、次の配列を含む。 使用法 形質転換された植物細胞にRPS2を導入すると、avrRpt2無毒性遺伝子を運搬す る細菌性の病原体に対する抵抗性が付与される。例えば、RPS2を発現する本発明 の形質転換した植物を用いることで、無毒性の遺伝子avrRpt2を運搬する植物病 原体に一般的に感染する植物の疾病耐性を簡単かつ安価に変えることができる。 本発明はまた、自然界の宿主耐性メカニズムを疑似することによって広範囲ス ペクトルの病原体耐性を付与することもできる。第1にRPS2トランス遺伝子は、 病原体からのシグナルがないところで構造的に植物防御応答が開始するほどの充 分な高レベルで植物細胞中に発現する。植物の防御応答を開始させることのでき る発現レベルは、「Dong et al.，supra」に記述されているように防御応答遺伝 子が発現するレベルを測定することによって決定される。第2にRPS2トランス遺 伝子は、組織特異性のプロモーター、細胞型特異性のプロモーターなどの調節可 能なプロモーターによって、または防御応答の時期と組織発現を制限する外部信 号や薬剤によって誘導されるプロモーターによって発現する。最後にRPS2遺伝子 産物は、avrRpt2遺伝子産物とともに発現する。RPS2遺伝子は天然に存在するプ ロモーターによって、CaMV 35S プロモーターなどの構造的に発現したプロモー ターによって、組織特異性または細胞型特異性のプロモーターによって、または 外部からの信号または薬剤によって活性化されるプロモーターによって発現する 。RPS2とavrRpt2との同時発現は、植物防御応答の開始に関連する遺伝子産物の 産生に疑似的であり、宿主植物と病原体における特異的耐性遺伝子−無毒性遺伝 子対応対がないところに病原体に対する抵抗性を付与する。 本発明はまた、図2に示された配列を持つ核酸の植物細胞における発現、また は図2のオープンリーディングフレーム「a」のアミノ酸配列をコードする変性変 異体の発現も提供する。 さらに本発明は、図2のRPS2配列または長さ9個以上の核酸からなる部分、好ま しくはプローブとして長さ約18個以上の核酸からなる部分を用いることによって RPS2に約50％またはそれ以上の同一性のある配列を持つ核酸配列を単離すること を提供する。適切に減縮されたハイブリダイゼーションの厳しい条件が、図2のR PS2配列に約50％またはそれ以上の配列同一性を持つDNA配列を単離する際に用い られる。 また本発明によって提供されるものに、RPS疾病耐性遺伝子に特徴的な短い保 存領域がある。これらの保存領域は他の植物疾病耐性遺伝子の単離のためのハイ ブリダイゼーションプローブ及びPCRプライマーの製造に対して有用なオリゴヌ クレオチド配列を提供する。 RPS2遺伝子及び関連するRPSファミリー遺伝子の両方が植物に、特定するなら ば農作物である植物に、最も特定するならばトマト、コショウ、トウモロコシ、 小麦、米、大豆やインゲン豆のような豆果などの重要な農作物である植物に、即 ち無毒性遺伝子、例えばavrRpt2無毒性遺伝子を運搬する病原体に感染する植物 に疾病耐性を付与する。このような病原体にはプソイドモナス・シリンゲ（Pseud omonas syringae）株が含まれるが、これに限定されるわけではない。 本発明はまた、生物学的に活性な断片またはRps2ポリペプチドのアナログを含 んでいる。「生物学的に活性な」とは、インビボ（in vivo）で図2に示したRps2 ポリペプチドの特徴的な活性を所有していることを意味している。有用なRps2断 片またはRps2アナログとは、生物学的アッセイで疾病耐性遺伝子産物の活性に対 する生物活性が存在するものである。なおこれらのアッセイについては例えば、 「Dong et al．(1991)，supra、Yu et al．(1993)supra」、「Kunkel et al．(1 993)supra」、及び「Whalen et al.，(1991)」に記載されている。特に生物学的 に活性なRps2ポリペプチド断片またはアナログは、avrRpt2無毒性遺伝子を運搬 する植物病原体に実質的な抵抗性を付与することができる。実質的な抵抗性によ って、avrRpt2無毒性遺伝子を運搬する植物病原体に感染する可能性の少なくと も部分的な減少が現れる。 好ましいアナログとしてはRps2ポリペプチド（または生物学的に活性なこのポ リペプチドのフラグメント）があり、その配列は同類のアミノ酸と置換すること 、例えば一個のアミノ酸が似た特徴を持つもう一つのアミノ酸と置換すること（ 例えばグリシンの代わりにバリンが置換したり、またリジンの代わりにアルギニ ンが置換したりすることなど）によってのみ、または一個あるいはそれ以上の非 −保存性アミノ酸の置換、欠失、あるいはポリペプチドの生物活性を損なわない 挿入によってのみ野生型の配列とは異なる。 アナログは自然界で生成するRps2ポリペプチドとアミノ酸配列が異なっていて もよいし、あるいは配列には関連のない方法で修飾されていてもよいし、またそ の両方であってもよい。概して本発明のアナログは、20個のアミノ酸残基、好ま しくは40個のアミノ酸残基、またはより好ましくは天然に存在するRps2ポリペプ チド配列の完全な配列からなるセグメントと、少なくとも70％、好ましくは80％ 、更に好ましくは90％、そして最も好ましくは95％または99％の相同性を有して いる。 一次配列の代替物には、遺伝子の変異体、即ち天然のものと誘導されたものの 両方が含まれる。また天然に存在するL−アミノ酸以外のもの、例えばD−アミノ 酸や、または天然に存在しない即ち合成のアミノ酸、例えばβまたはγアミノ酸 を含むアナログも含まれる。また本発明に含まれるものには、インビボ（in viv o）でのポリペプチドの化学的誘導、即ちアセチル化、メチル化、リン酸化、カ ルボキシル化、またはグリコシル化を含む化学的誘導で修飾されたRps2ポリペプ チドもある。 実質的に完全な長さのポリペプチドに加えて本発明は、そのポリペプチドの生 物学的に活性な断片も含んでいる。ここで用いられる「断片」なる用語はポリペ プチドに適用された場合、通常は少なくとも20個の残基を持つ長さのものであり 、より典型的な場合には少なくとも40個の残基を持つ長さのもので、好ましくは 少なくとも60個の残基を持つ長さのものである。Rps2ポリペプチドの断片は、当 業者に知られた方法によって生成することができる。Rps2の生物学的な活性を備 える候補断片の能力は、本明細書に記述した方法によって評価することができる 。本発明にはまた、ペプチドの生物学的活性に対して必要のない残基、例えばmR NAのスプライシングによってまたは他のタンパク質処理工程によって加えられる 残基を含むRps2ポリペプチドも含まれる。 この他の態様は、以下の請求の範囲内に含まれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 アメリカ合衆国 アメリカ合衆国 ワシントン ディーシー 14ス アンド インディペンデンス ア ヴェニュー エスダブリュー ユナイテッ ド ステイツ デパートメント オブ ア グリカルチャー (71)出願人 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オ ーガニゼーション オーストラリア国 エイシーティー2612、 キャンベル ライムストーン アベニュー （番地無し) (72)発明者 オースベル フレデリック エム. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ニ ュートン レイク アベニュー 271 (72)発明者 スタスカウィッチ ブライアン ジェイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 カス トロ バレイ マーシエル コート 18945 (72)発明者 ベント アンドリュー エフ. アメリカ合衆国 イリノイ州 アーバナ ウエスト アイオワ ストリート 308 (72)発明者 ダールベック ダグラス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 カス トロ バレイ レンロス コート 18851 (72)発明者 カタギリ フミアキ アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 サ マービル セブン ハーダン ロード（番 地なし) (72)発明者 クンケル バーバラ エヌ. アメリカ合衆国 ミズーリ州 セントルイ ス パーシング アヴェニュー 6042 (72)発明者 ミンドリノス マイケル エヌ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン ブルックリン アベニュー 400 (72)発明者 ユー グオ−リァング アメリカ合衆国 メリーランド州 ダーネ スタウン ストロー ベール レーン 13524 (72)発明者 ベーカー バーバラ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 リッ チモンド ビスタ ハイツ ロード 804 (72)発明者 エリス ジェフリー オーストラリア国 ウィータンジェラ ギ ブス ブレイス 10 (72)発明者 サルメロン ジョン アメリカ合衆国 ノースカロライナ州 ヒ ルスボロウ ブラックベリー レーン 1308

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1．5’GGNATGGGNGGNNTNGGNAARACNAC 3’［配列番号：158］（ここでNはA、T、G 、またはCであり、RはAまたはGである）の配列を含む実質的に純粋なオリゴヌク レオチド。 2．5’NARNGGNARNCC 3’［配列番号：169］（ここでNはA、T、G、またはCであ り、RはAまたはGである）の配列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 3．5’NCGNGWNGTNAKDAWNCGNGA 3’［配列番号：159］（ここでNはA、T、G、ま たはCであり、WはAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、KはGまたはTであ る）の配列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 4．5’GGWNTBGGWAARACHAC 3’［配列番号：160］（ここでＮはA、T、G、または Cであり、RはGまたはAであり、BはC、G、またはTであり、HはA、C、またはTであ り、WはAまたはTである）の配列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 5．5’TYGAYGAYRTBKRBRA 3’［配列番号：163］（ここでRはGまたはAであり、B はC、G、またはTであり、DはA、G、またはTであり、YはTまたはCであり、KはGま たはTである）の配列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 6．5’TYCCAVAYRTCRTCNA 3’［配列番号：164］（ここでNはA、T、G、またはC であり、RはGまたはAであり、VはGまたはCまたはAであり、YはTまたはCであ）の 配列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 7．5’GGWYTBCCWYTBGCHYT 3’［配列番号：170］（ここでBはC、G、またはTで あり、HはA、C、またはTであり、WはAまたはTであり、YはTまたはCである）の配 列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 8．5’ARDGCVARWGGVARNCC 3’［配列番号：171］（ここでNはA、T、G、またはC であり、RはGまたはAであり、WはAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、V はG、C、またはAである）の配列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 9．5’ARRTTRTCRTADSWRAWYTT 3’［配列番号：174］（ここでRはGまたはAであ り、WはAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、SはGまたはCであり、YはCま たはTである）の配列を含む実質的に純粋なオリゴヌクレオチド。 10．5’GGNATGGGNGGNNTNGGNAARACNAC 3’［配列番号：158］（ここでNはA、T、 G、またはCであり、RはAまたはGである）のDNA配列を含む組換え植物遺伝子。 11．5’NARNGGNARNCC 3’［配列番号：169］（ここでNはA、T、G、またはCであ り、RはAまたはGである）の配列をさらに含む請求の範囲10に記載の遺伝子。 12．5’NCGNGWNGTNAKDAWNCGNGA 3’［配列番号：167］（ここでNはA、T、G、ま たはCであり、WはAまたはTであり、DはA、G、またはTであり、KはGまたはTであ る）の配列をさらに含む請求の範囲11に記載の遺伝子。 13．請求の範囲10、11、及び12の配列うちの二個またはそれ以上の組合せを含む 組換え植物遺伝子。 14．Gly Xaa1 Xaa2 Gly Xaa3 Gly Lys Thr Thr Xaa4 Xaa5［配列番号：191］(こ こでXaa1はMetまたはProであり、Xaa2はGlyまたはProであり、Xaa3はIle、Leuま たはValであり、Xaa4はIle、LeuまたはThrであり、Xaa5はAlaまたはMetである) のアミノ酸配列を含む実質的に純粋な植物ポリペプチド。 15．Xaa1 Xaa2 Xaa3 Leu Xaa4 Xaa5 Xaa6 Asp Asp Xaa7 Xaa8［配列番号：192］ (ここでXaa1はPheまたはLysであり、Xaa2はArgまたはLysであり、Xaa3はIle、Va lまたはPheであり、Xaa4はIle、LeuまたはValであり、Xaa5はIleまたはLeuであ り、Xaa6はIleまたはValであり、Xaa7はIle、LeuまたはValであり、Xaa8はAspま たはTrpである)のアミノ酸配列を含む実質的に純粋な植物ポリペプチド。 16．Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Thr Xaa6 Arg［配列番号：193］(ここでXaa1はS erまたはCysであり、Xaa2はArgまたはLysであり、Xaa3はPhe、IleまたはValであ り、Xaa4はIleまたはMetであり、Xaa5はIle、LeuまたはPheであり、Xaa6はSer、 CysまたはThrである)のアミノ酸配列を含む実質的に純粋な植物ポリペプチド。 17．Gly Leu Pro Leu Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4［配列番号：194］(ここでXaa1はThr 、AlaまたはSerであり、Xaa2はLeuまたはValであり、Xaa3はIle、ValまたはLys であり、Xaa4はValまたはThrである)のアミノ酸配列を含む実質的に純粋な植物 ポリペプチド。 18．Xaa1 Xaa2 Ser Tyr Xaa3 Xaa4 Leu［配列番号：195］(ここでXaa1はLysまた はGlyであり、Xaa2はIleまたはPheであり、Xaa3はAspまたはLysであり、Xaa4はA la、GlyまたはAsnである)のアミノ酸配列を含む実質的に純粋な植物ポリペプチ ド。 19． （a）植物細胞のDNA試料を提供する工程、 （b）RPS疾病−耐性遺伝子の共通領域に相同の配列を持つ一対のオリゴヌクレ オチドを提供する工程、 （c）ポリメラーゼ連鎖反応を介するDNA増幅を行うのに好適な条件の下で、一 対のオリゴヌクレオチドを植物細胞のDNA試料と結合する工程、及び （d）増幅された疾病−耐性遺伝子またはそのフラグメントを単離する工程、 を含む植物細胞から疾病−耐性遺伝子またはそのフラグメントを単離する方法。 20．増幅が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる請求の範囲19に記載の 方法。 21．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応がRACEである請求の範囲19に記載の方法。 22． （a）植物細胞のDNA試料を提供する工程、 （b）RPS遺伝子の共通領域に相同である検出可能にラベルされたDNA配列を提 供する工程、 （c）50％またはそれ以上の配列同一性を備えた遺伝子の検出を可能にするハ イブリダイゼーション条件下で、植物細胞のDNA試料を検出可能にラベルされたD NA配列と接触させる工程、及び （d）検出可能なラベルとの結合により疾病−耐性遺伝子を同定する工程、 を含む植物細胞の疾病−耐性遺伝子を同定する方法。 23．DNA配列が、請求の範囲19に記載された方法により生成される請求の範囲22 に記載の方法。 24．植物細胞DNA試料が、植物ゲノムから単離される請求の範囲22に記載の方法 。 25． （a）組換え植物細胞ライブラリーを提供する工程、 （b）50％またはそれ以上の配列同一性を有する遺伝子の検出を可能にするハ イブリダイゼーション条件下で、組換え植物細胞ライブラリーを請求の範囲19に 記載の方法により生成された検出可能にラベルされた遺伝子フラグメントと接触 させる工程、及び （c）検出可能なラベルとの結合により疾病−耐性遺伝子の一つのメンバーを 単離する工程、 を含む組換え植物細胞ライブラリーから疾病−耐性遺伝子を単離する方法。 26． （a）組換え植物細胞ライブラリーを提供する工程、 （b）50％またはそれ以上の配列同一性を有する遺伝子の検出を可能にするハ イブリダイゼーション条件下で、組換え植物細胞ライブラリーを請求の範囲1〜9 のいずれかに記載の検出可能にラベルしたオリゴヌクレオチドと接触させる工程 、及び （c）検出可能なラベルとの結合により一つの疾病−耐性遺伝子を単離する工 程、 を含む組換え植物細胞ライブラリーから疾病−耐性遺伝子を単離する方法。 27．植物ポリペプチドがP−ループドメインまたはヌクレオチド結合部位ドメイ ンを含む疾病−耐性を付与することのできる組換え植物ポリペプチド。 28．ポリペプチドがさらに、ロイシン含量の多い反復ドメインを含む請求の範囲 27に記載の組換え植物ポリペプチド。 29．ロイシン含量の多い反復ドメインを含む疾病−耐性を付与することのできる 組換え植物ポリペプチド。 30． （a）植物細胞のDNA試料を提供する工程、 （b）RPS疾病−耐性遺伝子の共通領域に相同の配列を持つ一対のオリゴヌクレ オチドを提供する工程、 （c）ポリメラーゼ連鎖反応を介するDNA増幅を行うのに好適な条件下で、一対 のオリゴヌクレオチドを植物細胞のDNA試料と結合する工程、及び （d）増幅された疾病−耐性遺伝子またはそのフラグメントを単離する工程、 を含む方法により単離された植物疾病−耐性遺伝子。 31． （a）植物細胞のDNA調製物を提供する工程、 （b）RPS遺伝子の共通領域に相同性を有する検出可能にラベルされたDNA配列 を提供する工程、 （c）50％またはそれ以上の配列同一性を有する遺伝子の検出を可能にするハ イブリダイゼーション条件下で、前記植物細胞のDNA調製物を前記検出可能にラ ベルされたDNA配列と接触させる工程、及び （d）検出可能なラベルと共同して疾病−耐性遺伝子を同定する工程、 を含む方法により単離された植物疾病−耐性遺伝子。 32． （a）組換え植物細胞ライブラリーを提供する工程、 （b）50％またはそれ以上の配列同一性を有する遺伝子の検出を可能にするハ イブリダイゼーション条件下で、組換え植物細胞ライブラリーを請求の範囲1−4 に記載された方法によって生成された検出可能にラベルされた遺伝子フラグメン トと接触させる工程、及び （c）検出可能なラベルとの結合により疾病−耐性遺伝子を単離する工程、 を含む方法により単離された植物疾病−耐性遺伝子。 33． （a）植物組織試料を提供する工程、 （b）植物組織試料に植物疾病−耐性の候補となる遺伝子をバイオリスティッ クに形質転換することによって導入する工程、 （c）植物組織試料内で植物疾病−耐性の候補となる遺伝子を発現させる工程 、及び （d）植物組織試料が疾病−耐性応答を示すかどうかを決定する工程であって 、植物疾病−耐性遺伝子を該応答により同定する工程、 を含む植物疾病−耐性遺伝子を同定する方法。 34．植物組織試料が、葉、根、花、果実、または茎の組織を含む請求の範囲33に 記載の方法。 35．植物疾病−耐性の候補となる遺伝子が、cDNA発現ライブラリーから得られる 請求の範囲33に記載の方法。 36．疾病−耐性応答が、過剰応答である請求の範囲33に記載の方法。 37． （a）植物組織試料を提供する工程、 （b）植物組織試料に植物疾病−耐性の候補となる遺伝子をバイオリスティッ クに形質転換することによって導入する工程、 （c）植物組織試料内で前記植物疾病−耐性の候補となる遺伝子を発現させる 工程、及び （d）植物組織試料が疾病−耐性応答を示すかどうかを決定する工程であって 、植物疾病−耐性遺伝子を該応答により同定する工程、 を含む方法によって単離された植物疾病−耐性遺伝子。 38．rpsファミリータンパク質に特異的に結合する精製抗体。 39．図12に示されたDNA配列に実質的に同一のDNA配列。 40．図5（AまたはB）に示されたPrfアミノ酸配列に実質的に同一の配列を有する 実質的に純粋なポリペプチド。
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