JPH09507124A - 植物耐病原性遺伝子及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トマトCf−９遺伝子がクローン化され、そしその配列が、コードされたアミノ酸配列と共に提供されている。前記アミノ酸配列のポリペプチド、対立遺伝子、変異体及び誘導体をコードする DNA、及びそれに対して有意な程度の相同性を示すアミノ酸配列をコードする DNAが植物細胞中に導入され、そしてコードされたポリペプチドが発現され、そのような細胞を含んで成る植物及びその子孫に耐病原性を付与する。Cf−９配列は、ロイシンに富んでいる反復体を含んで成り、そしてそのような反復体の存在は、他の植物病原性遺伝子の同定を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】 植物耐病原性遺伝子及びその使用 本発明は、植物における耐病原性及びより詳しくは、耐病原性遺伝子の同定及 び使用に関する。 植物は潜在的に病原性の微生物により絶えまなく攻撃されている。収穫植物は 、それらが、遺伝的に変化しない単一栽培として通常栽培されるので、特に攻撃 を受けやすく；病気が襲うと、損害は重度である。しかしながら、ほとんどの植 物は、ほとんどの植物病原体に対して耐性である。自己防御のために、植物は一 連のあらかじめ存在する防御、及び誘導性防御を進行せしめる。病原体、特に生 存植物細胞との密接な結合からそれらの栄養を手に入れる生物栄養性病原体は、 宿主の防御機構を避けるために専門化しなければならない。病原体が病気を引き 起こすことができる場合、その相互作用は適合していると言われるが、しかし植 物が耐性である場合、その相互作用は不適合であると言われる。種属特異的耐性 は、過敏性応答（HR）、すなわち植物が攻撃された病原体進入の部位での局在化 した細胞の死により生存宿主細胞の病原体を遮断する誘発された応答（仮説であ る）と強く相互関係している。 HR−関連疾病耐性がしばしば、優性遺伝子（Ｒ遺伝子）により特定される（独 占的ではないが）ことは長く知られている。Florは、病原体がそのようなＲ遺伝 子を克服するために変異する場合、それらの変異は劣性であることを示した。Fl orは、Ｒ遺伝子が機能するためには、病原体に対応する遺伝子、すなわち無毒化 遺伝子(Avr遺伝子)と称する遺伝子もまた存在すべきことを結論づけている。毒 性になるためには、病原体は、Ｒ遺伝子−依存性防御機構を活性化 する生成物の製造を停止すべきである（Flor，1971）。しばしば誘発体（elicit or）／受容体モデルと称する広く許容できる作用仮説は、病原体がその対応する Avr遺伝子を担持する場合、植物が前記病原体の存在を検出することを可能にす る生成物をＲ遺伝子がコードすることである（Gabriel and Rolfe，1990）。次 にこの認識は、防御応答の活性化に変換される。 いくらかの相互作用は、異なった遺伝的性質を示す。毒素（Hc毒素）を発現す るヘルミントスポリウム・カルボナム種は、Hml耐性遺伝子を欠いているトウモ ロコシ系に感染する。Hc毒素発現の欠失への変異は劣性であり、そして毒性の欠 失と相互関係し、これは、毒性への変異が劣性である遺伝子対遺伝子相互作用(g ene-for-gene interaction)とは対照的である。Hml遺伝子の標識による単離によ る主な業績は1992年に報告されている（Johal and Briggs，1992）。もっともら しい議論が、いかに遺伝子対遺伝子相互作用が毒素依存性の毒性から展開するか について行なわれた。たとえば、その生成物が毒素の標的である植物遺伝子は、 HRに導びく、毒素に対するさらに強い感受性、及び耐性遺伝子への感受性遺伝子 の転換を付与するように変異することができる。しかしながら、これは、その遺 伝子生成物がHc毒素を不活性化する、Hmlの作用の態様であるとは思われない。 病原体非毒性遺伝子はまだ十分には理解されていない。いくつかの細菌性 Avr 遺伝子は他の種類のタンパク質に対して相同性を有さない親水性タンパク質をコ ードするが、ところが他は、それらが非毒性を示す植物の範囲を変えるようにそ の反復単位の数が変更され得る反復単位を担持する(Keen，1992；Long and Stas kawicz，1993)。追加の細菌性遺伝子(hrp遺伝子)が、HRを誘発するための細菌性 Avr遺伝子のために及びまた、病原性のために必要とされる(Ke en，1992；Long and Staskawicz，1993)。なぜ病原体が、植物が検出を可能にす る生成物を生産するのかは明確ではない。一定の容易に除去される Avr遺伝子が 病原性のために寄与しているが、但しは必要とされなく、ところが他の Avr遺伝 子はより一層、なくてもすまないと広く信じられている(Keen，1992；Long and Staskawicz，1993)。１つの真菌類の非毒化遺伝子の特徴付けも報告されている ；Cf−９遺伝子を担持するトマト品種の攻撃を試みるＣ．フルビュームに対して 非毒化を付与する、クラドスポラム・フルビュームのAvr9遺伝子が28個のアミノ 酸の最終の処理されたサイズを有する、分泌されるシステインに富むペプチドを コードするが、しかし適合性相互作用におけるその役割は明白ではない（De Wit ，1992）。 主に遺伝子基準に基づく遺伝子単離のための技法は、最近、劇的に改良されて 来ており、そして多くの研究者は現在、種々のＲ遺伝子をクローン化することを 試みている。標的は、多くある中でも、トウモロコシ、キンギョソウ(Antirrhin um)及びアマ（flax）におけるさび病耐性遺伝子（トランスポゾン標識による） ；レタス及びアラビドプシス(Arabidopsis)におけるベト病菌耐性遺伝子（地図 に基くクローニング及び T-DNA標識による）；トマトにおけるクラドスポラム・ フルビューム（Cf）耐性遺伝子（地図に基くクローニング及び非毒化遺伝子生成 物による親和性ラベリング）；トマト及びタバコにおけるウィルス耐性遺伝子（ 地図に基くクローニング及び標識による）；トマトにおける線虫類耐性遺伝子（ 地図に基くクローニングによる）；及びアラビドプシス及びトマトにおける細菌 病原体に対する耐性のための遺伝子（地図に基くクローニングによる）を包含す る。 細菌性斑点病原体、プソイドモナス シリンガエ pv トマト（Pst）に対して “遺伝子対遺伝子”耐性を付与するトマト Pto遺伝子の 地図に基くクローニングが報告されている（Martin et al，1993）。その遺伝子 にひじょうに強く結合される制限フラグメント長さ多型性（RFLP）マーカーを担 持するYAC(酵母人工染色体)クローンが同定された。この YACは、相同のcDNAク ローンを単離するために使用された。それらの２つのcDNAは、強いプロモーター に融合され、そして疾病感受性トマト品種の形質転換の後、それらの遺伝子融合 体の１つは、その対応する非毒化遺伝子、Avr Ptoを担持する Pst株に耐性を付 与することが示された。それらの２つのcDNAはお互い相同性を示す。実際、その Pto cDNAプローブは、少なくとも６個のメンバーの小さな遺伝子族を示し、その うち５つのメンバーは Ptoが単離される YAC上に見出され、そして従って、他の Ｒ遺伝子座の遺伝子分析から推定される局部的な多重遺伝子族の種類を正確に含 んで成る。Pto遺伝子のcDNA配列は、単純な誘発体／受容体モデルの提案者のた めには困った問題である。それは、シグナルトランスダクションにおける役割と 調和して、セリン／トレオニンキナーゼに対しての明確な相同性を示す。興味あ ることには、それら（キナーゼ）が遺伝子型で定義された不適合性花粉管の成長 を妨げるために必要とされることにおいて、類似する役割を実行する、ブラシカ （Brassicas）における自己不適合性に関連するキナーゼに対して強い相同性が 存在する。しかしながら、ブラシカ SRKキナーゼ(Stein et al．1991)とは対照 的に、Pto遺伝子は、キナーゼ触媒ドメインよりも小さなドメイン、及び膜との 関連性を促進する可能性あるＮ−末端ミリストイル化（myristoglation）部位を コードするように思われる。もし、そのような遺伝子生成物が、侵入する微生物 に検出される場合のみ、その防御応答を開始するために必要とされる特定の認識 を達成するために単独で作用するなら驚くべきことである。Avr Ptoを担持する Pst株により生成される種特異的誘発体分 子はまだ未知であり、そしてそれが特徴付けられなければ Pto遺伝子生成物によ るこの分子の可能な認識を研究することができない。 本発明者は、今や、菌類クラドスポラム・フルビュームに対して耐性を付与す るトマトCf−９遺伝子を単離しており、そしてこの遺伝子から DNAを配列決定し 、そしてアミノ酸配列を推定した。トマトCf−９ゲノム遺伝子の DNA配列は配列 番号１（及び図２）に示されており、そしてその推定されるアミノ酸配列は配列 番号２（及び図３）に示されている。cDNA配列は、配列番号４（及び図４）に示 されている。 下記により詳細に説明されるように、トマトCf−９遺伝子は、Avr9非毒化遺伝 子の発現のために構築されたトマトの形質転換系の使用を包含する方法により単 離された。機能的な成熟Avr9タンパク質を構成的に発現するこの形質転換された 系は、一定割合の子孫が実生の死をもたらす壊死表現型を示すように、Cf−９遺 伝子を担持する植物に交雑された。Cf−９遺伝子は、トランスポゾン標識の技法 により同定され、そしてそのCf−９遺伝子の標識はその得られる実生の生存性に より確認される。 １つの観点によれば、本発明は耐病原性遺伝子又はそのフラグメントをコード する DNA単離体を提供し、この遺伝子はそれが配列番号２で示されるアミノ酸配 列又はそれに対して有意な程度の相同性を示すアミノ酸配列をコードすることで 特徴づけられる。 たとえば、DNA単離体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して60％の 相同性、好ましくは80％の相同性、より好ましくは90％の相同性を示すアミノ酸 配列をコードする DNAを含んで成る。最とも好ましくは、その DNAは、配列番号 ２に示されるアミノ酸配列をコードし、この場合、DNA単離体は、配列番号１又 は４に示される配列を有する DNA、又は所望するポリペプチド（たとえば、最初 の開始メチオニンコドンから下流停止コドンまで）をコードするのに十分なそれ らの配列のいづれかの一部を含んで成る。１つの態様において、その DNAは配列 番号１のヌクレオチド1871〜2969であるヌクレオチドの配列、又はその変異体、 誘導体又は対立遺伝子を含んで成る。本発明のさらなる観点によれば、配列番号 １のヌクレオチド1871〜2969、又はそのフラグメント、誘導体、変異体又は対立 遺伝子を含んで成るプローブにより DNAライブラリーをスクリーニングし、そし て植物に耐病原性を付与できる、たとえばクラドスポラム・フルビューム（たと えばAvr9を発現する）に対する耐性を付与できるポリペプチドをコードする DNA を単離することによって得られる、耐病原性遺伝子、又はそのフラグメントをコ ードする DNA単離体が提供される。植物はトマトであってもよい。適切な技法は 当業界においてよく知られている。 本発明の DNAは、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は提供されるその配列 の変異体、誘導体又は対立遺伝子をコードできる。好ましい変異体、誘導体及び 対立遺伝子は、野生型遺伝子によりコードされるタンパク質の機能的な特徴、特 に耐病原性を付与する能力を保持するものである。変異体又は誘導体を生成する ための配列への変化は、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を導びく、 核酸における１又は複数のヌクレオチドの１又は複数の挿入、欠失又は置換によ るものである。もちろん、コードされたアミノ酸配列とは異ならない核酸への変 化も包含される。 配列番号２のアミノ酸配列又はそれらに対して有意な程度の相同性を示すアミ ノ酸配列をコードする DNAを含有する DNA単離体は、ゲノム DNA又はcDNAとして 、組換えベクター、たとえばファージベクター又はコスモドベクターの形で存在 し得る。その DNAは宿主細胞、たとえば植物細胞における発現のために、適切な プロモーター 及び調節要素の制御下で存在し得る。ゲノム DNAの場合、これはそれ自体のプロ モーター及び調節要素を含み、そしてcDNAの場合、これは宿主細胞における発現 のために適切なプロモーター及び調節要素の制御下で存在できる。 当業者は組換え遺伝子発現のためのベクターを構成することができ、そしてそ のための手段も企画できる。適切な調節配列、たとえばプロモーター配列、ター ミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺 伝子及び他の適切な配列を含む適切なベクターが選択され、又は構成され得る。 さらなる詳細のためには、たとえば Molecular Cloning：a Laboratory Manual ；第２版、Sambrook et al，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参 照のこと。 選択された遺伝子構造体を細胞中に導入する場合、当業者に良く知られている 一定の考慮が取られるべきである。挿入されるべき核酸は、転写を誘導するであ ろう効果的な調節要素を含む構造体内にアセンブルされるべきである。構造体を 細胞中に輸送するための方法は広く利用できる。本発明の異なった態様に従って 、構造体が細胞膜内に一旦存在すれば、内因性染色体物質中への組込みが生じて も良く又は生じなくても良い。最終的に、植物が関与する限り、標的の細胞型は 、細胞が完全な植物に再生され得るようなものであるべきである。 プレー配列を含む DNAセグメントにより形質転換された植物は、植物の遺伝子 操作についてすでに知られている標準の技法により生成され得る。DNAは、いづ れか適切な技法、たとえばその生来の遺伝子トランスファー能力を利用するアグ ロバクテリウムにより担持される武装解除された(diarmed)Ti−プラスミドベク ター（EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR12（22）8711-87215，1984）、粒子又は マイクロプロジェクチル衝撃（US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616）、マイ クロインジェクション(WO 92／09696，WO 94／00583，EP 331083，EP 175966)、 エレクトロポレーション(EP 290395，WO 8706614)又は直接的な DNA取り込みの 他の形（DE 4005152，WO 9012096，US 4684611）を用いて、植物細胞中に形質転 換され得る。アグロバクテリウム形質転換は、双子葉植物性を形質転換するため に当業者により広く使用されている。アグロバクテリウムはいくつかの単子葉植 物性中に外来性 DNAを形質転換することができることを報告されているが(WO 92 ／14828)、アグロバクテリウムが非能率的又は無能である場合、マイクロプロジ ェクチル衝撃、エレクトロポレーション及び直接的な DNA取り込み法が好ましい 。他方、異なった技法の組合せ、たとえば創傷を誘発するためにアグロバクテリ ウム被覆微小粒子による衝撃(EP-A-486234)、続くアグロバクテリウムとの同時 培養(EP-A-486233)が、形質転換工程の効能を高めるために使用され得る。 形質転換技法の特定の選択は、ある植物種を形質転換するためのその効率、並 びに特定の方法論の選択により本発明を実施する人々の経験及び好みにより決定 されるであろう。核酸を植物細胞中に導入するための形質転換システムの特定の 選択は本発明に必須ではなく又は本発明を限定するものではないことが当業者に 明らかであろう。 Cf−９遺伝子、及びそのCf−９遺伝子のタンパク質生成物に対して有意な程度 の相同性を示すタンパク質をコードするその変性された変形体、たとえばCf−９ 遺伝子の対立遺伝子、変異体及び誘導体が、植物、特にトマトに、病原体、たと えばＣ．フルビュームに対する耐性を付与するために使用され得る。このために は、上記のようなベクターが、トランスジェニック植物の生成のために使用され 得る。そのような植物は、Cf−９遺伝子により付与された耐病原性を有する。 従って、本発明はさらに、そのようなベクターにより形質転換された宿主細胞 、特に植物又は微生物細胞も包含する。従って、本発明の核酸を含んで成る宿主 細胞、たとえば植物細胞が提供される。細胞内の染色体内に核酸が組込まれ得る 。 本発明の核酸を含んで成るベクターは、特にそのベクターがゲノム中への組換 えのために細胞中に核酸を導入するために使用される場合、プロモーターを含む 必要はない。 また本発明によれば、コードされたポリペプチドの発現の制御のためのプロモ ーターの操作制御下で、本発明により供給されるようなヌクレオチドの配列をそ のゲノム中に組込まれた植物細胞が提供される。本発明の追加の観点は、ヌクレ オチドの配列を含んで成るベクターの植物細胞中への導入を包含する、そのよう な植物細胞の製造法を提供する。そのような導入の後、ゲノム中にヌクレオチド の配列を導入するためにベクターと植物細胞ゲノムとの間での組換えが続く。次 に、その導入された核酸によりコードされるポリペプチドは発現される。 本発明の植物細胞を含んで成る植物はまた、そのクローン又はそのいづれかの 部分、種子及びハイブリッド子孫と共に提供される。 本発明はさらに、植物の細胞又はその子孫中への核酸の導入の初期段階に従っ て、配列番号２のアミノ酸配列、又はその変異体、対立遺伝子又は誘導体、又は 有意に相同のアミノ酸配列をコードする核酸を、植物の細胞内で発現すること（ それによりコードされたポリペプチドが生成される）を含んで成る方法を提供す る。そのような方法は、植物に対して耐病原性を付与できる。 植物のゲノム中に安定して組込まれる遺伝子は植物の子孫に世代 から世代に引き渡され、この子孫の細胞はコードされたポリペプチドを発現する ことができ、そしてその結果、増強された耐病原性を有することができる。耐病 原性は、病原体（たとえばクラドスポラム フルビューム）の適合性を評価する ことによって又は病原体非毒性遺伝子、たとえばAvr9の組換え発現を用いること によって決定され得る。そのような遺伝子は、いづれか適切な形質転換技法又は 交雑により植物の細胞中に導入され得る。 Cf−９遺伝子の配列決定が示すところによれば、それがロイシンに富む反復体 (LRR)をコードする DNA配列を含み、そして相同性研究は LRRを含む他の遺伝子 に対する強い相同性を示した。より詳細に下記に論じる理由により、LRRの存在 が多くの耐病原性遺伝子の特徴を示しているものとして仮定され、そして従って 、LRRの存在が追加の耐病原性遺伝子を同定する方法に使用され得る。 さらなる観点によれば、本発明は、植物耐病原性遺伝子を同定するための方法 を提供し、ここで前記方法は、 （１）病原体に対して耐性を有する植物の細胞から、発現された DNA又はゲノ ム DNAを得； （２）前記 DNAを配列決定し、そして LRRの存在により推定上の耐病原性遺伝 子を同定し；そして （３）耐病原性遺伝子としての同一性を確証する； ことを含んで成る。 耐病原性遺伝子を含む DNAは多くの手段により得られる。耐病原性遺伝子の地 図を基礎とするクローニングにおいて、遺伝子分析によりその耐性遺伝子をたぶ ん担持し得る YACクローンを同定することができる。次に、そのような YACクロ ーンは、cDNAライブラリーからcDNAクローンをスクリーンするために使用され、 そしてその領域からマッピングされた相同cDNAクローンが配列決定される。次に 、それらの配列が、LRR、及びそのような LRRに基づいて同定された推定上の耐 病原性遺伝子の存在について詳しく調べられる。 あるいは、適切な植物源からのランダム DNA配列が、たとえばコスミドベクタ ー又は YACにおいてcDNA又はゲノム DNAとして得られ、そしてこのランダム DNA が配列決定され、そして推定上の耐病原性遺伝子が LRRに基づいて同定される。 多量の DNA配列情報が、多くの異なった源に由来する DNAからすでに得られてお り、そしてこの配列情報がデータベースに利用できる。そのような既知の DNA配 列は LRRについて調査され得、そして LRRを示す適切な源からの配列が再び、推 定上の耐病原性遺伝子として同定され得る。 LRRは多くの異なった遺伝子においてすでに知られており（たとえばChang et al 1992を参照のこと）、その結果、このタイプの配列は容易に同定され得る。L RRは、ロイシン残基に富む反復モチーフを担持する配列の部分を見出すために配 列の単純な視覚による検査により同定され得る。あるいは、適切なコンピュータ ー調査技法が、LRRを含む既知の配列又は LRRを含む既知の配列に由来するコン センサス配列に対する相同性を決定するために使用され得る。より具体的には、 たとえばBLASTXを調査する局部配列類似性のための１つの又は他の種々の入手で きるアルゴリズムが使用され得る。従って、たとえばBLASTX調査は US National Center for Biological Informationでのデータベースで使用され得、そして L RRを含む配列は配列番号２に示されるようなCf−９のための配列に対して少なく とも60又はそれ以上のBLASTX評点により同定され得る。 推定上の耐病原性遺伝子が同定された後すぐに、これは、必要なら完全なコー ド配列の単離に続いて、前記遺伝子が位置している染色体を決定し、そしてそれ が耐病原性遺伝子のための既知の位置に連鎖されているかどうかを決定するため に連鎖分析によりさらに調 査され得る。そのような連鎖分析はまた、包含される病原体の性質に関して指摘 することができる。連鎖分析に続いて、耐病原性遺伝子の同定が、適切な遺伝子 型を有する植物への DNA後部の再導入及び形質転換された植物に対する前記 DNA の効果の調査により確認され得る。非耐性植物に特定の病原体に対する耐性を付 与する効果が存在する場合、これは耐病原性遺伝子としての遺伝子を確認する。 上記の技法は、植物における耐病原性遺伝子の同定に対して一般的に適用でき る。この方法で同定され得る遺伝子のタイプの例は、ジャガイモにおけるファイ トフソラ（Phytophthora）耐性遺伝子、穀物、たとえば大麦及びトウモロコシに おけるカビ及びさび病耐性遺伝子、キンギョソウ及びアマにおけるさび病耐性遺 伝子、レタス及びアラビドプシスにおけるベト病菌耐性遺伝子、ジャガイモ、ト マト及びタバコにおけるウィルス耐性遺伝子、トマトにおける線虫類耐性遺伝子 、アラビドプシス及びトマトにおける細菌病原体に対する耐性及びコショウにお けるキサントモナス耐性遺伝子を包含する。 一旦、耐病原性遺伝子が同定されれば、それは当業者に良く知られている技法 により問題の植物中に再導入され、問題の耐性遺伝子を担持するように構築され たトランスジェニック植物が生成される。追加の観点によれば、本発明は LRRの 存在の使用及び特に上記の技法により同定された植物耐病原性遺伝子のタンパク 質生成物をコードする DNA単離物を提供する。さらに追加の観点によれば、本発 明は、LRRの存在により同定された耐病原性遺伝子を担持するように構築された トランスジェニック植物、特に収穫植物を提供する。適切な植物の例は、タバコ 、ヒョウタン、ニンジン、植物性プラシカ、レタス、イチゴ、アブラナ（oilsee d brassica）、サトウダイコン、小麦、大麦、トウモロコシ、米、ダイズ、エン ドウ、サトウ モロコシ、ヒマワリ、トマト、ジャガイモ、コショウ、キク、カーネーション、 ポプラ、ユーカリ及びマツを包含する。 本発明の追加の観点及び態様は当業者に明らかであろう。本明細書に言及され るすべての文書は引用により組込まれる。 すでに指摘したように、本発明はトマトCf−９遺伝子のクローニング及び配列 決定に基づかれており、そしてこの実験操作は次の図により一層詳細に記載され る。 図１はCf−９遺伝子の概略図を示す。 図２は、Cf−９遺伝子のゲノム DNA配列を示す（配列番号１）。特徴：核酸配 列−ヌクレオチド 898での翻訳開始；ヌクレオチド3487での翻訳停止；ヌクレオ チド3703−3708でのポリアデニル化部位；ヌクレオチド3507／９〜ヌクレオチド 3622／４の３′非コード配列における 115bpイントロン。推定されるタンパク質 配列− 863個の一次翻訳生成物；シグナルペプチド配列のアミノ酸１〜23；成熟 アミノ酸24〜863。 図３はCf−９タンパク質アミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図４はCF9 cDNAクローンの１つの配列を示す（配列番号４）。翻訳は位置＋58 での ATGで開始する。 図５は、Cf−２／Cf−９コスミドライブラリーから単離されたオーバーラップ コスミド(34，41，110及び138)から生成されるトマトCf−９遺伝子座の物理的地 図を示す。個々のコスミドの大きさ及びCf−９遺伝子の位置が図示されている。 また、転写の方向（矢印）及び制限酵素 BglIIのための部位の位置（Ｂ）も示さ れる。 トマトCf−９遺伝子のクローニング すでに指摘されたように、Ｃ．フルビュームAVR9遺伝子及び生成物は知られて いる(De Wit，1992；van Kan et al 1991；Marmeisse et al 1993；Van Den Ack erveken et al 1993)。従って、Cf−９ 遺伝子の単離は科学的に興味あるものである。なぜならば、それがAVR9遺伝子生 成物リガンドと推定されるCf−９遺伝子生成物受容体との間の結合の特徴化を可 能にするにちがいないからである。 （ｉ）Cf−遺伝子地図位置の指定 本発明者は、それらの染色体位置に対していくつかのCf遺伝子、たとえばCf− ９の地図を作った(Dickinson et al 1993；Jones et al 1993；Balint-Kurti et al 1993)。本発明者は、Cf−４及びCf−９は染色体１の短いアーム上でほぼ同 じ位置に存在し、そしてCf−２及びCf−５は染色体６上でほぼ同じ位置に存在す ることを示した。他は、染色体１に対してCf−９を個々に地図で示した(van der Beek et al 1992)。 （ii）トマトにおけるトランスポゾン標識の確立 本発明者は、メイズのトランスポゾン活性化因子（Ac）及びその解離（Ds）誘 導体を用いて、トマトにおけるトランスポゾン標識を行なう能力を確立した(Sco field et al 1992；Thomas et al 1994；Carroll et al 1995)。この技法は、そ れらのトランスポゾンが結合された部位に選択的に転移する事実に基づいて見出 される。従って、本発明者は、我々の同僚のために有用である位置で Dssを担持 する系を利用できるようにした。J.Hilleは、Cf−９に結合されるDsを担持するF T33系（Rommens et al 1992）を利用できるようにした。本発明者は、（ａ）T-D NA分離をモニターするためにβ−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子（Jefferson et al 1987）及び（ｂ）トランスポサーゼ(transposase)を発現し、そしてDsをトラ ンス−活性化できるが、しかしトランスポーズしないであろう安定したAc(sAc)( Scofield et al 1992)を含む構造体SLJ10512(Scofield et al 1992)を担持する 本発明者自身の系を独立して生成した。 （iii）変異誘発されたCf−９遺伝子を担持する配偶子が得られ、そ して同定されるストックの確立 FT33系はCf−９遺伝子を担持しなかった。発明者らは、結合され標的化された 標識の決定を実施するためにFT33における T-DNAによりシス位でのCf−９を置換 した組換え体を入手しなければならなかった。２種の手段が同時に実施された。 （ａ）FT33を、Cf−９遺伝子を担持するストックCf９に交雑した。得られたＦ １を次に、Cf０（Cf−遺伝子を担持しないストック）に戻し交雑した。FT33 T-D NAを担持する子孫は耐カナマイシン性である。耐カナマイシン性子孫を、Cf−９ の存在について試験し；５種のＣ．フルビューム耐性の個体を 180種の中から得 た。本発明者はまた、Cf−９についてホモ接合性であり、そしてSLJ10512の sAc T-DNAを担持する子孫を生成した。それらを、Cf−９及びFT33がシスで存在する 組換え体に交雑した。FT33 T-DNAにおいては、転移可能なDs要素は、その機能を 妨害する耐ヒグロマイシン性遺伝子中にクローン化される。トランスポサーゼ遺 伝子発現の存在下でのみ存在する、このDs要素の体細胞トランス活性化が、その ヒグロマイシン耐性の活性化をもたらす。従って、Cf−９とFT33との間の組換え 体を sAc−担持Cf−９ホモ接合体に交雑することから、sAc及びFT33を担持し、 そしてCf−９についてホモ接合性になる傾向がある耐ヒグロマイシン性個体が得 られる。こうして、この遺伝子型の 140個体が得られた。 （ｂ）sAc，FT33を担持し、そしてCf−９ホモ接合体である個体の獲得を促進 するために、FT33／Cf-9 F1 を、Cf−９及び sAcについてヘテロ接合性である系 に交雑した。得られた子孫の25％が T-DNAを担持し、そして耐ヒグロマイシン性 であり、そしてそれらのうち、50％よりわずかに多くのものが、Cf−９遺伝子の 少なくとも１つのコピーを担持するために耐病性であった。制限フラグメント長 さの多型性（RFLP）マーカーを入手し、CP46と命名し、これはCf−９遺伝子に関 してホモ接合体とヘテロ接合体との間の区別を可能にした(Balint-Kurti et al 1994(印刷中))。この態様においては、Cf−９ホモ接合体であり、そしてFT33 T- DNA及び sAcの両者を担持する２種の個体が得られた。それらの２種の個体は、 追加の交雑がこの遺伝子型に対して行なわれるように、挿木により繁殖された。 （iv）機能的な成熟AVR9タンパク質を発現するトマトのストックの確立 遺伝子標識実験におけるいづれかの所望の突然変異を得るための適切な頻度は 1000のうち１以下、及びしばしば10,000のうち１以下である（Doring，1989）。 病気感受性に対する突然変異についての数千の植物のスクリーニングを回避する ために、本発明者は植物における菌類のAvr9遺伝子の発現に基づく突然変異につ いての選択を確立した。成熟Avr9タンパク質の28個のアミノ酸の配列は知られて いる（van Kan et al 1991）。それは分泌されるタンパク質であり、そしてＣ． フルビュームのAvr9−担持種により感染された葉の細胞間流体から抽出され得る 。植物細胞からの分泌に関しては、本発明者は、成熟Avr9タンパク質（配列番号 ３を参照のこと）の初めのアミノ酸の前のPrla遺伝子（Cornelissen et al 1987 ）から、30個のアミノ酸の植物シグナルペプチドを担持する遺伝子をアセンブル するようにオリゴヌクレオチドを企画した。配列番号３に示される好ましいAvr9 遺伝子配列は、Prlaシグナルペプチド配列（Cornelissen et al 1987）及びAvr9 遺伝子配列（van Kan et al 1991）から構築されたキメラ遺伝子である。この読 み取り枠が、カリフラワーモザイクウィルスの35Ｓプロモーター（Odell et al 1984）及びオクトピン・シターゼ遺伝子の３′ターミネーター配列（DeGreve et al 1983）に融合され、そして当業者に良く知られている技法及び 容易に入手できるプラスミドを用いて、植物の形質転換のために二元プラスミド ベクター中に導入された。この遺伝子を発現する、形質転換されたCf０トマト系 が得られた。この形質転換された系を、Cf−９遺伝子を担持する植物に交雑した 。得られた子孫が発芽される場合、その50％が、実生の死が最高になる壊死表現 型を示した。この結果は、Avr9遺伝子を含んだ実生においてのみ観察された。同 じ形質転換体がCf０植物に交雑される場合、その得られる子孫はすべて十分に生 存性であった。一次形質転換体を自家受粉させることから、Avr9トランス遺伝子 のためにホモ接合性である個体を同定した。Avr9ホモ接合体がCf−９に交雑され る場合、すべての子孫は死亡した。従って、このシステムは、Cf−９遺伝子にお いて突然変異を担持する個体についての強力な選択を提供する(Hammond-Kosack et al 1994)。 （ｖ）Cf−９遺伝子の標識 Avr9遺伝子についてホモ接合性である個体(セクション(iv))を、Cf−９につい てホモ接合性であり、そしてFT33 T-DNAにおいて sAc及びDsの両者を担持する個 体(セクション（iiiａ）及び(iiiｂ))を受粉するために雄性の親として使用した 。そのような交雑から得られる数千種の子孫を発芽せしめた。ほとんどは死亡し 、そしていくつかが生存した。 DNAを生存体から得、そしてDsプローブを用いてサザンブロット分析にゆだ ねた。いくつかの独立した突然変異が一定のサイズのＢglIIフラグメントへのDs の挿入と相互関係したことが観察された。同じ結果が XbaＩに関して観察された 。これは、いくつかの独立した突然変異が同じ DNAフラグメント中へのDsの挿入 の結果であることを示唆した。 Ds配列に対するプライマーを用いて、転移されたDs−担持変異体 ♯18においてDsに隣接する DNAを、逆PCR(Triglia et al 1988)を用いて増幅し た。この DNAを他の変異体に対するプローブとして使用し、そして独立した突然 変異においては、そのDsが同じ 6.7kbの BalIIフラグメント中に挿入されたこと を証明した。 FT33におけるDsは細菌性レプリコン、及び細菌の選択マーカーとしてのクロラ ムフェニコール耐性遺伝子を含む（Rommens et al 1992）。これは、この転移さ れたDsを担持する植物 DNAが、Ds内で切断しない制限酵素（たとえば BglII）に より消化され得、その消化生成物が再環状化され得、そして次に、Ｅ．コリを形 質転換するために用いられることを意味する。Ds及び隣接する植物 DNAを担持す るクロラムフェニコール耐性クローンを得ることができる。この方法は、Dsの３ ′側に 1.7kbの植物 DNAを、及びDsの５′側に 4.9kbの植物 DNAを担持するクロ ーンを得るために使用された。 Cf−９遺伝子についての本発明者の現在の理解が図１に図示されている。Dsの ３′側の 1.8kbの植物 DNAがこの図上の挿入♯18と BglII部位との間に延長して いる。再環状化及び形質転換の前に BglIIの代わりに Xba１により変異体♯18の 植物 DNAを消化することによって追加のクローンを得た。これは、この BglII部 位の右側に相当に延長する(少なくとも５kb)DNAを担持するクローンの単離を可 能にし、そして従って、図１に示される BglII部位の右側への DNAの配列決定を 可能にした。 種々のサブクローン、新しく確立された配列に基づく追加の配列決定のための 新規配列決定プライマー（そのような実験に使用されるプライマーＦ１，２，３ ，４，５，６，７，12，13，10，26，27及び25が図に示されている）の合成、及 び当業者に良く知られている他の技法の組合せを用いて、3847bpの配列を決定し た。種々の他の制限部位(Xho１，Sst１，EcoRＩ及びHindIII）がまた図１に示さ れている。 Ｆ−シリーズのプライマーが、Dsの配列に基づくプライマーと協力して、PCR 分析により多数の独立した突然変異を特徴づけるために使用された。従って、そ れらのプライマーは、トランスポゾン挿入により引き起こされたCf−９の他の突 然変異の位置を特徴づけるために、メイズAc／Dsトランスポゾン配列に基づくプ ライマーによるポリメラーゼ鎖反応において使用された。 18個の独立した挿入が特徴づけられ、そして示されるように位置した。変異体 Ｅ，♯55，♯74及び♯100は不完全な生存性を与え、そして壊死表現型を示し、 そして利用できる配列の情報に基づけば、それらは実際のリーディングフレーム の５′側にあり、そして不完全な防御応答を活性化するのに十分なCf９タンパク 質発現を可能にする。 （vi）Cf−９遺伝子の DNA配列分析 Cf−９遺伝子の DNA配列分析が完結されており、そして概念上の翻訳に基づけ ば、他の耐性遺伝子の特徴であると仮定され得る興味あるモチーフ(ロイシンに 富む反復体、又はLRR)を示した。Cf−９のゲノム DNA配列は、図２及び配列番号 １に示されている。約3.9kbpのゲノム DNA配列が決定された。翻訳開始コドン(A TG)配列は位置 898に位置し、そして翻訳終結コドン TAG配列は位置3487bpに位 置し（図２）、そして介在する中断されていない 863個のアミノ酸の読み取り枠 を伴う。 得られた配列を用いて、遺伝子における他のトランスポゾン挿入の位置及び配 向の両者を特徴づけるために、Ds要素の配列に基づくプライマーと協力して PCR 反応に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを企画した。そのような実験の 結果に基づけば、17の他のDs挿入の地図での位置が現在、確実に割り当てられ得 る（図１に示 されるように）。 Avr9の存在下で生存する18の独立した変異体が DNAの同じ領域中への挿入に関 連している事実は、Cf−９遺伝子が標識されており、そしてこの領域から得られ た DNA配列がCf−９遺伝子に由来する強い証拠を提供する。 変異体♯18(sAcを欠いている安定した変異体)が sAcについてホモ接合体の系 に戻し交雑される場合、得られる子孫の１／４が sAc，Ds #18及びAvr9遺伝子を 担持している追加の証拠を提供する。それらの子孫は、Dsの sAc依存性体細胞切 除に基づいて、Cf−９遺伝子機能が体細胞的に修復され、死亡する部分を導びく という考えと一致して、種々の壊死を示す。Avr9選択を生存した個体がAvr9遺伝 子を担持するＣ．フルビューム種に対する耐病性を失なった事実により追加の証 拠が提供される。 （vii）Cf−９における、ロイシンに富む反復体領域の同定 Cf−９遺伝子のゲノム DNA配列が図２（配列番号１）に示される。Cf−９タン パク質の推定されるアミノ酸配列が図３（配列番号２）に示される。現在、18の 独立したDs挿入はすべて、図３に示される 863個のアミノ酸の読み取り枠に又は その５′側に存在する。cDNAライブラリーを、バクテリオファージλクリーニン グベクターにAVR9ペプチドを含む細胞間流体により注射されたトマト子葉から単 離されたmRNAから構成した。600,000個のcDNAクローンをスクリーンし、そして1 8個のクローンを、Cf−９遺伝子においてDs挿入に隣接する配列からの DNAプロ ーブにハイブリダイズするものとして同定した。それらのcDNAクローンのいくつ かはCf−９多重遺伝子族の他のメンバーからであるが（Jones et al 1994）、６ 個のクローンは、それらが図２配列のヌクレオチド3509及び3623間の３′未翻訳 領域における小さなイントロンからのスプライシングとは別の同一 の DNA配列を示すので、図２に示されるゲノム配列に由来するものとして同定さ れた。そのような１つのcDNAクローンの配列が図４（配列番号４）に示されてい る。 US National Centre of Biological Information（NCBI）でのデータベースに おける配列に対しての得られた配列の相同性調査は、ロイシンに富む反復体領域 (LRR)を含む他の遺伝子に対して強い相同性を示す。これらはアラビドプシス遺 伝子TMK1(Chang et al 1992)，TMKL1(Valon et al 1993)，RLK5(Walker，1993) 及び不完全配列及び未知の機能を有する発現された配列（たとえばアラビドプシ ス タリアナ転写配列〔ATTS〕1447）を包含する。LRRの存在は他の遺伝子に観 察されており、これらの遺伝子の多くはたぶん受容体として機能する（追加の参 考文献についてはChang et al（1992）を参照のこと）。 TMKI及びRLK5遺伝子は、それらがトランスメンブランセリン／トレオニンキナ ーゼをコードし、そして広範な LRR領域を担持することを示唆する構造体を有す る。これまでのところ、既知の機能はそれらに割り当てられていない。耐病性遺 伝子は、病原体生成物を認識し、そして続いて、防御応答に導びくシグナルトラ ンスダクション鎖を開始する遺伝子生成物をコードすることが知られている。も う１つの特徴化された耐病性遺伝子(Pto)がタンパク質キナーゼであることが知 られている(Martin et al 1993)。しかしながら、Cf−９においては、ゲノム DN A及びcDNA配列分析に基づいての見掛けのタンパク質キナーゼドメインは存在し ない。 予測されるCf−９のアミノ酸配列は次の７つのドメインに分けられ得る（また 、Jones et al 1994における図３も参照のこと）。 ドメインＡは23個のアミノ酸の推定のシグナルペプチドである。 ドメインＢはポリガラクツロナーゼインヒビタータンパク質に対 していくらかの相同性を有する68個のアミノ酸領域である。 ドメインＣは24個のアミノ酸の、ロイシンに富む反復体(LRR)の28個の不完全 コピーを含んで成る 668個のアミノ酸である。 ドメインＤは、ポリガラクツロナーゼインヒビタータンパク質に対していくら かの相同性を有する28個のアミノ酸ドメインである。 ドメインＥは、負に荷電された残基に富む18個のアミノ酸ドメインである。 ドメインＦは推定上のトランスメンブランドメインをコードする37個のアミノ 酸の疎水性ドメインである。 ドメインＧは正に荷電された残基に富んでいる21個のアミノ酸ドメインである 。 ドメインＥ，Ｆ及びＧは共に、適切な膜アンカーを含んで成る。 （viii）ゲノムCf−９遺伝子を担持するバイナリーコスミドベクタークローンの 単離 トランスポゾン標識により特徴づけられた遺伝子が実際にCf−９であることを 示すために、本発明者はMoneymaker Cf9に近いイソジェニック系（Cf９原物）か らの相同 DNA配列が、それらの配列が形質転換されているトランスジェニックCf ０トマト植物にＣ．フルビュームに対する耐性及びAvr9ペプチドに対する感受性 の両者を付与できることを示した。 ゲノム DNAライブラリーを、染色体１上のCf−９遺伝子及び染色体６上のCf− ２遺伝子の両者を担持するストックから構成し、その結果、前記ライブラリーが 両遺伝子を単離するために使用され得る。ライブラリーを、Dr.C.Dean，John In nes Centre，Colney Lane，Norwichから得られたバイナリーコスミドクローニン グベクター pCLD04541に構成した（また、Bent et al.，1994も参照のこと）。 このベクターは、pUCA18（Olszewski et al.，1988）に実質的に類 似する。それはλパッケージング抽出物によりベクターをパッケージ可能にする ためにバクテリオファージλ cos部位を含み、そして従って、コスミドである（ Hohn and Collins，1980）。これはまたバイナリーベクター（van den Elzen et al.，1985）も含み、その結果、単離されるいづれかのコスミドクローンがクロ ーン化された遺伝子の機能について試験するために植物中に直接的に導入され得 る。 高分子量 DNAを、当業者に良く知られている技法(Thomas et al 1994)により 温室で栽培された６週目の植物の葉から単離し、そして MboＩ制限酵素により一 部消化した。その部分消化生成物をスクロースグラジエントを用いてサイズ分別 し、そして20〜25キロベース（kb）の範囲のサイズの DNAを、当業者に良く知ら れている技法を用いて、BamHＩにより消化された pCLD04541 DNAに連結した。St ratagene製のパッケージング抽出物を用いてインビトロパッケージングした後、 コスミドを、StratageneからのＥ．コリ株SURE（TM）のテトラサイクリン感受性 バージョン（Stratageneから得られた）中に導入した。組換え体を、pCLD04541 上の耐テトラサイクリン性遺伝子を用いて選択した。 ライブラリーを、プール当たり約1500個のクローンを含む 144個のプールキロ ランダムに分配し、細胞を個々のプールから増殖し、そして10mlの細胞から、９ mlを多量のプラスミド DNA抽出のために使用し、そして１mlを、0.2mlのグリセ ロールの添加の後、凍結原物を調製するために使用した。プラスミド DNAをアル カリ溶解により単離し(Birnboim and Doly，1979)、そしてそのゲノム DNA配列 の位置 707−728 及び1494−1518からお互いに対してプライムする、それぞれ配 列、５′GGAAGAGATGTTTACAGATTCAAGG ３′（配列番号５）及び５′ATCAGCAGGTCG ATTCTTGTGG３′（配列番号６）を有する PCRプライマーＦ７及びＦ10を用いて、Cf−９相同 DNAを担持するプールについ て PCRにより分析した。プール 34，41，110及び 138は、このアッセイにより陽 性であることがわかった。 個々のプールのために、約10,000個のコロニーをプレートし、そして放射性Cf −９プローブとのコロニーハイブリダイゼーションによりCf−９の相同性につい て詳しく調べ、そして個々のプールから、そのような相同性を担持し、そしてプ ライマーのＦ７，Ｆ10の組合せとの PCR反応の実施に基づいて PCR生成物を付与 する単一のクローンを単離した。それらの技法はすべて当業者に良く知られてい る。 それらのクローンを、Cf−９プローブを用いてのサザンブロットハイブリダイ ゼーションにより、及び制限酵素マッピングによりさらに特徴づけた。それらの オーバーラッピングコスミドにより定義されるように、Cf−９のまわりの隣接す る DNAの大きさの現在の評価が図５に示されている。続いて、それらのコスミド を、当業者に良く知られている技法を用いて、耐カナマイシン性に形質転換され た植物細胞について選択する、植物形質転換実験に使用した。コスミド 34，41 ，110及び 138の少なくとも１つを有するトランスジェニックトマト、タバコ及 びジャガイモ植物を製造した(Fillatti et al.，1987；Hammond-Kosack et al. ，1994；Horsch et al.，1985；Spychalla and Bevan，1993)。 （ix）トランスジェニックのトマト，タバコ及びジャガイモにおけるCf−９機能 の評価 推定上のクローン化されたCf−９遺伝子の機能が、Avr9−担持Ｃ．フルビュー ムに対する耐性に関してのみならず、また活性Avr9ペプチドを含む細胞間流体（ IF）に対する壊死応答に関して、形質転換体を試験することによって形質転換さ れたトマトにおいて評価さ れ得る。Ｃ．フルビュームのための宿主、たとえばタバコ及びジャガイモでない 種におけるクローン化されたCf−９遺伝子の機能は、IFに対する応答を評価する ことによって単に査定され得る。 異なったCf−９コスミドを担持する一次形質転換体をトマト、ジャガイモ及び タバコに対して付与する生物学的活性を評価するために、成熟葉の葉脈間パネル に、Avr9ペプチドを含むか又はそれを欠いているIFを注入した。それらのIFは、 de Wit and Spikman（1982）の方法に従って調製された。Avr9ペプチドを含むIF は、０及びCf０植物種を包含する適合性Ｃ．フルビューム相互作用又は35Ｓ：Av r9構造体（SLJ6201）（Hammond-Kosack et al．1994）に対してホモ接合性であ るトランスジェニックタバコ植物のいづれかから得られた。Avr9を欠いているIF は、２，４，５，９及びCf０植物種を包含する適合性Ｃ．フルビューム相互作用 又は形質転換されていないタバコ植物のいづれかから得られた。 トマト、タバコ及びジャガイモ中に導入される種々のコスミドによる実験から の結果の要約は表１に示されている。Avr9−誘発性壊死の基準に基づいて機能的 なCf−９遺伝子を担持したすべてのトマト植物はまた、コスミドクローンが形質 転換されていないＣ．フルビュームー感受性Cf0 Moneymaker種とは異なって、Av r9を発現するＣ．フルビューム種による感染に対しても耐性であった。 Cf-9-Avr9 −依存性の灰色の壊死性応答が、注入後24時間までに、ほとんどの トマト（23のうち17）、ジャガイモ（５のうち５）及びタバコ（13のうち10）形 質転換体の、IF注入された葉パネル内に生じた。それらのデータは、それ自体の プロモーターの制御下でのゲノムCf−９遺伝子が、種々の植物種、たとえばトマ ト、ジャガイモ及びタバコ中に導入される場合、機能的であり、そして予測され る作用の特異性を現わすことを示唆する。 タバコにおけるCf−９の生物学的活性のさらなる確認が、35Ｓ：Avr9 T-DNAの ためにホモ接合性であるトランスジェニックタバコ植物に、コスミド34の単一の コピーを担持する５つの異なった一次形質転換体（形質転換された系Ｂ，Ｈ，Ｉ ，Ｌ及びＭ）を交雑することによって得られた。実生の死亡率は、種子をまいた 後、11日目までにＦ，子孫の50％で生じた。類似する実生の死亡表現型が、Cf− ９を担持するトマト植物が35Ｓ：Avr9を発現するトマト植物に交雑される場合に 得られた（Hammond-Kosack et al．1994）。これらのデータは、トマト以外のト ランスジェニック植物に耐病性を付与するためにAvr9とCf−９との間の認識を利 用する手段の実行可能性を示す。 35Ｓ：Avr9の構造体(SLJ6201)のためにホモ接合性のトランスジェニックタバ コ植物から得られた Avr-9ペプチドを含む細胞間流体 に対しての、異なったCf−９コスミド構造体を担持するトランスジェニックトマ ト、ジャガイモ及びタバコ植物（一次形質転換体）の応答。（＋）は、灰色の壊 死性徴候が24時間までに注入された葉パネル内に形成したことを示唆する。コス ミド挿入体のコピー数を、サザンブロット分析により決定した。 １：35Ｓ：Avr9 T-DNAについてホモ接合性のトランスジェニックタバコ植物との 交雑のために使用される、コスミド34の単一のコピー。 ２：植物はまた、適合性Ｃ．フルビューム相互作用（種０−Cf０）から得られた Avr9ペプチドを含むIFに対して陽性の応答を示すが、しかしAvr9を欠いている２ 種の異なった細胞間流体（種２，４，５，９−Cf０）及び形質転換されていない タバコに対しての応答は示さない。 図１のキー： 図１はCf−９遺伝子の標識された対立遺伝子を示す。Ｘは可能性あるプロモー ターである。 配列番号：３ 本明細書に記載されるようにして使用される好ましい形のキメラAvr9遺伝子の アミノ酸配列及び DNA配列。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１２月１２日 【補正内容】 請求の範囲 １．耐病原性遺伝子をコードする DNA単離体であって、前記耐病原性遺伝子が 配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメント、又は配列番号２に示 される配列に対して有意な程度の相同性を示すアミノ酸配列又はそのフラグメン トをコードすることを特徴とする DNA単離体。 ２．配列番号２に示されるようなアミノ酸配列、又はその対立遺伝子、変異体 又は誘導体をコードする請求の範囲第１項記載の DNA単離体。 ３．配列番号１又は４に示される配列を有する DNAを含んで成る請求の範囲第 ２項記載の DNA単離体。 ４．組換えベクターであって、ここにおける DNAが請求の範囲第１〜３のいづ れか１項記載の DNAであり、そして宿主細胞における発現のために適切なプロモ ーター及び調節要素の制御下にあることを特徴とする組換えベクター。 ５．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の DNA単離体、又は請求の範囲第 ４項記載の組換えベクターのトランスジェニック植物の生成のためへの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者 ハモンド−コサック，キム エリザベス イギリス国，ノーウィッチ アールエヌ４ ６エヌエル，チェストナット ヒル ６ (72)発明者 トーマス，コルウィン マーティン イギリス国，ノーウィッチ エヌアール１ ２エイチピー，シティ ロード 95 (72)発明者 ジョーンズ，デビッド アレン イギリス国，ノーウィッチ エヌアール４ ６ピーディー，イートン，グリーンウェ イズ 139

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．耐病原性遺伝子又はそのフラグメントをコードする DNA単離体であって、 前記遺伝子が、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はそれに対して有意な程度 の相同性を示すアミノ酸配列をコードすることにより特徴づけられる DNA単離体 。 ２．配列番号２に示されるようなアミノ酸配列、又はその対立遺伝子、変異体 又は誘導体をコードする請求の範囲第１項記載の DNA単離体。 ３．配列番号１又は４に示される配列を有する DNAを含んで成る請求の範囲第 ２項記載の DNA単離体。 ４．組換えベクターであって、DNAが請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載 の DNAであり、そして宿主細胞における発現のために適切なプロモーター及び調 節要素の制御下にあることを特徴とする組換えベクター。 ５．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の DNA単離体又は請求の範囲第４ 項記載の組換えベクターのトランスジェニック植物の生成のためへの使用。 ６．請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の DNA単離体又は請求の範囲第４ 項記載の組換えベクターを含んで成る宿主細胞。 ７．微生物細胞である請求の範囲第６項記載の宿主細胞。 ８．植物細胞である請求の範囲第６項記載の宿主細胞。 ９．請求の範囲第８項記載の植物細胞を含んで成る植物又はそのいづれかの部 分。 10．請求の範囲第９項記載の植物の種子、同種又はハイブリッド子孫、又はそ のいづれかの部分。 11．植物に対して耐病原性を付与するための方法であって、植物 の細胞又はその前駆体中に核酸の導入の初期段階に続いて、その植物の細胞内で 、配列番号２で示されるアミノ酸配列、又はその変異体、対立遺伝子又は誘導体 、又は有意に相同のアミノ酸配列をコードする核酸を発現せしめることを含んで 成る方法。 12．前記核酸が配列番号１又は４に示される配列を含んで成る請求の範囲第11 項記載の方法。 13．植物耐病原性遺伝子を同定するための方法であって： （１）病原体に対して耐性を有する植物の細胞から、発現された DNA又はゲノ ム DNAを得； （２）前記 DNAを配列決定し、そしてロイシンに富む反復体(LRR)の存在によ り推定上の耐病原性遺伝子を同定し；そして （３）耐病原性遺伝子としての同一性を確証することを含んで成る方法。 14．前記 LRRが、配列番号２の配列に比較される場合、60又はそれ以上のBLAS TX評点を有するものとして同定される請求の範囲第13項記載の方法。 15．前記耐病原性遺伝子の同一性が、形質転換された適切な植物の表現型に対 する遺伝子の連鎖分析及び／又はその遺伝子の効果により確証される請求の範囲 第13又は14項記載の方法。