DE69534058T2

DE69534058T2 - Genetische sequenzen welche pflanzenkrankheiten verursachen und verwendungen davon

Info

Publication number: DE69534058T2
Application number: DE69534058T
Authority: DE
Inventors: Gregory James Lawrence; Jeffrey Graham Ellis; Elzabeth Jean Finnegan
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1994-04-21
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2015-04-22
Also published as: EP0763113A1; EP0763113B1; EP0763113A4; AU2298695A; WO1995029238A1; DE69534058D1; CA2188418A1; AU698060B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Gensequenzen und insbesondere Gensequenzen, die Krankheitsresistenz bei Pflanzen, beispielsweise gegenüber Rost und Mehltau, verleihen oder in anderer Weise ermöglichen. Die vorliegende Erfindung stellt ferner transgene Pflanzen bereit, die die betreffenden Gensequenzen tragen, die die Erzeugung krankheitsresistenter Pflanzen ermöglichen. Die vorliegende Erfindung ist zur Entwicklung von Krankheitsresistenz bei Feldfrüchte- bzw. Getreidearten besonders verwendbar.
Bibliographische Einzelheiten der Veröffentlichungen, auf die in dieser Beschreibung durch Zahlen verwiesen wird, sind am Ende der Beschreibung gesammelt angegeben. Die Sequenzidentitätsnummern (SEQ ID NOs) für die in der Beschreibung angegebenen Nucleotid- und Aminosäuresequenzen sind nach der Bibliographie definiert.
Durchgängig in dieser Beschreibung sind, falls es der Kontext nicht anders erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen, wie "umfasst" oder "umfassend", so zu verstehen, dass impliziert wird, dass ein Element oder eine ganze Zahl oder eine Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen, die angegeben sind, eingeschlossen sind, jedoch ein anderes Element oder eine andere ganze Zahl oder eine andere Gruppe von Elementen oder ganzen Zahlen nicht ausgeschlossen sind.
Die rasch zunehmende Verfeinerung der Gentechnologie erleichtert die Wirksamkeit kommerziell bedeutender landwirtschaftlicher Verfahren stark. Von spezieller Bedeutung ist die Wirkung von Pflanzenkrankheiten auf die Wirksamkeit dieser landwirtschaftlichen Verfahren. Pflanzenkrankheiten und insbesondere Krankheiten bei Feldfrüchte- bzw. Getreidepflanzen stellen einen Hauptfaktor dar, der zu Verlusten an Feldfrüchten beiträgt, was einen ökonomisch signifikanten Abschwung der Produktivität pro Quadratmeter verursachen kann. Die Entwicklung von krankheitsresistenten Pflanzen ist daher in der Forschung in Landwirtschaft und Gartenbau ein bedeutendes Ziel.
Hauptgene zur Konditionierung von Resistenz gegenüber Pflanzenkrankheiten wurden in der Landwirtschaft intensiv untersucht. von spezieller wirtschaftlicher Bedeutung sind Gene, die Beständigkeit gegenüber Rost und Mehltau kontrollieren. Rost ist ein besonders signifikantes Problem unter Feldfrüchten weiter Flächen, wie Weizen-, Gerste- und Hafergetreide, und es wird durch eine Infektion mit einer Klasse von Pilzen, die als die Basidiomycetes bekannt sind, verursacht. Obwohl Rostbeständigkeitsgene eine potentielle unschätzbare Genressource in der Landwirtschaft sind, ist die molekulare Basis von generalisierter Genbeständigkeit unbekannt, und bis zur vorliegenden Erfindung wurden Gene, die Rost- oder Mehltaubeständigkeit verleihen, nicht kloniert.
Eine Genanalyse zeigt, dass Rostbeständigkeitsgene die spezifische Erkennung der Produkte von Rostavirulenzgenen kontrollieren. Bei der Entwicklung von Krankheitsresistenzarten unter Verwendung von Krankheitresistenzgenen entwickeln Pflanzenzüchter Resistenzgene, die mit den Avirulenzgenen, die in den lokalen Stämmen der Pathogene vorhanden sind, übereinstimmen. Die Pathogenpopulationen sind dynamisch und häufig entstehen neue pathogene Stämme durch eine Zahl von Mitteln wie Mutation, Rekombination oder zufällige oder natürliche Einführung neuer pathogener Stämme. Die vorhandenen krankheitsresistenten Arten werden dann gegenüber den neuen pathogenen Stämmen empfindlich. Pflanzenzüchter sind dann gezwungen, neue krankheitsresistente Arten zu entwickeln. Derzeit verwenden Züchter Resistenzgene, die in entweder Weizen oder dessen Verwandten vorhanden sind, als deren Pool für neue Gene.
Die Klonierung eines Resistenzgens ist die erste Stufe zum Verständnis der Basis der Resistenzgenwirkung und insbesondere des Spezifitätskontrollmechanismus. Ellis et al. (1) beschrieben die Entwicklung eines Transposon-Taggingsystems zur Isolierung von Rostbeständigkeitsgenen aus Flachs (Lein, Linum usitatissimum). Jedoch war trotz der allgemeinen Wirksamkeit des Verfahrens die Isolierung mutierter Flachspflanzen, die ein tagmarkiertes Resistenzgen besaßen, kein direktes zum Ziel führendes Verfahren (2). Miklas et al. (15) beschreibt die Identifizierung eines molekularen Markers für Rostbeständigkeit und dessen Verwendung als Selektionswerkzeug.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden Rostbeständigkeit verleihende Gensequenzen aus Flachs kloniert. Die Klonierung dieser Sequenzen stellt das Mittel zur Erzeugung transgener Pflanzen mit neuer, erhöhter oder in anderer Weise verstärkter Rostbeständigkeit bereit. Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner das Screening ähnlicher Rostbeständigkeitsgene durch genetische oder immunologische Mittel in anderen Pflanzen zur Verwendung bei der Entwicklung oder Verstärkung von Rostbeständigkeit in kommerziell und wirtschaftlich wichtigen Arten. Ferner bietet die Anwendung von Erkenntnissen der molekularen Basis hinter der Wirkung eines Resistenzgens und der Spezifität desselben das Potential einer neuen Quelle für Gene, die mittels einer Vielzahl rekombinanter Techniken hergestellt werden. Diese neuen Gene mit veränderten Krankheitsresistenzspezifitäten werden hier als "modulare Resistenzgene" bezeichnet.
Daher umfasst ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die Krankheitresistenz in einer Pflanze verleiht oder in anderer Weise ermöglicht. Insbesondere ist die Krankheitsresistenz bzw. -beständigkeit Rostbeständigkeit. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich jedoch auf Resistenz gegenüber obligaten biotrophen Pathogenen, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, Pilze, Viren und Nematoden umfassen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf ein Nucleinsäuremolekül gerichtet, das eine Sequenz von Nucleotiden umfasst, die der in 1 angegebenen Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) entspricht oder zu dieser komplementär ist oder eine Ähnlichkeit von mindestens 45% mit der gesamten Sequenz aufweist und wobei das Nucleinsäuremolekül Rostbeständigkeit in einer Pflanze verleiht oder in anderer Weise ermöglicht.
In einem verwandten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, das eine Sequenz von Nucleotiden mit Codierung für eine Sequenz mit Codierung für die in 1 angegebene Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2 bis 5) oder mit einer Ähnlichkeit von mindestens 60% zur gesamten Sequenz umfasst oder komplementär zu einer derartigen Sequenz von Nucleotiden ist, und wobei das Nucleinsäuremolekül Rostbeständigkeit in einer Pflanze verleiht oder in anderer Weise ermöglicht.
Vorzugsweise beträgt der Prozentsatz der Ähnlichkeit mindestens 65%. Noch besser beträgt der Prozentsatz der Ähnlichkeit mindestens 80–90%, was mindestens 91% oder 93% oder 95% umfasst.
Zum Zwecke der Nomenklatur betreffen die Sequenzen in 1 das "L6"-Allel des Krankheitsresistenzgens L, das die Wirtresistenz gegenüber Flachsrostrassen, die das entsprechende Avirulenzgen AL6 tragen, kontrolliert. Jedoch erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf andere Allele des Gens oder Allele des M-Gens. Daher betrachtet eine verwandte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das eine Sequenz von Nucleotiden mit Codierung für ein Peptid, Polypeptid oder Protein, wobei das Peptid, Polypeptid oder Protein mit einem Avirulenzgenprodukt an einem Flachsrost wechselwirken kann, umfasst oder komplementär zu einer derartigen Sequenz ist. Allgemein ist, wenn das Rostbeständigkeitsgen das L6-Allel ist, das entsprechende Avirulenzgen AL6. Eine ähnliche Nomenklatur wird für die anderen Allele des L-Gens, beispielsweise die L2- und L10-Allele, verwendet. Deren entsprechende Avirulenzgene sind AL2 bzw. AL10.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrachtet ein Nucleinsäuremolekül, das Rostbeständigkeit in einer Pflanze verleiht oder in anderer Weise ermöglicht und mit dem in SEQ ID NO: 1 definierten Nucleinsäuremolekül unter Bedingungen von mindestens mittlerer Stringenz hybridisieren kann.
Für die Zwecke der Definition des Grades der Stringenz sei günstigerweise auf Sambrook et al. (3) verwiesen, wobei die Waschstufen auf den Seiten 9.52–9.57 als hohe Stringenz betrachtet werden. "Niedrige" Stringenz wird hier als 0,1–0,5% (Gew/V) SDS bei 37–45°C während 2–3 h definiert. In Abhängigkeit von der Quelle und Konzentration der an der Hybridisierung beteiligten Nucleinsäure können alternative Stringenzbedingungen verwendet werden, beispielsweise Bedingungen "mittlerer" Stringenz, die hier als 0,25–0,5 % (Gew/V) SDS bei ≥ 45°C während 2–3 h betrachtet werden, oder Bedingungen "hoher" Stringenz gemäß der Offenbarung bei Sambrook et al. (3) verwendet werden.
Es wird vorgeschlagen, dass die Gensequenzen der vorliegenden Erfindung zur spezifischen Erkennung der Produkte von Rostavirulenzgenen notwendig sind. Daher sind die Gensequenzen zur Verstärkung von vorhandenen Rostbeständigkeitsgenen, erneuten Bereitstellung der erforderlichen spezifischen Erkennung von Rostavirulenzgenprodukten oder Einführung zusammen mit Rostavirulenzgenen auf beispielsweise einer einzigen Genkassette verwendbar. Daher werden diese Aspekte der Erfindung durch den Ausdruck "Verleihen oder in anderer Weise Verstärken der Rostbeständigkeit" oder einen anderen ähnlichen Ausdruck umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere auf Resistenz verleihende oder ermöglichende Gensequenzen von Flachspflanzen und deren Verwandtem Linum marginale gerichtet. Die vorliegende Erfindung betrachtet jedoch klar andere Quellen von Rostbeständigkeitsgenen, beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, andere Arten von Linum, Sojabohnen, Sonnenblumen und Getreidearten unter anderen Pflanzen einschließlich der Wildarten von Weizen, Hafer und Mais.
Die Gensequenzen, die Rostbeständigkeit verleihen oder in anderer Weise ermöglichen, können der natürlich vorkommenden Sequenz entsprechen oder sich durch eine oder mehrere Nucleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen unterscheiden. Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Rostbeständigkeitsgene und alle funktionalen Allelmutanten, Derivate, Teile, Fragmente, Homologa oder Analoga derselben oder nichtfunktionale Moleküle, die zumindest als beispielsweise Gensonden oder bei der Erzeugung immunologisch interaktiver rekombinanter Moleküle verwend bar sind. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf die Promotorregion der Rostbeständigkeitsgene, beispielsweise von L6, L2 oder L10. Ein bevorzugter Promotor stammt von L6. Derartige Promotoren können zum Antreiben der Expression von Transgenen verwendbar sein.
Beispiele für Allele des Flachsrostbeständigkeitsgens L umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, L6, L2 und L10, obwohl alle Allele des L-Locus durch die vorliegende Erfindung umfasst werden. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf Allele des M-Locus.
Die vorliegende Erfindung betrachtet ferner rekombinante oder synthetische Rostbeständigkeitsgenprodukte, wie die Produkte der L6-, L2- oder L10-Allele des L-Resistenzgens. Ein besonders bevorzugtes rekombinantes oder synthetisches Rostbeständigkeitsgenprodukt stammt von dem L6-Gen. Das L6-Protein weist die folgenden Merkmale auf: eine aminoterminale Hälfte, die eine Nucleotidbindungsstelle (NBS) enthält, die aus mehreren Motiven einschließlich der P-Schleife und ferner strangabwärts einem Kinase-2-Motiv besteht (14). In L6 ist die Kinase-2-Sequenz ILVVLDDVD (SEQ ID NO: 13) und allgemeiner XXXXDDX, wobei X = L, I, V, F (unter Verwendung der im folgenden definierten Nomenklatur einzelner Aminosäuren). Die C-terminale Hälfte des Peptids ist eine leucinreiche Region, die aus etwa 17% Leucinresten besteht. Innerhalb dieser Region treten Strecken von Resten auf, worin Leucin als LXXL oder LXL, wobei X ein beliebiger Rest ist, wiederholt ist. Diese Sequenzen sind ähnlich den leucinreichen Repeatsequenzen mit 25–30 Resten, die in vielen Proteinen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden, gefunden werden. Insbesondere besteht die leucinreiche Region von L6 in dem L6-Produkt aus zwei Teilen, wobei der C-terminale Teil der Region aus zwei direkten leucinreichen Repeats mit 146 und 149 Aminosäuren, die zu 74% identisch sind, besteht.

Die im vorhergehenden genannten funktionalen Mutanten, Derivate, Teile, Fragmente, Homologa und Analoga werden hier als "rostbeständigkeitsähnliche Gene" oder "Rostbeständigkeitsgensequenzen" bezeichnet. Der Bezug auf "Gene" soll hier im breitesten Kontext genommen werden und er umfasst ein klassisches Genomgen sowie mRNA oder cDNA, die den codierenden Regionen (d.h. Exons) des Gens entspricht. Der Ausdruck "Gen" wird auch zur Beschreibung von synthetischen oder Fusionsmolekülen mit Codierung für ein gesamtes funktionales Produkt oder einen Teil eines funktionalen Produkts verwendet. Bevorzugte rostbeständigkeitsähnliche Gene werden von einem natürlich vorkommenden Rostbeständigkeitsgen durch rekombinante Standardverfahren abgeleitet. Allgemein kann ein Rostbeständigkeitsgen einer Mutagenese unterzogen werden, um einzelne oder mehrfache Nucleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen herzustellen. Nucleotidinsertionsderivate des Rostbeständigkeitsgens der vorliegenden Erfindung umfassen 5'-terminale und 3'-terminale Fusionen sowie Intrasequenzinsertionen von einzelnen oder mehreren Nucleotiden. Insertionsnucleotidsequenzvarianten sind solche, bei denen ein oder mehrere Nucleotide an einer vorgegebenen Stelle in der Nucleotidsequenz eingeführt sind, obwohl eine randomisierte Insertion mit einem geeigneten Screening des erhaltenen Produkts ebenfalls möglich ist. Deletionsvarianten sind durch die Entfernung von einem oder mehreren Nucleotiden aus der Sequenz gekennzeichnet. Substitutionsnucleotidvarianten sind solche, in denen mindestens ein Nucleotid in der Sequenz entfernt und ein unterschiedliches Nucleotid an dessen Stelle insertiert wurde. Eine derartige Substitution kann insofern "stumm" sein, als die Substitution die durch das Kodon definierte Aminosäure nicht ändert. Alternativ werden Substituenten so gestaltet, dass sie eine Aminosäure durch eine andere ähnlich wirkende Aminosäure austauschen. Typische Substitutionen sind solche, die gemäß dem folgenden durchgeführt werden: Geeignete Reste für Aminosäuresubstitutionen

Ursprünglicher Rest	Beispielsubstitutionen
Ala	Ser
Arg	Lys
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala
His	Asn; Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln; Glu
Met	Leu; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

In einer speziell bevorzugten Ausführungsform werden die Rostbeständigkeitsgensequenzen oder ähnliche Gensequenzen zur Identifizierung und Isolierung ähnlicher Gene aus anderen Pflanzen verwendet. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifizierung einer Rostbeständigkeitsgensequenz oder rostbeständigkeitähnlichen Gensequenz in einer Pflanze betrachtet, wobei das Verfahren das Kontak tieren von aus der Pflanze isolierter genomischer DNA oder cDNA mit einer zur Hybridisierung wirksamen Menge einer Gensequenz, die Rostbeständigkeit verleiht oder in anderer Weise ermöglicht, oder eines Teils derselben und die anschließende Detektion der Hybridisierung umfasst.
Vorzugsweise stammt die letztere genannte Gensequenz von Flachs oder einer ähnlichen Pflanze, wie einer Linum-Art. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform ist die letztere Gensequenz die in SEQ ID NO: 1 angegebene oder sie entspricht einer Sonde wie der in 2 definierten (SEQ ID NO: 11).
Vorzugsweise ist die letztere Gensequenz mit einem Reportermolekül markiert, das ein identifizierbares Signal ergeben kann (beispielsweise ein Radioisotop, wie ³²P oder ³⁵S oder ein biotinyliertes Molekül).
Vorzugsweise ist die zu screenende Pflanze ein Flachs, eine Linum-Art oder eine Körnerfeldfruchtpflanze, wie Weizen, Hafer, Mais, Roggen, Lupinen oder Reis und/oder Wildarten derselben.
Alternativ wird die Pflanze unter Verwendung von Antikörpern gegenüber einem rekombinanten Produkt eines Rostbeständigkeitsgens gescreent. Gemäß einem ersten Aspekt dieser Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Expression der entsprechenden Gensequenz in einem geeigneten Wirt (beispielsweise einem Prokaryoten oder Eukaryoten) zur Produktion rekombinanter Rostbeständigkeitsgenprodukte voller Länge oder nicht voller Länge bereit. Die einzige Anforderung besteht darin, dass die rekombinanten Produkte mit Antikörpern gegenüber einem gesamten Rostbeständigkeitsgenprodukt oder einem Teil desselben immunologisch interaktiv sind. Das immunologische Screening auf Rostbe ständigkeitsgenprodukte kann in einigen Fällen günstiger als ein genetisches Screeningverfahren sein.
Ein weiterer Aspekt ist daher auf Antikörper gegenüber einem rekombinanten Rostbeständigkeitsgenprodukt oder einem Teil oder Fragment desselben gerichtet. Derartige Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und aus natürlich vorkommenden Antikörpern gegenüber einem Rostbeständigkeitsgenprodukt gewählt werden oder spezifisch für ein rekombinantes Rostbeständigkeitsgenprodukt gebildet werden. Im Falle des letzteren muss das Rostbeständigkeitsgenprodukt zunächst mit einem Trägermolekül in Verbindung gebracht werden. Alternativ können Fragmente von Antikörpern, beispielsweise Fab-Fragmente, verwendet werden. Ferner werden rekombinante und synthetische Antikörper und Antikörperhybride beschrieben. Ein "synthetischer Antikörper" soll hier Fragmente und Hybride von Antikörpern umfassen. Ferner können Antikörper gegenüber Fragmenten oder Derivaten des Rostbeständigkeitsgenprodukts, wie Oligopeptiden, die von dem Produkt von beispielsweise dem L6-Gen abgeleitet sind oder auf diesem basieren, gebildet werden. Die Antikörper und/oder die rekombinanten Rostbeständigkeitsgenprodukte sind für das immunologische Screening von Rostbeständigkeitsgenprodukten in verschiedenen Pflanzen, zur Überwachung der Expression von Rostbeständigkeitsgensequenzen in transgenen Pflanzen und als proprietäres Taggingsystem besonders günstig.
In einer Ausführungsform werden spezifische Antikörper zum Screening für Rostbeständigkeitsgenprodukte in Pflanzen verwendet. Techniken für die hier betrachteten Assays sind einschlägig bekannt und umfassen beispielsweise Sandwichassays und ELISA.
Es ist möglich, zweite Antikörper (monoklonale, polyklonale oder Fragmente von Antikörpern), die auf die im vorhergehenden diskutierten ersten genannten Antikörper gerichtet sind, mitzuverwenden. Sowohl die ersten als auch die zweiten Antikörper können in Detektionsassays verwendet werden oder ein erster Antikörper kann mit einem im Handel erhältlichen Anti-Immunoglobulin-Antikörper verwendet werden. Ein Antikörper, der hier betrachtet wird, umfasst einen Antikörper, der für eine beliebige Region eines rekombinanten Rostbeständigkeitsgenprodukts spezifisch ist.
Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sind durch Immunisierung mit einem rekombinanten Rostbeständigkeitsgenprodukt erhältlich und jede Art ist für Immunoassays verwendbar. Die Verfahren zur Gewinnung beider Serumarten sind einschlägig bekannt. Polyklonale Seren sind weniger bevorzugt, jedoch durch Injektion einer wirksamen Menge eines rekombinanten Rostbeständigkeitsgenprodukts oder antigener oder immunointeraktiver Teile desselben in ein geeignetes Labortier, Gewinnen von Serum von dem Tier und Isolieren spezifischer Seren durch eine der bekannten Immunadsorptionstechniken relativ leicht herstellbar. Obwohl durch dieses Verfahren hergestellte Antikörper in tatsächlich jeder Art eines Immunoassays verwendbar sind, sind sie wegen der potentiellen Heterogenität des Produkts weniger favorisiert.
Die Verwendung monoklonaler Antikörper in einem Immunoassay ist wegen der Möglichkeit der Herstellung derselben in großen Mengen und der Homogenität des Produkts besonders bevorzugt. Die Herstellung von Hybridomzelllinien, die durch Fusion einer unsterblichen Zelllinie und von gegenüber dem immunogenen Präparat sensibilisierten Lymphocyten abgeleitet sind, zur Produktion monoklonaler Antikörper kann durch Techniken erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind (siehe beispielsweise die Literaturstellen 4, 5 und 6).
Das Vorhandensein eines Rostbeständigkeitsgenprodukts in einer Pflanze oder häufiger einem Pflanzenextrakt kann auf eine Zahl von Wegen, wie Western Blotting und ELISA-Verfahren, festgestellt werden. Ein breiter Bereich von Immunoassaytechniken ist verfügbar, was unter Bezug auf US-Patent Nr. 4 016 043, 4 424 429 und 4 018 653 ersichtlich ist. Diese umfassen natürlich sowohl Einzentren- als auch Zweizentren- oder "Sandwich"-Assays der nicht-kompetitiven Arten sowie die traditionellen Assays mit kompetitiver Bindung. Diese Assays umfassen auch die direkte Bindung eines markierten Antikörpers an ein Ziel.
Sandwichassays gehören zu den günstisten und am häufigsten verwendeten Assays und sie werden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung favorisiert. Eine Zahl von Variationen der Sandwichassaytechnik existiert. Kurz gesagt, wird in einem typischen Nachweistest ein unmarkierter Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert und die zu testende Probe mit dem gebundenen Molekül in Kontakt gebracht. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode über einen Zeitraum, der zur Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes ausreichend ist, wird dann ein zweiter Antikörper, der für das Antigen spezifisch ist, der mit einem Reportermolekül mit der Fähigkeit zur Bildung eines nachweisbaren Signals markiert ist, zugesetzt und eine Inkubation durchgeführt, wobei eine Zeitdauer zugestanden wird, die zur Bildung eines weiteren Komplexes Antikörper/Antigen/markierter Antikörper ausreichend ist. Alles nicht-umgesetzte Material wird weggewaschen und das Vorhandensein des Antigens wird durch Beobachtung eines durch das Reportermolekül hervorgerufenen Signals bestimmt.
In diesem Fall wird der erste Antikörper gegenüber einem rekombinanten Rostbeständigkeitsgenprodukt gebildet und das Antigen ist ein Rostbeständigkeitsgenprodukt in einer Pflanze.
Die Ergebnisse können entweder qualitativ, durch einfache Betrachtung des sichtbaren Signals, sein oder durch Vergleich mit einer Kontrollprobe, die bekannte Mengen des Haptens enthält, quantitativ bestimmt werden. Variationen des Nachweistests umfassen einen simultanen Assay, bei dem sowohl Probe als auch markierter Antikörper simultan zu dem gebundenen Antikörper gegeben werden. Diese Techniken sind einschließlich geringer Variationen, die ohne weiteres ersichtlich sind, dem Fachmann geläufig. Die Probe ist eine, die ein Rostbeständigkeitsgenprodukt enthalten und einen rohen oder gereinigten Pflanzenextrakt, wie Extrakte von Blättern, Wurzeln und Stängeln, umfassen kann.
In dem typischen Nachweissandwichassay ist ein erster Antikörper, der gegen ein rekombinantes Rostbeständigkeitsgenprodukt gebildet ist, entweder kovalent oder passiv an eine feste Oberfläche gebunden. Die feste Oberfläche ist typischerweise Glas oder ein Polymer, wobei die am häufigsten verwendeten Polymere Cellulose, Polyacrylamid, Nylon, Polystyrol, Polyvinylchlorid oder Polypropylen sind. Die festen Träger können in der Form von Röhren, Perlen, Platten von Mikroplatten oder jeder anderen zur Durchführung eines Immunoassays geeigneten Oberfläche sein. Die Bindungsverfahren sind einschlägig bekannt und bestehen allgemein aus Vernetzung, kovalenter Bindung oder physikalischer Adsorption, wobei der Polymer-Antikörper-Komplex zur Vorbereitung auf die Testprobe gewaschen wird. Ein Aliquot der zu testenden Probe wird dann zu dem Festphasenkomplex gegeben und es wird über einen ausreichenden Zeitraum (beispielsweise 2–40 min) und unter geeigneten Bedingungen (beispielsweise 25°C), um eine Bindung eines in der Probe vorhandenen Antigens an den Antikörper zu ermöglichen, inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wird der Reaktionsort gewaschen und getrocknet und mit einem zweiten Antikörper, der für einen Teil des ersten Antikörpers spezifisch ist, inkubiert. Der zweite Antikörper ist mit einem Reportermolekül, das zum Anzeigen der Bindung des zweiten Antikörpers an das Hapten verwendet wird, verknüpft.
Ein alternatives Verfahren umfasst die Immobilisierung der Zielmoleküle in der biologischen Probe und das anschließende Einwirken eines spezifischen Antikörpers, der mit einem Reportermolekül markiert oder nicht markiert sein kann, auf das immobilisierte Ziel. In Abhängigkeit von der Menge des Ziels und der Intensität des Reportermolekülsignals kann ein gebundenes Ziel durch direkte Markierung mit dem Antikörper detektiert werden. Alternativ wird ein zweiter markierter Antikörper, der für den ersten Antikörper spezifisch ist, auf den Ziel/erster Antikörper-Komplex zur Bildung eines tertiären Komplexes Target/erster Antikörper/zweiter Antikörper einwirken gelassen. Der Komplex wird durch das von dem Reportermolekül emittierte Signal detektiert.
Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck "Reportermolekül" bedeutet ein Molekül, das aufgrund seiner chemischen Natur ein analytisch identifizierbares Signal ergibt, das die Detektion eines antigengebundenen Antikörpers erlaubt. Die Detektion kann entweder qualitativ oder quantitativ sein. Die bei diesem Assaytyp am häufisten verwendeten Reportermoleküle sind entweder Enzyme, Fluorophore oder ein Radionuclid enthaltende Moleküle (d.h. Radioisotope) und chemilumineszierende Moleküle.
Im Falle eines Enzymimmunoassays wird ein Enzym, allgemein mittels Glutaraldehyd oder Periodat, an den zweiten Antikörper konjugiert. Wie ohne weiteres klar ist, existieren jedoch eine breite Vielzahl unterschiedlicher Konjugationstechniken, die dem erfahrenen Fachmann ohne weiteres verfügbar sind. Üblicherweise verwendete Enzyme umfassen u.a. Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Die mit den speziellen Enzymen zu verwendenden Substrate werden allgemein zum Hervorrufen einer detektierbaren Farbveränderung bei Hydrolyse des entsprechenden Enzyms gewählt. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen alkalische Phosphatase und Peroxidase. Es ist auch möglich, statt der oben angegebenen chromogenen Substrate fluorogene Substrate, die ein fluoreszierendes Produkt ergeben, zu verwenden. In allen Fällen wird der enzymmarkierte Antikörper zu dem erster Antikörper/Hapten-Komplex gegeben, binden gelassen und dann wird das überschüssige Reagens abgewaschen. Eine das geeignete Substrat enthaltende Lösung wird dann zu dem Komplex Antikörper/Antigen/Antikörper gegeben. Das Substrat reagiert mit dem an den zweiten Antikörper gebundenen Enzym, wobei ein qualitatives visuelles Signal erhalten wird, das ferner, üblicherweise spektrophotometrisch, quantitativ erfasst werden kann, wobei eine Anzeige der Menge des in der Probe vorhandenen Haptens erhalten wird. Der Ausdruck "Reportermolekül" erstreckt sich auch auf die Verwendung von Zellagglutination oder Hemmung der Agglutination, beispielsweise rote Blutkörperchen auf Latexperlen und dgl.
Alternativ können fluoreszierende Verbindungen, wie Fluorescein und Rhodamin, chemisch an Antikörper ohne Änderung von deren Bindungsvermögen gekoppelt werden. Bei Aktivierung durch Beleuchtung mit Licht einer speziellen Wellenlänge adsorbiert der fluorochrommarkierte Antikörper die Lichtenergie unter Induktion eines Anregungszustands in dem Molekül und anschließender Emission des Lichts mit einer charakteristischen Farbe, die mit einem Lichtmikroskop visuell detektierbar ist. Wie bei Enzymimmunoassays (EIA) wird der fluoreszenzmarkierte Antikörper an den erster Antikörper/Hapten-Komplex binden gelassen. Nach dem Abwaschen des nicht-gebundenen Reagens wird der verbliebene tertiäre Komplex dann Licht der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt, wobei die beobachtete Fluoreszenz das Vorhandensein des interessierenden Haptens anzeigt. Immunfluoreszenz- und EIA-Techniken sind beide auf dem Gebiet sehr gut etabliert und für das vorliegende Verfahren besonders bevorzugt. Jedoch können andere Reportermoleküle, wie Radioisotop-, chemilumineszierende oder biolumineszierende Moleküle, ebenfalls verwendet werden.
Dem erfahrenen Techniker ist ohne weiteres offensichtlich, wie die obigen Assays zu variieren sind, und alle derartigen Variationen werden von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung wird speziell mit Bezug auf das Flachsrostbeständigkeitsgen L und dessen Allele L6, L2 und L10 beschrieben. Dies erfolgt jedoch in der Bedeutung, dass sich die vorliegenden Erfindung auf einen Bereich von Resistenzgenen und Allelen derselben gegenüber Rost und anderen Pathogenen erstreckt. Tatsächlich erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf ein Resistenzgen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Gen für ein Produkt mit mindestens einer leucinreichen Region codiert. vorzugsweise ist die leucinreiche Region ein leucinreiches Repeat am 3'-Ende des Moleküls und mit mindestens 60% Ähnlichkeit, vorzugsweise mindestens 70% Ähnlichkeit und noch günstiger mindestens 80% Ähnlichkeit zueinander. Noch besser entspricht die leucinreiche Region der folgenden Aminosäuresequenz:
oder sie weist mindestens 60% Ähnlichkeit oder vorzugsweise mindestens 70% Ähnlichkeit oder noch besser mindestens 80% Ähnlichkeit zu dieser auf. Alternativ oder zusätzlich codiert das Rostbeständigkeitsgen ferner eine p-Schleife an dessen 5'-Ende mit Codierung für die Aminosäuresequenz:
wobei ein beliebiger Aminosäurerest ist. Vorzugsweise umfasst die Sequenz der p-Schleife die Aminosäurereste:
und insbesondere
oder eine mit einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen gegenüber diesen, vorausgesetzt, derartige Derivate funktionieren noch als p-Schleife. Eine p-Schleife ist an der ATP/GTP-Bindung beteiligt. Es wird hier vorgeschlagen, dass die Kopienzahl und Aminosäuresequenz dieses wiederholten Elements die Determinanten der Gen-Gen-Spezifität von Rostbeständigkeitsgenen sind. Die Mischung und Übereinstimmung dieser Elemente von existierenden Genen ergeben ein Mittel für Möglichkeiten zur Erzeugung neuer und günstiger Resistenzgenspezifitäten zur Verwendung in der Pflanzenzucht. Derartige neue Gene werden hier als "modulare Resistenzgene" bezeichnt. Dies ist ein völlig neuer Ansatz zur Krankheitsresistenzzucht.
Gemäß dieser Ausführungsform wird ein modulares Resistenzgen betrachtet, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Gen für eine nicht natürlich vorkommende leucinreiche Region codiert. "Nicht natürlich vorkommend" bedeutet, dass die Manipulation einer Gensequenz zur Einführung einer leucinreichen Codierungssequenz, zur Erhöhung der Kopienzahl einer existierenden leucinreichen Codierungssequenz, zur Deletion oder Insertion einer Nucleotidsequenz für eine oder in eine leucinreiche Codierungssequenz oder zur sonstigen Modifizierung einer leucinreichen Codierungssequenz zur Modulation der Pathogenspezifität eines Krankheitsresistenzgens umfasst wird. Beispielsweise können die leucinreichen Regionen von zwei oder mehr Allelen des L-Locus, wie L6, L2 und L10, kombiniert werden, um den Bereich von Pathogenen, gegenüber denen ein Gen Resistenz verleihen kann, zu erweitern. Alternativ können Kombinationen von Allelen von den L- und M-Loci gebildet werden. Die vorliegende Erfindung betrachtet daher ein Verfahren zur Herstellung eines modularen Resistenzgens, das Resistenz gegenüber einem Pathogen in einer Pflanze verleiht, durch Manipulation der leucinreichen Regionen in einem Krankheitsresistenzgen.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf transgene Pflanzen, wie transgene Feldfrüchtepflanzen (beispielsweise Weizen, Hafer oder Mais), die eine nicht-indigene Gensequenz tragen, die Rostbeständigkeit in der Pflanze verleiht oder in anderer Weise ermöglicht. Vorzugsweise stammt die nicht-indigene Gensequenz von einer der transgenen Pflanze nahe verwandten Art. Die Expression der nicht-indigenen Gensequenz kann konstitutiv oder induzierbar oder entwicklungsmäßig reguliert sein. Ferner kann die nicht-indigene Sequenz in eine spezielle endogene Gensequenz insertiert oder mit dieser fusioniert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die transgene Pflanze Weizen und die nicht-indigene Gensequenz stammt von einer Wildart von Weizen, Hafer, Mais, Flachs oder einer Linum-Art. Andere transformierte Arten oder Resistenzgenquellen werden nicht ausgeschlossen.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Figuren und Beispiele weiter beschrieben.
Für die Figuren gilt:
1 ist eine Darstellung der Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) und entsprechenden Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2 bis 5) des Rostbeständigkeitsgens L6. Es gibt zwei vorausgesagte Produkte, die Produkte "voller Länge" und "gestutzte" Produkte. Das gestutzte Produkt resultiert aus einer alternativ gespleißten mRNA, die das Intron 3 behält. Bei fehlendem Spleißen dieses Introns wird die Translation über das 82-bp-Intron 3 als Folge nicht veränderter Rahmen fortgesetzt, wobei ein Stoppcodon unmittelbar strangabwärts des Intronendes erreicht wird. Dies führt zu einem Produkt, aus dem der Hauptteil der leucinreichen Region entfernt ist, und auch zur Addition von zusätzlichen 29 Amino (siehe die unterstrichenen Aminosäuren [SEQ ID NO: 6 und 7]), die in dem Produkt voller Länge nicht vorhanden sind.
2 ist eine Darstellung eines Teils des L6-Gens, die die LU-1-Sonde (unterstrichen) und die Ac-Insertion in der Mutante X75 (SEQ ID NO: 11) zeigt.
3 ist eine schematische Darstellung des L6-Gens, die die Position der LU-2-Sonde zeigt.
4 ist eine Darstellung der Aminosäuresequenzen des leucinreichen Repeats in L6.
5 ist eine schematische Darstellung der L-Locus-Allele.
BEISPIEL 1
PFLANZENMATERIAL
Experimente wurden in der Flachslinie der Bezeichnung "Forge" durchgeführt, die für die Rostbeständigkeitsgene L⁶, M, N und P² homozygot ist (2). Ein spezieller Flachs wird als TC257 bezeichnet und ist eine primäre Transformante von "Forge", die 10 Kopien des transponierbaren Elements Ac von Mais besitzt (1). Rostgencultivare werden als "Birio" (L⁶), "Dakota" (M), "Bobay" (N) und "Abyssinian" (P²) bezeichnet (8).
BEISPIEL 2
ROSTSTÄMME
Vier Roststämme wurden zum Screening auf Mutanten verwendet. Drei dieser Stämme mit der Bezeichnung CH5-78, CH5-84 und CH5-133 wurden durch Selbstbefruchten des Stamms CH5 erhalten. Der vierte Stamm der Bezeichnung C war ein Mutterstamm von CH5. Die Herkunft von C und CH5 wurde früher beschrieben (7). Jeder dieser Stämme ist gegenüber einem der einzelnen verschiedenen Gene avirulent und gegenüber den anderen drei virulent. Der Stamm CH5-84 ist avirulent gegenüber "Birio" (L⁶), CH5-78 ist avirulent gegenüber "Dakota" (M), C ist avirulent gegenüber "Bombay" (N) und CH5-133 ist avirulent gegenüber "Abyssinian" (P²). Rosterhaltungs- und -inokulationsverfahren waren wie früher beschrieben (8).
BEISPIEL 3
TRANSFORMATION
Flachs-Kotyledonen wurden mit entweder dem Vektor pKU3 (9), pBT175 (10), pB135SAc11, 12 (11) oder einem Ac-Element, in das der OCS-Enhancer (12) an der BamH1-Stelle an Position 182 insertiert worden war, gemäß dem früher beschriebenen Protokoll (13) transformiert.
BEISPIEL 4
TAGMARKIERUNGSSCHEMA
Das in dieser Studie verwendete Tagmarkierungsschema wurde von Ellis et al. (1) und Lawrence et al. (13) beschrieben. "Forge"-Pflanzen mit und ohne Ac-Elemente einschließlich von TC257 und dessen selbstbefruchtete Abkömmlinge wurden in großem Ausmaß als weiblicher Elternteil mit "Hoshangabad" gekreuzt, um Hybridsamen, die heterozygot für die vier Rostbeständigkeitsgene sind, herzustellen. Sobald die Sämlinge etwa 5 cm groß waren, wurde die Spitze abgeschnitten, und die zwei seitlichen Sprosse, die sich anschließend entwickelten, wurden mit einem Gemisch der vier Roststämme, von denen jeder ein einzelnes Resistenzgen erkennt, geimpft. Die meisten Pflanzen waren gegen alle vier Roststämme resistent. Empfindliche Mutanten waren von drei Arten, nämlich "ganze", in denen alle Blätter an beiden Seitensprossen empfindlich waren, "zweisektorige", in denen alle Blätter an einem Seitenspross empfindlich waren, während der andere Spross völlig resistent war, und "minisektorige", in denen nur einige der Blätter an einem Spross empfindlich waren. Wenn seltene rostempfindliche Mutanten detektiert wurden, wurde das mutante Gen durch das Gewinnen von Rostsporen und Inokulieren derselben auf einem Satz von vier Rostbeständigkeitsgenen L⁶, M, N oder P² identifiziert.
Wenn beispielsweise der von einer empfindlichen mutanten Pflanze gewonnene Rost auf den verschiedenen Genen M, N und P², jedoch nicht auf dem verschiedenen L⁶-Gen wuchs, zeigte dies an, dass die Pflanze eine Mutante für das L⁶-Gen war.
BEISPIEL 5
DETEKTION VON TRANSPONIERTEN Ac-ELEMENTEN IN MUTANTEN PFLANZEN
Das Verfahren zur Identifizierung transponierter Ac-Elemente war wie früher beschrieben (2).
BEISPIEL 6
LAMBDA-KLONIERUNG
Flachs-DNA wurde mit BamHI oder BglII verdaut und die nicht fraktionierte DNA wurde in den lambda-Vektor EMBL4 wie früher beschrieben (3) kloniert.
BEISPIEL 7
GENANALYSE
Die Genanalyse einschließlich von RFLP-Techniken, PCR-Analyse, Southern-Blot-Analyse und Verknüpfungsanalyse war wie früher beschrieben (1, 2). Die Nucleotid- und entsprechende Aminosäuresequenz für das L6-Gen ist in 1 gezeigt. Es gibt zwei vorausgesagte Produkte, das Produkt "voller Länge" und das "gestutzte" Produkt. Das gestutzte Produkt resultiert aus alternativ gespleißter mRNA, die das Intron 3 behält. Bei fehlendem Spleißen dieses Introns wird die Translation über das 82-bp-Intron 3 fortgesetzt und infolge keiner Veränderung von Rahmen ein Stoppcodon unmittelbar strangabwärts des Intronendes erreicht. Dies führt zu einem Produkt, aus dem der Hauptteil der leucinreichen Region entfernt ist, und auch zur Addition von zusätzlichen 29 Aminosäuren (siehe die unterstrichenen Aminosäuren in 1), die in dem Produkt voller Länge nicht vorhanden sind.
BEISPIEL 8
IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINER ROSTEMPFINDLICHEN MUTANTEN PFLANZE, IN DER DAS L6-GEN DURCH Ac TAGMARKIERT WURDE
Die TC257 (Beispiel 1)-Linie von transgenem Flachs, die mindestens 10 Kopien von Ac enthielt (1, 2), von denen eine (29 Karteneinheiten) von dem L6-Rostbeständigkeitsgen verknüpft war, wurde in großem Ausmaß mit einer Linie ohne Resistenzgene gekreuzt, und die Abkömmlinge wurden auf mangelnde L6-Aktivität gescreent. Eine rostempfindliche Mutante mit fehlender L6-Spezifität (der Bezeichnung Mutante X75) enthielt ein transponiertes Ac-Element, das nach experimentellen Anzeichen vermutlich in dem L6-Gen positioniert ist.
BEISPIEL 9
X75 ENTHÄLT EIN TRANSPONIERTES Ac, DAS ENG AN DAS MUTANTE L6-GEN GEKNÜPFT IST
Die L6-Mutante X75 enthält ein transponiertes Ac (im folgenden als "Tr-Ac" bezeichnet), das in deren resistentem Mutterstamm nicht vorhanden ist. Die Position dieses Elements wurde in Bezug auf das L6-Gen kartiert. Eine Verbindungssegregationsanalyse von Tr-Ac und dem mutanten L6-Gen zeigte eine feste Verknüpfung dieser zwei Charaktere. X75 wurde mit der Cultivar "Birio" (L6) gekreuzt und die Abkömmlinge, die Tr-Ac erbten, wurden mittels Southern-Analyse identifiziert. Zwei Pflanzenabkömmlinge, D766 und D769, wurden mit der Cultivar "Hoshangabad" (kein L6) zum Test gekreuzt. Sechsunddreißig Abkömmlinge wurden auf L6-Rostbeständigkeit getestet und bezüglich des Vorhandenseins von Tr-Ac gezählt. Achtzehn der Abkömmlinge waren empfindlich und diese besaßen alle Tr-Ac, während die übrigen 18 resistent waren und diesen allen Tr-Ac fehlte. Dies ist das erwartete Ergebnis, wenn das Allel für Empfindlichkeit ein durch Tr-Ac inaktiviertes L6-Gen ist.
Die Insertionsstelle von Tr-Ac wurde auch durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-analyse in einer Familie von 88 Test-Kreuzungsabkömmlingen, in denen eine Segregation von L6 erfolgte, kartiert. Ein Fragment von Flachs-DNA (Sonde LU-1), das aus einem lambda-Klon, der die 3'-Verbindung zwischen Tr-Ac und Flachs-DNA enthielt, isoliert wurde, detektierte 3 RFLPs, die die zwei Elternteile unterschieden, wenn deren DNA mit EcoRI, BglII und XbaI geschnitten wurde. Die Analyse der Segregation dieser drei Marker und des L6-Gens bei der Testkreuzung zeigte, dass alle vier Marker eng verknüpft waren. Ein einziges rekombinantes Individuum, das L6 und den in mit XbaI verdauter DNA detektierten RFLP-Marker umfasste, wurde unter den 88 Abkömmlingen detektiert. Wie im folgenden detailliert angegeben ist, erfolgte dieses Rekombinationsereignis, das in dem Pflanzenabkömmling D237 vorhanden ist, in der Region des L6-Gens.
BEISPIEL 10
REKOMBINATION IN DER NÄHE DER Ac-INSERTIONSSTELLE ÄNDERT DIE RESISTENZREAKTION ODER SPEZIFITÄT VON L6
Die RFLP-Sonde LU-1 wurde verwendet, um eine Restriktionskarte der homologen Regionen der resistenten und empfindlichen Elternteile der Testkreuzungsfamilie und des rekombinanten Pflanzenabkömmlings D237 zu erstellen. Drei polymorphe Restriktionsstellen wurden detektiert und ein Vergleich der Karten zeigt, dass ein Crossing-over innerhalb einer Region von etwa 3 kbp auf jeder Seite der Ac-Insertions stelle erfolgt war.
Die rekombinante Pflanze D237 wurde selbstbefruchtet und 16 Abkömmlinge wurden mit einem Rostisolat, das L6 erkennt, gescreent. Die Abkömmlinge wurden auch mittels Southern Blotting analysiert, um das rekombinante Chromosom zu detektieren. Die Abkömmlinge segregierten hinsichtlich der Rostreaktion: 6 waren vollständig empfindlich, während 10 partiell resistent waren, wobei das beschränkte Rostwachstum auf die jüngeren Blätter begrenzt war. Dieses Ergebnis ist mit der Segregation eines neuen Gens für eine partielle Resistenz konsistent, die in dem ursprünglichen Forge-Elternteil nicht vorhanden war. Es bestand eine vollständige Verbindung zwischen der zweiten Klasse mit neuer Rostreaktion und dem Vorhandensein des rekombinanten Chromosoms.
Daher führt ein Crossing-over in der Nähe des L6-Gens zu einer Änderung des Phänotyps der L6-Resistenz.
BEISPIEL 11
UNABHÄNGIGE L6-MUTANTEN ENTHALTEN INSERTIONEN IN DER REGION VON 0,5 BIS 3,0 KB DER Ac-INSERTIONSSTELLE
Vierunddreißig unabhängige L6-Mutanten wurden bei dem Screening auf tagmarkierte L6-Gene isoliert. Alle außer X75 waren entweder Deletionen oder sie enthielten, wenn sie keine Deletionen waren, keine transponierten Ac-Elemente (2). Die Analyse von Mutanten in letzterem Fall unter Verwendung der LU-1-Sonde ergab, dass zwei derselben (X3A und X117) eine kleine (etwa 200 bp) Insertion in dieser Region enthielten. Im Falle von X117 wurde die Mutante mit deren resistentem Stammgen verglichen, um zu bestätigen, dass der Polymorphismus nicht zuvor existierte. Im Falle von X3A waren die Insertion und der Verlust von L6 somatisch erfolgt. Die Mutante X3A bildete sich als Sektor. Von zwei Sprossen an einer einzigen F1-Pflanze hatte einer (X3A) L6 verloren und der zweite, X3B, war der Wildtyp für L6. DNA von den zwei Sektoren wurde unter Verwendung der LU-1-Sonde geprüft. Eine Insertion wurde nur in DNA von dem mutanten Sektor beobachtet.
BEISPIEL 12
DIE EXZISION VON TR-AC BEI ABKÖMMLINGEN VON X75 IST MIT DER WIEDERUMKEHR ZU ROSTBESTÄNDIGKEIT VERBUNDEN
Die X75-Mutante wurde selbstbefruchtet und die Abkömmlinge, die für das transponierte Ac-Element homozygot waren, wurden durch Southern Blotting identifiziert. Die selbstbefruchteten Abkömmlinge von vier derartigen Pflanzen wurden wiederum mit einem Roststamm, der die L6-Resistenzspezifität erkennt, gescreent. Siebenunddreißig resistente Pflanzen wurden unter 3105 Abkömmlingen identifiziert. 15 der revertierten Pflanzen wurden mittels entweder PCR oder Southern-Analyse auf ein Exzisionsfragment, das sich aufgrund der Exzision von Ac aus der L6-Region ergeben würde, überprüft. Der Exzisionsmarker trat in allen Pflanzen auf. In zwei Fällen wurde die Exzisionsregion sequenziert und es ergaben sich kleine Baseänderungen (ein "Ac-Footprint") in dem 8-bp-Repeat, das Ac in X75 flankierte, aus dem Exzisionsprozess.
BEISPIEL 13
EINE DNA-SONDE ANGRENZEND AN Ac DETEKTIERT EINEN ZWEITEN LOCUS IN FLACHS, DER ENG MIT DEM RESISTENZLOCUS VERKNÜPFT IST
Eine zweite DNA-Sonde LU-2 wurde aus dem gleichen lambda-Klon wie LU-1 isoliert. Diese zwei Fragmente sind durch etwa 2 kb getrennt. LU-2 hybridisiert wie viele andere Flachs-DNA-Sonden bei den meisten Restriktionsverdaus mit zwei Genomfragmenten, was einen molekularen Nachweis für die tetraploide Natur von Flachs ergibt. Bei Xba1-Verdaus detektiert LU-2 zwei polymorphe Marker, LU-2-1 und LU-2-2, die die resistenten und empfindlichen Eltern einer Testkreuzungsfamilie von 52 Abkömmlingen unterscheiden, unter denen die L6- und M-Resistenzgene segregieren. Die Bindungssegregationsanalyse von diesen zwei RFLP-Markern und den L6- und M-Resistenzgenen zeigte eine vollständige Verknüpfung von LU-2-1 mit L6 und LU-2-2 mit dem Resistenzgen M. Daher ermöglichte die Klonierung des L6-Locus einen Zugang zur M-Resistenzgenregion. Die LU-2-Sonde und ein flankiertes Ac in X75 in L6 ist in den 2 und 3 gezeigt.
BEISPIEL 14
ROSTBESTÄNDIGKEITSGENE BILDEN IN FLACHS EINE MULTIGENFAMILIE
Die Sonde LU-1 und mehrere angrenzende Restriktionsfragmente von einem lambda-Klon wurden als Hybridisierungssonden zur Isolierung einer cDNA aus einer unter Verwendung von Blatt-mRNA erzeugten Bibliothek verwendet. Ein cDNA-Klon und mehrere andere Sonden aus dem L6-Gen wurden als Sonden für genomische Southern-Analyse verwendet. Diese Sonden detektieren allgemein mehrere Fragmente in Southern-Blots, was anzeigt, dass Flachs eine Familie von Genen ähnlicher Sequenz enthält. Alle mit dieser Sonde detektierten RFLPs lassen sich auf entweder den L6- oder M-Resistenzgenregionen kartieren.
BEISPIEL 15
DIE SONDE LU-1 IDENTIFIZIERT ALLELE VON L6
Bei genetischen Studien verhält sich der L-Locus von Flachs wie ein einziges Gen mit mehreren Allelspezifitäten. Zwölf Resistenzspezifitäten lassen sich auf dem L-Locus kartie ren. Die Sonde LU-1 wurde zur Prüfung eines unterschiedlichen Satzes von Flachspflanzen, die jeweils ein einziges L-Allel enthalten, verwendet (siehe 2 und 3). DNA von den 12 verschiedenen Spezies und von "Hoshangabad", das ein "Null"-Allel am L-Locus trägt, wurde mit XbaI, BglII und EcoRI geschnitten. In jedem Fall wurde in den verschiedenen L-Spezies ein einzelnes Fragment detektiert und jedes L-Allel konnte von dem Nullallel von "Hoshangabad" unterschieden werden. Unter Verwendung dieser drei Enzyme wurden 10 RFLP-Genotypen detektiert. Nur zwei Paare von L-Allelen, L3 und L4 und L6 und L7 konnten mit dieser begrenzten Probe von Verdaus nicht unterschieden werden.
BEISPIEL 16
EINE cDNA AUS FLACHS DETEKTIERT SEQUENZÄHNLICHKEIT IN EINER WILDART VON LINUM
Die Southern-Analyse von DNA der Wildart Linum marginale, die die Resistenz gegenüber Flachsrost kontrollierende Gene enthält, detektierte stark hybridisierende Fragmente.
BEISPIEL 17
BESTIMMUNG DER AMINOSÄURESEQUENZ VON L6

Die Aminosäuresequenz der L6-cDNA wurde bestimmt und ist in 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz ist im Einbuchstabencode gezeigt, wobei Einbuchstabenabkürzungen für Aminosäuren im folgenden definiert sind:

Aminosäure	Einbuchstabensymbol
Alanin	A
Arginin	R
Asparagin	N
Asparaginsäure	D

Cystein	C
Glutamin	Q
Glutaminsäure	E
Glycin	G
Histidin	H
Isoleucin	I
Leucin	L
Lysin	K
Methionin	M
Phenylalanin	F
Prolin	P
Serin	S
Threonin	T
Tryptophan	W
Tyrosin	Y
Valin	V
Aminosäure	X

BEISPIEL 18
VERGLEICH DER AMINOSÄURESEQUENZ VON LEUCINREICHEM REPEAT VON L6
Das L6-Allel umfasst ein leucinreiches Repeat bei den Aminosäureresten 969 bis 1115 und 1116 bis 1265. Dieses Repeat wurde bezüglich Identität verglichen und der Vergleich ist in 4 gezeigt. Einzelheiten der Vergleiche sind im folgenden angegeben:

Länge: 156 Aminosäuren

Lücken: 3

Lückengewicht: 3,000

Längengewicht: 0,100

Qualität: 160,4

Verhältnis: 1,091

Durchschnittliche Übereinstimmung: 0,540

Durchschnittliche Nichtübereinstimmung: –0,396

Prozentuale Ähnlichkeit: 82,979%

Prozentuale Identität: 74,468
BEISPIEL 19
KLONIERUNG UND VERGLEICH VON L-LOCUS-ALLELEN
Unter Verwendung des L6-Gens der Klone als Sonde (Sonde LU-1) wurden die L2- und L10-Allele auf EcoR1-DNA-Fragmente kloniert. Diese Allele besitzen verschiedene Resistenzspezifitäten und kontrollieren die Resistenz gegenüber Flachsroststämmen, die die AL2- bzw. AL10-Avirulenzgene tragen.
Die L2- und L10-Klone wurde einer Restriktionsendonucleaseanalyse unterzogen und eine schematische Darstellung ist in 5 angegeben. Das L2-EcoRI-Fragment ist etwa 400 bp länger als das entsprechende L10-Fragment. Die DNA-Sequenzanalyse von beiden Enden der L2- und L10-Fragmente ergab eine praktisch identische Sequenz (> 90%) und zeigt, dass sich L2 von L10 um etwa 400 bp zusätzlicher DNA unterscheidet. Ferner bestätigten Sequenzanalyse und Restriktionsfragmentkartierung ausgehend von internen Restriktionsstellen die zusätzliche DNA und sie zeigten, dass die 5'-Hälften von L2, L6 und L10 sehr ähnlich (> 90% identisch) sind und dass die Unterschiede zwischen den Allelen in der 3'-Hälfte des Gens auftreten. Der Unterschied hinsichtlich der Genlänge liegt in einer Region mit Codierung für die Struktur eines leucinreichen Repeats mit 156 Aminosäuren, die in L6 zwei Kopien (4) und nur eine Kopie in einer cDNA von einem verwandten, jedoch kein Allel darstellenden Gen der Bezeichnung FC4 aufweist.
Dem Fachmann ist klar, dass die hier beschriebene Erfindung anderen Variationen und Modifikationen als den hier speziell beschriebenen zugänglich ist.
LITERATURSTELLEN:

1. Ellis, J. G., Finnegan, E. J. und Lawrence, G. J. (1992) Theor. Appl. Genet. 83: 46–54.
2. Lawrence, G. J., Finnegan, E. J. und Ellis, J. G. (1993) The Plant J. 4: 659–669.
3. Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
4. Douillard und Hoffman Basic Facts about Hybridomas, in Compendium of Immunology Band II, Hrsg. Schwartz, 1981.
5. Kohler und Milstein Nature 256: 495–499, 1975.
6. Kohler und Milstein European Journal of Immunology 6: 511–519, 1976.
7. Lawrence, G. J., Mayo, G. M. E, und Shepherd, K. W. (1981) Phytopathology 71: 12–19.
8. Lawrence, G. J. (1988) Adv. Plant Pathol. 6: 313–331.
9. Baker, B., Coupland G., Fedoroff, N., Starlinger, P. und Schell, J. (1987) EMBO J. 6: 1547–1554.
10. Taylor, B. H., Finnegan, E. J., Dennis, E. S. und Peacock, W. J. (1989) Plant Mol. Biol. 13: 109–118.
11. Finnegan, E. J., Lawrence, G. J., Dennis, E. S. und Ellis, J. G. (1993) Plant Mol. Biol. im Druck.
12. Ellis, J. G., Llewellyn, D. J., Walker, J. C., Dennis, E. S. und Peacock, W. J. (1987) EMBO J. 6: 3203–3208.
13. Lawrence, G. J., Ellis, J. G., Finnegan, E. J., Dennis, E. S. und Peacock, W. J. (1989) Tagging rust resistance genes in flax. In Breeding Research: The Key to the Survival of the Earth (Iyanma, S. und Takeda, G., Hrsg.). Tsukuba: The Organising Committee, The 7th Int. Congr. of SABRAO, S. 535–538.
14. Traut (1994) Eur. J. Biochem. 222: 9.12.
15. Miklas et al. (1993) Theor Appl Genet 85: 745–749

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Sequenz von Nucleotiden umfasst, die der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nucleotidsequenz entspricht oder zu mindestens 45 mit dieser identisch ist, und das Rostbeständigkeit in Pflanzen verleiht oder in anderer Weise ermöglicht, oder eine Sequenz von Nucleotiden, die hierzu komplementär ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das eine Sequenz von Nucleotiden mit Codierung für die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 bis 5 angegeben ist oder eine zu mindestens 60% hierzu ähnliche Aminosäuresequenz aufweist, umfasst oder komplementär zu einer derartigen Sequenz von Nucleotiden ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das eine Sequenz von Nucleotiden mit Codierung für ein Peptid, Polypeptid oder Protein, das zur Wechselwirkung mit einem Avirulenzgenprodukt eines Leinrosts fähig ist, umfasst oder komplementär zu einer derartigen Sequenz ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, wobei die Nucleotidsequenz einem Allel des Rostbeständigkeitsgens L oder M entspricht.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei das Rostbeständigkeitsallel das L6-Allel ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei das Rostbeständigkeitsallel das L2-Allel ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei das Rostbeständigkeitsallel das L10-Allel ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das Rostbeständigkeit in einer Pflanze verleiht oder in anderer weise ermöglicht und eine Nucleotidsequenz umfasst, die zu einer Hybridisierung unter mittelstringenten Bedingungen mit der in SEQ ID NO: 1 definierten Nucleotidsequenz oder dem Komplement von SEQ ID NO: 1 fähig ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die zur Hybridisierung unter hochstringenten Bedingungen mit der in SEQ ID NO: 1 definierten Nucleotidsequenz oder dem Komplement von SEQ ID NO: 1 fähig ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8, das eine Nucleotidsequenz aufweist, die der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nucleotidsequenz entspricht oder zu mindestens 80% mit dieser identisch ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Molekül aus einer Pflanze, die aus der aus Lein, Sojabohne, Sonnenblume und beliebigen Linum-Arten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, isolierbar ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Molekül aus einer Getreidepflanze isolierbar ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei die Getreidepflanze Weizen oder Gerste oder Mais oder eine Wildsorte von Weizen oder Gerste oder Mais ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Rostbeständigkeit verleihenden Gensequenz in einer Pflanze, wobei das Verfahren das Kontaktieren von genomischer DNA oder cDNA oder mRNA von der Pflanze mit einer zur Hybridisierung wirksamen Menge eines Nucleinsäuremoleküls, das eine wie in einem der Ansprüche 1 bis 13 definierte, Rostbeständigkeit verleihende oder ermöglichende Gensequenz umfasst, und das anschließende Detektieren der Hybridisierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Pflanze aus der aus Lein, Sojabohne, Sonnenblume und beliebigen Linum-Arten bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Pflanze eine Getreidepflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Getreidepflanze Weizen oder Gerste oder Mais oder eine Wildsorte von Weizen oder Gerste oder Mais ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Rostbeständigkeitsgensequenz die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz oder einen Teil derselben mit Codierung für Rostbeständigkeit umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei die Rostbeständigkeitsgensequenz eine Aminosäuresequenz codiert, die im wesentlichen einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 bis 5 angegebenen entspricht oder eine zu mindestens 60% hierzu ähnliche Aminosäuresequenz aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Sequenz von Nucleotiden umfasst, die: (i) Rostbeständigkeit in einer Pflanze verleiht oder in anderer Weise ermöglicht; und (ii) zu mindestens 45% identisch mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist oder mit der Sequenz unter mittelstringenten Bedingungen hybridisiert; und (iii) ein Produkt codiert, das mindestens eine leucinreiche Region und/oder eine p-Schleife, die die Aminosäuresequenz
worin X ein beliebiger Aminosäurerest ist, und wobei die p-Schleife durch eine Sequenz am 5'-Ende des Nucleinsäuremoleküls codiert wird, umfasst, aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20, wobei das Produkt eine leucinreiche Region aufweist, die ein durch das 3'-Ende des Moleküls codiertes leucinreiches Repeat ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20 oder 21, wobei das Produkt eine leucinreiche Region aufweist, die die Aminosäuresequenz:
oder eine Sequenz, die zu mindestens 60% zu dieser ähnlich ist, umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 20, wobei das Produkt eine p-Schleife-Sequenz aufweist, die die Aminosäuresequenz
umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 23, wobei die p-Schleife die Aminosäuresequenz GLYGMGGIGKTT umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Pflanze eine Getreidepflanze ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 25, wobei die Getreidepflanze Weizen oder Gerste oder Mais oder eine Wildsorte von Weizen oder Gerste oder Mais ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 20 bis 24, wobei die Pflanze eine aus der aus Lein, Sojabohne, Sonnenblume und beliebigen Linum-Arten bestehenden Gruppe ausgewählte Pflanze ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein modulares Resistenzgen, das Gensequenzen von mindestens zwei Nucleinsäuremolekülen mit Codierung für Krankheitsresistenz in Pflanzen umfasst und wobei mindestens eines der Nucleinsäuremoleküle das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder der Ansprüche 20 bis 27 ist, umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 28, wobei das modulare Krankheitsresistenz- oder modulare Rostbeständigkeitsgen eine Nucleotidsequenz, die eine leucinreiche Region codiert, umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 29, wobei die leucinreiche Region durch ein Allel des Rostbeständigkeitsgens L oder M codiert wird.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 30, wobei das Rostbeständigkeitsallel aus der aus L6, L2 und L10 bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Transgene Pflanze, die eine Gensequenz, die keine eigene ist, die das isolierte Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder der Ansprüche 20 bis 31 umfasst, trägt.
Transgene Pflanze nach Anspruch 32, wobei die Pflanze Weizen oder Gerste oder Lein ist.
Verwendung des isolierten Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder der Ansprüche 20 bis 31 zur Herstellung einer rostbeständigen Pflanze, wobei die Pflanze das Nucleinsäuremolekül trägt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit Rostbeständigkeit, das das Einführen eines isolierten Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder der Ansprüche 20 bis 31 in die Pflanze umfasst, wobei die Pflanze das Nucleinsäuremolekül trägt.