DE69121240T2

DE69121240T2 - T-Zell Lymphoma cDNA Klone

Info

Publication number: DE69121240T2
Application number: DE69121240T
Authority: DE
Inventors: Carol L. San Diego Ca 92103 Macleod
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1990-04-13
Filing date: 1991-04-12
Publication date: 1997-01-09
Anticipated expiration: 2011-04-13
Also published as: HK1006726A1; EP0527813A4; EP0527813A1; RU2116346C1; AU7745791A; IE911250A1; US5440017A; NO307341B1; IL97775A0; DE69121240D1; NO923918L; US5312733A; FI924575A; ES2093100T3; NO923918D0; IE75903B1; ATE141105T1; IL97775A; FI108037B; KR100212371B1

Description

=

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, rekombinante DNA- Moleküle, Verfahren zur Herstellung von neuen Transmembranproteinen, die bei der T-Zell-Entwicklung exprimiert werden und die neuen Transineinbranproteine in im wesentlichen reiner Form. Genauer betrifft sie neue DNA-Sequenzen, die in geeigneten Wirten exprimiert werden, und die neuen Proteine, von denen zwei integrale Membranproteine sind, die in diesen Wirten erzeugt werden. Die DNA-Sequenzen und rekombinanten DNA- Moleküle der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß jede Sequenz und jedes Molekül ein neues Protein kodiert mit mindestens zwei der folgenden Eigenschaften: (1) Es wird von T- Lymphomzellen exprimiert, (2) es wird in normalen Thymus-, aktivierten Milzzellen oder darmassozuertem Lymphoidgewebe exprimiert, (3) es wird in Elerstockgewebe, normalen Leberoder immortalisierten oder Krebszellinien exprimiert, (4) es wird bei der Embryoentwicklung exprimiert und/oder (5) hat mehrfach die Membran durchdringende Domänen. Wie aus der folgenden Beschreibung zu entnehmen ist, können die DNA-Sequenzen, die rekombinanten DNA-Moleküle und die Verfahren zur Herstellung neuer Proteine, die bei der T-Zell-Entwicklung exprimiert werden und die neuen T-Zell-Proteine in im wesentlichen reiner Form nützlich sein, um die Regulation der T- Zell-Entwicklung zu manipulieren, den tumorerzeugenden Phänotyp zu verändern und kännen auch nützlich sein, um metastatische Herde von Tumoren zu lokalisieren. Die Erfindung liefert auch neue Antikörper, die an Epitope auf Proteinen der vorliegenden Erfindung binden und die Verwendung dieser Antikörper, um Arzneimittel oder andere Mittel zu identifizieren und zu spezifischen Zelltypen, die die neuen Proteine exprimieren, zu führen.

Stand der Technik

In der Entwicklung des Immunsystems stammen T-Lymphozyten von Vorläufer-Stammzellen, die in den Thymus eintreten und einer Differenzierung und Reifung unterliegen. Viele Gene werden entweder aktiviert oder reprimiert, wenn die T-Zelle verschiedene Stadien der Entwicklung innerhalb des Thymus durchläuft. Zum Beispiel bekommen die Zellen während dieser Zeit den IL-2-Rezeptor, CD4, und/oder CD8 an ihrer Oberfläche. Diese Differenzierungsmarker sind wichtig für die T-Zell-Entwicklung und/oder -Funktion. Viele Genprodukte werden in ihrem Expressionsgrad verstärkt in sich entwickelnden T- Lymphozyten. Dies schließt den T-Zell-Rezeptor für Antigene ebenso wie die Marker CD4 und CD8 ein. Viele andere Antigene haben als T-Zell-Marker gedient, bevor ihre genaue Funktion in Lymphozyten bekannt war. Erst kürzlich wurde gefunden, daß das T-Zell-Antigen Pgp1 dazu beiträgt, Thymozyten in den Thymus zu bringen, wohingegen T200 (CD45) als Komponente für intrazelluläre Signale dient. Von einem weiteren T-Zell-Marker, Thyl ist immer noch keine mit ihm verbundene Funktion bekannt.
Die SL 12.4-Zellen haben einen CD4-CDB-doppelt negativen Phänotyp und ähneln daher Thymozyten in einem relativ frühen Stadium der Entwicklung. Außerdem exprimieren sie nicht die (1-Untereinheit des T-Zell-Rezeptors. SL 12.4-Zellen können jedoch dazu induzert werden, CD4 und CD8 auf ihrer Oberfläche nach Co-Kultivierung auf Thymusepithel-Einfachschichten (bzw. Monolayer) zu exprimieren. TCR-α-mRNA wird nach diesen Behandlungen auch induziert. Somit scheint es, daß SL 12.4-Zellen die Fähigkeit haben, einer Differenzierung und Reifung zu unterliegen. Dieses einzigartige biologische in vitre-System ahmt in einem gewissen Ausmaß die Thymus-Mikroumgebung nach.
Eine Anzahl von Genen wurde identifiziert, die zuerst bei der Entwicklung von Thymozyten exprimiert werden. Viele dieser Gene kodieren Proteine, die exprimiert werden müssen, damit T-Zell-Vorläufer in dem Immunsystem ihre Funktion aufnehmen, z.B. 1) der TCR für das Antigen, der für die Antigen-Erkennung erforderlich ist, 2) CD25 (der IL2-Rezeptor), der exprimiert werden muß, damit die Zellen auf das Cytokin IL2 ansprechen; 3) Genprodukte, die für die Signalübertragung während der Antigen-Erkennung wesentlich sind, wie CD3, CD4, CDS, CD45, 4) einige der Genprodukte, die an der Thymozyten- Rückkehr zu Zielorganen beteiligt sind und 5) Genprodukte, die an der T-Zell-Aktivierung beteiligt sind (Fowlkes and Pardoll, Advances in Immunology 44:207-264 (1989); Hood et al., (1985) Cell 40, 225-229; Rothenberg and Lugo, Develop. Biol. 112, 1-17 (1985); Adkins et al., Ann. Rev. Immunol. 5:325-365 (1987); Crabtree, Science 243:343-355 (1989); Kwon and Weissmann, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 36:1963-1967 (1989). Es besteht eine bemerkenswerte Heterogenität in den Thymozyten-Untergruppen, die verschiedene Kombinationen von exprimierten Genen exprimieren. Die Gen-Expression wurde im Detail bei vielen, aber nicht allen der zahlreichen Thymozytenklassen analysiert und es ist wahrscheinlich, daß Gene, die noch identifiziert werden müssen, Produkte kodieren, die in der T-Zell-Entwicklung und der Zielfindung wirken; insbesondere solche, die in numerisch nicht so häufigen, kurzzeitigen Stamm-Thymozyten exprimiert werden.
Aufgrund der außerordentlichen Heterogenität der Thymozyten ist es nicht möglich, fraktionierte Stamm-Thymozyten in ausreichender Zahl oder Reinheit zu erhalten, um die Kaskade der Gen-Expression vollständig aufzuklären, die während der Entwicklung auftritt. Aus diesem Grund wurden Lymphom- und Leukämie-Zellinien intensiv verwendet, um die Gen-Expression bei der Lymphoid-Entwicklung zu untersuchen (Greaves, Science 234:697-704 (1986); Hanley-Hyde und Lynch Ann. Rev. Immunol. 4:621-649 (1986). Ein beträchtlicher Anteil an Literatur zeigt, daß numerisch nicht häufige, kurzzeitige Stammzellen das Ziel einer Umwandlung zur Bösartigkeit sind und weiterhin, daß einige der kennzeichnenden Eigenschaften der umgeformten Zielzellen in den Tumorzellen konserviert sind. Eine unerwartete Gen-Expression in Tumorzellen wurde häufig als Fehler bei der Umwandlung verworfen. Eine sorgfältige Analyse der "falschen" Gen-Expression in hämopoetischen Tumorzellen hat jedoch seltene Untergruppen normaler Stamm-Zellen gezeigt, die solche Gene exprimieren (Greaves, Science 234:697-704 (1986); Hanley-Hyde und Lynch, Ann. Rev. Immunol. 4:621-649 (1986); Pierce und Speers, Cancer Res. 48:1996-2004 (1988).
Die Heterogenität von Lymphom-Zellinien aus Mäusen und Menschen, die aus einem einzelnen Individuum stammen, kann durch Unterschiede im Reifungsgrad, der von den einzelnen Zellen erreicht wird, entstehen. Die Heterogenität von etablierten T-Lymphom-Zellinien wurde verwendet, um nah verwandte Zellklone zu erhalten, die sich nur in einer begrenzten Anzahl von Eigenschaften unterscheiden. Hedrick et al. (Hedrick et al., Nature 308:149-153 (1984)) verwendete, lieferte unter Verwendung von subtraktiven Klonierungs-Techniken Schätzungen, daß sich T-Zellen und B-Zellen in der Expression von etwa 100 Genen unterscheiden. Es ist wahrscheinlich, daß nah verwandte T-Lymphomzellen sich in der Expression von noch weniger Genen unterscheiden könnten. Solche Zellklone bieten eine Möglichkeit, mit reinen Populationen von Zellen mit definierten und stabilen Phänotypen zu arbeiten, die sich in einer begrenzten Anzahl von Eigenschaften unterscheiden. Das SL12-T-Lymphom-Modellsystem wurde entwickelt und in der vorliegenden Anmeldung verwendet, um eine solch nahe verwandte Zell-Population zu liefern (Hays et al., Int. J. Cancer 30:597-601 (1986); MacLeod et al., Cancer Research 44:1784- 1790 (1984); MacLeod et al., J. Nat. Cancer Inst. 74:875-882 (1985); MacLeod et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6989- 6993 (1986); Siegal et al., J. Exp. Med. 166:1702-1715 (1987).

Kurze Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert neue DNA-Sequenzen, rekombinante DNA-(rDNA)-Moleküle, Verfahren zur Erzeugung neuer T- Zell-Proteine, die bei der T-Zell-Entwicklung exprimiert werden, die neuen T-Zell-Proteine in im wesentlichen reiner Form und Antikörper, die an die neuen Proteine binden. Genauer betrifft sie neue DNA-Sequenzen, die in geeigneten Wirten exprimiert werden und die neuen T-Zell-Proteine, die in diesen Wirten erzeugt werden. Die vorliegende Erfindung liefert auch neue Transmembran-Proteine in im wesentlichen reiner Form, rDNA-Moleküle, die die Transmembran-Proteine kodieren und Verfahren zur Herstellung der neuen Transmembran-Proteine. Die DNA-Sequenzen und rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, daß sie von T-Lymphomzellen exprimiert werden und mindestens eine der folgenden Eigenschaften haben: (1) sie werden in normalen Thymus-, aktivierten Milzzellen oder darmassozuertem Lymphoidgewebe exprimiert, (2) sie werden in Eierstockgewebe, normaler Leber und/oder in einer für eine Stufe der Embryo-Entwicklung spezifischen Art exprimiert und (3) sie kodieren neue Transmembran-Proteine mit mehrfach die Membran durchdringenden Domänen.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein neues Gen, 19.5, das hier auch als Lov bezeichnet wird, das in SL 12.4 Zellen nach Co-Kultivierung auf Thymus-Epithel-Einfachschichten induzierbar ist. Die vorliegende Erfindung liefert auch polyklonale Antikörper gegen ein Oligopeptid-Konstrukt auf Basis der Lov-cDNA-Sequenz. Die Induktion von Lov scheint stabil zu sein, da Zellklone, die aus einer SL 12.4-Zellpopulation nach Co-Kultivierung isoliert werden, einen höheren Grac an Lov-Expression zeigen, auf der Ebene der mRNA, ebenso wie auf der Ebene des Oberflächenproteins. Das Lov-Gen wurde dem Mäuse-Chromosom 16 zugeordnet. Das Lov- Gen-Produkt wird in der Entwicklung gesteuert und spielt eine Rolle bei der T-Zell-Entwicklung.
Eine SL 12.4-cDNA-Bibliothek wurde konstruiert, aus der sechs neue cDNA's über subtraktive Hybridisierung gegen eine verwandte Schwester-Lymphom-Zellinie, SL 12.3, isoliert wurden. SL 12.3-Zellen haben die Eigenschaften von Thymozyten in einem unreiferen Zustand der Entwicklung, als SL 12.4. Einer der cDNA-Klone, 19.5, wird in SL 12.4 exprimiert, ist aber in SL 12.3-Zellen nicht vorhanden. Diese Sequenz wurde Lov genannt (Lymphoid- und Eierstock-Zell-Expression). Das vorhergesagte Protein scheint äußerst hydrophob zu sein und enthält, nach einer Computer-Analyse, vier die Transmembran durchdringende Bereiche. Weder zwischen der Lov-cDNA noch der vorhergesagten Protein-Sequenz und anderen bekannten Sequenzen wurden wesentliche Homologien gefunden. Lov ist innerhalb der Säugetierart konserviert, z.B. bei Menschen, Nagetieren, Kaninchen, Seelöwen und Vögeln und das Transkript scheint stark in Eierstöcken und darmassozuertem Lymphoidgewebe (GALT) exprimiert zu werden, ebenso wie im Thymus. Die Lov- Expression und die Induzierbarkeit in dem Biosystem, die physikalischen Eigenschaften des Lov-Proteins ebenso wie die chromosomale Lokalisierung dieses Gens bei der Maus werden hier offenbart.
Indem die DNA-Sequenzen und rekombinanten DNA-Moleküle bereitgestellt werden, liefert die vorliegende Erfindung auch Sonden und Methoden, um Zellen zu identifizieren, die diese Sequenzen enthalten oder nicht enthalten und Mittel, um diese Sequenzen Zellen zu verabreichen, die diese Sequenzen nicht haben. Außerdem liefert die vorliegende Erfindung ein Mittel, um die Expression der neuen Sequenzen zu hemmen, indem eine Antisense-RNA-Sequenz bereitgestellt wird, die wenn sie einer Zelle verabreicht wird oder wenn die DNA, die diese Antisense-RNA kodiert, einer Zelle verabreicht wird, die diese DNA-Sequenz enthält, eine Antisense-RNA erzeugt, die an die RNA, die die neuen Proteine der Erfindung kodiert, binden kann und dadurch die Synthese blockieren kann. Es ergibt sich für den Fachmann aus dieser Offenbarung auch, daß Antikörper gegen Proteine der Erfindung verwendet werden können, um die Bindung von Liganden an die Proteine und an Ziel-Arzneimittel oder anderer Mittel (z.B. Markierungen) an Zellen, die diese Proteine exprimieren, zu blockieren.
Es wird auch ein cDNA-Klon, 20.5, bereitgestellt, der hier auch als Tea bezeichnet wird (SEQ ID Nr. 5), der Transkripte identifiziert, die sich nur in einer begrenzten Anzahl von Geweben finden. Tea-Transkripte werden induziert in Splenocyten, die mit dem T-Zell-Mitogen ConA aktiviert wurden. Anders als andere bekannte Gene, die in aktivierten T-Zellen exprimiert werden, scheint das Tea-Gen ein Protein zu kodieren, das die Membran mehrere Male durchquert, wohingegen eine große Anzahl von bekannten integralen Membranproteinen, die bei der T-Zell-Aktivierung induziert werden, einmalig die Membran durchdringende Proteine sind (Crabtree, (1989) Science 243:355-361).
Die vorliegende Erfindung liefert auch Verfahren zur Erzeugung neuer Transmembran-Proteine und die neuen Transmembran- Proteine in im wesentlichen reiner Form, die geeignet sein können zur Regulation der T-Zell-Entwicklung, zur Regulation des tumorerzeugenden Phänotyps und auch geeignet sein können, um die Aktivierung von T-Zellen bei Autoimmun-Krankheiten zu blockieren.
Neue cDNA-Klone, die von zwei nah verwandten T-Lymphom-Zellklonen verschieden exprimiert wurden, wurden isoliert unter Verwendung eines subtraktiv angereicherten differentiellen Screenings. SL 12.4-Zellen, aus denen die cDNA's isoliert wurden, haben Eigenschaften von Thymozyten in einer Zwischenstufe der Entwicklung und verursachen hervortretende extranodale Eierstock-Tumoren bei syngenen Tieren. Ein Schwesterzellklon, SL 12.3, der aus dem selben Tumor stammt, hat einen anderen Phänotyp und verursacht aggressivere, diffusere Lymphome. Vier der fünf neuen Gene werden in normalem Thymus, aktivierten Nilzzellen oder darmassozuertem Lymphoidgewebe exprimiert. Die DNA-Sequenzen und vorhergesagten Proteinsequenzen der neuen cDNA-Klone sind in den Figuren 3, 13 und 20 bis 23 dargestellt. Der neue 19.5 cDNA-Klon weist mRNA in normalem Thymus, darmassozuertem Lymphoidgewebe und Eierstockgewebe nach. Das vorhergesagte Protein hat vier mutmaßliche Transmembran durchdringende Regionen. Die Expression des Transkripts wird in somatischen Zellhybriden, die aus SL 12.4-Zellen, die mit drei verschiedenen T-Lymphom-Zellinien fusioniert wurden, denen eine zu dem neuen cDNA-Klon komplementäre nachweisbare mRNA fehlt, reprimiert. Diese transnegative Regulation deutet darauf hin, daß die Expression des Gens durch Repressionsmechanismen gesteuert wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die Expression von fünf verschiedenen SL 12.4- spezifischen cDNA-Klonen durch Northern-Blot.
Figur 2 zeigt eine Southern-Blot-Hybridisierung von vier verschiedenen SL 12.4-spezifischen cDNA-Klonen.
Figur 3 zeigt die DNA und die vorhergesagte Proteinsequenz des 19.5-cDNA-Klons (SEQ ID Nr. 4). A, die DNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz wurden erhalten unter Verwendung der Doppelstrang-Sequenzierung. Mikrogenie (Beckman) wurde verwendet, um die DNA-Sequenz zusammenzustellen und die vorhergesagte Aminosäuresequenz herzustellen. B, Restriktionsstellen innerhalb der cDNA zur Subklonierung und die Sequenzierungsstrategie werden gezeigt. Der offene Leserahmen wird durch die gepunktete horizontale Linie gezeigt. Beide Stränge wurden aus dem intakten Insert und vier Subklonen sequenziert unter Verwendung von Primern mit der T3- und T7-Region des Plasmids pT7T3 und einem synthetischen Oligonucleotidprimer. Die Software-Programme SOAP, HELIXMEM, NONOTNY und RAOARGOS von PC-Gene wurden verwendet, um die physikalischen Eigenschaften des vorhergesagten Proteins zu untersuchen und das in C gezeigte Schema herzustellen.
Figur 4 zeigt das Expressionsmuster von 19.5 und 20.2 cDNA in somatischen Zellhybriden und von 19.5 in normalem Mausgewebe.
Figur 5 zeigt durch Northern-Blot-Sequenzen, die komplementär zu 19.5 sind, daß cDNA in menschlichen Eierstock-Carcinom- Zellinien enthalten ist.
Figur 6 zeigt durch Southern-Blot, daß die Sequenzen, die komplementär zu 19.5 sind, in einer Vielzahl von Säugetierarten vorhanden sind und daher in der Evolution konserviert sind.
Figur 7 zeigt durch Northern-Blot, daß beide Transkripte von Lov induziert werden als Reaktion auf die Co-Kultivierung.
Figur 8 zeigt eine Analyse mit fluoreszierendem Antikörper von SL 12.4-Zellen auf Oberflächen-Expression von Lov.
Figur 9 zeigt die Spezifität des 19.5-Antikörpers für das immunisierende Antigen.
Figur 10 zeigt die Induzierbarkeit von Lov-Protein durch Thymus-Epithel-Zellen.
Figur 11 zeigt die Stabilität der Lov-Expression mit Northern-Blot und FACS-Analyse.
Figur 12 zeigt die Anordnung von Lov auf dem Chromosom 16.
Figur 13 zeigt die DNA und die vorhergesagte Proteinsequenz von cDNA aus Klon 20.5 (SEQ ID Nr. 5).
Figur 14 zeigt die Expression des Tea-Gens.
Figur 15 zeigt die Kinetik der Tea-Gen-Induktion bei aktivierten Splenozyten.
Figur 16 zeigt die Übereinstimmung der 20.5- und ERR-cDNA- Sequenzen.
Figur 17 zeigt die Übereinstimmung der vorhergesagten Tea- Proteinsequenz mit der ökotropen retroviralen Rezeptorsequenz der Maus.
Figur 18 zeigt die physikalischen Eigenschaften der vorhergesagten Proteinprodukte von Tea- und Rec-1-Gen.
Figur 19 zeigt eine Southern-Analyse von DNA aus verschiedenen Arten und eine Analyse von rekombinanter Inzucht-DNA um das Tea-Gen auf Chromosom 8 zu lokalisieren.
Figur 20 zeigt die DNA und die vorhergesagte Proteinsequenz von Klon 19.2 cDNA (SEQ ID Nr. 2).
Figur 21 zeigt die DNA und die vorhergesagte Proteinsequenz von Klon 19.4 cDNA (SEQ ID Nr. 3).
Figur 22 zeigt eine schematische Darstellung von pNEO/TfR-NC.
Figur 23 zeigt eine schematische Darstellung von pMAMneo- Blue.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Damit die hier beschriebene Erfindung besser verstanden werden kann, wird die folgende detaillierte Beschreibung angegeben.
In der Beschreibung werden die folgenden Ausdrücke angewendet:
Der Ausdruck "Wirt", wie er hier verwendet wird, ist so zu verstehen, daß nicht nur Prokaryoten, sondern auch Eukaryoten, wie Hefe und fadenförmige Zellen, ebenso wie Pflanzenund Tierzellen eingeschlossen sind.
Der Ausdruck "Prokaryot" bedeutet, daß alle Bakterien eingeschlossen sind, die mit der DNA zur Expression von Transmembran- oder rekombinanten Transmembran-T-Zell-Proteinen (rtTCP) der vorliegenden Erfindung transformiert werden können.
Der Ausdruck "Eukaryot" soll alle Hefen, Pilze, Tier- und Pflanzenzellen einschließen, die mit der DNA zur Expression der Transmembran- oder rekombinanten Transmembran-T-Zell-Proteine der vorliegenden Erfindung transformiert werden können.
Die DNA für die T-Zell-Proteine der vorliegenden Erfindung kann aus irgendwelchen Säugetierzellen stammen. Es ist nur erforderlich, daß die genetische Sequenz für die T-Zell-Proteine (TCP) in dem prokaryotischen oder eukaryotischen Organismus exprimiert wird. Bevorzugt ist die T-Zell-DNA, die/das die TCP-Protein(e) exprimiert, aus der Maus. Besonders bevorzugt ist eine Sequenz der T-Zell-DNA, die mit vielen Tierarten immunologisch kreuzreagiert (z.B. Mäusen, Kaninchen, Seelöwen oder Menschen).
Ein rekombinantes DNA-Molekül, das irgendeines der T-Zell- Proteine der vorliegenden Erfindung kodiert, kann verwendet werden, um einen Wirt zu transformieren unter Verwendung irgendeiner der dem Fachmann allgemein bekannten Techniken. Besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Vektors, der die kodierende Sequenz für die T-Zell-Proteine der vorliegenden Erfindung enthält, für die prokaryotische Transformation.
Das rekombinante T-Zell-Protein (rTCP) der Erfindung könnte an den flankierenden Enden mehr oder weniger Aminosäuren haben, als die Aminosäuresequenz der nativen T-Zell-Proteine.
Der Ausdruck "im wesentlichen rein" bedeutet, wenn er für das Transmembran-T-Zell-Protein der vorliegenden Erfindung angewendet wird, daß das Polypeptid im wesentlichen frei ist von anderen Proteinen, die normalerweise mit dem T-Zell-Protein in seinem natürlichen Zustand assoziiert sind, und konstante und reproduzierbare elektrophoretische oder chromatographische Reaktionen, Elutionsprofile und Antigenaktivitäten aufweist. Der Ausdruck "im wesentlichen rein" soll nicht künstliche oder synthetische Mischungen des T-Zell-Proteins mit anderen Verbindungen ausschließen.
Verfahren zur Herstellung von fusionierten, operativ verbundenen Genen und zur Expression in Bakterien sind bekannt und werden z.B. in US-Patent Nr. 4,366,246, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen wird, gezeigt. Die genetischen Konstrukte und Methoden, die darin beschrieben werden, können für die Expression von Transmembran-T-Zell-Protein in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirten verwendet werden.
Prokaryotische Wirte können gramnegative ebenso wie grampositive Bakterien einschließen, wie E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis.
Eukaryotische Wirte können Hefen einschließen, wie Pichia pastoris oder Säugetierzellen.
Im allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorse quenzen enthalten, die die wirksame Transkription des insertierten DNA-Fragments erleichtern, zusammen mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, Promotor(en), Terminator(en) ebenso wie spezifische Gene, die eine Phänotypische Selektion der transformierten Zellen liefern können. Die transformierten Wirte können mit im Stand der Technik bekannten Mitteln fermentiert und gezüchtet werden, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen.
Beispiele für Promotoren, die für die Erfindung verwendet werden können, schließen rec A, trp, lac, tac, pR oder pL des Bakteriophagen Lambda, MMTV, SV40 ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Beispiele für einige der Plasmide oder Bakteriophagen, die für die Erfindung verwendet werden können, sind in Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982, aufgeführt und andere sind dem Fachmann bekannt und können leicht erhalten werden.
Die Erfindung erstreckt sich auf jeden Wirt, der mit den beschriebenen Methoden modifiziert wurde oder mit irgendwelchen anderen Methoden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, modifiziert wurde, z.B. durch Transfer von genetischem Material unter Verwendung eines lysogenen Phagen und der einen Prokaryoten oder Eukaryoten liefert, der das Gen für das Transmembran-T-Zell-Protein exprimiert.
Ein Gen ist eine DNA-Sequenz, die durch ihre Matrize oder Messenger-RNA eine Sequenz von Aminosäuren kodiert, die für ein spezifisches Peptid charakteristisch ist. Der Ausdruck cDNA schließt Gene ein, aus denen die dazwischenliegenden Sequenzen entfernt wurden. Der Ausdruck rDNA soll ein Molekül einschließen, das rekombiniert wurde, indem cDNA oder genomische DNA-Sequenzen in vitro gespleißt wurden.
Ein Klonierungsvektor ist Plasmid- oder Phagen-DNA oder eine andere DNA-Sequenz, die in einer Wirtszelle repliziert werden kann, die durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen gekennzeichnet ist, an denen solche DNA-Sequenzen in nachweisbarer Weise geschnitten werden können, ohne Verlust einer wichtigen biologischen Funktion der DNA und die eine Markierung enthält, die geeignet ist zur Verwendung, um transformierte Zellen zu identifizieren. Markierungen sind z.B. die Tetracyclin-Resistenz, Neomycin- Resistenz oder Ampicillin-Resistenz. Das Wort "Vektor" wird manchmal statt Klonierungsvektor verwendet.
Ein Expressionsvektor ist ein Vektor, der einem Klonierungsvektor ähnlich ist, der aber ein gegebenes Strukturgen in einem Wirt, normalerweise unter der Kontrolle bestimmter Kontrollsequenzen, exprimieren kann.
Wirte, die mit dem Transmembran-T-Zell-Genom für Transmembran-T-Zell-Proteine transformiert sind, sind besonders geeignet zur Herstellung von Transmembran-T-Zell-Polypeptiden und -Proteinen.
Das rekombinante T-Zell-Protein kann die gesamte Aminosäuresequenz des T-Zell-Proteins enthalten oder kann nur eine spezifische Determinante enthalten. Ein Tier, das mit dem rekombinanten T-Zell-Protein immunisiert wurde, wird Antikörper erzeugen, die an Epitope binden, die auf den rekombinanten oder natürlich vorkommenden Polypeptiden vorhanden sind. So kann die kommerzielle Herstellung von T-Zell-haltigen rekombinanten Proteinen durchgeführt werden.
Der Ausdruck "Individuum" soll irgendein Tier, bevorzugt ein Säugetier, am meisten bevorzugt ein Nagetier, eine Katze, einen Hund, eine Kuh oder einen Menschen einschließen.
Nachweisbare Markierungen können irgendwelche Moleküle sein, die nachgewiesen werden können. Üblicherweise verwendete nachweisbare Markierungen sind radioaktive Markierungen einschließlich ³²P, ¹&sup4;C, ¹²&sup5;I, ³H und ³&sup5;S, ohne darauf beschränkt zu sein. Mit Biotin markierte Nudeotide können in DNA oder RNA durch Nick-Translation, mit enzymatischen oder chemischen Mitteln eingearbeitet werden. Die biotinylierten Sonden werden nach der Hybridisierung unter Verwendung von Avidin/Streptavidin, fluoreszierenden, enzymatischen oder kolbidalen Goldkonjugaten nachgewiesen. Nudeinsäuren können auch mit anderen fluoreszierenden Verbindungen, mit immunologisch nachweisbaren fluoreszierenden Derivaten oder mit Biotin-Analogen markiert werden. Nudeinsäuren können auch durch Bindung an ein Protein markiert werden. Nudeinsäuren, die mit radioaktivem oder fluoreszierendem Histon H1, Enzymen (alkalischer Phosphatase und Peroxidasen) oder einzelsträngigem bindendem (ssB) Protein vernetzt sind, können auch verwendet werden.
So macht die vorliegende Erfindung einen Anti-Transmembran-T- Zell-Protein-Antikörper zur Verwendung als Sonde für die Transmembran-Proteine der vorliegenden Erfindung und als Inhibitor der Bindung der natürlichen Liganden der Transmembran-T-Zell-Proteine der vorliegenden Erfindung und als Arzneimittel- oder Markierungszielorientiertes Abgabesystem verfügbar.
Zwei Zellklone, die von der SL12-T-Lymphomzellinie stammen, wurden für die Isolierung neuer differenziert exprimierter Gene auf Basis bekannter Unterschiede in der Genexpression und aufgrund ihrer unterschiedlichen Fähigkeit, Tumoren in syngenen Wirtstieren zu verursachen, ausgewählt (Hays et al., Int. J. Cancer 38:597-601 (1986); MacLeod et al., Cancer Research 44:1784-1790 (1984); MacLeod et al., J. Nat. Cancer Inst. 74:875-882 (1985); MacLeod et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6989-6993 (1986); Siegal et al., J. Exp. Med. 166:1702-1715 (1987); Weinroth et al., Cancer Research 45:4804-4809 (1985); Wilkinson et al., EMBO J. 7:101-109 (1988) und Tabelle 1 für eine Zusammenfassung von Phänotypen). Die SL 12.3-Zellinie exprimiert sehr wenige der Gene, die für die T-Zell-Funktion erforderlich sind, ist äußerst bösartig bei syngenen Tieren und bildet diffuse, aggressive Tumoren. Im Gegensatz dazu exprimieren SL 12.4-Zellen mRNA's für alle Komponenten des TCR/CD3-Komplexes außer TCR-α und die Zellen sind in mehrerer Hinsicht Thymocyten in einer Zwischenstufe der Thymocyten-Entwicklung ähnlich. SL 12.4- Zellen sind weniger tumorigen und induzieren hervortretende extranodale Tumoren. Bei weiblichen Wirtstieren ist die Primärstelle der Tumorbildung der Eierstock. Die neuen Transmembran-Proteine können an der Zielsuche der Tumorzellen am Eierstock beteiligt sein.
Neue cDNA-Klone wurden aus den zwei Zellinien, die sich in ihrer tumorigenen Fähigkeit, den Zielsuche-Eigenschaften und dem Reifestadium unterscheiden, isoliert. Diese cDNA-Klone stellen Gene dar, die Produkte kodieren, die mit der unterschiedlichen Fähigkeit der zwei Zellinien, Tumoren zu verursachen und/oder in der T-Zell-Entwicklung zu wirken, verwandt sind. Die Erfindung offenbart die Isolierung und Charakterisierung von fünf neuen cDNA-Klonen, die Gene zeigen, die bevorzugt in dem SL 12.4-T-Zell-Klon exprimiert werden und in dem Schwester-Zell-Klon SL 12.3 nicht nachweisbar sind oder schwach exprimiert werden. Die cDNA-Klone wurden erhalten durch eine Kombination von durch subtraktive Hybridisierung angereicherten Sonden und dem klassischen differentiellen Screening. Neue cDNA-Klone, die Gene aufweisen, die bei den zwei Zellkionen verschieden exprimiert werden, werden offenbart. Alle entsprechenden Gene werden in einer begrenzten Untergruppe von Geweben exprimiert. Einige Transkripte finden sich nicht nur in Lymphoidzellen, sondern zeigen eine Anzahl von Expressionen. Die Sequenzen von zwei cDNA's (19.5 und 20.5) (SEQ ID Nr. 4 bzw. 5) zeigen, daß die Genprodukte neue mehrfach die Membranen durchdringende Proteine sind, die in normalem Eierstockgewebe, Thymus, darmassozuertem Lymphoidgewebe, Milz und Leber von Mäusen exprimiert werden. Eine Sequenz hybridisierte auch mit Human-Eierstock-Carcinomzellen und normalem Gewebe.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird zum vollständigen Verständnis auf die folgenden spezifischen Beispiele verwiesen. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollen wenn nicht anders angegeben, in keiner Weise beschränkend wirken.

Beispiel 1

Isolierung, Charakterisierung und Züchtung von Zellen

A. Lymphom-Zellinien

Isolierung, Charakterisierung und die Kulturerfordernisse für die T-Lymphom-Zellinien SL 12.1, SL 12.3, SL 12.4 und für somatische Zellhybride, die zwischen diesen gebildet wurden, wurden im Detail beschrieben bei Hays et al., Int. J. Cancer 38:597-601 (1986); MacLeod et al., Cancer Research 44:1784-1790 (1984); MacLeod et al., J. Nat. Cancer Inst. 4:875-882 (1985); MacLeod et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6989-6993 (1986) und Weinroth et al., Cancer Research 45:4804-4809 (1985); die alle hier durch Bezugnahme eingeschlossen werden.
Die Phänotypen der Zellklone SL 12.3 und SL 12.4 sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Transkriptexpression, die Oberflächenprotein-Expression, die Tumorbildungsfähigkeit und die Tumorart wurden durch Northern-Analyse, Durchfluß- Zytometrie bzw. in vivo-Injektion von klonierten Zellen in syngene Tiere bestimmt. TCR-β-1.0 und 1.3 kb Transkripte kodieren (D)-J-C- bzw. V-D-J-C-Sequenzen. Die Glucocorticoid-Reaktion wurde bestimmt durch Wachstum der Zellen in 1 mM Dexamethason. Tabelle 1 Phänotypische Eigenschaften der Zellklone SL 12.4 und SL 12.3
R = Zellen, die gegenüber einer Lysis resistent sind,
5 = empfindlich für eine Lyse.
SAK-8-Zellen (Gasson und Bourgeois, J. Cell. Biol. 96, 409- 415 (1983)) wurden von Dr. Gasson erhalten. Die Lymphomzellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium, das mit 10 % fetalem Kälberserum, Glutamin, Penicillin und Streptomycin ergänzt war, gezüchtet. Zwei menschliche Eierstock-Carcinom-Zellinien 2008 (Disaea et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 114:979-989 (1972)) und COLO 316 (Woods et al., Cancer Res. 39:4449-4459 (1979)) wurden in RPMI-Medium 1640, das mit 5 % Rinderkalbserum, Glutamin und 1 % Fungi-bact (Irvine Scientific, Santa Ana, CA.) ergänzt war, gezüchtet. Wenn die Zellen verwendet wurden, um RNA herzustellen, wurden sie während des exponentiellen Wachstums bei einer Dichte von etwa 5 bis 8 x 10&sup5;-Zellen pro ml geerntet (Wilkinson und MacLeod, EMBO J. 7:101-109, (1988)). Splenozyten, die von BALB/c-Mäusen stammten, wurden mit 3 X 10&sup6; Zellen pro ml geimpft und mit 10 µg/ml ConA zwei Tage vor der Ernte der RNA stimuliert.

B. Co-Kultivierung von SL 12.4-Zellen und Thymus-Epithel-Einfachschichten

Die Co-Kultivierungs-Bedingungen für SL 12.4-Zellen und Thymus-Epithel-Einfachschichten sind im folgenden angegeben. Kurz gesagt wurden SL 12.4-Zellen in einer solchen Dichte geimpft, daß ihre endgültige Konzentration nach der dreitägigen Co-Kultivierung 1 x 10&sup6;-Zellen pro ml war. TEL oder TEPI waren am dritten Tag zusammenfließend. Die Zellen wurden in Dulbeco's modifiziertem Eagle's Medium, das 10 % fetales Kälberserum enthielt und mit Glutamin und Penicillin/Streptomycin ergänzt war, bei 37ºC gezüchtet.

C. Zellinien für Expressionsstudien mit 20.5

Zellinien aus den folgenden Quellen wurden verwendet für die Untersuchungen der Expression bei 20.5: Embryonal-Carcinome F9 und PCC4 (Bemstine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70:3899-3903 (1973), Hypophysentumor ATt20 (Buonassisi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 48: 1184- 1192 (1962)), Thymus-Epithel-TEPI (Beardsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 6005-6009 (1983)), Brustdrüsenepithel (Evans, (1988) Science 240: 889-894)12.9), 3T3 (ATCC # 92) und MEF wurden hergestellt gemäß Freshney (Freshney, (1983), Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc. Seiten 99 bis 110). Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, das mit 10 % fetalem Kälberserum, Glutamin, Penicillin und Streptomycin ergänzt war, gezüchtet. Die Zellen, die verwendet wurden, um RNA herzustellen, wurden während des exponentiellen Wachstums aus Kulturen geerntet, die 5 bis 8 x 10&sup5;-Zellen pro ml enthielten. Splenozyten, die von BALB/c-Mäusen erhalten wurden, wurden mit 3 x 10&sup6;-Zellen pro ml in RPMI 1640, das wie oben ergänzt war, geimpft und mit 10 µg/ml ConA 6, 24, 48 oder 72 Stunden vor dem Ernten der RNA stimuliert.

Beispiel 2

Klonierungs- und Screening-Strategie

Poly(A)&spplus; mRNA von SL 12.4-Zellen wurde als Matrize verwendet, um doppelsträngige (ds) cDNA herzustellen (Gubler und Hoffman, Gene 25:263-269 (1983). EcoRI-Linker wurden zu der ds- DNA zugegeben, die vorher methyliert worden war. Dephosphorylierte lambda-gt10-Arme (Stratagene) wurden mit der cDNA ligiert und in den Phagen Lambda gepackt unter Verwendung des Stratagene-Verpackungsextraktes nach den Anleitungen des Herstellers (Huynh et al., D. Glover (ed.), DNA Cloning Techniques: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, Großbritannien (1984)).
Die substraktive Hybridisierung wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie sie ursprünglich von Hedrick et al. beschrieben wurde (Nature 308:149-153 (1984); Timberlake, Dev. Biol. 78:497-503 (1980)). Einzelsträngige cDNA wurde aus 10 mg Poly(A)+ SL12.4-RNA hergestellt unter Verwendung von 250 mC ³²P DCTP (Amersham) in Gegenwart von 100 µg/ml Actinomycin D und auf eine Rot von 1260 (Nucleotidmolekül pro Liter x Sekunden) mit 25 mg Poly(A)&spplus;-RNA aus SL 12.3-Zellen in einem Volumen von 8 ml bei 68ºC 18 Stunden lang hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde die ss cDNA durch Chroinatographie durch eine Hydroxyapatitsäule gesammelt. Aus 1 µg Ausgangs-SL 12.4-cDNA wurden ungefähr 120 ng (12 % der eingesetzten cDNA, die 3 x 10&sup7; cpm enthielt) gewonnen und verwendet, um zwei Nitrocellulosefilter mit 150 mm, die 20.000 lambda gt10 Plaques pro Filter enthielten, zu sondieren. Der erste der beiden von der SL 12.4 Lambda gt10 Bibliothek abgehobene Filter wurde mit der gesamten cDNA aus SL 12.3-mRNA sondiert und der zweite abgehobene Filter wurde mit der aus SL 12.4 durch Subtraktion angereicherten cDNA, die wie oben hergestellt worden war, sondiert. Die verwendete Strategie war ähnlich der, die von Filmus et al. verwendet wurde. Die von Plaques gereinigten Lambda Phagenklone wurden durch zwei Screening-Durchgänge als SL 12.4-spezifisch identifiziert (unter Verwendung von getrennt hergestellten subtrahierten Sonden). Anschließend wurde eine Northern-Analyse verwendet, um zu bestätigen, daß der Klon nur mit mRNA von SL 12.4- Zellen und nicht von SL 12.3-Zellen hybridisierte. Die cDNA- Inserts wurden aus Lambda-DNA durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Hind III und Bgl II entfernt, in niedrigschmelzender Agarose (Sea Kem) isoliert und in den Plasmidvektor pt7/T3 (Bethesda Research Laboratory), der mit HindIII und BamHI verdaut worden war, subkloniert. Die Inserts konnten nicht aus dem Phagen mit EcoRI herausgeschnitten werden, da die EcoRI-Stellen in allen Isolaten beschädigt waren, Kuziel et al., Nucl. Acid. Res. 15:3181 (1987).

Beispiel 3

Northern-Blot-Analyse

A. Allgemeines Vorgehen

Die gesamte zelluläre RNA wurde aus Zellinien und Geweben mit der Guanidin-Isothiocyanat-Methode isoliert (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1983), modifiziert, wie beschrieben (Wilkinson et al., EMBO J. 7:101-109 (1988)). Für die Northern-Analyse wurden 10 µg RNA elektrophoretisch in 1 % Agarosegelen, die Formaldehyd enthielten, getrennt und auf Nitrocellulose-Membranen überführt (Meinkoth, Wahl, Anal. Biochem. 13:267-284 (1984)).
Eine gleiche Beladung und gleicher Transfer von RNA pro Bahn wurden sichergestellt durch Anfärbung mit Acridinorange (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1983)) und durch Hybridisierung mit Actin, CHO-A und/oder Cyclophillin cDNA. Northern-Blots wurden mit statistisch geprimten (Random Priming) (Amersham) P-markierten cDNA-Inserts in Gegenwart von 10 % Dextransulfat und 50 % Formamid 12 bis 18 Stunden lang bei 42ºC hybridisiert,schrittweise gewaschen und schließlich 30 Minuten lang in 0,1 x SSPE, 0,1 % SDS bei 42 oder 50ºC. Um die markierte Sonde zu entfernen, wurden die RNA-Blots mit 0,1 x SSPE und 0,1 % SDS bei 90ºC gewaschen, auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, an der Luft getrocknet und im Vakuum aufbewahrt, bis sie wiederum hybridisiert wurden.

B. Northern-Analyse von Lov (19.5) RNA

Die SL 12.4-Zellen wurden nach Co-Kultivierung geerntet und in 4 M Guanidin-Isothiocyanat, 1 M 2-Mercaptoethanol und 25 mM Natriumacetat (pH 5,2) lysiert. Das Lysat wurde dann auf eine Schicht aus 5,7 M Cäsiumchlorid/2 mM EDTA gebracht und mit 38.000 Upm 18 Stunden lang bei 4ºC zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde dann in TE-Puffer resuspendiert und zweimal mit Chloroform/Butanol extrahiert. 10 µg RNA wurden auf jeder Bahn eines 1 % Formaldehyd-- Agarosegels elektrophoretisch getrennt und auf Nitrocellulose-Membranen überführt. Die Northern-Blots wurden mit dem cDNA-Insert des Lov-Gens, das mit ³²P markiert worden war unter Verwendung des Kits für die Oligolabelling-Technik von Amersham hybridisiert. Die Hybridisierung wurde 12 bis 18 Stunden lang bei 42ºC in Gegenwart von 10 % Dextransulfat und 50 % Formaldehyd fortschreiten gelassen. Die entstehenden Autoradiogramme wurden dann auf Veränderungen der Lov-RNA analysiert durch Raster-Laser-Densitometrie. Die scheinbaren Induktionen wurden normalisiert für die RNA-Beladung unter Verwendung einer nachfolgenden Hybridisierung mit Actin und CHO-A, das nicht durch Co-Kultivierung induziert wurde (MacLeod et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6989-6993 (1986)). Die dafür angegebenen Werte zeigen den korrigierten xfachen Anstieg der Lov-Expression in cokultivierten SL 12.4-Zellen gegenüber unbehandelten SL 12.4-Zellen.

C. Northern-Blot-Analyse von 20.5-(Tea)-RNA

Die gesamte zelluläre RNA wurde aus SL 12.4, SL 12.3 und frischen Gewebepräparaten von Balb/c-Mäusen mit der oben beschriebenen Guanidin-Isothiocyanat-Methode isoliert. Cytoplasmatische oder nudeare RNA wurde wie oben beschrieben hergestellt. Für die Northern-Analyse wurden 10 µg RNA in 1 % Formaldehyd-Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nitrocellulose-Membranen überführt (Maniatis et al., (1983), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Meinkoth und Wahl (1984) Anal. Biochem. 13: 267-284).

Beispiel 4

Southern-Blot-Analyse

A. Allgemeines Vorgehen

Die gesamte zeiluläre DNA wurde aus Zellen, T-Lymphomen und somatischen Maus-Hamster-Zellhybriden isoliert und Gewebe aus anderen Arten wurde mit den in den Figurlegenden angegebenen Restriktionsenzymen nach den Anweisungen des Herstellers verdaut. 10 µg verdaute DNA wurden pro Bahn eines 0,7 % Agarosegels aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nytran-Träger geblottet, im wesentlichen wie beschrieben (Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem. 13:267-284 (1984)), hybridisiert und gewaschen, wie für die Northern-Blot-Analyse beschrieben.

B. Southern-Blot-Analyse von 20.5

Die Southern-Blot-Analyse von 20.5 wurde wie oben durchgeführt, außer den unten angegebenen Ausnahmen.
Die gesamte zelluläre DNA wurde isoliert aus SL 12.4-Zellen, Maus- und Hamster-Leber- und somatischen Zellhybriden. DNA aus Hühnohen- und menschlicher Leber wurde im Handel erhalten von Clonetec, Pab Alto, Californien. Die DNA wurde mit den Restriktionsenzymen, die in den Beispielen angegeben sind, nach den Vorschriften des Herstellers verdaut. 10 µg verdaute DNA wurden auf jede Bahn eines 0,8 % Agarosegels aufgetragen und elektrophoretisch in Tris-Acetatpuffer mindestens 48 Stunden lang aufgetrennt und auf Nytran-Träger geblottet, hybridisiert und, wie für die Northern-Blot-Analyse beschrieben, gewaschen. Die Blots, die DNA aus anderen Arten enthielten, wurden mit einer geringeren Stringenz gewaschen. Das letzte Waschen wurde bei Raumtemperatur mit 2x SSPE durchgeführt.

Beispiel 5

Isolierung neuer cDNA-Klone unter Verwendung eines durch Subtraktion verbesserzen differentiellen Screenings

Neue cDNA-Klone, die ausschließlich von SL 12.4-Zellen oder stärker von SL 12.4-Zellen als von SL 12.3-Zellen exprimiert wurden, wurden und, wie in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben identifiziert und isoliert. Das anfängliche Screening von 40.000 rekombinanten ggt10-Phagen lieferte nur 11 Kandidaten, von denen 8 nach einem weiteren Screening mit subtraktiven Sonden gewonnen wurden und 6 verschiedene Genprodukte darzustellen schienen. Die Charakterisierung von 5 cDNA-Klonen wurde durchgeführt. Northern-Blots von RNA aus SL 12.3- und SL 12.4-Zellen zeigten, daß die isolierten cDNA-Klone verschieden in SL 12.3- und SL 12.4-Zellen exprimiert wurden, wie in Figur 1 gezeigt. Gereinigte Inserts aus den jeweiligen SL 12.4-T-zellspezifischen cDNA-Klonen wurden markiert und verwendet, um Northern-Blots zu sondieren. Jede Bahn enthielt 10 µg der gesamten zellulären RNA aus SL 12.4- bzw. SL 12.3- Zellinien, wie angegeben. Der Blot wurde nach und nach mit dem angegebenen radioaktiv markierten cDNA-Insert sondiert. Die Pfeile markieren die relative Mobilität des 18S und 28S- rRNA-Transkripts. Die Menge an SL 12.3- und SL 12.4-RNA, die pro Bahn aufgetragsn wurde, war äquivalent, wie durch Hybridisierung mit einer CHO-A-cDNA-Sonde wie in Beispiel 3 bestimmt wurde.
Einige der cDNA-Klone wurden ausschließlich in SL 12.4-Zellen exprimiert (19.5 und 20.5) (SEQ ID Nr. 4 bzw. 5), wohingegen andere (19.2 und 19.4) (SEQ ID Nr. 2 bzw. 3) viel stärker durch SL 12.4-Zellen exprimiert wurden. Mehrere der cDNA's identifizierten mehr als eine Größenklasse von Transkripten, was darauf hindeutet, daß sie an verschiedenen Stellen beginnen oder enden könnten, verschieden gespleißt wurden oder von nah verwandten Genen stammen könnten.
Die cDNA-Klone entsprechen Genen mit geringer Kopienzahl oder Einzelgänger-Genen, die in beiden SL 12-Zellinien vorhanden sind. Da SL 12.3-Zellen keine nachweisbare Expression von 19.5- und 20.5-Transkripten zeigen, wurde untersucht, ob das Gen zerstört oder umgelagert worden sein könnte, um die Abwesenheit des Transkripts zu erklären. Genomische DNA aus SL 12.3-, SL 12.4-Zellen und normale Leber-DNA wurde mit EcoRI, Hind III oder PstI verdaut und mit gereinigten Insertsonden der cDNA-Klone analysiert. Figur 2 zeigt die Southern-Blot-Hybridisierung von SL 12.4-spezifischen cDNA- Klonen. Genomische DNA (10 µg pro Bahn) aus AKR-Mausleber, SL 12.3, SL 12.4 und SAK klonierten T-Lymphom-Zellinien und von SL 12.3 x SL 12.4-, SAK x SL 12.4-, SAK x SL 12.3- Hybridzellen wurde mit EcoRI verdaut und durch Southern-Blots analysiert, die mit dem angegebenen cDNA-Klon, wie in Beispiel 4 beschrieben, hybridisiert wurden. Die Fragmentgrößen in Kilo-Basenpaaren (bestimmt durch gleichzeitiges Wandern von mit Hind III verdauter Lambda-DNA) sind an der Seite angegeben. Ein oder wenige Restriktionsfragmente wurden erkannt durch die Sonden, was darauf hindeutet, daß die entsprechenden Gene n beiden Zellinien in geringer Kopienzahl im Mäusegenom vorhanden sind. Die Intensität der Hybridisierung war in allen Bahnen ähnlich, was darauf hindeutet, daß die Gene in der DNA der SL 12.3-Zellen in etwa den gleichen Mengen und ohne nachweisbare Umlagerungen unter Verwendung vier verschiedener Enzyme (Figur 2) vorhanden war. Daher ist es wahrscheinlich, daß Unterschiede in der Expression der Gene in den SL 12-Zellklonen auf einer zellspezifischen Regulation und nicht auf dem Verlust oder nachweisbaren Umlagerungen der jeweiligen Genen beruhen. Jedoch können kleine Umlagerungen oder Punktinutationen in SL 12.3-Zellen nicht ausgeschlossen werden.
Die SL 12.4-spezifischen cDNA-Klone stellen neue Gene dar. Die cDNA-Klone 19.2, 19.5 und 20.5 (SEQID Nr. 2, 4 bzw. 5) wurden vollständig sequenziert. Es gibt keine signifikanten Homologien mit veröffentlichten Sequenzen. Die Sequenzen sind in den Figuren 3, 13, 20, 21 und 22 gezeigt.
Obwohl die Sequenz von 19.4 (SEQ ID Nr. 3) nur teilweise bestimmt wurde (ungefähr 2,8 Kb³ von 3,6 Kb), wurde keine bedeutende Sequenz-Homologie in den DNA-Datenbanken oder durch Transkriptgrößen, Expressionsgrade und Gewebe-Expressionsmuster festgestellt. Weiterhin entsprach keiner der cDNA-Klone bekannten T-Zell-Genen, Onkogenen oder retroviralen Genen aus der Maus, von denen bekannt ist, daß sie in AKR-Zellinien exprimiert werden, auf Basis der Transkriptgröße oder einer Expression (Hagiwara et al., J. Immunol. 138:2514-2517 (1987); Heckford et al., J. Immunol. 137:3652- 3663 (1986); LeClair et al., EMBO J. 5:3227-3234 (1986); Mushinski et al., Science 220:795-798 (1983); Yague et al., Cell 42:81-87 (1985); Quint et al., J. Virol. 39:1-10 (1981); Selton et al., EMBO J. 4:1793-1798 (1985)).
Die Größe der cDNA's und der Transkripte, die von ihnen erkannt werden, zusammen mit der Länge des offenen Leserahmens (ORF&sup4;) sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Größe der cDNA-Inserts und IRLRNA-Transkripte
* Die Größe des cDNA-Inserts ist angegeben in Kilobasen- (kb)-Paaren und wurde durch DNA-Sequenzanalyse bestimmt.
' Die Transkriptgrößen, in kb, wurden grob abgeschätzt durch die relative Wanderung der ribosomalen 18S- und 28S-RNA in Forinaldehyd-Agarosegelen, wie in Materials and Methods beschrieben.
&spplus;LORF = Long open reading frame (langer offener Leserahmen) angegeben in Basenpaaren. Die DNA-Sequenzen wurden untersucht unter Verwendung von Microgenie-Software, um ORFs zu lokalisieren; solche mit > 300 bp sind hier enthalten. Das - bedeutet, daß kein langer ORF gefunden wurde. Der 19.4 LORF mit 2400 bp ist vorläufig, wegen der unvollständigen Sequenzierungs-Information.
&spplus;&spplus; Die 19.2-cDNA enthält 2 ORFs, die länger sind als 450 bp, die nach einer weiteren Untersuchung, tatsächlich zusammengehörig sein könnten und daher etwa 920 bp umfassen.
Aufgrund eines Vergleichs der Transkript- und cDNA-Insertgröße wird angenommen, daß keine der cDNA's ihre volle Länge hat. Die cDNA von 19.2 ist 3,5 kb lang, hat aber einen relativ kurzen ORF (471 bp&sup5;, Tabelle 2). Die Teilsequenz der cDNA von 19.4 hat einen ORF von 2,4 kb. Wie bei 19.4 scheint der 19.5 cDNA-Klon die gesamte kodierende Sequenz zu enthalten und hat fast die vollständige Länge.

Beispiel 6

Analyse der cDNA von 19.5

Der cDNA-Klon 19.5 scheint ein mehrfach die Membran durchdringendes Protein zu kodieren. Die 19.5-cDNA und die vorhergesagte Aminosäuresequenz sind in Figur 3A gezeigt. Die Sequenzierungsstrazegie ist in Figur 3B gezeigt. Die cDNA- Sequenz liefert mehrere Hinweise darauf, daß der gesamte kodierende Bereich in dem 19.5-Klon vorhanden ist: 1) Es gibt Stopsignale in allen drei Leserahmen vor der vorhergesagten Startposition und innerhalb der vorhergesagten 3' untranslatierten Region; 2) die vorhergesagte Methionin-Startstelle ist von einer Sequenz umgeben, die mit der Kozak- Konsensussequenz GXC AUG G (worin X A, C, G oder U sein kann) übereinstimmt für eine optimale Translations-Startstelle (30); 3) ein mögliches Polyadenylierungssignal, ATTAAA, (31) ist 3' des Terminationscodons vorhanden.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz ergibt eine vorhergesagte (unmodifizierte) Proteingröße von 32.981 Dalton und liefert zwei potentielle Glykosylierungsstellen, die in Figur 3A durch Sterne gezeigt sind. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz liefert eine präzise Abschätzung des Molekulargewichts, das entweder durch Glykosylierung oder Phosphorylierung oder beides verändert sein kann. Unter Verwendung der Intelli- Genetics Software-Programme wurden vier äußerst hydrophobe potentielle die Transmembran durchdringende Bereiche identifiziert (in Figur 3A unterstrichen). Es wurde keine Signalsequenz gefunden. Ein Schema einer möglichen membranassoziierten Struktur auf Basis der physikalischen Eigenschaften des vorhergesagten Proteins ist in Figur 3C gezeigt. Obwohl die vorhergesagte Struktur an den Nicotinacetylcholin-Rezeptor erinnert, wurde keine Ähnlichkeit mit der Protein- oder DNA-Sequenz gefunden. Figur 3 zeigt die DNA und vorhergesagte Proteinsequenz des cDNA-Klons 19.5. Aufstellung A zeigt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz, die unter Verwendung der Doppelstrang-Sequenzierung erhalten wurde. Microgenie (Beckman) wurde verwendet, um die DNA-Sequenz zusammenzustellen und die vorhergesagte Aminosäuresequenz zu erstellen. Aufstellung B zeigt die Restriktionsstellen innerhalb der für die Subklonierung verwendeten cDNA und die verwendete Sequenzierungsstrategie. Der offene Leserahmen ist durch eine gepunktete vertikale Linie angezeigt. Beide Stränge wurden aus dein intakten Insert und vier Subklonen sequenziert unter Verwendung von Primern der T3- und T7-Bereiche des Plasmids PT7T3 und eines synthetischen Oligonucleotid-Primers. Die PC-Gene-Software-Programme SOAP, HELIXMEM, NOVOTNY, RAOARGOS wurden verwendet, um die physikalischen Eigenschaften des vorhergesagten Proteins zu untersuchen und das auf Platte C gezeigte Schema aufzustellen.

Beispiel 7

Negative Regulation der Genexpression von 19.5 in somatischen Zellhybriden

Die unterschiedliche Expression von mit 19.5 verwandten Transkripten in SL 12.3- und SL 12.4-Zellinien wurde untersucht unter Verwendung von somatischen Zellhybriden, die durch Fusion von SL 12.3- und SL 12.4-Zellen gebildet wurden (SL 12.3 x SL 12.4). Diese Hybride sind teilweise nützlich, da sie eine ungewöhnlich stabile und fast tetraploide Chromosomenzahl haben. Die SL 12.3 x SL 12.4 Hybridzellen enthalten 79 Chromosomen und haben über einen Zeitraum von mehreren Jahren kein einziges Chromosom verloren. Figur 4A zeigt, daß die Expression der 19.5 Transkripte stark reprimiert wird in SL 12.3 x SL 12.4 Hybridzellen. Außerdem führen Fusionen, die zwischen SL 12.4-Zellen und zwei anderen T-Lymphom-Zellinien, SAK8 oder SL 12.1, die keine Expression der 19.5-mRNA zeigen (Figur 4A), gebildet wurden, auch zu Hybridzellen, denen nachweisbare 19.5-Transkripte fehlen, wie in Figur 4A dargestellt.
Der geringe Anteil einer Expression des 19.5-Gens in allen drei somatischen Zellhybriden beruht nicht auf dem Verlust der Gene oder größeren Genumlagerungen, da die Southern- Blots, bei denen DNA aus SL 12.3- und SL 12.4-Zellinien verglichen wurde, keine nachweisbaren Unterschiede in der Bandengröße oder Intensität zeigten, wie in Figur 2 gezeigt. Außerdem ist es unwahrscheinlich, daß beide Chromosomen, die das Gen, das durch den SL 12.4-Elternteil beigetragen wird, enthalten, in drei unabhängigen Hybriden verlorengegangen sind, bei dem fast tetraploiden Chromosomengehalt der Zellen und der Stabilität des Karyotyps. Das Gen, das durch die 19.5-cDNA dargestellt wird, wird bei somatischen Zellfusio nen, die zwischen SL 12.4-Zellen und drei verschiedenen T- Zellinien gebildet wurden, denen die Expression des 19.5-Gens fehlt, negativ reguliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Repressorfaktoren, die durch SL 12.3 erzeugt werden, mindestens teilweise verantwortlich sind für die unterschiedliche Expression des durch die 19.5-cDNA-Sonde nachgewiesenen Gens. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, daß TCR-beta- und CD3-delta-Transkripte durch negative Faktoren, die in SL 12.3-Zellen vorhanden sind, gesteuert werden. Da drei verschiedene T-Lymphomzellinien als Fusionspartner für SL 12.4- Zellen verwendet wurden und alle drei Fusionen keine nachweisbare 19.5 mRNA exprimieren konnten, ist es wahrscheinlich, daß negative Faktoren an der Regulation der Expression des 19.5-Gens beteiligt sind. Es ist unwahrscheinlich, daß eine Mutation oder nicht nachweisbare Deletionen beider 19.5- Allele aus der SL 12.4-Eltemzelle in drei unabhängigen Fusionen, die aus verschiedenen Zellquellen stammen, auftreten könnten.
In Untersuchungen von somatischen Zellhybriden zwischen Zellen verschiedener Abstammung wird das Phänomen der Phänotypischen Auslöschung beobachtet, wodurch sich die meisten für die Differenzierung spezifischen Merkmale nicht mehr akkumulieren (Davidson, Ann. Rev. Genet. 8:195-218 (1974); Hyman und Stallings, Immunogenetics 6:447-458 (1978)). Die Phänotypische Auslöschung ist ungewöhnlich bei Hybriden, die zwischen nah verwandten Zellen der gleichen Abstammung gebildet werden (Hyman et al., Immunogenetics 10, 261-271 (1980)). Wenn eine Repression bei somatischen Zellhybriden ähnlicher Abstammung auftritt, wird sie gewöhnlich spezifischen transwirkenden Depressoren, die von einer der Eltern-Zellinien exprimiert werden, zugerechnet. Im Fall des Wachstumshorinongens wird die Repression bei den somatischen Zellhybriden indirekt durch einen spezifischen positiven Aktivator, GHF1, ausgeübt (Mccorinic: et al., Cell 55:379-389 (1988)).

Beispiel 8

Gewebeverteilung von spezifischen Sequenzen des SL 12.4-Klons

RNA aus einer Vielzahl von Mausgeweben wurde untersucht, um festzustellen, ob das 19.5 entsprechende Gen überall oder gewebespezifisch exprimiert wird. Figur 4 zeigt das Expressionsinuster von 19.5- und 20.2-cDNA in somatischen Zellhybriden und von 19.5 in normalem Mausgewebe. Die Northern-Blots wurden hergestellt, wie in Figur 1 und Beispiel 3 beschrieben. Platte A zeigt RNA aus den SL 12.3-, SL 12.4-, SAK8- und SL 12.1-Elternzellinien und Hybridzellen, die auf Expression der Gene von 19.5 und 20.2 untersucht wurden. Platte B zeigt RNA aus normalen Geweben und Organen, die von Balb/c-Mäusen stammen. Die Transkriptgrößen wurden abgeschätzt aufgrund ihrer relativen Wanderung mit Actin, Cyclophyllin, ribosomaler 18- und 28S-RNA. Die 19.5-cDNA hybridisierte mit zwei Transkripts mit 1,7 und 1,5 kb. Die Blots wurden mit statistisch geprimtem 19.5-cDNA-Insert sondiert und anschließend mit CHO-A, Actin und/oder Cyclophyllin (CP) sondiert, um sicherzustellen, daß alle Bahnen ungefähr äquivalente Mengen an RNA enthielten. Die CP-Kontrolle schien ein zuverlässigeres Maß der RNA-Beladung für normale Gewebe zu sein, als Actin, wenn RNA aus normalen Zellen untersucht wurde. Alle schienen gleich beladen zu sein nach der Anfärbung der Gele vor dem Blotten mid Acridinorange.
Geringe Mengen an 19.5 mRNA sind in GALT (Gut associated lymphoid tissue) (darmassozuertes Lymphoidgewebe), einschließlich Peyer Plaques), Gehirn, Herz und Lunge vorhanden und das Transkript ist ziemlich vorherrschend im Eierstock (Figur 4B). 19.5-Transkripte waren weder in Leber oder Eingeweiden (Figur 4B) noch in der Bauchspeicheldrüse, den Hoden, dein Knochenmark, ruhenden Splenozyten oder durch das T-Zell- Mitogen ConA aktivierten Splenozyten (Tabelle 3) nachweisbar. Obwohl mit 19.5 in Beziehung stehende Transkripte weder in unfraktionierten Thymozyten (Figur 4B) noch in gereinigten CD4-CD8-doppelt negativen Thymozyten nachweisbar sind, ist die mRNA im gesamten Thymus (Figur 4B) und einer Thymus-Epithel-Zellinie (TEL) vorhanden. Daher ist es wahrscheinlich, daß Thymus-Drüsenzellen das Transkript exprimieren.
Verschiedene der neuen cDNA-Klone identifizieren mRNAs, die nicht in ihrer Expression auf die Lymphoidabstammung beschränkt sind. Diese Erkenntnis ist ähnlich bei anderen Genen, die eine bekannte T-Zell-Funktion haben, wie Thy-1 und CD4, die auch in normalen Gehimzellen exprimiert werden (Lonberg et al., Mol. Cell. Biol. 8:2224-2228 (1988)) und Antigen 6C3, ein Marker für Prä-B-Zellneoplasmen, der auch auf kortikalen Epithelzellen des Thymus gefunden wird (Adkins et al., Ann. Rev. Immunol. 5:325-365 (1987)). Die Expression von 19.5-Transkripten in normalen Eierstöcken und in Eierstock-Carcinom-Zellinien ist interessant, da die SL 12.4- Zellinie hervortretende extranodale Tumoren im Eierstock bei 95 % der weiblichen Empfänger-Tiere (14) induziert. Im Gegensatz dazu bilden SL 12.3-T-Lymphomzellen diffuse Tumoren, die sich nicht im Eierstock festsetzen (MacLeod et al., J. Nat. Cancer Insc. 74:875-882 (1985)) und sie exprimieren keine 19.5-Transkripte. Ein bekanntes humanes B-Lymphom (Burkitt's) metastasiert häufig in die Eierstöcke (Harrison's Priciples of Internal Medicine, 11. Ausgabe (Ed. Braunwald et al., A. McGraw-Hill, N.Y. (1987)). Da 19.5-cDNA mit zwei verschiedenen humanen Eierstock-Carcinom-Zellinien hybridisiert, kann es eine Erkennungsstelle oder Zielfunktion für das 19.5-Genprodukt geben, das es zuläßt, daß es sich festsetzt und im Eierstock wächst. Obwohl 19.5-mRNA in Gesamt-Thymozyten oder fraktionierten doppelt negativen Thymozyten nicht gefunden wurde, ist es möglich, daß das Gen in einer seltenen Untergruppe der Thymozyten exprimiert wird oder nur vorübergehend während der fetalen oder erwachsenen Lymphopoiese exprimiert wird. In situ-Hybridisierungs-Untersuchungen werden die Arten von Zellen im Thymus, im Eierstock und im Herzen bestimmen, die mit 19.5 verwandte Transkripte exprimieren.
Tabelle 3 faßt die an allen 5 cDNA-Klonen durchgeführten Expressions-Untersuchungen zusammen (19.5 ist zum Vergleich enthalten). Tabelle 3 Expression von mRNA für neue cDNA-Klone in Mausgewebe
Die relative Expression von Transkripten, die zu den neuen cDNA-Klonen komplementär sind, wurden mit Northern-Analyse festgestellt. + bedeutet, daß die Sonde ein Transkript in dem angegebenen Gewebe nachwies. In allen Fällen wanderten Transkripte aus dem Mausgewebe mit der RNA aus der SL 12.4- Zellinie. - bedeutet eine Expression, die mindestens 10- bis 20fach geringer ist als in SL 12.4-Zellen.
Drei der fünf cDNA-Klone wiesen Transkripte im Lymphoidgewebe nach: 19.2, 19.4 und 19.5 wurden nachweisbar im Thymus exprimiert; 19.2- und 19.4-Expression wird induziert in durch ConA stimulierten Splenocyten und 19.2 und 19.5 werden exprimiert in GALT. Mehrere Nichtlymphoidgewebe enthalten Transkripte, die mit 19.2- und 19.5-cDNA-Sonden hybridisieren (Figur 4B und Tabelle 3).
Menschliche Eierstock-Carcinom-Zellinien exprimieren Sequenzen, die komplementär zu 19.5-cDNA sind. Da ein hoher Expressionsgrad des 19.5-Gens in Maus-Eierstockgewebe gezeigt wurde, wurden Eierstock-Carcinom-Zellinien auf die Gegenwart der 19.5-Sequenz getestet. Northern-Blots von 10 µg der gesamten RNA aus SL 12.4-Zellen und von zwei Eierstock-Carcinom-Zellinien wurden, wie in Figur 2 beschrieben, sondiert. Das letzte Waschen des Blots auf der linken Seite erfolgte mit 2 x SSPE bei Raumtemperatur. Der gleiche Blot, der auf der rechten Seite gezeigt ist, wurde anschließend mit 0,2 x SSPE bei Raumtemperatur gewaschen, was zu einem Verlust des Signals in den Bahnen führte, die die menschliche RNA enthielten, nicht aber aus der Bahn, die die aus der Maus stammende SL 12.4-RNA enthielt. RNA aus zwei etablierten Humanzellinien 2008 und COLO 316 wurde mit Northern-Analyse untersucht und es wurde gefunden, daß sie ein 1,7 kb Transkript enthielt, das mit der 19.5-cDNA-Sonde hybridisierte (Figur 5). Die Erkenntnis, daß Zellen, die ihren Ursprung in mesodermalem Epithel haben, das Transkript exprimieren, ist etwas unerwartet, da diese Zellen nur einen geringen Prozentsatz der Masse eines normalen Eierstocks ausmachen. Sie werden in einer eine Zelle dicken Schicht an der äußeren Oberfläche des Eierstocks gefunden. Eierstock-Drüsenzellen können das Gen auch exprimieren. Die Gegenwart von Transkripten, die mit 19.5-cDNA hybridisieren, deutet darauf hin, daß ein Gen, das mit dem, das 19.5-mRNA kodiert, verwandt ist, sich im Humangenom befindet.
Mehrere Säugetierarten exprimieren Sequenzen, die komplementär zu 19.5-cDNA sind. Um zu bestimmen, ob andere Säugetier- DNA's Sequenzen enthalten, die mit 19.5 übereinstimmen, wurde ein Southern-Blot von DNA aus Seelöwe, Hamster, Maus und Mensch sondiert. Southern-Blots von 10 µg DNA aus den angegebenen Quellen, die mit PstI verdaut worden war, wurden sondiert mit einem statistisch geprimten ³²P-markierten 19.5- cDNA-Insert. Die Blots wurden gewaschen, zuletzt mit einer Stringenz von 1 x SSPE bei Raumtemperatur. Die Bahn, die menschliche DNA enthielt, hatte ein relativ hohes Hintergrundrauschen. Punkte auf der rechten Seite der Bahn zeigen die reproduzierbar nachgewiesenen DNA-Fragmente, die mit der Maussonde kreuzhybridisieren. Alle DNA's hatten einfache Hybridisierungsinuster, was darauf hindeutet, daß das Gen unter den Säugetierarten konserviert ist (Figur 6). Wie in Figur 6 gezeigt, wurden auch komplementäre Sequenzen in Ratten-, Kaninchen-, Leinuren- und Orang-Utan-DNA nachgewiesen. Somit scheint es, daß das durch den 19.5-cDNA-Klon dargestellte Gen bei den Säugetieren konserviert ist. Die Konservierung dieses Gens deutet darauf hin, daß es eine wichtige, bis jetzt jedoch unentdeckte Funktion haben könnte.
Die Häufigkeit von Transkripten, die von den neuen cDNA-Sonden erkannt werden, wurde bis jetzt nicht direkt bestimmt. Jedoch sind bei einem Vergleich der Northern-Blots 19.2 und 19.5 relativ wenig häufig und werden in geringerer Kopienzahl exprimiert, als TCR-β-mRNAs. Die Beobachtung, daß vier der in SL 12.4-Zellen klonierten Gene nachweisbar im Thymus expriiniert werden, drei in aktivierten Splenozyten und drei in GALT-Zellen zeigt, daß Lymphommodellsysteme geeignet sind zur Isolierung von Genen, die in normalen Lymphoidgeweben gesteuert werden und vielleicht für die T-Zell-Ontogenese.
Keiner der neuen in diesem Bericht beschriebenen cDNA-Klone entspricht einer publizierten Gensequenz. Das PC-Gen- Programm, Prosite (IntelliGenetics) wurde verwendet, um die vorhergesagten Proteine, die durch die 19.2-, 19.4-, 19.5- und 20.5-cDNA wiedergegeben werden, zu untersuchen auf potentielle Nucleotid- oder DNA-Bindungsstellen, Zinkfinger, Leucin-Zipper, enzymaktive Stellen, zelluläre Zielstellen oder Merkmale von Strukturproteinen, Rezeptoren, Cytokinen und Wachstumsfaktoren. Diese Analyse identifizierte keine Stellen, die mit den oben aufgeführten in irgendeinem der vorhergesagten Proteine in Beziehung standen. Derzeit gibt es noch keinen Hinweis auf die potentielle Funktion.
Es ist möglich, daß diese Gene Produkte kodieren, die an der Differenzierung beteiligt sind, da 1) die Gene in den SL 12.3- und SL 12.4-Zellklonen verschieden exprimiert werden, die verschiedene Stufen der Thymozytenreifung darzustellen scheinen; 2) die Gene bei ihrer Expression eine Gewebespezifität zu haben scheinen; 3) die Expression des 19.2- und 19.4-Gens in durch das T-Zell-Mitogen Con-A aktivierten Milz- T-Zellen induziert wird; 4) mit 20.5 und 19.5 verwandte Gene in frühen Embryos in einer stadiumspezifischen Weise exprimiert werden.
Die Reihe neuer cDNA-Klone wird von Genen kodiert, die interessante Expressionsmuster und Regulationsmuster aufweisen. Sie werden nützlich sein zur Untersuchung des molekularen Mechanismus, der die Zelldifferenzierung, die Zielsuche der T-Lymphome und die tumorbildenden Eigenschaften von transformierten T-Zell-Stammzellen steuert. Diese cDNA-Klone sind auch geeignet als Sonden, um Zellen zu lokalisieren, die diese neuen T-Zell-Gene tragen und als Quelle für im wesentlichen reine neue T-Zell-Proteine.

Beispiel 9

Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen Lov

Ein Oligopeptid mit 14 Aminosäuren wurde synthetisiert in der Einrichtung des UCSD-Zentrums. Die Sequenz des konstruierten Gens ist K-G*-H-A-D-R-E-Q-E-S-E-E-E-V. Diese Sequenz stellt die letzten 13 Aminosäuren des vorhergesagten C-terminalen Endes von Lov dar unter Hinzufügung eines ¹&sup4;C-Glycins zur Verwendung als Indikator der Bindung an den Träger. 2 mg dieses Peptids wurden mit 4 mg des als Trägerprotein verwendeten Keyhole-Limpet-Hemocyanins (KLH) durch langsame Zugabe von Glutaraldehyd über einen Zeitraum von 30 Minuten verbunden. Es wurde dann gegen PBS über Nacht dialysiert. 10 ml Serum wurden zwei weiblichen weißen Neuseeland-Kaninchen (Holbarts - Alter 6 Monate) vor der Immunisierung abgenommen. Den Tieren wurde dann das konjugierte Peptid in Gegenwart von Freund's komplettem Adjuvans injiziert. 0,2 ml Gesamtpeptid wurden subcutan an 5 Stellen dem Tier injiziert. Eine anschließende Boosterimpfung mit 0,2 mg Peptid in Freund's inkomplettem Adjuvans wurde vier Wochen später gegeben. Wöchentlich abgenommenes Blutserum wurde auf die Erzeugung von Anti-Lov-Antikörpern mit ELISA untersucht.

Beispiel 10

Analyse der Lov-Antiseren

Die Gegenwart von Antikörpern, die Lov erkennen, wurde mit dem ELISA-Test überwacht. Das Oligopeptid und KLH wurden direkt auf den ELISA-Platten in Näpfen getrocknet. Verschiedene Verdünnungen der Antiseren wurden dann zugegeben und zwei Stunden lang reagieren gelassen. Nach Waschen in Blotto wurden die Proben mit einer 1:1000-Verdünnung des zweiten Antikörpers (Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Fc) verbunden mit Meerrettich-Peroxidase) zwei Stunden lang inkubiert. Die Meerrettich-Peroxidase katalysiert eine colorimetrische Reaktion unter Verwendung von H&sub2;O&sub2; und OPD als Substrat. Die Ergebnisse wurden an einem automatisierten ELISA-Lesegerät analysiert. Als der Antikörper-Titer ein Plateau erreichte, wurden die Kaninchen entblutet (ungefähr 9 Wochen nach der ersten Injektion). In ELISA-Tests unter Verwendung zellulärer Komponenten wurden die Zellen durch Beschallung lysiert. Die Membranfraktion wurde von dem Zytoplasma isoliert, indem das Lysat 30 Minuten lang mit 45.000 g zentrifugiert wurde.
Sowohl die Membran, als auch die Cytosolfraktionen wurden dann auf den ELISA-Näpfen über Nacht getrocknet.

Beispiel 11

Analyse mit fluoreszierendem Antikörper

10&sup6; co-kultivierte oder unbehandelte SL 12.4-Zellen wurden in 25 µl Puffer A (PBS, der 5 % fetales Rinderserum und 0,02 % Natriumazid enthielt) suspendiert. 50 µl einer 1: 100-Verdünnung der Antiseren gegen Lov wurde dann zugegeben und 30 Minuten lang auf Eis inkubieren gelassen. Nach drei Waschungen mit Puffer A wurden die Zellen 30 Minuten lang mit Ziege- Anti-Kaninchen-IgG (verdünnt 1:1000) auf Eis inkubiert. In Versuchen, in denen die Spezifität der Wechselwirkung getestet wurde, wurde ein gleiches Volumen einer Oligopeptidlösung mit 1 mg/ml zu den Antiseren 30 Minuten vor der Zugabe zu den Zellen zugegeben. Die Zellen wurden mit einem fluoreszenzaktivierten Cytofluorograph 50H-Zellzähler, der mit einem Laser, der eine Emission bei 488 nm hatte, betrieben wurde, analysiert. Tote Zellen wurden ausgesondert aufgrund der Färbung mit Propidiumiodid. 5.000 Zellen wurden analysiert, um die entsprechenden Histogramme zu erzeugen.

Beispiel 12

Immunologische Ausfällung des Proteins

Die Untersuchungen der immunologischen Ausfällung wurden durchgeführt unter Verwendung des von Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1988), beschriebenen Verfahrens. Die Zellen wurden 4 Stunden lang mit ³&sup5;S-Methionin in methioninfreiem Medium pulsmarkiert. Die Zellen wurden dann entweder in RIPA- oder NP40- Lysepuffer lysiert. Die Lysate wurden vorgeklärt durch Zugabe von 50 µl Präimmunseren, eine Stunde auf Eis inkubiert und kreuzreaktive Proteine immunologisch ausgefällt unter Verwendung von Staphylococcus aureus (Calbiochem). Als nächstes wurden 5 µl Immunseren zugegeben, eine Stunde lang inkubiert und immunologisch ausgefällt. Das Material wurde dann gewaschen und auf einem SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Nach einer Verstärkung wurde das Gel einem Film für die autoradiographische Analyse ausgesetzt mit dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannten Methoden.

Beispiel 13

Gen-Kartierung von Lov

Die Erzeugung und Charakterisierung von somatischen Zellhybriden Chinesischer Hamstern X Maus wurde bereits beschrieben (Kozak (1983) J. Virol. 48:300-303). DNA wurde aus diesen Hybridzellen isoliert und vollständig mit PstI verdaut, einem Enzym, das ein einzigartiges Muster für jede Art ergab, wenn Maus- oder Hamster-DNA-Verdaus mit einem 10 kb 19.5-cDNA- Insert sondiert wurden. Die verdaute DNA wurde auf 0,8 % Agarosegelen 72 Stunden lang bei 25 V elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nytranmembranen überführt. Die entstehenden Blots wurden dann mit ³²P-inarkierter Lov-cDNA sondiert und Kodak XAR-Film ausgesetzt. Es wurde beobachtet, daß Anteile von Maus-Chromosomen mit Lov hybridisierten in verschiedenen Zellinien und die Ergebnisse wurden mit dem Computer analysiert, um den besten Kandidaten für eine Lokalisierung des Lov auf Maus-Chromosomen zu bestimmen.

Beispiel 14

Lov-Expression wird induziert in SL 12.4-Zellen nach einer Co-Kultivierung auf Thymusepithel-Einfachschichten

TEL (Glimcher et al., Scand J. Immunol. 17:1-11 (1983)) und TEPI (Beardsley und Hays, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6005- 6009 (1983)) sind zwei immortalisierte Thymus-Epithel-Zellinien, die eine stabile Expression von CD4- und CD8-Gen in SL 12.4-Zellen induzieren können. Nachdem SL 12.4-Zellen entweder auf TEL- oder TEPI-Einfachschichten drei Tage lang co-kultiviert worden waren, wurden die mRNA-Gehalte von Lov bestimmt. Der Northern-Blot in Figur 7 zeigt, daß beide Transkripte (1,7, 1,5 kb) von Lov als Antwort auf die Co-Kultivierung induziert werden. Beide Thymusepithel-Zellinien können diese Induktion hervorrufen, obwohl die Expression von Lov nach der TEL-Co-Kultivierung um eine Größenordnung höher ist, verglichen mit TEPI (Tabelle 4). Die angegebenen Werte zeigen den Mittelwert und den Standardfehler von fünf einzelnen Versuchen nach einer densitometrischen Analyse. Außerdem blieb der erhöhte Gehalt von Lov-mRNA in SL 12.4-Zellen auch noch nach der Entfernung der stimulierenden Thymus-Einfachschichten bestehen. Anhaftende Nicht-Thymus-Zellen (MME: eine Maus-Brustdrüsenepithellinie und AKR1-2B: eine fibroblastische Linie) hatten keine induzierende Wirkung auf die Lov-Expression in SL 12.4-Zellen. Fragmente mit 100 bp entsprechend der 5'- und 3'-Region der Lov-cDNA wurden verwendet, um Northern-Blots zu sondieren. Beide Sonden erkannten beide Transkripte von Lov. Tabelle 4 Vergleich der Genexpression nach TEL- und TEPI-Co-Kultivierung
Autoradiogramme, die aus Northern-Blots stammten, hybridisierten aufeinanderfolgend mit CD4, CD8, TCR-α, 19,5 (lov) und schließlich mit Actin/CHO-A und wurden mit Laser-Densitometrie gescannt. Die densitometrischen Signale wurden normalisiert unter Verwendung von Actin/CHO-A als Kontrolle für die Menge an aufgegebener RNA. Die angegebenen Werte zeigen das Verhältnis der Hybridisierungs-Intensität der induzierten mRNA dividiert durch nicht induzierte mRNA. Somit zeigen sie den mittleren xfachen Anstieg ± den Standardfehler des Mittelwertes für die mRNA-Akkumulierung gegenüber dem für nicht behandelte SL 12.4-Zellen nachgewiesenen Wert.
Die Co-Kultivierung dieser Zellen auf den Thymus-Epithel-Einfachschichten scheint die Reifung der SL 12.4-Zellen zu verursachen. In dieser Veröffentlichung wurde gezeigt, daß ein neues Gen, Lov, auch in SL 12.4-Zellen nach dieser Behandlung induziert zu werden scheint. Die Sequenz von Lov deutet darauf hin, daß das vorhergesagte Protein, das kodiert wird, ein Oberflächenmolekül ist, das mehrfach die Membran durchdringende Domänen enthält. Sowohl der Anstieg der Message(drei- bis vierfache Induktionen) als auch der Oberflächen- Expression von Lov wurden nach einer Co-Kultur auf Thymusepithel beobachtet. Diese Induktionen der Lov-Expression scheinen auch stabil zu sein, da Klone, die nach der Co- Kultur isoliert wurden, die hohe Lov-Expression beibehielten, sogar nach monatelanger Zellkultur. Wegen der relativ geringen Induktion können nudeare Durchlaufversuche, um zu bestimmen, ob die Induktion durch Transkriptions- oder Posttranskriptionsmechanismen erklärt werden kann, nicht durchgeführt werden.
Die Lov-mRNA besteht aus zwei Transkriptgrößen, 1,7 kb und 1,5 kb. Beide Transkripte werden in gleicher Weise bei Co- Kultivierung von SL 12.4-Zellen auf Thymusepithel-Einfachschichten induziert. Außerdem werden beide Transkripte durch 5'- und 3'-Sonden aus der Lov-cDNA erkannt. Es ist unbekannt, ob diese Transkripte durch andere Startstellen, Spaltung, Polyadenylierungssignale oder vielleicht irgendwelche anderen Mechanismen entstehen. Jedoch wird nur das größere Transkript in anderen ausgewachsenen getesteten Geweben, die Lov exprimieren (d.h. Eierstock, Herz) beobachtet. Außerdem scheint es innerhalb eines sich entwickelnden Maus-Embryos eine Verschiebung der Expression beider Transkripte hin zur Expression nur des größeren Transkripts am Tag 15 zu geben (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, daß nur das 1,7 kb Transkript das funktionelle Protein im ausgewachsenen Tier kodiert.

Beispiel 15

Lov-Protein ist nachweisbar auf SL 12.4-Zell-Membranen

Antikörper gegen Lov erkennen Epitope, die auf der Plasma- Membran von SL 12.4-Zellen gefunden werden. Polyklonale Antikörper gegen die letzten 13 Aminosäuren von Lov wurden in Kaninchen gezüchtet unter Verwendung des synthetischen Peptids als Antigen. Diese Antikörper erkennen ein Antigen, das mit der Plasmamembran von SL 12.4-Zellen assoziiert ist. Figur 8 zeigt eine Analyse mit fluoreszierendem Antikörper von SL 12.4-Zellen auf Oberflächen-Expression von Lov. Die Histogramme zeigen die Fluoreszenz von SL 12.4-Zellen, die mit Immunseren gefärbt wurden, aufgetragen gegen SL 12.4- Zellen, die mit Präimmunseren gefärbt wurden. Wenn man permeabilisierte Zellen unter einem Mikroskop betrachtete, wurde die Bindung des Antikörpers nur an der Plasmamembran beobachtet und das Cytoplasma war nicht gefärbt. Es werden auch die Fluoreszenzdaten eines Schwester-Lymphom-Zellklons, SL 12.3, gezeigt. SL 12.3-Zellen exprimierten mRNA für Lov nicht und zeigten keine Lov-Expression an ihrer Zelloberfläche. Die Bindung der Immunserum-Antikörper an das Antigen wurde auch spezifisch blockiert bei Zugabe von konkurrierenden Mengen des immunisierenden Oligopeptids (Figur 9), aber nicht durch ein irrelevantes Oligopeptid. Membran-Präparate, nicht aber Cytosol-Fraktionen, von SL 12.4-Zellen zeigten auch Lov- Protein, wenn sie mit ELISA getestet wurden.
Der gegen ein synthetisches Oligopeptid, das dem carboxyterininalen Ende von Lov entsprach, gezüchtete Antikörper erkannte ein Epitop, das auf der Oberfläche von SL 12.4-Zellen gefunden wird, spezifisch. Eine verwandte Zellinie, SL 12.3, die Lov-mRNA nicht exprimiert, exprimiert auch nicht das Protein, was durch Fluoreszenz nachgewiesen wird. Untersuchungen mit einer immunologischen Ausfällung des Lov-Proteins wurden durchgeführt, aber es scheint eine ungewöhnliche Menge an nicht spezifischen Wechselwirkungen mit den Präimmunseren zu geben. Die Tatsache, daß das Lov-Protein wahrscheinlich nicht häufig ist (aufgrund der Basislinien-Expression von mRNA in diesen Zellen), kompliziert diese Versuche weiter. Nichtsdestotrotz scheinen drei spezifische Banden bei einer Markierung mit ³&sup5;S-Methion in SL 12.4 und F6 (einem Zellklon, der Lov stark exprimiert) vorhanden zu sein, in SL 12.3- Zellen jedoch nicht vorhanden zu sein. Diese drei Banden verschwinden auch nach der konkurrierenden Zugabe des spezifischen Oligopeptids. Die 32 Kd Bande korreliert mit dem vorhergesagten Molekulargewicht des Lov-Gerüstes. Die 22 Kd Bande kann ein Spaltprodukt sein, wohingegen die 50 Kd Bande die glycosylierte Form von Lov darstellen kann.

Beispiel 16

Induktion der Oberflächen-Expression von Lov

Ein Anteil an Oberflächen-Expression von Lov wurde auch induziert bei einer dreitägigen Co-Kultivierung auf der Thymusepithel-Einfachschicht. Eine FACS-Analyse wurde durchgeführt an SL 12.4-Zellen nach einer dreitägigen Co-Kultivierung auf Thymusepithel-Einfachschichten. Figur 10 zeigt, daß die Menge an Lov-Protein, die auf der Oberfläche von SL 12.4- Zellen nachweisbar ist, nach einer Thymus-Epithel-Behandlung induzierbar war. Die Histogramme zeigen Antiseren, die gegen Vorproben in stimulierten und unstimulierten SL 12.4-Zellen aufgetragen wurden. Es ist auch das Ergebnis gezeigt, wenn co-kultivierte SL 12.4-Zellen auf TEL mit unbehandelten SL 12.4-Zellen verglichen wurden (untere Kurve). Diese Kurven wurden aufgetragen unter Verwendung einer logarithmischen Skala. TEPI-Zellen riefen eine ähnliche Reaktion auf die Lov- Induktion hervor.
Zellklone, die vorher auf Thymus-Epithel-Einfachschichten cokultiviert worden waren, zeigten eine höhere Grundexpression von 19.5. Die Co-Kultivierung führte zu einem höheren Ausmaß der Lov-Expression in bestimmten Zellen. Eine Anzahl von Zellklonen wurden isoliert aus SL 12.4 nach Co-Kultivierung entweder auf TEL oder TEPI. Das Klonieren wurde durchgeführt durch begrenzte Verdünnung. Zum Beispiel sind F6 Zellen, die von einer SL 12.4-Zellpopulation stammen und daraus kloniert wurden, nachdem diese drei Tage lang auf einer TEL-Einfachschicht co-kultiviert worden ist. Diese Zellklone wurden in normalen Medien mehrere Monate lang gezüchtet ohne das stimulierende Thymusepithel. Sowohl die Northern-Analyse von RNA als auch die FACS-Analyse des Oberflächenproteins auf F6 zeigen, daß dieser Zellklon ein stabil höheres Ausmaß an Lov- Expression hat, als die Eltern-SL 12.4-Zellen (Figur 11). Andere Zellklone, die isoliert und getestet wurden, zeigen ein variierendes Ausmaß der Lov-Expression. Weiterhin führt die Co-Kultivierung dieser Zellklone auf Thymus-Epithel-Einfachschichten nicht zu einem zusätzlichen signifikanten Anstieg der Lov-Expression.

Beispiel 17

Lokalisierung auf den Chromosomen

Genomische DNA wurde hergestellt aus somatischen Hamster- Maus-Hybridzellen, die ein Komplement eines spezifischen Satzes von Maus-Chromosomen enthielten. Ein Restriktionsenzymverdau mit PstI ergab ein unterschiedliches Restriktionsmuster bei Hamster und Maus (Figur 12, Bahnen 1, 2). Southern-Blots der DNA dieser Hybridzellen, die mit Lov sondiert wurden, zeigten, daß nur wenige Hybride das Mausmuster der Hybridisierung enthielten (Figur 12). Auf Basis der Southern-Analyse an einer Anzahl dieser Hybrid-Zellinien besteht die beste Korrelation mit Maus-Chromosom 16. Probe Nr. 77 ist eine Hybridzelle, deren einziger Maus-Bestandteil Chromosom 16 ist. Tabelle 5 zeigt die Computer-Analyse, die darstellt, daß Chromosom 16 die geringste Abweichung für Lov bei den getesteten Hybridzellen hat. Das Lov-Gen wurde weiter einem spezifischen Bereich von Chromosom 16 zugeordnet. Tabelle 5 Analyse der Übereinstimmung zwischen spezifischen Maus- Chromosomen und der Gegenwart des Lov-Gens bei einer Reihe von somatischen Maus-Hamster-Zellhybriden
Die Kartierung des 19.5-(Lov)-Gens unter Verwendung von somatischen Maus-Hamster-Zellhybriden. Die Symbole zeigen die Gegenwart (+/) oder Abwesenheit (-/) des Maus-Lov-Restriktionsfragmentes bezogen auf die Gegenwart (/+) oder Abwesenheit (/-) des jeweiligen Maus-Chromosoms, das durch die Zahl in der letzten Spalte gezeigt wird, das durch Hybridisierung mit der 20.5-cDNA-Sonde nachgewiesen wurde. Die Anzahl von nicht übereinstimmenden Beobachtungen ist die Summe der + /-und -/+-Beobachtungen.
* Keiner dieser Hybride wurde karyotypisiert. Sie wurden auf andere Marker überprüft, so daß es möglich ist, daß die Ausnahmen unrichtige Zuordnungen zu den Chromosomen sind.

Beispiel 18

Immunologische Ausfällung von Lov-Protein

Um die Größe des Lov-Proteins zu bestimmen, wurden Untersuchungen mit immunologischer Ausfällung durchgeführt. Sowohl ³&sup5;S, um neu synthetisiertes Gesamtprotein zu markieren, als auch ¹²&sup5;I, um Oberflächenproteine zu markieren, wurden verwendet. Die Präimmunseren aus beiden Kaninchen hatten ähnliche unspezifische Banden. Obwohl viele unspezifische Banden in den Lysaten vorhanden waren, wurden wenige spezifische Banden identifiziert. Zwei Banden, die einem Molekulargewicht von 22 bzw. 32 kd entsprachen, schienen spezifisch für SL 12.4-Zellen, die mit ³&sup5;S-Methionin markiert waren, zu sein. Keine Bande war in den Präimmunseren vorhanden, noch in Lysaten, die aus SL 12.3-Zellen hergestellt wurden. Die zwei Banden wurden jedoch nicht bei mit ¹²&sup5;I-markierten Zellen gefunden, statt dessen wurde eine 50 kd Bande bei SL 12.4 gefunden, nicht jedoch bei SL 12.3-Zellen. Es wurden Versuche gemacht, um die Menge an Hintergrundbanden zu verringern (d.h. Ammoniumsulfat-Ausfällung der IgG-Fraktion, Affinitätsreinigung des Antikörpers über eine Sepharosesäule, an die das synthetische Oligopeptid gebunden war, unter Verwendung des Klons F6 als einem Klon mit starker Expression von Lov), waren aber nicht erfolgreich für eine Verringerung der beobachteten unspezifischen Wechselwirkungen.
Somit kodiert das Lov-Gen ein Protein, das an der Zelloberfläche expriiniert wird. Außerdem scheinen die Gehalte an Lov mit dem Reifungszustand dieser T-Lymphomzelllinien zu korrelieren. SL 12.4-Zellen werden nicht nur zu einem doppelt positiven CD4+CD8+-Phänotyp nach einer Co-Kultivierung mit Thymusepithel verschoben, sondern es gibt auch einen Anstieg der Lov-Expression in diesen Zellen. Lov ist eine neue cDNA und ein neues Protein mit keiner signifikanten Homologie mit irgendeiner anderen bekannten Sequenz. Viele andere T-Zell- Marker, wie Thy-1 und T-200 wurden beschrieben, bevor ihre Funktion bestimmt wurde. Obwohl Lov aus einer T-Lymphom- Zellinie isoliert wurde, können andere Zellarten dieses Gen exprimieren. Das Expressionsmuster von Lov deutet auf eine mögliche Funktion. Die Gewebe, die die höchsten Anteile an Lov-mRNA exprimieren, sind der Thymus, darmassozuertes Lymphoidgewebe (GALT) und die Eierstöcke. Die ersten zwei Orte sind normale Stellen, wo Lymphozyten gefunden werden. Es ist interessant festzustellen, daß die Eierstöcke die ersten Stellen einer Tumorbildung sind, wenn SL 12.4-Zellen in syngene Mäuse injiziert werden. Außerdem enthalten die Eierstöcke in intensives lymphatisches System. GALT-Zellen, die auch Peyer Plaques genannt werden, werden von stark endothelialen Gefäßen gebunden und es wurde gezeigt, daß das Antigen Mel-14 erforderlich ist, damit sie hindurchgehen können. SL 12.4-Zellen exprimieren Mel-14 auf ihrer Zelloberfläche und sind daher ein Kandidat für ein Festsetzen in diesen spezialisierten Bereichen des Dünndarms. Da Lov an der Oberfläche von Zellen expriiniert wird, kann es eine Rolle bei den Zielsuche-Eigenschaften der Lymphozyten spielen. Lov wurde nicht nachgewiesen in vollständigen Populationen von Lymphozyten und Thymozyten. Vielleicht wird es nur in einer bestimmten in der Minderheit vorhandenen Untergruppe von T- Zellen exprimiert und ist kein vorherrschendes Merkmal. SL 12.4-Zellen können einen numerisch nicht häufigen normalen Thymozyten darstellen.

Beispiel 19

Konstruktion einer cDNA-Bibliothek und Screenen des 20.5-Gens

Wie bei anderen Klonen wurde die Konstruktion einer cDNA- Bibliothek und das Screenen nach dem 20.5-Gen durchgeführt, wie in den Beispielen 1 bis 4. Das cDNA-Insert wurde aus Lambda-DNA durch Verdau mit den Restriktionsenzymen HindIII und BglII entfernt und in den Plasmidvektor PT7/T3 (Bethesda Research Laboratories) subkloniert.

Beispiel 20

DNA-Sequenz-Analyse von 20.5 oder Tea

Eine Restriktions-Endonucleasekarte wurde erstellt und Fragmente wurden in PT7T3 subkloniert, das Plasmid auf Cäsiumchlorid gereinigt und direkt sequenziert durch doppelsträngige Didesoxysequenzierungsinethoden unter Verwendung von Sequenase-Reagenzien (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Ein Teil dieser Sequenz wurde bestimmt unter Verwendung von Primern für das Wirtsplasmid und andere spezifische Oligonucleotidprimer (17 mer) wurden hergestellt für die cDNA in der molekularbiologischen Fakultät des UCSD-Krebszentrums. Beide DNA-Stränge wurden in ihrer Gesamtheit sequenziert und alle Sequenzen wurden in mindestens zwei Reaktionen, die doppelt durchgeführt wurden, bestimmt. Mikrogenie-Computer- Programme wurden verwendet, um die überlappende Sequenz-Information zusammenzusetzen und die anfängliche Analyse der DNA-Sequenz durchzuführen.

Beispiel 21

Gen-Kartierung von 20.5

Die Herstellung und Erzeugung von somatischen Chinesischer Hamster X Maus-Zelihybriden aus wurde früher bei Hoggan et al. in J. Virol. 62:1055-1056 (1988) beschrieben. Mäuse des NFS/N-Stammes wurden erhalten von der Division of Natural Resources, NIH, Bethesda, Maryland. Mus musculus musculus- Mäuse wurden erhalten aus einer Laborkolonie, die von Mäusen stammte, die ursprünglich in Skive, Dänemark gefangen worden waren und von Dr. M. Potter gehalten wurden (NCI, NIH, Vertrag Nr. NO1-C82-5584) in den Hazelton-Laboratorien, Rockville, Maryland. Weibliche Hybride NFS/N x X. m. musculus wurden rückgekreuzt mit männlichen M. m. musculus, um die Versuchstiere zu erzeugen. Die DNA wurde aus der Mausleber extrahiert, mit SacI und BamHI verdaut, in 0,4 % Agarosegelen 48 Stunden lang bei 24 V elektrophoretisch aufgetrennt und auf Nylonmembranen überführt (Hybond N+, Amersham). Die Membranen wurden mit der [³²P]-markierten 20.5-cDNA und einer 438 bp Sonde hybridisiert, die das DNA-Polymerase-B-Gen darstellt, das auf Chromosom 8 vorhanden ist (MacBride et al., in Druck). Membranen wurden gewaschen und sondiert, wie vorher beschrieben. Nierenproben aus den gleichen Mäusen wurden auf die Vererbung der Markierungen Gr-1 und Es-1 durch histochemische Anfärbung nach einer Elektrophorese auf Stärkegelen untersucht (Harris und Hopkinson "Handbook of Enzyme Electrophoresis in Human Genetics", North Holland Publishing Co., Amsterdam (1976)).

Beispiel 22

Isolierung und DNA-Sequenz des 20.5-cDNA-Klons

40.000 Mitglieder der SL 12.4-cDNA-Bibliothek in ggt10 (16,24) wurden mit einer SL 12.4-cDNA-Sonde, subtrahiert gegen SL 12.3-mRNA, und gleichzeitig auf Duplikatfilter mit der gesamten SL 12.3-cDNA gescreent, wie oben beschrieben.
Dieses Screeningverfahren wurde verwendet, um das 20.5-Gen zu charakterisieren. Bezogen auf die Expressionseigenschaften, die unten beschrieben werden, wurde der cDNA-Klon als Tea bezeichnet (T-Cell early activation gene - frühes T-Zell-Aktivierungsgen). Das Insert aus diesem Klon wurde mit Doppelstrangmethoden an beiden Strängen sequenziert und die Sequenz ist in Figur 13 gezeigt. Das cDNA-Insert ist 2397 Basenpaare lang und enthält einen einzigen offenen Leserahmen, der bei Basenpaar 409 beginnt und sich bis 1769 erstreckt. Die cDNA enthält weder eine Polyadenylierungs-Signalsequenz noch einen Poly-A-Schwanz. Die 20.5-cDNA-Sequenz deutet auf ein mehrfach die Membran durchdringendes Protein hin. Figur 13 zeigt die vorhergesagte 453 Aminosäuresequenz des vorhergesagten Proteins, das ein Molekulargewicht von 49,57 Kilodalton hat (unmodifiziert). Die cDNA-Sequenz scheint die gesamte kodierende Region zu enthalten, da das vorhergesagte N-terminale Methionin-Codon von einer Kozak-Consensussequenz umgeben ist (GXC AUG G, worin X A, U, G oder C sein kann), die eine optimale Translations-Startstelle ist und die vorhergesagten 5'- und 3'-untranslatierten Regionen mehrfache Stopcodons in allen drei Leserahmen enthalten. Die physikalischen Eigenschaften des vorhergesagten Proteins wurden analysiert unter Verwendung von Mikrogenie- und PC-Gene-Programmen. Drei potentielle N-Glycosylierungsstellen werden in Figur 13 durch Sterne angegeben. Das vorhergesagte Protein hat 9 äußerst hydrophobe Bereiche (in Figur 13 unterstrichen); 7 davon haben Eigenschaften von Transmembran durchdringenden Domänen aufgrund einer Analyse unter Verwendung der IntelliGenetics Software Programme SOAP, HELIXMEN, NOVOTNY und RAOARGOS.
Das Tea-Gen wird in T-Lymphomzellen als in aktivierten T- Lymphoidzellen aus normaler Milz exprimiert. Die Expression von Transkripten, die von dem 20.5-cDNA-Klon erkannt wurden, wurde untersucht. Figur 14 zeigt die Tea-Gen-Expression. Das gereinigte Insert, das die gesamte kodierende Region enthält, wurde mit ³²p marktert durch Random Priming und verwendet, um Northern-Blots zu sondieren, bei denen jede Bahn 10 µg der gesamten Zell-RNA enthielt (oder im Fall von Platte B, cytoplasmatische und Kern-RNA) aus SL 12.4-Zellen, SL 12.3- Zellen, den angegebenen Zellinien oder Geweben aus normalen Balb/c-Mäusen. Autoradiogramme der Northern-Blots sind auf den Tafeln A bis D gezeigt. Tafel A zeigt einen Vergleich der Tea-mRNA-Expression in SL 12.3- und SL 12.4-Zellinien. Tafel B zeigt die Tea-mRNA-Expression in der gesamten zellulären, cytoplasmatischen und nudearen RNA von SL 12.4-Zellen. Tafel C zeigt die Tea-mRNA-Expression in einer Reihe von Maus- Zellinien, die im Text beschrieben wurden und Tafel D enthält RNA der angegebenen normalen Gewebe aus Balb/c-Mäusen (GALT ist darmassozuertes Lymphoidgewebe). Die Größe der Transkripte in Kilobasen (kb) ist auf jeder Tafel angegeben und wurde abgeschätzt durch die relative Wanderung gegen BRL- Marker und endogene ribosomale 18- und 28S-RNA. Eine gleiche Beladung und ein gleicher Transfer in allen Bahnen wurde bestimmt durch Anfärbung mit Acridinorange, durch Hybridisierung mit ³²P-Cyclophyllin (Cyc) und/oder mit ³²P-Cho-A-markierter cDNA.
Die 20.5-cDNA-Sonde erkannte zwei Transkripte mit ungefähr 4 kb und 7 kb, die in SL 12.4-Zellen, nicht aber in SL 12.3- T-Lymphomzellen vorhanden sind (Figur 14A). Die subzelluläre Anordnung der zwel Transkripte wurde untersucht, um zu bestimmen, ob beide reife Transkripte waren, die in Cytoplasma gefunden werden oder ob die größere RNA ein Kernvorläufer war. Beide Transkripte scheinen vollständig prozessierte RNA zu sein, da sie im Cytoplasma gefunden werden (Figur 14B). Der Ursprung der beiden Transkripte ist bis jetzt nicht bekannt; sie könnten aus einer unterschiedlichen Inituerung der Transkription, einem unterschiedlichen Spleißen des Transkripts oder der Verwendung verschiedener Polyadenylierungssignale stammen. Beide reifen cytoplasmatischen Transkripte (7 und 4 kb) sind größer als der cDNA-Klon (2,4 kb). Somit hat die cDNA nicht die volle Länge, obwohl sie die gesamte kodierende Region zu enthalten scheint. Beide Transkripte wurden mit Sonden nachgewiesen, die für einen 5'- (Nucleotid 1 bis 380) und einen 3'- (Nucleotid 2005 bis 2394)-Bereich des cDNA-Klons hergestellt wurden, was darauf hindeutet, daß die cDNA kein Klonierungsartefact ist, das zwei verschiedene Transkripte verband. Zusätzlich zu den zwei reifen RNAs gibt es verschiedene größere, viel weniger häufige Transkripte, die in den Kern- und Gesamtzell-RNA-Präparaten vorhanden sind, die ungespleißte oder teilweise gespleißte Kernvorläufer sein können (Figur 14B).
Verschiedene Maus-Zellinien aus Embryo (F9 und PCC4), Brustdrüsenepithel (MME) und Neuronen (ATt20) wurden untersucht auf die Expression von Tea-RNA. Keine dieser Zellinien expriinierte nachweisbar Tea-RNA. Im Gegensatz dazu enthalten Zellinien aus Thymusepithel (TEPI) und Fibroblasten (3T3, MEF) Tea-mRNA, obwohl es in SL 12.4-T-Lymphomzellen viel häufiger ist (Figur 14C).
Um zu bestimmen, ob normale Gewebe und Zellen lymphoider Abstammung das Tea-Gen exprimieren, wurden Northern-Blots, die aus Mausgewebe-mRNA hergestellt worden waren, untersucht. Zellen aus Thymus, ruhende Milzzellen, darmassozuertes Lymphoidgewebe (GALT) und Knochenmark haben keine nachweisbare Expression von Tea-mRNA (Figur 14D). Jedoch wurden Tea- Transkripte in normalen Milzzellen, die mit dem T-Zell-Mitogen Concanavalin A (ConA, Figur 14D) aktiviert waren, induziert. ConA wurde verwendet, um die Aktivierung von Milz-T- Zellen nachzuahmen, die normalerweise in einem Zellklon spezifisch nach geeigneter Präsentation eines fremden Antigens auftritt. Leber war das einzige Nichtlymphoidgewebe, das getestet wurde, das mäßige Mengen an Tea-mRNA exprimierte. Tea-Transkripte waren in Eingeweide, Magen, Eierstock (Figur 14D), Gehirn, Herz, Lunge, Niere, Pankreas oder Hoden nicht nachweisbar. Somit ist die Tea-Gen-Expression auf wenige Zellarten begrenzt, wie aktivierte Milzzellen, Thymus-Epithelzellen, T-Lymphomzellen und Leber.

Beispiel 23

Induktion von Tea-mRNA

Um die Induktion von Tea-mRNA weiter zu untersuchen, wurde RNA hergestellt 6, 24, 48 und 72 Stunden nachdem ConA zu Splenozyten zugegeben worden war. Figur 15 zeigt die Kinetik der Tea-Geninduktion bei aktivierten Splenozyten. Eine Northern-Analyse der RNA aus ruhenden und aktivierten Milzzellen, die zu den angegeben Zeiten nach der Aktivierung mit dein T-Zellmitogen ConA geerntet worden waren, wurde durchgeführt. Figur 15, Tafel A zeigt den Zeitpunkt nach 72 Stunden. Tafel B zeigt einen anderen Blot von RNA zusammen mit der Kontrolisonde Cyclophyllin (Cyc), um die relative Menge an mRNA, die auf jede Bahn gegeben wurde, zu zeigen. Anders als Cyc-mRNA war die rRNA-Beladung in jeder Bahn gleich, was durch Anfärbung mit Acridinorange gezeigt wurde. Die Tea- Transkripte waren nicht nachweisbar in ruhenden Milz-Lymphozyten, wurden aber innerhalb von 6 Stunden nachweisbar und hatten einen Spitzenwert bei etwa 48 Stunden. Obwohl die Gesamtmenge an RNA in jeder Bahn äquivalent war (10 µg), was durch Anfärbung mit Acridinorange gezeigt wurde, scheint sich das relative Verhältnis von ribosomaler RNA zu mRNA während der T-Zell-Aktivierung zu verändern, da die Menge an Actin, CHO-A und Cyclophphyllin-Transkripten/10 µg Gesamt-RNA ansteigt (Figur 15). Jedoch gibt es klar eine Induktion der Tea-Gen-Expression bezogen auf diese Kontroll-RNAs während der T-Zell-Aktivierung.

Beispiel 24

Homologie der 20.5-DNA und Aminosäuresequenz mit dem ökotropen retroviralen Rezeptor der Maus

Homologie-Untersuchungen unter Verwendung der Bionet-Datenbank zeigten keine signifikante Sequenzähnlichkeit zwischen 20.5-cDNA und anderen DNA-Sequenzen, von denen bisher berichtet wurde. Jedoch wurde die Sequenz mit einem kürzlich erschienenen Bericht über den ökotropen retroviralen Rezeptor-cDNA-Klon der Maus (ERR) (Albritton et al., Cell 57, 659- 666 (1989)) verglichen und eine starke Sequenzidentität gefunden. Das Gen, das den ökotropen retroviralen Rezeptor kodiert, wurde mit Rec-1 bezeichnet. Figur 16 zeigt einen Vergleich der 20.5-cDNA-Sequenz mit der ERR-cDNA-Sequenz. Figur 16 zeigt die Übereinstimmung der 20.5- und ERR-cDNA- Sequenzen. In Figur 16, Tafel A, sind die Bereiche der ERR- und 20.5-cDNA-Sequenzen, die in der Übereinstimmungsanalyse enthalten sind, durch vertikale Linien angezeigt. Die offenen Leserahmen für jede cDNA sind angegeben. In Tafel B ist die gesamte cDNA-Sequeiiz von 20.5 auf der oberen Zeile von jedem Zeilenpaar gezeigt, der cDNA-Sequenz von ERR (bp 400 bis 2425) fehlen die ersten 400 Basenpaare und sie ist in der unteren Zeile jedes Zeilenpaars gezeigt. Die horizontalen Linien markieren die Positionen der Sequenzidentität. Der Vergleich wurde gemacht unter Verwendung von Microgenie-Software, wobei Abstände erzeugt wurden, um die ähnlichsten Sequenzen in Übereinstimmung zu bringen. Der Prozentanteil der Identität ist nur für die Bereiche der cDNA angegeben, die sich eindeutig überlappen. Es ist anzumerken, daß die 20.5-cDNA am 3'-Ende viel länger ist und die ERR-cDNA am 5'- Ende viel länger ist.
Das Schema der zwei cDNAs (Figur 16) zeigt, daß die ERR-cDNA am 5'-Ende länger ist, während die 20.5-cDNA-Sequenz am 3'-Ende viel länger ist; die zwei cDNAs haben ungefähr die gleiche Gesamtlänge. Die kodierende Region jeder cDNA wird durch den schraffierten Bereich jedes cDNA-Klons angezeigt. Die DNA-Übereinstimmung zeigt eine Gesamt-DNA-Sequenz-Identität zwischen den überlappenden Bereichen von 20.5-cDNA (bp 1 bis 2047) und ERR-cDNA (bp 400 bis 2425) von 59 %; eine Region von 20.5-cDNA (bp 1011 bis 1088) ist zu 80 % identisch. Die 5'-nicht kodierende Region der 20.5-cDNA-Sequenz (bp 1 bis 410) hat eine Sequenzidentität von 68 % mit der überlappenden 5'-kodierenden Region der ERR-cDNA-Sequenz, was darauf hindeutet, daß die zwei Gene aus einer gemeinsamen Sequenz durch ein Gen-Verdoppelungsereignis abgeleitet sind.
Das vorhergesagte Tea-Protein hat eine strukturelle Ähnlichkeit mit anderen Proteinen mit mehrfach die Membran durchdringenden Domänen, wie den Transduktionsproteinen, Ionenkanälen, Ionenpumpen und Zuckertransportern. Es gibt jedoch keine bedeutende Sequenzähnlichkeit mit diesen Genfamilien, noch wurde eine bedeutende Ähnlichkeit mit anderen bekannten Proteinsequenzen gefunden, mit der angegebenen Ausnahme des vorhergesagten ERR-Proteins, das aus der ERR-cDNA-Sequenz abgeleitet ist. Eine Ausrichtung des vorhergesagten Tea- Proteins mit dem ERR-Protein zeigt zwei Bereiche mit starker Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz (Figur 17). Figur 17 zeigt die Übereinstimmung der vorhergesagten Tea-Proteinsequenz mit der Sequenz des ökotropen retroviralen Rezeptors der Maus. Auf Tafel A zeigt das unterstrichene Stück den Bereich der zwei vorhergesagten Proteinprodukte, die verglichen wurden; Das Tea-Protein erstreckt sich von Aminosäure 1 bis 404, das ERR-Protein von Aminosäure 204 bis 603. Auf Tafel B zeigt die Übereinstimmung der beiden vorhergesagten Proteine die Aminosäuresequenz, die für die 20.5-cDNA vorhergesagt wird, oben und die für die ERR-cDNA unten. Die Klammern zeigen die Grenzen der zwei Bereiche mit starker Aminosäure-Identität; Bereich 1 ist zu 81,3 % identisch über 192 Aminosäuren, Bereich 2 zeigt eine Identität über 79 Aminosäuren von 51,9 %. Bereich 1, der durch die Klammern gezeigt ist, hat eine Sequenz-Identität von 81 % und eine Ähnlichkeit von 91 % über 193 Aminosäuren. Region 2 hat eine Sequenz-Identität von 62 % und eine Ähnlichkeit über eine Länge von 60 Aminosäuren von 75 %. Konservative Aminosäure-Unterschiede (R. Doolittle, Of Urfs and Orfs: A primer on how to analyze derived amino acid sequences., University Science Books, Mill Valley, California 1986) sind durch zwei Punkte angegeben. Aminosäure-Identitäten sind durch einen langen Strich zwischen beiden gezeigt.
Im Gegensatz zu dem vorhergesagten Tea-Genprodukt ist das ERR-Protein größer und hat 13 bis 14 vorhergesagte Transmembran-durchdringende Bereiche. Außerdem hat es ein kürzeres hydrophiles Carboxyende und ein Aminoende gleicher Länge. Die vorhergesagten Carboxy- und Aminoenden der Proteine zeigen die meisten Sequenzunterschiede. Ähnlich wie ERR und andere mehrfach die Membran durchdringende Proteine enthält das Tea- Genprodukt keine Signalsequenz. Der Vergleich zeigt größere Bereiche einer Aminosäure-Ähnlichkeit, jedoch sind die zwei Proteine klar verschiedene Genprodukte.
Figur 18 zeigt ein Schema der vorhergesagten Proteinstruktur, die unter Verwendung des PC-Gen-Programms erstellt wurde, um die physikalischen Eigenschaften zu untersuchen, wie in der Figurlegende angegeben. Figur 18 zeigt die physikalischen Eigenschaften der vorhergesagten Proteinprodukte der Tea- und Rec-1-Gene. Darstellung A zeigt ein Modell für eine mögliche Struktur des vorhergesagten Tea-Proteins. Die dicken Linien zeigen die zwei Bereiche einer starken Ähnlichkeit mit dem ERR-Protein. Die PC-Gene-Software-Programme von Intelli- Genetics, SOAP, HELIXMEM, NOVOTNY, RAOARGOS wurden verwendet, um die physikalischen Eigenschaften des vorhergesagten Proteins zu untersuchen, um das gezeigte Modell zu erstellen. Darstellung B zeigt den Bereich der zwei vorhergesagten Proteine, der für einen Vergleich der Hydrophobizität analysiert wurde, wie gezeigt (Aminosäure 1 bis 403 für das Tea-Protein und Aminosäure 204 bis 603 für das ERR-Protein). Darstellung C zeigt die Diagramme der Hydrophobizität des vorhergesagten Tea-Proteins (oben) und des vorhergesagten ERR-Proteins (unten).
Das Modell hebt die Regionen mit starker Ähnlichkeit mit dem ERR-Protein hervor. Da ERR ein Zelloberflächenprotein kodiert, wurden die Hydrophobizitätprofile der zwei vorhergesagten Proteine in den überlappenden Bereichen (Aminosäure 1 bis 401 des vorhergesagten Tea-Proteins und Aminosäuren 204 bis 600 des ERR-Proteins) verglichen. Die Zeile oben in Figur 18 zeigt den Bereich der zwei Proteine, der in dem Hydrophobizitätsdiagramm verglichen wurde. Der Vergleich deckt einen Bereich von 401 aneinandergrenzenden Aminosäuren ab und zeigt eine beträchtliche Ähnlichkeit. Daher ist es wahrscheinlich, daß das Produkt des Tea-Gens auch ein Zelloberflächenprotein ist.
Das Tea-Gen scheint in höheren Wirbeltieren konserviert zu sein. Um zu bestimmen, ob die Tea-Gensequenzen in der Evolution konserviert sind, wurde DNA aus Mensch, Hamster, Maus und Huhn auf Kreuzhybridisierung mit der 20.5-cDNA-Sonde getestet. Wenn der cDNA-Klon mit vollständiger Länge verwendet wurde, um den Southern-Blot zu sondieren, trat eine nachweisbare Hybridisierung mit allen getesteten genomischen DNAs auf (Figur 19). Figur 19 zeigt eine Southern-Analyse der DNA aus verschiedenen Arten und eine Analyse einer rekombinanten Inzucht-DNA, um das Tea-Gen auf Chromosom 8 anzuordnen. Die 32p markierte cDNA-Sonde für beide Proben war ein fast vollständiges Bali-Fragment des 20.5-cDNA-Klons. Darstellung A zeigt ein Autoradogramin mit dem Hybridisierungsmuster von mit PstI verdauter DNA aus Mensch, Hamster, Maus und Huhn, die mit dem Bali-Fragment sondiert wurde, wie in Materials und Methods beschrieben. Darstellung B zeigt ein Autoradiogramm von Leber-DNA aus rekombinanten Inzuchttieren. Figur 19 zeigt ein Beispiel des Hybridisierungsmusters, das von ver schiedenen rekombinanten Tieren, wie gezeigt und aus NFS/N- Eltern-DNA, die mit SacI verdaut wurde, erhalten wurde.
Um zu testen, ob irgendwelche der nachgewiesenen DNA-Fragmente aus dem Rec-1-Gen stammten, wurde gefunden, daß eine Sonde des 3'-Bereichs des 20.5-cDNA-Klons (der stark von der ERR-cDNA-Sequenz abweicht) mit DNA-Fragmenten der gleichen Größe hybridisierte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß die am abweichenden 3'-Ende nachgewiesenen Sequenzen auch während der Evolution konserviert wurden und daß die Kreuzhybridisierung mit der DNA anderer Arten mit der am meisten abweichenden Sequenz zwischen den zwei cDNA-Klonen gefunden wurde. Diese Daten zeigen, zusammen mit Daten aus dem vorhergehenden Abschnitt, daß das Tea-Gen ein Protein kodiert, das von ERR, das in anieren Arten gefunden wird, verschieden ist. Die Divergenz der Aminosäuresequenz am Carboxy- und Aminoende deutet darauf hin, daß die zwei Proteine verschiedene Funktionen haben könnten.

Beispiel 25

Kartierung des Tea-Gens auf Chromosom 8

Da das ERR-Genprodukt als viraler Rezeptor dient, wurde das Tea-Gen kartiert, um zu bestimmen, ob es auf einem Chromosom war, von dein bekannt ist, daß es einen der anderen bekannten retroviralen Rezeptoren kodiert (Kozak (1983), J. Virol. 48:300-303). Mehrere verschiedene somatische Zellhybride, die zwischen chinesischen Hamster- und Mauszellen gebildet wurden, enthielten jeweils eine begrenzte Anzahl verschiedener Maus-Chromosomen. Diese Hybride wurden verwendet, um das Tea- Gen zu kartieren (Hoggan et al., (1988) J. Virol. 62:1055- 1056). Die Southern-Analyse von DNA's, die mit PstI verdaut waren, aus Hybridzellen zeigte, daß 7 von 21 Hybriden mausspezifische DNA-Fragmente enthielten. Ein Vergleich des bekannten Maus-Chromosoingehalts mit der positiven Hybridisie rung von mausspezifischen DNA-Fragmenten zeigte, daß die beste Korrelation die mit dem Chromosom 8 der Maus ist (Tabelle 6). Tabelle 6 Analyse der Übereinstimmung zwischen spezifischen Maus- Chromosomen und der Gegenwart des Tea-Gens in einer Reihe von somatischen Maus/Hamster-Zellhybriden
Die Kartierung des Tea-Gens unter Verwendung von somatischen Maus-Hamster-Zellhybriden. Die Symbole zeigen die Gegenwart (+/) oder Abwesenheit (-/) des Maus-Tea-Restriktionsfragmentes verglichen mit der Gegenwart (/+) oder Abwesenheit (/-) des jeweiligen Maus-Chromosoms, das mit der Zahl in der linken Spalte angegeben ist, die durch Hybridisierung mit der 20.5-cDNA-Sonde nachgewiesen wurde. Die Anzahl von nicht übereinstimmenden Beobachtungen ist die Summe von +/-- und -/+-Beobachtungen.
* Keines dieser Hybride wurde karyotypisiert. Sie wurden mit anderen Markern gekennzeichnet. Daher ist es möglich, daß die +/--Hybridzelle Fragmente von Chromosom 8 enthält oder ein geringer Prozentanteil der Zellen das Chromosom enthält. Die -/+-Ausnahme kann einen Teil von Chromosom 8 enthalten, es fehlt ihr aber der Bereich, der das Tea-Gen enthält.
Um diese Beobachtung zu bestätigen und auszuweiten, wurde Tea auf Chromosom 8 angeordnet durch Analyse mit einer artenübergreifenden Rückkreuzung. DNA, die mit SstI verdaut war, zeigte, daß NFS/N-Mäuse kreuzreaktive Banden mit 10,0, 7,4 und 5,5 kb produzieren. M. m. musculus-DNA erzeugt Fragmente mit 10, 6,4 und 5,5 kb. Figur 19B zeigt das Hybridisierungsmuster der 20.5-cDNA-Sonde in Rückkreuzungen von NFS/N x M. m. musculus F1-Mäusen mit M. in. musculus. Das Auftrennungsmuster dieses Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus mit anderen Markern auf Chromosom 8 zeigt, daß dieses Gen mit Gr-1 und Es-1 verbunden ist mit der Gen-Reihenfolge: Zentromer-Polb-Gr-1-Tea-Es-1 (Tabellen 7 und 8). Tabelle 7 Auftrennung des Tea-Hybridisierungs-Fragmentes mit Allelen von Polb Gr-1 und Es-1 bei 57 Nachkommen einer artenübergreifenden Rückkreuzung
+ = erbte das Allei; - = erbte das Allel nicht. Tabelle 8 Rekombination
a Abstände in Centimorgan (cM) und Standardfehler für jedes Ortspaar wurden berechnet nach Green (19) aus der Anzahl von Rekombinanten (r) bei einer Probengröße n.
b Weitere 46 Mäuse wurden auf Tea und Es-1 untersucht für eine Gesamtanzahl von Rekombinanten von 24 bei 103 rückgekreuzten Mäusen (23,3 cM +/- 4,2).
Die Anordnung des Tea-Gens auf Chromosom 8 liefert den Beweis, daß das Gen von dem Rec-1-Gen verschieden ist, das ERR kodiert und auf Chromosom 5 angeordnet ist. Es räumt auch die Möglichkeit aus, daß Tea der retrovirale MCF-Rezeptor ist, der auf Chromosom 1 angeordnet wurde, obwohl es bis jetzt nicht ausreichend Daten gibt, um zu bestimmen, ob er mit dem Rezeptor für A/10-Virus verwandt ist, der bis jetzt noch keinem Chromosom zugeordnet wurde.
Von 70 Genen oder Genprodukten ist bekannt, daß ihre Expression erhöht ist, wenn T-Zellen aktiviert sind als Reaktion auf eine Kombination von Antigen- und Autohistokompatibilitätsmolekülen auf der Oberfläche von Antigen präsentierenden Zellen. Polyklonale Aktivatoren wie Lectine, Calciumionophore oder Antikörper gegen den T-Zell-Rezeptor für ein Antigen können die durch ein Antigen induzierte Reaktion nachahmen. Einige dieser "Aktivierungs"-Gene sind an dem Übergang von G auf G&sub1; des Zellzyklus beteiligt. Einige kodieren Cytokine und deren Rezeptoren, regulatorische Kernproteine und noch andere sind an dem Transport von Ionen und Nährstoffen in die Zelle beteiligt, um sie für das Wachstum vorzubereiten. Mindestens 26 T-Zell-"Aktivierungs"-Genprodukte wurden auf der Zellmembran lokalisiert. 20.5 ist das erste Beispiel eines klonierten Gens oder einer cDNA, die das Potential hat, ein mehrfach Transmembran-durchdringendes Protein zu kodieren, das während der T-Zell-Aktivierung induziert wird.
Das Verfahren der Milz-T-Zellaktivierung, das durch ConA oder ein Antigen initiiert wird, beginnt innerhalb von Minuten nach dem Kontakt mit Pectin oder einer Antigenpräsentation und verläuft über einen Zeitraum von etwa 7 bis 14 Tagen. Veränderungen der Genexpression treten in der gesamten Aktivierungsperiode auf. Crabtree hat diese Veränderungen der Genexpression in Analogie zu Aktivierungen von viralen Genen eingeordnet (sofort, früh, spät und sehr spät). Nach dem Crabtree-Kriterium ist Tea ein frühes Gen, da Tea-mRNA in normalen ruhenden T-Zellen praktisch nicht nachweisbar ist, auf nachweisbare Gehalte innerhalb von 6 Stunden ansteigt und einen Spitzenwert bei etwa 24 Stunden hat. Die Funktion des Tea-Gens ist bis jetzt noch nicht bekannt; es könnte die Funktion haben, Signale zu übermitteln oder kleine Moleküle zu transportieren, die Signalübermittler sind, oder es könnte als Rezeptor für einen nicht identifizierten Liganden dienen. Das ziemlich lange Carboxyende des mutmaßlichen Tea-Proteins könnte als Signalübermittler dienen, obwohl es keinen Hinweis gibt, der diese Spekulation stützt. Da SL12.3-T-Lymphomzellen und zahlreiche andere T- und B-Tumorzellinien dieses Gen nicht exprimieren, ist die Tea-Genexpression für das Zellwachstum nicht erforderlich. Jedoch schließen die Untersuchungen die Möglichkeit nicht aus, daß normale T-Zellen Tea-Genexpression erfordern, um die normale Zellvermehrung zu durchlaufen, die die T-Zell-Aktivierung begleitet. Eine Störung der Expression dieses Gens könnte die Aktivierung von T- Zellen bei Autoimmun-Krankheiten, wie Arthritis, Diabetes und anderen T-Zell-vermittelten Immunkrankheiten blockieren.
Die eindeutige Homologie zwischen dem Tea-Protein und dem ERR-Protein deutet darauf hin, daß das Tea-Genprodukt als retroviraler Maus-Rezeptor wirken könnte, da mindestens vier Klassen von retroviralen Maus-Rezeptoren genetisch definiert wurden und nur einer molekular kloniert wurde. Die Anordnung des Tea-Gens auf Chromosom 8 räumt die Möglichkeit aus, daß Tea den rekombinanten ökotropen MCF-Virus-Rezeptor kodiert und verstärkt die Möglichkeit, daß es den amphotropen retroviralen Rezeptor kodieren könnte, der auf Chromosom 8 lokalisiert wurde. Im Gegensatz zum Rec-1-Gen (das ERR kodiert), das überall im Mausgewebe exprimiert wird, hat das Tea-Gen eine viel begrenztere Gewebeverteilung. Wenn das Tea-Gen ein Protein kodiert, das als retroviraler Rezeptor wirkt, könnte eine begrenzte Gewebeverteilung eine Spezifität für die Retroviren liefern, die auf die Lymphoid-Abstammung beschränkt ist. Ein Beispiel für eine durch Rezeptor vermittelte Restriktion ist der menschliche Retrovirus HIV, der das CD4-Protein als Hauptrezeptor verwendet. Jedoch ist es unwahrscheinlich, daß zellspezifische Rezeptoren vollständig verantwortlich sind für die Gewebespezifität von Maus-Retroviren. Der Gewebetropismus, der von Retroviren gezeigt wird, entsteht wahrscheinlich durch eine komplizierte Reihe von Faktoren, wie der Gewebespezifität von LTRs, Variationen von gp70-env-Proteinen, zellulären Faktoren und/oder der Expression geeigneter Zeiloberflächen-Rezeptoren. Wenn die ERR-Bindungsstelle für den Virus identifiziert ist, wird es möglich sein, zu bestimmen, ob die Stelle in einem Bereich hoher Ahnlichkeit mit dem Tea-Protein liegt. Virale Bindungs- und Infektionsuntersuchungen sind erforderlich, um zu bestimmen, ob Tea-Protein als viraler Rezeptor dient.
Trotz des hohen Ähnlichkeitsgrades mit dem ERR-Genprodukt gibt es wesentliche Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften der vorhergesagten Tea- und ERR-Proteine. Sie befinden sich auf verschiedenen Chromosomen und ihre Gewebe-Expressionsmuster sind verschieden. Da die natürlichen zellulären Funktionen beider Gene unbekannt sind, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu bestimmen, ob irgendwelche funktionellen Ähnlichkeiten zwischen den zwei Proteinen existieren könnten. Eine Analyse der konservierten und nicht konservierten Aminosäuren könnte Einblick in ähnliche oder verschiedene Funktionen des ERR-Proteins und des Tea-Gen- Produkts liefern. Insbesondere erlaubt die Identifizierung dieser neuen Genfamihe und der Bereiche der DNA-Sequenz, die stark konserviert sind zwischen beiden Molekülen, eine Suche nach neuen Mitgliedern der Genfamilie.
Die mit PT7T3-19.2 (Hinterlegungsnummer 68299), PT7T3-19.4 (Hinterlegungsnummern 68300, 68301, 68302), PT7T3-19.5 (Hinterlegungsnummer 68303) und PT7T3-20.5 (Hinterlegungsnummer 68305) bezeichneten Vektoren wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA am 13. April 1990 hinterlegt. Die Hinterlegungen sind zugänglich, wie vom Patentgesetz und den Bestimmungen der Vereinigten Staaten und fremden Ländern gefordert, in denen korrespondierende Anmeldungen zu dieser Anmeldung eingereicht wurden. Die Verfügbarkeit der Hinterlegungen liefert keine Lizenz zur Durchführung der Erfindung dieser Anmeldung oder irgendeines darauf erteilten Patentes oder irgendeiner Teilanmeldung oder Continuation-Anmeldung davon.

Claims

1. Rekombinantes Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz eines T-Zellproteins, das von Genen kodiert wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 19.5 (SEQ ID Nr. 4), 20.5 (SEQ ID Nr. 5), 19.2 (SEQ ID Nr. 2) und 19.4 (SEQ ID Nr. 3).

2. Polypeptid nach Anspruch 1 in reiner Form.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, worin das T-Zellprotein von DNA aus T-Lymphomen kodiert wird.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz von der in Figur 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz kodiert wird (SEQ ID Nr. 4).

5. Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz von der in Figur 13 gezeigten Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 5) kodiert wird.

6. Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz von der in Figur 20 gezeigten Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 2) kodiert wird.

7. Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz von der in Figur 21 gezeigten Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) kodiert wird.

8. Expressionsvektor, umfassend eine DNA-Sequenz eines Gens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 19.2 (SEQ ID Nr. 2), 19.4 (SEQ ID Nr. 3), 19.5 (SEQ ID Nr. 4) und 20.5 (SEQ ID Nr. 5), wobei der Expressionsvektor in einem Wirt repliziert werden kann, der in operativer Verbindung umfaßt:

a) einen Replikationsursprung;

b) einen Promotor und

c) eine DNA-Sequenz, die ein T-Zell-Protein kodiert.

9. Expressionsvektor nach Anspruch 8, worin der Expressionsvektor ein Plasmid ist, das in einem Wirt repliziert werden kann, das in operativer Verbindung umfaßt:

a) einen Replikationsursprung;

b) einen Promotor und

c) eine DNA-Sequenz, die ein T-Zell-Protein kodiert.

10. Expressionsvektor nach Anspruch 8, worin der Expressionsvektor ein Phage oder ein Plasmid ist, der/das in einem prokaryotischen Wirt repliziert werden kann, der/das in operativer Verbindung umfaßt:

a) einen prokaryotischen Replikationsursprung;

b) einen prokaryotischen Promotor und

c) eine DNA-Sequenz, die ein T-Lymphom-Zellprotein kodiert,

wobei das Protein von einem Gen kodiert wird ausgewählt aus der Gruppe von cDNA-Klonen, bestehend aus 19.2 (SEQ ID Nr. 2), 19.4 (SEQ ID Nr. 3), 19.5 (SEQ ID Nr. 4) und 20.5 (SEQ ID Nr. 5).

11. Expressionsvektor nach Anspruch 9, worin der Expressionsvektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus pMAMneo, pNEO/Tfr-NC und pMAM/neo/Tfr-NC.

12. Vektor, umfassend eine DNA-Sequenz, die ein T-Lymphom- Zellprotein kodiert, wobei das T-Zell-Protein von einem Gen kodiert wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 19.2 (SEQ ID Nr. 2), 19.4 (SEQ ID Nr. 3), 19.5 (SEQ ID Nr. 4) und 20.5 (SEQ ID Nr. 5) und wobei der Vektor in einem Wirt repliziert werden kann, der in operativer Verbindung umfaßt:

a) einen Replikationsursprung;

b) einen Promotor und

c) eine DNA-Sequenz, die das Gen kodiert.

13. Vektor nach Anspruch 12, worin der Vektor isoliert wurde aus der Gruppe bestehend aus einem Plasmid, einem Phagen und einem Cosmid.

14. Vektor nach Anspruch 13, worin der Vektor pT7T3-19.2 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 68299 ist.

15. Vektor nach Anspruch 13, worin der Vektor pT7T3-19.4 mit den ATCC-Hinterlegungsnummern 68300-68302 ist.

16. Vektor nach Anspruch 13, worin der Vektor pT7T3-19.5 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 68303 ist.

17. Vektor nach Anspruch 13, worin der Vektor pT7T3-20.5 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 68305 ist.

18. Wirt, transformiert mit einem rekombinanten DNA-Molekül, worin das rekombinante DNA-Molekül eine DNA-Sequenz für ein Gen umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 19.2 (SEQ ID Nr. 2), 19.4 (SEQ ID Nr. 3), 19.5 (SEQ ID Nr. 4) und 20.5 (SEQ ID Nr. 5).

19. Wirt nach Anspruch 18, der E. coli ist.

20. Verfahren zur Herstellung eines T-Lymphom-Zellproteins das umfaßt: daß man

a) einen Wirt mit einer DNA-sequenz transformiert, die das Protein kodiert, wobei das Protein von einem Gen kodiert wird ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 19.2 (SEQ ID Nr. 2), 19.4 (SEQ ID Nr. 3), 19.5 (SEQ ID Nr. 4) und 20.5 (SEQ ID Nr. 5);

b) die DNA-Sequenz exprimiert und

c) das T-Zell-Protein gewinnt.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung geeignet, um die Produktion von Antikörpern gegen Transmembran-T-Zellprotein bei einem Individuum zu induzieren, umfassend eine immunogen wirksame Menge von Transmembran-T-Zellprotein, hergestellt mit dem Verfahren von Anspruch 20.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 21, worin das Antigen rekombinantes T-Zell-Protein ist.