DE3854952T2

DE3854952T2 - Mykobakterielle rekombinanten und peptide

Info

Publication number: DE3854952T2
Application number: DE3854952T
Authority: DE
Inventors: Richard Houghten; Thomas Shinnick
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1987-02-26
Filing date: 1988-02-25
Publication date: 1996-11-07
Anticipated expiration: 2008-02-26
Also published as: NO885659D0; US5840855A; DE3854952D1; NO885659L; EP0305488A1; AU610154B2; AU1495688A; NO302175B1; EP0305488A4; US4976958A; ATE133681T1; US5478726A; EP0305488B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante Proteine und Peptide, die mit Mykobakterien in Zusammenhang stehen, und insbesondere auf Proteine aus Mycobacterium tuberculosis, für die benachbarte offene Leseraster auf komplementären DNA- Strängen des Genomes kodieren, und auf Vektoren zum Vermehren und Exprimieren dieser Rekombinanten sowie auf Peptide, deren Sequenz Teilen dieser Proteine im wesentlichen entspricht.

Hintergrundkenntnisse

Mykobakterien sind eine diverse Sammlung säurebeständiger, Gram-positiver Bakterien, deren einige bedeutende humane und tierische Krankheiten verursachen (übersichtsartig zusammengefaßt in Bloom et al., (1983), Rev. Infect. Dis., 5: 765-780; und Chaparas, (1982), CRC Reviews in Microbioloav. 9: 139-197). In Menschen sind die beiden verbreitetesten von Mykobakterien verursachten Erkrankungen Tuberkulose und Lepra, die die Folge von Infektionen mit Mycobacterium tuberculosis bzw. Mycobacterium leprae sind. Diese beiden Erkrankungen betreffen weltweit mehr als 65 Millionen Individuen und führen zu über 4 Millionen Todesfällen jährlich (Bloom et al., (1983), Rev. Infect. Dis., 5: 765-780).
Die Pathogenizität dieser mykobakteriellen Infektionen ist eng mit der Immunantwort des Wirtes auf das eindringende Mykobakterium verbunden (Chaparas, (1982), CRC Reviews in Microbiology, 9: 139-197; Collins, (1982), Am. Rev. Respir. Dis., 125: 42-49; Dannenberg, (1982) Am. Rev Respir. Dis., 125: 25-29; und Grange, (1984), Adv. Tuberc. Res., 21: 1-78). M. tuberculosis infiziert nicht nur Zellen des Wirtsimmunsystemes und wächst darin, in erster Linie den Alveolar-Makrophagen, sondern es ist außerdem die zelluläre Immunantwort des Wirtes, die die Schlüsselrolle bei der Immunität vor der Infektion, dem In-Schach-Halten der Infektion am ursprünglichen Infektionsherd, Progression oder Regression der Infektion und Gewebeschädigung oder -zerstörung am Infektionsherd spielt (Chaparas, (1982), CRC Reviews in Microbiology. 9: 139-197; Collins, (1982), Am. Rev. Respir. Dis., 125: 42-49; Dannenberg, (1982) Am. Rev. Respir. Dis., 125: 25-29; und Grange, (1984, Adv. Tuberc. Res., 21: 1- 78). Weiterhin mißt das übliche Verfahren zum Nachweisen einer M. tuberculosis-Infektion, der Tuberkulinhauttest, tatsächlich die zelluläre Immunantwort des Wirtes auf das Mykobakterium (Snider, (1982), Am. Rev. Respir. Dis., 125: 108-118). Die mykobakteriellen Bestandteile, die für das Hervorrufen der zellulären Immunantwort bedeutsam sind, sind bis jetzt nicht gut definiert.
Eine Anzahl von Untersuchungen hat versucht, die mykobakteriellen Antigene durch übliche biochemische und immunologische Verfahren einschließlich der Analyse des Zielantigenes für monoklonale Hybridomantikörper, die gegen Mykobakterien gerichtet sind, zu definieren (Daniel et al., (1978), Microbiol. Rev., 42: 84-113; Engers et al., (1985), Infect. Immun., 48: 603-605; Engers et al., (1986), Infect. Immun., 51: 718-720; Grange, (1984), Adv. Tuberc. Res., 21: 1-78; Ivanyi et al., (1985), Monodonal Antibodies Against Bacteria (A.J.L. und E.C. Macario, Hrsg.) Academic Press, Inc. New York, 5. 59-90; und Stanford, (1983), The Biobav of the Mvcobacteria (Ratledge und Stanford, Hrsg.), Academic Press, London, Band 2, 5. 85-127).
Ein besonderes Antigen, ein Protein von 65 Kilodalton (kD), ist in einem weiten Bereich mykobakterieller Arten vorhanden und ist als ein Antigen aus M. leprae besonders intensiv untersucht worden (Emmrich et al., (1986), J. Exp. Med., 163: 1024-1029; Gillis et al., (1985), Infect. Immun., 49: 371-377; Young et al., (1985), Nature 316: 450-452; und Mehra et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 7013-7017). Dieses Antigen ist das 65 kd-Antigen oder das Zellwandprotein-a(CWP-a)-Antigen genannt worden, da es in einigen Isolationsverfahren mit den Zellwänden zusammen gereinigt zu werden scheint (Gillis et al., (1985), Infect. Immun., 40: 371-377).
In Western-Blot-Tests reagieren monoklonale Antikörper, die gegen dieses Antigen gerichtet sind, mit zwei hauptsächlichen Bestandteilen in einem M. leprae-Extrakt, die mit apparenten Größen von 55000 und 65000 Dalton wandern, und sie reagieren gelegentlich auch mit kleineren Bestandteilen (Engers et al., (1985), Infect. Immun., 48: 603-605 und Gillis et al., (1985), Infect. Immun. 37: 172-178). Es ist nicht bekannt, ob diese Spezies diskrete Proteine oder Vorläufer und Produkte darstellen oder aus einer chemischen oder enzymatischen Spaltung während der Isolierung resultieren. In anderen Arten, beispielsweise M. pordonae, wird mit den monoklonalen Antikörpern nur eine einzelne Spezies von ungefähr 65000 Dalton nachgewiesen (Gillis et al., (1985), Infect. Immun., 49: 371-377).
Das 65 kD-Antigen ist eines der hauptsächlichen immunreaktiven Proteine der Mykobakterien. Dieses Antigen enthält Epitope, die für eine gegebene mykobakterielle Spezies einzigartig sind, sowie Epitope, die die verschiedensten Arten von Mykobakterien gemeinsam haben (Engers et al., (1985), Infect. Immun., 48: 603-605 und Gillis et al., (1985), Infect. Immun., 49: 371-377). Weiterhin ist von einigen anderen Antigenen, die von nur einer mykobakteriellen Art exprimiert zu werden scheinen, festgestellt worden, daß sie Epitope enthalten, die auch in anderen mykobakteriellen Arten exprimiert werden. (Kingston et al., (1987) Infect. Immun., 55: 3149).
WO-A-885823 offenbart die Nukleotidsequenz des Bereiches, die das 65 kD-Gen aus Mycobacterium tuberculosis enthält, sowie die abgeleiteten Sequenzen der Proteine mit 540 und 517 Aminosäureresten.
Biological Abstracts, Band 84, 1987, Zusammenfassung Nr. 5614 offenbart die Verwendung des 65 kD-Proteines aus Mycobacterium gordonae als einen Hauttest für eine Mycobacterium leprae- Exposition.
Shinnick et al., J. Bacteriol., Band 169, 1987, 1080-1087, offenbarten, daß gereinigtes 65 kD-Antigen in experimentell mit mit M. tuberculosis infizierten Säugern eine starke Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ hervorrufen kann. Die gegen dieses Protein gerichteten Antikörper können auch im Serum von Patienten mit Tuberkulose oder Lepra nachgewiesen werden, und mit diesem Antigen reaktive T-Zellen können aus Patienten mit Lepra oder Tuberkulose sowie aus BCG-geimpften Personen isoliert werden (Emmrich et al., (1986), J. Exp. Med., 163: 1024-1029; Engers et al., (1986), Infect. Immun., 51: 718-720; Mustafa et al., (1986)., Nature 319: 63-66; und Thole et al., (1985), Infect. Immun., 50: 800-806). Insgesamt erscheint das 65 kD-Antigen ein hauptsächliches, medizinisch bedeutendes B- und T-Zell-Immunogen und -Antigen in Menschen zu sein.
EP-A-0262710 offenbart ein Polypeptid mit 70 Aminosäuren, von dem gesagt wird, es stelle eine antigene Determinante eines 64 kD-Polypeptides aus M. bovis zur Verfügung.

Kurze Zusammenfassuna der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide, die mit einem Mycobacterium tuberculosis in Zusammenhang stehen, auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Insbesondere stehen diese Peptide im Zusammenhang mit zwei Proteinen, die das 540- (65 kD-) und 517-Protein genannt werden, für die benachbarte offene Leseraster auf komplementären DNA-Strängen des mykobakteriellen Genomes kodieren. Die Peptide entsprechen im wesentlichen Teilen dieser Proteine.
Eine Ausführungsform dieser Erfindung ist ein Peptid, das im wesentlichen aus einer Sequenz von 5 bis ungefähr 40 Aminosäureresten besteht, die im wesentlichen einer Sequenz des Proteines mit 540 Aminosäureresten oder des Proteines mit 517 Aminosäureresten entspricht, für das die DNA-Sequenz der Abbildung 2 kodiert. Bevorzugt enthält das Peptid ungefähr 10 bis ungefähr 20 Aminosäurereste.
Die Peptide haben eine Sequenz, die, unter Verwendung von Einbuchstabensymbolen von links nach rechts in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, einer Formel entspricht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:
AVLEDPYILLVSSK V (22; 211-225);
LLVSSKVSTVKDLLP (23; 219-233);
LLPLLEKVIGAGKPL (24; 231-245);
AILTGGQVISEEVGL (30; 291-305);
IAFNSGLEPGVVAEK (46; 451-465);
ARRGLERGLNALADAVKV (58; 11-28);
EKIGAELVKEVAKK (59; 67-78);
GLKRGIEKAVEKVTETL (50; 114-130) und
IEDAVRNAKAAVEEG (62; 394-408),
wobei jede der zuerst in Klammern gesetzten Zahlen sich auf die Peptidnummer der Tabelle 5, unten, bezieht, und die zweiten, durch Gedankenstrich miteinander verbundene Zahlen beziehen sich auf die Position in der Sequenz des Proteines, das 540 Aminosäurereste enthält, dessen vollständige Aminosäuresequenz und Genomsequenz in den Abbildungen 2A und 2B gezeigt sind.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Feststellen der Gegenwart von Mykobakterien ausgesetzten oder gegen Mykobakterien immunen, d.h. zuvor immunologisch ausgesetzten mononukleären Zellen, beispielsweise T-Zellen in einer Körperprobe. Hier werden mononukleäre Zellen aus einem zu testenden Säugerwirt mit einem wäßrigen Zellkulturmedium mit einer stimulierenden Menge sowohl Antigen-präsentierender Zellen als auch eines Peptidantigenes gemischt und in Kontakt gebracht, um eine stimulierende Zellkultur zu bilden. Diese stimulierende Zellkultur wird für einen Zeitraum aufbewahrt, der für die vorhandenen mononukleären Zellen ausreichend ist, stimuliert zu werden und von ihrer Stimulation Zeugnis zu geben. Das Vorhandensein einer Stimulation mononukleärer Zellen wird anschließend bestimmt. Dieser Test kann in vivo als ein DCH-Test ausgeführt werden, wo die Antigen-präsentierenden Zellen endogene Zellen sind, beispielsweise Makrophagen, und das wäßrige Medium durch Blut und Lymphe bereitgestellt wird. Der Test kann auch in vitro durchgeführt werden. Ein Polymer mit dem oben erwähnten Peptid als sich wiederholende Einheiten kann ebenfalls als Antigen verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Polymer, das eine Vielzahl von sich wiederholenden Pentapeptideinheiten umfaßt. Jede dieser sich wiederholenden Pentapeptideinheiten besteht im wesentlichen aus einer Sequenz, die von links nach rechts in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben durch eine Formel
NNNIG oder XGNZG
dargestellt wird, wobei X ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus F, S, T, L, D und I besteht; und Z ist ein Aminosäurerest, der aus der aus T, I, L, S und V bestehenden Gruppe ausgewählt ist. In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung sind die sich wiederholenden Pentapeptideinheiten durch Peptidbindungen aneinander gebunden, während in noch weiteren Ausführungsformen die sich wiederholenden Pentapeptideinheiten durch oxidierte Cysteinreste an den Enden dieser sich wiederholenden Einheiten aneinander gebunden sind.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Die folgenden Abbildungen bilden einen Teil dieser Offenbarung.
Abbildung 1 ist eine schematische Restriktionskarte von Rekombinanten, die das 65 kD-Antigen aus M. tuberculosis exprimieren. Der Teil des Genomes, der das 65 kD-Protein enthält, ist als eine dicke Linie im oberen Teil der Abbildung zusammen mit den relativen Positionen (kurze senkrechte Linien, die auf die dicke Linie stoßen) von Restriktionsendonukleasespaltstellen gezeigt. Die Einzelbuchstaben, die diesen Linien benachbart sind, geben die Endonuklease an, die das Genom an den angegebenen Stellen spaltet, und bedeuten: A = SacI, B = BglII, K = KpnI, M = BamHI, P = PstI, R = EcoRI, S = SalI, V = PvuII und X = XhoI.
Zwanzig der hier diskutierten Rekombinanten sind entlang des rechten Randes der Abbildung gegenüber den Darstellungen der entsprechenden Genomteile in schematischen Linien, die die jeweiligen Rekombinanten enthalten, aufgezählt. Die Längen und Positionen solcher genomischer Teile relativ zum Genom des 65 kD-Proteines sind durch die relativen Längen und Positionen der Linien gezeigt. Gedankenstriche an den Enden der ersten 6 kürzeren Linien zeigen, daß diese Rekombinanten weitere Basenpaare enthalten, aber die Herkunft und die Sequenzen dieser weiteren Basenpaare ist gegenwärtig unsicher.
Die DNA wurde aus Phagenstammkulturen der das 65 kD-Antigen exprimierenden Rekombinanten isoliert, wie von Helms et al. (1985) DNA 4: 39-49 beschrieben, und eine Restriktionsenzymspaltstellenkarte erstellt.
Abbildung 2 zeigt die Nukleotidsequenz des das M. tuberculosis 65 kD-Antigen enthaltenden Bereiches und des 517-Proteingenes und wird in Form von vier Seiten, bezeichnet 2A, 2B, 2C und 2D, zur Verfügung gestellt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der beiden langen offenen Leseraster (ORFs), die für die Proteine mit 540 bzw. 517 Aminosäureresten kodieren können, sind unter Verwendung des Einbuchstabencodes über (540) oder unter (517) den entsprechenden Tripletts gezeigt. Sternchen über oder unter den entsprechenden Sequenzen zeigen die Positionen der Stoppkodons (TGA, TAG oder TAA) in den DNA-Sequenzen. Jede Sequenz ist als mit dem ersten Methionin(M)-Rest in Phase mit dem ORF beginnend und stromabwärts vom nächsten stromaufwärts gelegenen Stoppkodon gezeigt.
Abbildung 3 ist eine schematische Darstellung der offenen Leseraster, die in dem Teil der mykobakteriellen DNA-Sequenz gefunden werden, der für das 65 kD-Antigen kodiert. Die dicke Linie nahe dem oberen Ende der Abbildung bedeutet einen Teil des Genomes, der die 540- und 517-Proteine umfaßt. Die kürzeren, mit einer Pfeilspitze versehenen Linien unterhalb der dicken Linie weisen auf DNA-Sequenzen hin, die eine Länge von 120 Aminosäureresten überschreiten. Mutmaßliche Initiationstripletts werden auf den kürzeren Linien durch den Buchstaben "M" (AUG) oder den Buchstaben "V" (GUG) am 5'-Ende des jeweiligen offenen Leserasters in den relativ kürzeren Sequenzen, die unterhalb der dicken Linie gezeigt sind, angegeben. Pfeile geben die Transkriptions(coding)-Richtung an.
Abbildung 4 ist eine Photographie einer Western-Blot-Analyse von Produkten des offenen Leserasters mit 540 Aminosäureresten und enthält 2 Reihen, A und B. Die Zellen wurden wachsengelassesn und induziert (mit Ausnahme von Spur 2, Reihe A) und Rohextrakte wurden hergestellt, wie im Abschnitt "Material und Methoden", unten, beschrieben. Für jede Spur mit Ausnahme von Spur 5 wurden 200 Mikrogramm (µg) Protein auf einem 10%igen Laemmli-Gel elektrophoretisiert und auf Nitrozellulose übertragen. Für Spur 5 wurden 500 µg Protein aufgeladen. Die immobilisierten Proteine wurden mit IT-13-Antikörpern umgesetzt und sichtbar gemacht, wie im folgenden diskutiert.
Für Reihe A waren die Proteine in den Spuren: Spur 1 - JM83; Spur 2 - JM83 (pTB22), nicht induziert; und Spur 3 - JM83; (pTB22), induziert mit IPTG. Für Reihe B waren die Proteine in den Spuren: Spur 1 - JM83 (pTB12); Spur 2 - Y1089 (λSK116); Spur 3 - Y1089 (λRY3L46); Spur 4 - BNN97 (E. coli C600, enthaltend λgt11); und Spur 5 - JM83 (pTB12).

Definitionen

Die folgenden Abkürzungen und Symbole werden hier verwendet.
bp - Basenpaar(e)
kbp - 1000 bp
kD - Kilodalton
Mr - apparente relative Molekularmasse
DNA - Desoxyribonukleinsäure
Replikon - die Einheit, die den individuellen Akt der Replikation steuert; sie hat einen Ursprung, an dem die Replikation initiert wird, und kann einen Endpunkt haben, an dem die Replikation endet.
Wenn sie in einem Zusammenhang verwendet werden, der Nukleotidsequenzen beschreibt oder zeigt, werden die die Nukleotidsequenz bildenden Purin- oder Pyrimidin-Basen wie folgt dargestellt:
A - Desoxyadenyl
G - Desoxyguanyl
C - Desoxycytosyl
T - Desoxythymidyl
Bei der Beschreibung einer Nukleotidsequenz stellt jedes aus den oben identifizierten Basen zusammengesetzte dreibuchstabige Triplett ein DNA-Trinukleotid (ein Kodon) mit einem 5'-Ende auf der linken und einem 3'-Ende auf der rechten Seite der oberen Sequenz von Abbildung 2 und einem 5'-Ende auf der rechten und einem 3'-Ende auf der linken Seite der unteren, komplementären Sequenz dar.
Das Wort "Antigen" wird im Stand der Technik oft für eine Einheit gebraucht, die von einem Antikörper gebunden wird. Das Wort "Immunogen" wird oft im gleichen Zusammenhang für die Einheit gebraucht, die die Erzeugung von Antikörpern induziert. Wo das Antigen und das Immunogen die gleiche Einheit sind, werden beide oft als ein Antigen bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit Antigenen und Immunogenen im oben erwähnten Zusammenhang, wobei sich dieser Zusammenhang typischerweise auf B-Zellen und Antikörper bezieht. Ungeachtet des B-Zell/Antikörper-Zusammenhangs betrifft die vorliegende Erfindung außerdem T-Zellen.
Eine allgemeinere Definition von Immunogen und Antigen findet im Zusammenhang mit T-Zellen und T-Zell-Stimulation Anwendung. In dieser allgemeineren Definition ist ein "Antigen" eine Einheit, auf die ein Bestandteil des Immunsystemes einwirkt, und ein "Immunogen" ist eine Einheit, die eine Antwort des Immunsystemes initiiert. Wo Antigen und Immunogen das gleiche sind, werden beide als ein Antigen bezeichnet. Eine "immunologisch aktive" Einheit wechselwirkt mit Antikörpern oder T-Zellen oder kann eine zelluläre oder humorale Immunantwort initiieren.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

I. Überblick

In den im folgenden diskutierten Untersuchungen wird über die Isolierung des für das M. tuberculosis 65 kD-Antigen kodierenden Genes und die Bestimmung seiner Nukleotidsequenz berichtet. Die Sequenz enthält ein offenes Leseraster, das für 540 Aminosäurereste oder ungefähr 60000 Dalton kodiert, was dem 65 kD- Antigen entspricht. Ein zweites langes offenes Leseraster, das für ein Protein mit 517 Aminosäuren kodieren kann, wurde auf dem das 65 kD-Antigengen enthaltenden mykobakteriellen DNAFragment benachbart zu diesem Gen ebenfalls gefunden. Interessanterweise enthält der zentrale Bereich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des 517-Aminosäurenproteins verschiedene tandemartig angeordnete, perfekte und nicht perfekte Wiederholungen einer Sequenz von 5 Aminosäureresten. Dieses Merkmal erinnert an die Merkmale der Sequenz des Haupt-T-Zell-Antigenes des Sporozoitenstadiums der humanen Malariaparasiten (Nussenzweig et al., (1985), Cell. 42: 401-403).

II. Ergebnisse

A. Isolierung und Analyse von Rekombinanten. die das 65 kD- Antigen exprimieren

Um das Gen zu isolieren, das für das 65 kD-Antigen kodiert, wurden monoklonale Hybridomantikörper, die gegen dieses Antigen gerichtet waren, verwendet, um eine Proteinexpressionsbank zu durchmustern, die mit mykobakterieller DNA konstruiert worden war. Es wurde eine Expressionsbank gewählt, weil es nicht von vornherein bekannt war, ob die M. tuberculosis-Gene in E. coli exprimiert werden würden. Eine solche rekombinante DNA-Bank ist von Young et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 2583- 2587, konstruiert worden und enthält genomische DNA-Fragmente von M. tuberculosis, die in die Expressionsstelle des lambdagt11 (λgtll) Vektors insertiert sind. In diesem System können die insertierten kodierenden Sequenzen als ein Fusionsprotein mit β-Galactosidase exprimiert werden. Die für das 65 kD- Antigen spezifischen monoklonalen Hybridomantikörper, die in diesen Untersuchungen verwendet wurden, wurden in den Labors von Dr. T.M. Buchanon (Pacific Medical Center, University of Washington, Seattle, WA) und Dr. J. Ivanyi (MRC Tuberculosis Unit, Hammersmith Hospital, London) erzeugt und wurden vom Steering Committee on the Immunology of Tuberculosis der Weltgesundheitsorganisation erhalten.
Als ursprüngliche Antikörpersonde wurde ein Pool verwendet, der drei gegen das 65 kD-Antigen gerichtete monoklonale Antikörper enthielt (IT-13, IT-31 und IT-33). Bei der Durchmusterung von ungefähr 8 x 10&sup5; rekombinanten Phagen wurden achtunddreißig positive Signale nachgewiesen.
Die den positiven Signalen entsprechenden Phagen wurden zweimal Plaque-gereinigt und dann mit den einzelnen Antikörpern auf Reaktivität getestet. Die Ergebnisse dieser Reinigung und des Tests werden in Tabelle 1, unten, gezeigt. TABELLE 1 Muster der Antikörperreaktivitäten¹ Anzahl der Klone Reaktivität mit Antikörpern
¹ Rekombinante Klone, die Antigene exprimieren, die mit den für das 65 kD-Antigen spezifischen monoklonalen Antikörpern IT-13, IT-31 und IT-33 reaktiv sind, wurden wie im Text beschrieben isoliert. Für die ursprüngliche Durchmusterung wurde ein Pool der drei Antikörper, der eine 1:1000 Verdünnung jedes Antikörpers enthielt, verwendet, um insgesamt ungefähr 8 x 10&sup5; rekombinante Phagen aus der lambda-gt11-M. tuberculosis-Bank zu durchmustern. Um zu bestimmen, welcher monoklonale Antikörper mit welcher der 38 Plaque-gereinigten Rekombinanten reagierte, wurden ungefähr 100 plaquebildende Einheiten (pfu) jedes rekombinanten Phagen in kleinen Flecken auf einem Rasen aus E. coli Y1090 inokuliert. Die Phagen wurden wachsengelassen und wurden zur Synthese von Fremdproteinen induziert, wie im folgenden beschrieben. Die Filter wurden dann mit einer 1:1000 Verdünnung eines der monoklonalen Antikörper umgesetzt, wie in "Material und Methoden" beschrieben.
Achtundzwanzig der Rekombinanten erzeugten Antigene, die mit allen drei Antikörpern reagierten, während zehn Rekombinanten Antigene erzeugten, die mit nur einem oder zwei der Antikörper reagierten. Insgesamt weisen die Reaktivitätsmuster darauf hin, daß, obwohl die drei Antikörper mit dem gleichen mykobakteriellen Antigen reagieren, jeder ein anderes Epitop auf diesem Antigen erkennt. Richard A. Young (Whitehead Institute, M.I.T.) hat diese λgt11-M. tuberculosis-Bank ebenfalls mit einem dieser Antikörper (IT-13) durchmustert und zehn weitere Rekombinanten entdeckt (Young et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 2583-258). Diese Rekombinanten wurden nicht auf Reaktivität mit den anderen Antikörpern getestet.
Die DNA aus zwanzig dieser Rekombinanten, die das 65 kD-Antigen exprimieren, wurde isoliert und eine Restriktionsenzymspaltkarte für diesen Bereich des mykobakteriellen Genomes abgeleitet (Abb. 1). In den meisten dieser Rekombinanten war das mykobakterielle DNA-Insert von EcoRI-Stellen flankiert, wie aus der Art, in der die Bank konstruiert wurde, erwartet werden konnte.
Jedoch war in 6 der zwanzig untersuchten Rekombinanten nur eine der erwarteten EcoRI-Stellen vorhanden. Diese Beobachtung weist auf die Möglichkeit hin, daß ein signifikanter Anteil der rekombinanten Phagen in dieser Bank aus der Insertion eines Fragmentes mit nur einer funktionellen EcoRI-Stelle in die λgt11- EcoRI-Stellen entstanden sein könnte oder daß einige Klone irgendwelchen Rekombinations-, Umstellungs- oder Deletionsereignissen während der Vermehrung unterworfen gewesen sein könnten, die zur Entfernung einer der EcoRI-Stellen geführt haben.
Die abgeleitete Restriktionskarte ist in guter Übereinstimmung mit der publizierten Karte des Genes für das M. bovis-65 kD- Antigen (Thole et al., (1985), Infect. Immun., 50: 800-906) mit Ausnahme der Gegenwart von zwei zusätzlichen SmaI-Stellen im M. tuberculosis-Gen. Die Karte stimmt nicht gut mit der des M. leprae-65 kD-Antigengenes überein (Young et al., (1985), Nature. 316: 450-452). Dies kommt in Anbetracht der Tatsache, daß auf Grundlage von DNA-Homologieuntersuchungen festgestellt wurde, daß M. tuberculosis mindestens 90% homolog mit M. bovis ist und nur ungefähr 30% mit M. leprae, nicht unerwartet (Athway et al., (1984), Int. J Syst. Bacteriol., 34: 371-375; Imaeda, (1985), Int. J. Syst. Bacteriol., 35: 147-150).
Um die Nukleotidsequenz dieses Bereiches des mykobakteriellen Genomes zu bestimmen, wurden verschiedene Fragmente der λgt11- Rekombinanten in den Plasmidvektor pUC19 subkloniert. Die Mehrheit der Sequenzen dieses Bereiches wurde von einem Subklon (pTB7) des 1,4 Kilobasenpaar (kbp) EcoRI-Fragmentes von λSK7 und einem Subklon (pTB9) des 2,6 kbp EcoRI-Fragmentes von λRY3143 bestimmt. Die Sequenz über die EcoRI-Stelle an der Verbindung dieser beiden Fragmente hinaus wurde von einem Fragment bestimmt, das aus einem Subklon (ptbll) des 2,8 kbp KpnI-Fragmentes von λSK119 isoliert worden war. Die Sequenz des Bereiches 5' vom 2,6 kbp EcoRI-Fragment wurde aus einem Subklon (pTB12) des 2,4 kbp KpnI-Fragmentes von λSK119 bestimmt.
Insgesamt wurde die Nukleotidsequenz von 4380 Basenpaaren der mykobakteriellen DNA durch eine Kombination des Didesoxykettenterminationsverfahrens nach Sanger (Sanger et al., (1980), J. Mol. Biol., 143: 161-178) und des auf chemischem Abbau beruhenden Sequenzierverfahrens nach Maxam-Gilbert (Maxam et al., (1976), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 560-564) bestimmt. Die Sequenz ist in Abbildung 2 gezeigt.
Wie für genomische M. tuberculosis-DNA erwartet (Wayne et al., (1968), J. Bacteriol., 96: 1916-1919), wies die Basenzusammensetzung dieses Fragmentes ungefähr 66% G+C auf. Der hohe G+C- Gehalt erhöhte die Chancen von Sequenzierartefakten infolge von Kompressionen und machte es unbedingt notwendig, daß die Sequenzen für beide Stränge in allen Bereichen bestimmt wurden.

B. Offene Leseraster

Die Sequenz enthält fünf offene Leseraster (ORFs), die mit einem ATG-Triplett beginnen und mehr als 120 Aminosäuren enthalten. Zwei dieser Leseraster überschreiten Längen von 200 Aminosäuren. Eines kann für 517 Aminosäuren kodieren und das andere für 540 Aminosäuren.
Es gibt weitere drei offene Leseraster mit Längen von 140 bis 190 Aminosäureresten, die kein Initiations-ATG-Triplett enthalten, aber ein GTG-Triplett. Es ist nicht bekannt, ob ein GTG- Triplett in Mykobakterien als Translationsinitiations-Triplett wirken kann. Die Anordnung dieser acht offenen Leseraster ist schematisch in Abbildung 3 gezeigt. Kein Teil der abgeleiteten Aminosäuresequenzen irgendeines dieser offenen Leseraster zeigte irgendwelche signifikante Homologie mit Sequenzen in der Proteinsequenz Database der Protein Identification Resource.
Es sollte festgehalten werden, daß, obwohl von einem offenen Leseraster mit mehr als 100 Aminosäuren angenommen werden würde, daß es mit hoher Wahrscheinlichkeit in den meisten Bakterien als Protein exprimiert wird, dies für Mykobakterien nicht zutreffen mag. Das heißt, daß ein Translationsterminations- Triplett (TAA, TAG oder TGA) bei einem gegebenen G+C-Gehalt des Inserts von ungefähr 66% durchschnittlich ungefähr einmal alle 41 Aminosäuren erwartet werden würde im Vergleich zu ungefähr einmal alle 21 Aminosäuren in einem Genom mit einem G+C-Gehalt von 50%. Ein offenes Leseraster von 150-200 Aminosäuren kann dann vielleicht die Folge der zufälligen Verteilung von Terminations-Tripletts sein, anstatt eine mögliche biologische Bedeutung erkennen zu lassen. Als solches sind nur die beiden sehr langen offenen Leseraster, die für Proteine mit 517 und 540 Aminosäureresten kodieren, hier beschrieben.

C. Das 540-Aminosäuren-ORF entspricht dem 65 kD-Antigen

Eines der langen offenen Leseraster beginnt mit einem ATG- Triplett an den Positionen 252-254 der DNA-Sequenz und erstreckt sich bis zu einem TGA-Triplett an den Positionen 1872- 1874. Dieses ORF kodiert für 540 Aminosäuren. Um zu bestimmen, ob dieses offene Leseraster dem Gen für das 65 kD-Antigen entsprach, wurde das 1511 bp BamHI-Kpni-Fragment aus pTB12 (Reste 438-1948 der in Abbildung 2 dargestellten Sequenz), das den größten Teil des offenen Leserasters enthält, in BamHI-KpnI- gespaltenen pUC19 insertiert. In diesem Konstrukt, das pTB22 genannt wurde, wird das offene Leseraster unter Verwendung der lacZ-Transkriptions- und Translationsinitiationssignale, die im Vektor pUC19 vorhanden sind, exprimiert und führt zur Erzeugung eines Fusionsproteines, das 15 Aminosäurereste am Aminoterminus enthält, für die das lacZ-Gen von pUC19 kodiert, gefolgt von 478 Aminosäuren des mykobakteriellen offenen Leserasters.
Aus den dieses Plasmid enthaltenden Zellen wurden Rohextrakte hergestellt und auf die Reaktivität von für das 65 kD-Antigen spezifischen Antikörpern in Western-Blot-Analysen untersucht. Die Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper IT-13 ist in Reihe A der Abbildung 4 gezeigt. Insgesamt reagierten fünf verschiedene monoklonale Antikörper, die für das 65 kD-Antigen spezifisch sind, mit einer Spezies in dem Rohextrakt, die mit einer apparenten relativen Molekularmasse (Mr) von ungefähr 55000 Dalton wanderte (Spur 3).
In Extrakten von E. coli, die das Plasmid nicht enthielten (Spur 1), wurde keine Reaktivität gesehen. Weiterhin ist die Expression dieses Fusionsproteines mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbar (vgl. Spuren 2 und 3). Daher wird angenommen, daß dieses lange offene Leseraster, das die Reste 252-1871 umfaßt, für das M. tuberculosis-65 kD- Antigen kodiert. Die Ausdrücke "540-Aminosäureprotein", "540- Protein", "65 kD-Protein" und "65 kD-Proteinantigen" werden hier austauschbar für das 65 kD-Protein von M. tuberculosis verwendet. Zusätzlich wurde gereinigtes rekombinantes 65 kD-Protein in Western-Blot-Analysen verwendet, wobei Serum aus menschlichen Patienten eingesetzt wurde, von denen bekannt war, daß sie mit M. tuberculosis infiziert sind. In vorläufigen Untersuchungen immunreagierten die Antiseren dieser Patienten mit dem gereinigten rekombinanten Protein.
Diese Untersuchungen zeigen die Verwendung des natürlichen oder rekombinanten Proteines als Antigen in einem diagnostischen Testverfahren auf die Gegenwart von natürlich auftretenden Antikörpern gegen das 65 kD-Protein in infizierten Patienten und daher für den Nachweis einer Infektion mit M. tuberculosis in diesen Patienten. Ähnliche Ergebnisse werden in einem üblicheren Festphasentest erhalten, so wie sie in einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden, wo das rekombinante 65 kD-Protein an einer Festphasenmatrix befestigt ist, um einen Festphasenträger zu bilden, und das Patientenserum die Quelle der zu untersuchenden Antikörper darstellt.
Festphasentests erfordern ähnliche Schritte und stellen Varianten voneinander dar, egal, ob sie in einer Mikrotiterplatte, mit einem einzutauchenden Stäbchen (dip stick) oder als Western-Blot durchgeführt werden. Jeder hat eine Festphasenmatrix (Mikrotiterplattenvertiefung, Stäbchenoberläche oder Nitrozellulose), an die das gereinigte natürliche oder rekombinante 540-Aminosäurenprotein, für das das Genom von M. tuberculosis kodiert, als Antigen fixiert wird, gewöhnlich durch Adsorption, um den Festphasenträger zu bilden. Die getestete Probe, beispielsweise Patientenserum oder Cerebrospinalflüssigkeit (wo ein Hinweis auf eine tuberkulöse Meningitis getestet werden soll) in flüssiger Form wird mit den Festphasenträger unter Bildung einer Fest-Flüssigphasenmischung gemischt. Diese Mischung wird unter üblichen biologischen Testbedingungen (z.B. 0ºC bis ungefähr 40ºC) für einen Zeitraum aufbewahrt, der für die in der getesteten Probe vorhandenen Antikörper ausreichend ist, mit dem Antigen eine Immunreaktion einzugehen und an das Antigen des Festphasenträgers zu binden. Die festen und flüssigen Phasen werden getrennt, z.B. durch Spülen. Die Gegenwart von an den festen Träger gebundenen Antikörpern wird anschließend bestimmt, beispielsweise mit einem markierten Reagenz, das mit den gebundenen humanen Antikörpern reagiert.
Ein markiertes Reagenz, das mit den vorhandenen gebundenen Antikörpern reagiert, wird mit der festen Phase gemischt, um eine zweite Fest-Flüssigphasenmischung zu bilden. Die zweite Fest- Flüssigphasenmischung wird für einen Zeitraum aufbewahrt, der für das markierte Reagenz ausreichend ist, mit den gebundenen humanen Antikörpern zu reagieren. Die zweite Fest-Flüssigphasenmischung wird getrennt, z.B. durch Spülen, und die Menge des vorhandenen Markers bestimmt. Eine Menge von über einen gewissen Hintergrund (Kontrollwert) hinaus vorhandenem Marker weist auf die Gegenwart von Antikörpern gegen das 65 kD-Protein und daher eine Infektion mit M. tuberculosis hin.
Das markierte Reagenz, das mit den gebundenen humanen Antikörpern reagiert, ist bevorzugt eine markierte Zubereitung von xenogenen anti-Human-Antikörpern, beispielsweise mit alkalischer Phosphatase konjugierten Ziegen-anti-Human-Ig-Antikörpern, die von Tago, Burlingame, CA, erhältlich sind. Die Gegenwart der gebundener alkalischer Phosphatase wird typischerweise spektrophotometrisch durch Messen der enzymatischen Hydrolyse eines Substratmoleküles, beispielsweise Q-Nitrophenylphosphat zu p- Nitrophenol, bestimmt. Andere Enzyme, beispielsweise Meerrettichperoxidase, und andere Markertypen, beispielsweise radioaktive Elemente, wie Iod 125, sind ebenfalls nützlich. S. aureus Protein A, gebunden an einen Marker, beispielsweise ¹²&sup5;I, kann ebenso mit den gebundenen Human-Antikörpern der getrennten festen Phasen reagieren, um ihre Gegenwart nachzuweisen.
Das oben beschriebene diagnostische Testverfahren wird typischerweise in einem klinischen Ansatz unter Verwendung eines Kits durchgeführt. Der Kit umfaßt mindestens eine Packung, die einen Festphasenträger mit gereinigtem 540-Protein enthält, für das das M. tuberculosis-Genom kodiert, das von einem Mykobaktenum stammt oder ein rekombinantes Protein ist, wie es hier diskutiert wird, das als ein Antigen an eine feste Matrix fixiert ist, beispielsweise eine Kunststoffmikrotiterplatte oder einen "dipstick". Ein oder mehrere zusätzliche Reagenzien, beispielsweise das markierte Reagenz, das mit dem festphasengebundenen humanen Antikörper reagiert, ein Substrat für das markierte Reagenz (wo Bedarf besteht, für den Marker), Puffersalze in Lösung oder trockener Form und ähnliches können in separaten Packungen in dem Kit ebenfalls vorhanden sein.

D. Das 65 kD-Antigen wird in E. coli exprimiert

Weil vorherige Untersuchungen gezeigt hatten, daß die meisten mykobakteriellen Gene in E. coli bei Verwendung mykobakterieller Transkriptions- und Translationssignalsequenzen nicht exprimiert werden (Clark-Curtis et al., (1985), J Baceriol., 161: 1093-1102 und Thole et al., (1985), Infect. Immun., 50: 800-806), wurde für diese Klonierungsuntersuchungen eine Proteinexpressionsbank verwendet. In der λgt11-M. tuberculosis- Bank sollten die insertierten mykobakteriellen kodierenden Sequenzen als Fusionsproteine mit β-Galactosidase exprimiert werden (Young et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 2583-2587). Es war etwas überraschend, festzustellen, daß der für das 65 kD-Antigen kodierende offene Leseraster sich nicht bis zum 5'-Ende des mykobakteriellen DNA-Inserts in λSk119 erstreckte. Dies legte nahe, daß das 65 kD-Antigen unter Verwendung mykobakterieller Transkriptions- und Translationssignalsequenzen exprimiert wurde.
Hinsichtlich der zuvor beschriebenen E. coli-Konsensus- Signalsequenzen weisen die mykobakteriellen Sequenzen 180 bis 230 Basenpaare stromaufwärts von dem mutmaßlichen Initiator- ATG-Kodon eine vernünftige übereinstimmung mit den Konsensus- Sequenzen für den -35-Bereich (3/3 Übereinstimmungen mit dem hochkonservierten TTG) und -10-Bereich (4/6 Übereinstimmungen mit TATAAT) von E. coli-Promotoren auf (Rosenberg et al., (1979), Ann. Rev. Genet., 13: 319-353). Weiter gibt es eine 5/5 Übereinstimmung mit der Shine-Dalgarno-Sequenz (Shine et al., (1974), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71: 1342-1346) für eine prokaryontische Ribosomenbindungsstelle (GGAGG) 13 Basenpaare stromaufwärts des mutmaßlichen Initiator-Tripletts für das offene Leseraster des 65 kD-Antigenes. Obwohl die genauen Anordnungen der mykobakteriellen Regulationssequenzen experimentell nicht bestimmt worden sind, lassen die Ergebnisse der beiden unten beschriebenen Untersuchungen vermuten, daß die mykobakteriellen Sequenzen in E. coli tatsächlich funktionell sind.
Die Größe des mit Antikörpern gegen das 65 kD-Protein reaktiven Materials, das von den Rekombinanten erzeugt worden war, wurde in einem Western-Blot-Test bestimmt. Um dies durchzuführen, wurden Rohlysate von Zellen, die rekombinante Plasmide oder Phagen exprimieren, von denen gezeigt worden war, daß sie das gesamte 65 kD-Antigengen enthalten (λSK116, pTB12), und von solchen, von denen gezeigt worden war, daß sie einen großen Teil des Leserasters des 65 kD-Antigens an β-Galaktosidase fusioniert enthalten (λRY3146; pTB22, das die 540-Protein-DNA von Position 438 bis Position 1948 gemäß Abb. 2 enthält), wie im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben hergestellt.
Die Lysate wurden auf 10%igen Laemmli SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisiert und die getrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen. Die SDS-denaturierten, immobilisierten Proteine wurden dann mit für das 65 kD- Antigen spezifischen monoklonalen Antikörpern umgesetzt
Die Ergebnisse unter Verwendung des Antikörpers IT-13 sind in Abb. 4 gezeigt. In Zellen, die Rekombinanten exprimieren, die das fusionierte offene Leseraster tragen, wiesen die monoklonalen Antikörper eine einzelne stark reaktive Spezies nach, die mit einem Mr von ungefähr 160000 Dalton wanderte, sowie gelegentlich kleinere Spezies (Abb. 4, Reihe B, Spur 3). In einer anderen Rekombinanten mit fusioniertem offenen Leseraster wiesen die monoklonalen Antikörper eine einzelne reaktive Spezies nach, die mit einem Mr von ungefähr 55000 Dalton wanderte (Abb. 4, Reihe A, Spur 3). In den Extrakten von Zellen, die Rekombinanten exprimieren, die das gesamte 65 kD-Gen enthielten, wiesen die monoklonalen Antikörper eine einzelne stark reaktive Spezies nach, die mit einem Mr von ungefähr 64000 Dalton (Abb. 4, Reihe B, Spuren 1 und 2) wanderte.
Kleinere reagierende Spezies (ungefähr 40000 bis 55000 Dalton) wurden beobachtet, wenn große Mengen des Extraktes aufgetragen wurden (Spur 5) oder wenn dem Lysepuffer kein Proteaseinhibitor zugesetzt wurde. Gelegentlich wurde eine schwächer vertretene reagierende Spezies beobachtet, die mit einem Mr von ungefähr 67000 Dalton wanderte.
In Anbetracht der Größe der mit dem Antikörper gegen das 65 kD- Protein reaktiven Materiales weisen diese Daten darauf hin, daß das 65 kD-Antigen unter Verwendung der mykobakteriellen Translationsinitiationssignale, die im 65 kD-Gen vorhanden sind, exprimiert werden kann. Da außerdem die vom Vektor beigetragenen Anteile zum rekombinanten Plasmid keine bekannten Sequenzen enthalten, die geeignet angeordnet und orientiert sind, um die Transkription der insertierten DNA zu fördern, weisen diese Daten darauf hin, daß die mykobakteriellen Transkriptionsinitiationssignale in E. coli funktionieren und die Expression des 65 kD-Antigens erlauben.
Um eine ungefähre Messung der Effizienz der Verwendung der mykobakteriellen Transkriptions- und Translationsinitiationssignale in E. coli zu erhalten, wurden 2 Plasmide konstruiert, die die Expression von enzymatisch aktiver β-Galaktosidase unter die Kontrolle entweder der mykobakteriellen Signalsequenzen oder der im Plasmid pUC19 vorhandenen lac-Gensignalsequenz stellen.
Zuerst wurde ein 3000 bp BamHI-Fragment aus pMC1871, das die für die Aminosäurereste 8 bis 1021 von β-Galactosidase kodierenden Sequenzen enthält (Shapira et al., (1983), Gene. 25: 71- 82), in die Bamlil-Stelle von pTB12 (Reste 437 bis 442 der in Abb. 2 dargestellten Sequenz) insertiert. Das resultierende 8,1 kbp-Plasmid (pTB27) enthält ein offenes Leseraster, das für ein Fusionsprotein mit 63 Aminosäureresten kodiert, die vom 65 kD- Antigengen abgeleitet sind, gefolgt von 1014 Aminosäuren β-Galaktosidase, und deren Expression unter der Kontrolle der in der mykobakteriellen DNA vorhandenen Transkriptions- und Translationssignalsequenzen steht. Wie erwartet, exprimiert dieses Konstrukt ein Protein von ungefähr 120000 Dalton, das mit anti- β-Galaktosidase-Antikörpern in einem Western-Blot-Test reagierte.
Als zweites wurde das 3000 bp BamHI-Fragment aus pMC1871 in die BamHI-Stelle des Polylinkers von pTB9 insertiert, das ein 2,4 kbp-Fragment des 65 kD-Antigengenes in die E. coli-Stelle von pUC19 insertiert enthält. Das resultierende 8,1 kbp-Plasmid (pTB28) enthält ein offenes Leseraster, das für ein Fusionsprotein mit 15 vom pUC19 lacZ-Gen abgeleiteten Aminosäureresten und Polylinkersequenzen kodiert, gefolgt von 1014 Aminosäureresten von β-Galaktosidase, und dessen Expression unter der Kontrolle der in pUC19 vorhandenen lac-Gensignalsequenzen steht.
Rohextrakte der diese Plasmide enthaltenden Zellen wurden, wie zuvor beschrieben, auf ihre β-Galaktosidase-Aktivität getestet. In Zellen, die pTB27 enthielten, betrug die β-Galaktosidase- Aktivität (ungefähr 2800 Einheiten/Mikrogramm (µg) Protein) ungefähr ein Viertel der in IPTG-induzierten Zellen, die pTB28 enthielten, gefundenen (11000 Einheiten/µg Protein). In Anbetracht der dieser Untersuchung inhärenten Unbekannten (z.B. der spezifischen Aktivitäten und der relativen Stabilitäten der beiden Fusionsproteine) kann man keine genaue quantitative Angabe über die relativen Stärken der mykobakteriellen Signalsequenzen und der E. coli-lac-Gensignalsequenzen auf der Grundlage der relativen enzymatischen Aktivitäten, die in den beiden Zellextrakten gefunden wurden, machen. Die Daten weisen jedoch darauf hin, daß diese mykobakteriellen Transkriptions- und Translationssignalsequenzen in E. coli effizient erkannt werden.

E. Die 65 kD-Antigensequenz

Verschiedene interessante Eigenschaften dieses langen offenen Leserasters sind durch eine computergestützte Analyse der Sequenz enthüllt worden. Die Basengesamtzusammensetzung dieses offenen Leserasters beträgt 65,5% G+C. Der G+C-Gehalt variiert jedoch innerhalb der Kodons beträchtlich, so daß der G+C-Gehalt der die ersten beiden Reste des Kodons besetzenden Basen 55% beträgt, während er 87% für die an der dritten Stelle des Kodons gefundenen Basen ist, wodurch eine positive Auswahl für die Verwendung von Kodons, die ein G oder C in der dritten Position haben, getroffen wird.
Beispielsweise haben 50 von 51 Leucinkodons (CTX) ein G oder C in der dritten Position. Interessanterweise ist das im wesentlichen statistische Auftreten irgendeiner der vier Basen in den ersten beiden Positionen eines Kodons zusammen mit der Präferenz für G oder C in der dritten Position eines Kodons eine Strategie, die es einem Organismus erlaubt, einen hohen G+C- Gehalt zu haben, ohne den Zugang zu Aminosäuren zu beschränken, deren Kodons A- oder T- Reste in den ersten beiden Positionen enthalten.
Obwohl die abgeleitete Aminosäuresequenz des 65 kD-Antigens insbesondere reich an Alanin-, Glycin-, Leucin- und Valinresten ist, enthält die Aminosäuregesamtzusammensetzung 52% hydrophobe und 48% hydrophile Reste. Die computergestützte Analyse des α- Helixgehaltes (Chou et al., (1978), Adv. Enzym., 47: 45-148) und der Hydrophobizität (Hopp et al., (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3838) der Aminosäuresequenz zeigte viele Bereiche, die an α-helikalen Strukturen beteiligt sein könnten, und keine ausgedehnten Bereiche hoher Hydrophobizität. Diese Daten legen nahe, daß das 65 kD-Antigen kein integrales Membranprotein ist, und daß seine Sequenz eher die eines löslichen Proteines darstellt.
Wie zuvor diskutiert, scheint das 65 kD-Antigen ein bedeutendes T-Zell-Immunogen und -Antigen im Menschen zu sein. Es ist vorgeschlagen worden, daß die immundominanten T-Zell-Epitope kurze Strecken von Aminosäuren sind, die amphiphile Helices bilden können, bei denen eine Seite der Helix hydrophob und die andere Seite hydrophil ist (Berzofsky, (1985), Science. 229: 932-940). Auf der Grundlage von Computermodellen sind 7 Strecken von Aminosäuren innerhalb der Sequenz des 65 kD-Antigenes identifiziert worden, die solche amphiphilen Helices bilden könnten. Eine Liste solcher Peptide ist in Tabelle 2, unten, gezeigt. TABELLE 2 Position der Reste¹ Sequenz² ¹ Die Positionen der Reste sind unter Verwendung der einbuchstabigen Aminosäuresequenz des 65 kD-Proteines, die in Abb. 2 gezeigt ist, angegeben, wobei der Methioninrest, für den das an der Basenpaarposition 252 beginnende Triplett kodiert, als der erste Rest des Proteines gezeigt ist. Zahlen in Klammern bezeichnen die Nummern von Peptiden, die in Tabelle 5 gezeigt sind. ²Diese Aminosäuresequenzen sind von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus gezeigt, wie es üblich ist.

F. DCH-Test mit einem rekombinanten 65 kD-Protein

Beispielhafte Tests zur verzögerten Hautüberempfindlichkeit wurden unter Verwendung beispielhafter rekombinanter Proteine, die hier als Testantigene beschrieben sind, nach Immunisierung mit M. tuberculosis, M. bovis oder Kochsalz durchgeführt. Diese Tests wurden nach dem von Minden et al., Infect. Immun. 53: 560-564, (1986), beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Kurz gesagt, wurden die Säugetierwirte mit einer ausreichenden Menge von M. tuberculosis oder M. bovis oder mit einer Kontrolle (Kochsalzlösung) immunisiert, um eine immunologische Antwort zu induzieren. Die Tiere wurden für einen Zeitraum gehalten, der für das Abklingen der ursprünglichen immunologischen Antwort auf das Immunogen ausreichend ist, dann wurden die Tiere mit einer intradermalen Injektion mit Inokula behandelt, die das 65 kD-Protein, ein rekombinantes 65 kD-Protein oder ein rekombinantes Fusionsprotein, das das 65 kD-Protein enthielt, als Testantigen in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel gelöst oder dispergiert enthielten, oder sie wurden mit einer Kontrolle behandelt Die Testantigene waren in einer Menge vorhanden, die ausreichend ist, Erytheme und Verhärtungen an der Stelle der Verabreichung in einem Säugetier zu induzieren, das zuvor mit M. tuberculosis oder M. bovis immunisiert worden ist.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 3, unten gezeigt. TABELLE 3 DCH-Tests mit rekombinanten Antigenen Anzahl positiver/Anzahl getesteter Meerschweinchen, die immunisiert waren mit²: Verabreichtes Antigen¹ M. Tubercolosis M. bovis Kochsalzlösung
¹Die verabreichten Antigenzusammensetzungen wurden, wie in "Material und Methoden" diskutiert, intradermal injiziert, wobei Mengen von 1 oder 10 µg/100 µl pro Injektion verwendet wurden, wie durch die in Klammern gesetzten Zahlen nach jedem Antigen angegeben ist, mit Ausnahme des gereinigten Proteinderivates (PPd), das in einer Menge von 5 Tuberkulineinheiten (T.E.) verwendet wurde.
²Die Anzahl von Meerschweinchen, die eine positive DCH-Antwort aufweisen, steht im Zähler, während die Anzahl der getesteten Meerschweinchen im Nenner angegeben ist. Das Immunisierungsprotokoll ist in "Material und Methoden" beschrieben.
³ BNN97 war ein Rohlysat, das aus λgt11-infizierten E. coli hergestellt wurde. Das Rohlysat wurde teilweise durch Ammoniumsulfatpräzipitation, wie im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben, gereinigt.
&sup4; λ1089 war ein Rohlysat, das aus λSK119-infizierten E. coli hergestellt wurde, die das 65 kD-Antigen exprimierten. Das Rohlysat wurde teilweise durch Ammoniumsulfatpräzipitation gereinigt, wie im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben.
&sup5; pTB22 war ein Rohlysat, das aus pTB22 enthaltenden E. coli hergestellt worden war, die 65 kD-Antigen als Fusionsprotein exprimierten, das einen Teil des β-Galaktosidasemoleküls und ungefähr die carboxyterminalen 88% des 65 kD-Proteines enthielt. Das Rohlysat wurde durch Ammoniumsulfatpräzipitation teilweise gereinigt, wie im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben.
&sup6; BCG-S war ein Extrakt aus M. tuberculosis, hergestellt, wie im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben.
&sup7; PPD wurde von den Connaught Laboratories, Ltd., Willowdale, Ontario, Kanada, erhalten.
Wie aus den oben gezeigten Ergebnissen entnommen werden kann, kann das 65 kD-Protein, das von der DNA-Sequenz gemäß Abb. 2 kodiert wird, in DCH als Teil eines Verfahrens verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Säugetierwirt, beispielsweise ein Meerschweinchen, zuvor M. tuberculosis immunologisch exponiert war, da die T-Leukozyten der Wirtstiere Erytheme und Verhärtungen an den Stellen der Verabreichung in den Tieren erzeugten, die zuvor mit M. tuberculosis und M. bovis immunisiert worden waren, und keine Reaktionen in kochsalzimmunisierten Tieren hervorriefen. Diese Ergebnisse zeigen außerdem, daß rekombinante 65 kD-Proteinmoleküle gleichermaßen nützlich sind. Rekombinante Fusionsproteine, die einen Teil des β-Galaktosidasemoleküles über eine Peptidbindung an den Aminoterminus des 65 kD- Proteines gebunden enthalten, sind ebenfalls nützlich, wie es auch Fusionsproteine sind, die einen Teil des β-Galaktosidasemoleküles und einen immunologisch aktiven Teil, ungefähr die carboxyterminalen 85% des 65 kD-Proteines, z.B. das von pTB22 exprimierte Protein, enthalten.
Fusionsproteine, die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Peptidsequenzen enthalten, sind ebenfalls nützlich. Der Ausdruck "vorherige immunologische Exposition" und seine grammatikalischen Varianten werden hier verwendet um auszusagen, daß das Wirtssäugetier mit einem der Mykobakterien immunisiert oder infiziert worden war und daß das Wirtsäugetier eine Immunantwort (primäre Antwort) gegen das durch die Mykobakterien zur Verfügung gestellte Immunogen aufbaute, und das die Immunantwort abgeklungen war.

G. Das 517-Aminosäureprotein

1. Der offene Leseraster
Ein zweiter langer offener Leseraster beginnt mit einem ATG- Kodon an den Positionen 3948-3946 der Abb. 2 und erstreckt sich bis zu einem TAA-Triplett an den Positionen 2397-2395 auf einem DNA-Strang, der dem für das 65 kD-Antigen kodierenden DNA- Strang komplementär ist, wodurch diese offenen Leseraster im Genom benachbart sind. Dieses offene Leseraster kann für ein Protein kodieren, das eine Sequenz von 517 Aminosäureresten enthält, und dieses Protein wird hier als das 517-Aminosäureprotein oder das 517-Protein bezeichnet. Der für das 517- Protein kodierende Bereich erstreckt sich daher von Position 3948 bis Position 2398 von Abb. 2.
In Anbetracht der Tatsache, daß die beiden langen offenen Leseraster benachbart und auf komplementären Strängen jeweils stromabwärts angeordnet sind, könnte man erwarten, daß die Transkription eines Genes die Transkription des anderen Genes stören könnte, es sei denn, es gäbe Transkriptionsterminationssignale innerhalb des intergenischen Bereiches. Tatsächlich gibt es mehrere kurze Sequenzen (z.B. 2134-2160) innerhalb des intergenischen Bereiches von 520 Basenpaaren, die Merkmale haben, die an die Transkriptionsterminationssignale von Gramnegativen Bakterien erinnern (Rosenberg et al., (1979), Ann. Rev. Genet., 13: 319-353). Das heißt, es gibt Bereiche, die kurze, G+C-reiche, invertierte wiederholte Sequenzen enthalten, die "stem and loop"-Strukturen (Stamm und Schlaufe) bilden können, gefolgt von einer Strecke von 3 oder mehr T-Resten ungefähr 20 Basen vom Zentrum der Spiegelsymmetrie. Diese invertierten wiederholten Sequenzen können vielleicht als Transkriptionsterminationssignale wirken, um die unabhängige Expression jedes dieser mykobakteriellen Gene zu erlauben.
Um festzustellen, ob das offene Leseraster für 517 Aminosäuren in E. coli in Protein exprimiert wird, wurden Extrakte von Zellen, die ein Plasmid (pTB11) enthalten, daß das vollständige offene Leseraster enthält, mit einem polyklonalen Kaninchenantiserum in einem Western-Blot-Test untersucht, wobei das Antiserum mit einem beschallten Extrakt von M. tuberculosis-Bakterien erzeugt worden war. In diesen Rekombinanten müßte das mutmaßliche Proteinprodukt des offenen Leserasters von 517 Aminosäuren unter Verwendung mykobakterieller Regulationssequenzen exprimiert werden. Das polyklonale Antiserum wies mehr als 100 Spezies in einem Extrakt von M. tuberculosis-Zellen sowie das 65 kD-Antigen in Extrakten von E. coli-Zellen nach, die das entsprechende Plasmid (pTB12) enthielten, aber entdeckte keine neuen Proteine in Extrakten von E. coli-Zellen, die Plasmide enthalten, die das offene Leseraster von 517 Aminosäuren tragen. Daher wird dieses offene Leseraster entweder in E. coli nicht unter Verwendung mykobakterieller Regulationssequenzen exprimiert oder das in dem Immunblot verwendete spezielle Antiserum enthielt keine gegen dieses Protein gerichteten Antikörper.
Es ist nicht überraschend, daß dieses offene Leseraster in E. coli nicht unter Verwendung der zuvor diskutierten Rekombinanten exprimiert wird, da frühere Untersuchungen nahelegen, daß die meisten mykobakteriellen Gene in E. coli nicht exprimiert werden (Clark-Curtiss et al., (1985), J. Bacteriol., 161: 1093- 1102; und Thole et al., (1985), Infect. Immun., 50: 800-806). Weiterhin enthält dieses offene Leseraster keine beeindruckende Übereinstimmung mit den E. coli-Konsensus-Promotorsequenzen innerhalb von 400 Basen stromaufwärts vom ATG-Triplett, obwohl es eine Übereinstimmung von 3/5 mit der Shine-Dalgarno-Sequenz für Ribosomenbindungsstellen 12 Basen stromaufwärts vom Initiator ATG-Triplett enthält. In Anbetracht der Größe des offenen Leserasters und seiner einzigartigen strukturellen Merkmale (unten diskutiert) wird es dennoch höchst wahrscheinlich in M&sub4; tuberculosis in Protein exprimiert und kann in E. coli unter Verwendung eines rekombinanten Vektors, der für diese Expression entworfen ist, exprimiert werden, wie im folgenden diskutiert wird.
2. Strukturelle Merkmale des 517-Proteines
Das zweite lange offene Leseraster könnte für 517 Aminosäuren oder ein Protein von ungefähr 51000 Dalton (berechnetes Molekulargewicht: 50561) kodieren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist reich an Alanin, Asparagin, Glycin und Serin und ist insgesamt aus 54% hydrophoben Resten und 46% hydrophilen Resten zusammengesetzt. Die Aminosäuresequenz dieses Proteines weist keine signifikanten Homologien mit irgeneiner der in der Protein-Database enthaltenen Proteinsequenzen auf.
Die auffälligsten Merkmale dieser Sequenz treten zwischen den Aminosäureresten 200 und 350, inbesondere an den Positionen 217 bis 328 auf. Dieser Bereich enthält viele Wiederholungen von kurzen Strecken von Aminosäuren.
Beispielsweise wird die Sequenz von 5 Aminosäuren Asparagin- Asparagin-Asparagin-Isoleucin-Glycin (N N N I G unter Verwendung des Einbuchstabencodes) dreimal hintereinander an den Positionen 227 bis 241 wiederholt.
Aber das vielleicht interessanteste Merkmal betrifft eine Sequenz von 5 Aminosäureresten, die mindestens teilweise Übereinstimmungen mit mehreren Sequenzen in diesem Bereich aufweist. Diese wiederholten Sequenzen von fünf Aminosäuren beginnen bei Position 217 und erstrecken sich bis Position 328 von Abb. 2. Die Konsensus-Sequenz dieser Wiederholungen scheint X-Glycin- Asparagin-Z-Glycin oder, unter Verwendung des Einbuchstabencodes, XGNZG zu sein. Bei den 15 Sequenzen, die mit dieser Konsensus-Sequenz übereinstimmen, ist X am häufigsten Phenylalanin, Serin oder Threonin (12/15), obwohl X auch Isoleucin, Leucin oder Asparaginsäure sein kann. Z ist meistens Isoleucin oder Threonin (10/15), aber auch manchmal Serin, Leucin oder Valin. Zusätzliche Sequenzen zwischen den Positionen 200 und 350 weisen teilweise Übereinstimmungen mit der Konsensus- Sequenz auf (d.h. stimmen mit zwei der drei Kemreste überein).
Die oben erwähnten Sequenzen mit fünf Resten sind vom Aminoterminus zum Carboxyterminus mit zwei aneinandergrenzenden (aufeinanderfolgenden) XGNZG-Sequenzen angeordnet, die auf die drei NNNIG-Sequenzen folgen, die selbst auf acht fortlaufende XGNZG- Sequenzen folgen. Es folgt eine Lücke von ungefähr 17 Resten, der selbst drei fortlaufende XGNZG-Konsensus-Sequenzen folgen. Eine weitere Lücke von fünf Resten folgt, die an weitere zwei fortlaufende XGNZG-Konsensus-Sequenzen mit fünf Resten grenzt. Interessanterweise enthalten beide Lücken zwei der drei Kemreste der Konsensus-Sequenz sowie korrekt angeordnete X- und Z- Reste.
Weiter wird bemerkt, daß dieser Bereich eine direkte Wiederholung einer Sequenz von 14 Aminosäureresten mit nur einer Fehlpaarung (Reste 295-308 und 315-328) enthält. Diese Sequenzen sind unten unter Verwendung des Einbuchstabencodes gezeigt:
295-308 FNSGSGNIGFGNSG
315-328 FNSGSGNIGFGNSG
Da die Aminosäurerest-Wiederholungen der Konsensus-Sequenzen nicht exakt sind, sind die Nukleotidsequenzen in diesem Bereich, wie erwartet, keine exakten Wiederholungen. Diese Beobachtung legt nahe, daß Rekombinationsereignisse, beispielsweise ein ungleicher Crossover, bei den schnellen evolutionären Veränderungen in diesem Bereich keine Rolle spielen werden, wie es bei häufig wiederholten Nukleotidsequenzen oft beobachtet wird.
Der Rest dieser Proteinsequenz zeigt keine weiteren besonders auffallenden Merkmale.
Der hochrepetitive Charakter des 517-Restproteins erinnert an die wiederholten Strukturen, die in den Haupthüllproteinen des Sporozoitenstadium des Malariaparasiten gefunden werden (Nussenzweig et aln, (1985), Cell. 42: 401-403). Diese Circumsporozoit- oder CS-Proteine sind 40-60 kD-Proteine, die auf der Membran des infektiösen Sporozoiten angeordnet sind und ein stark immundominantes Epitop enthalten, das mit den meisten anti- Sporozoiten-Antikörpern reagiert, die in polyklonalen Antiseren gefunden werden, sowie auch mit allen monoklonalen Antikörpern, die gegen das Sporozoitenstadium erzeugt worden sind. Der zentrale Bereich dieser Proteine enthält 20 bis 40 tandemartig angeordnete Wiederholungen einer Sequenz von 11-12 Aminosäuren.
In Plasmodium falciparum ist das immundominante Epitop innerhalb drei aufeinanderfolgender Wiederholungen der Sequenz Asparagin-Alanin-Asparagin-Prolin (NANP; diese Sequenz ist 37mal in einem Isolat wiederholt) enthalten und gegen diese wiederholte Sequenz mit 12 Resten gerichtete Antikörper können einen immunologischen Schutz gegen eine Infektion mit dem Malariaparasiten bereitstellen. Die Sequenz der wiederholten Sequenzen unterscheidet sich in verschiedenen Arten dieses Parasiten und die Anzahl der Wiederholungen kann innerhalb verschiedener Isolate der gleichen Spezies variieren. Die Ähnlichkeit der wiederholten Natur des CS-Proteines und der des 517-Aminosäurereste-Proteines aus M. tuberculosis weist auf die interessante Möglichkeit hin, daß die wiederholten Sequenzen in dem Protein mit 517 Aminosäureresten eine Rolle in der Immunantwort gegen Mykobakterien spielen k:nnten.
3. Expression des 517-Proteines
Obwohl das 517-Protein unter Verwendung des zuvor beschriebenen rekombinanten Konstruktes nicht exprimiert worden war, wurde das Protein in E. coli unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsvektors, der speziell für seine Expression entworfen worden ist, exprimiert. Dieser rekombinante Expressionsvektor wurde wie folgt konstruiert, wobei die Basenpaarnumerierung von Abb. 2 verwendet wird. Es sollte verstanden werden, daß die interessierende DNA-Sequenz hier die untere der beiden gezeigten DNA-Sequenzen ist, und daß die Sequenz von rechts nach links und in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende gelesen wird, obwohl die Sequenz-Positionszahlen von links nach rechts und in Richtung vom 5'-Ende zum 3'-Ende der oberen Sequenz gelesen werden.
Die doppelsträngige DNA-Sequenz von Abb. 2 wurde mit der Endonuklease PvuII gespalten, um ein Fragment zur Verfügung zu stellen, daß sich von Position 3511 bis Position 4019 (509 bp) erstreckt. Das Fragment wurde in die Smai-Stelle des Vektors pUC19 ligiert, um das Intermediat I zu bilden. Für die Ligation des PvuII-Fragmentes in den Vektor waren zwei Orientierungen möglich. Die richtige Orientierung wurde durch übliche Verfahren, beispielweise Isolierung von mehreren inserthaltigen Klonen und Erstellung von Restriktionskarten der DNA aus diesen Klonen bestimmt. Beispielsweise hat ein Bgli-Fragment aus einem Klon mit dem PvuII-DNA-Fragment in richtiger Orientierung ungefähr 1500 bp, während ein BglI-Fragment aus einem Klon mit einem falsch orientierten PvuII-Fragment nur ungefähr 1300 bp hat. Das Intermediat 1 wurde in E. coli eingeführt, um die Vektor-DNA zu vermehren.
Die vermehrte DNA des Intermediates I wurde anschließend mit den Endonukleasen NotI (Position 3603) und SalI (in der pUC19- Polylinkerstelle) gespalten. Das resultierende NotI-SalI- Fragment wurde verworfen, während der Rest der DNA des Intermediates I zurückbehalten wurde.
Eine weitere Probe der DNA-Sequenz von Abb. 2 wurde mit den Endonukleasen NotI (Position 3603) und SalU (Position 2202) gespalten, um ein NotI-SalI-Fragment zur Verfügung zu stellen, das mit den geeigneten Stellen der zurückbehaltenen Intermediat I-DNA ligiert wurde, um einen zweiten pUC19-abgeleiteten Vektor zu bilden, der Intermediat II genannt wurde. Dieser Vektor enthielt die vollständige 517-Protein-DNA-Sequenz und wurde in E. coli weiter vermehrt.
Die vermehrte DNA von Intermediat II wurde gesammelt und mit den Endonukleasen EcoRI und HindIII an ihren entsprechenden Stellen in dem 517-Proteingen und im Polylinker von pUC19 gespalten. Das resultierende EcoRI-HINDIII-Fragment, das die 517- Protein-DNA enthielt, wurde anschließend gesammelt und mit den entsprechenden Stellen in dem Polylinker vom Plasmidvektor pKK223-3 ligiert, um das Intermediat III zu bilden, das den carboxyterminalen Teil des Genes enthielt. Intermediat III wurde in E. coli JM105 kloniert. (pKK223-3 und JM105 sind von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, erhältlich.)
Eine weitere Probe der DNA von Intermediat II wurde nur mit EcoRI gespalten, um einen Teil der DNA von einer Position im Polylinker bis zur Position 2969 im 517-Protein auszuschneiden. Das resultierende EcoRI-Fragment, das DNA enthält, die für den aminoterminalen Teil des 517-Proteines kodiert, wurde gesammelt und anschließend in die einzige EcoRI-Stelle von Intermediat III ligiert, um einen Expressionsvektor zu bilden, der das gesamte 517-Proteingen enthält. Dieser Vektor wurde in E. coli JM105 als ein Replikations-/Expressionsmedium kultiviert.
Es wird angemerkt, daß für die Ligierung des EcoRI-Fragmentes in den Expressionsvektor zwei Orientierungen möglich waren. Die geeignete Orientierung wurde mit üblichen Verfahren, beispielsweise Isolierung mehrerer inserthaltiger Klone und Herstellung von Restriktionskarten der DNA aus diesen Klonen, bestimmt. Beispielsweise enthält ein KpnI-HindIII-Fragment aus einem Klon mit dem EcoRI-DNA-Fragment in richtiger Orientierung ungefähr 2000 bp, während ein KpnI-HindIII-Fragment aus einem Klon mit einem falsch orientierten EcoRI-Fragment nur ungefähr 800 bp enthält.
Die Expression eines rekombinanten Proteines aus Vektor pKK223-3 ist mit IPTG induzierbar und das induzierte rekombinante Protein wird als das Protein selbst und nicht als ein Fusionsprodukt exprimiert. Die resultierenden E. coli-Zellen wurden daher wachsengelassen und dann mit IPTG induziert, wie andernorts in dieser Anmeldung diskutiert werden wird.
Das exprimierte Protein wurde in einer relativ großen Menge erzeugt und konnte in einem SDS-Gel eines Lysates der E. coli- Zellen leicht identifiziert werden. Das 517-Protein hatte ein apparentes Mr von ungefähr 55000 Dalton in SDS-PAGE, wie erwartet.
Das exprimierte 517-Protein kann auch gesammelt und gereinigt werden, beispielsweise mit einer Affinitätssäule aus Sepharose 4B (Pharmacia), an die gegen eines oder mehrere der mit dem 517-Protein in Zusammenhang stehenden Peptide gerichtete Antikörper mittels der Bromcyan-Aktivierungstechnik gebunden werden, oder durch Ammoniumsulfatpräzipitation, gefolgt von DEAE- Cellulosechromatographie.

I. Peptide

Eine Ausführungsform der vorliegenden Peptide bezieht sich auf ein Peptid, das im wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz besteht, die im wesentlichen einem Teil der Sequenz des 540- oder 517-Proteines entspricht. Ein solches Peptid enthält 5 bis ungefähr 40 Aminosäurereste, bevorzugt ungefähr 10 bis ungefähr 20 Aminosäurereste, deren Sequenz im wesentlichen entweder der des 540-Aminosäureproteins oder des 517-Aminosäureproteins entspricht, für die die in Abb. 2 gezeigte DNA-Sequenz kodiert.
Ein nützliches Peptid enthält bevorzugt nur solche Aminosäurereste, die identisch oder homolog mit Resten sind, die in der Sequenz eines der beiden oben erwähnten Proteine vorhanden sind (oder konservative Substitutionen darstellen). Zusätzliche Reste von im wesentlichen jeder Länge können an einem oder beiden Enden des Peptides vorhanden sein. Jedoch darf jeder weitere Rest nicht mit der Aktivität des Peptides interferieren, wie im folgenden diskutiert werden wird, und daher wird gesagt, daß ein erfindungsgemäßes Protein "im wesentlichen besteht" aus einer angegebenen Sequenz. Beispielsweise ist das erfindungsgemäße Peptid frei von immunsupprimierenden Sequenzen. Außerdem ist das resultierende Peptid auch von einem Molekulargewicht von weniger als dem des natürlich auftretenden 540- bzw. 517-Proteines, wenn zusätzliche Reste vorhanden sind und zusammen mit einem oben gezeigten Peptid hinsichtlich der Sequenz im wesentlichen weiteren Teilen des gleichen Proteines entsprechen, denen die Sequenz des Peptides im wesentlichen enspricht.
Ein erfindungsgemäßes Peptid ist unter anderem zur Induktion der Erzeugung von Antikörpern in einem Laborsäugetier, beispielsweise einer Maus oder einem Kaninchen, nützlich. Solche induzierten Antikörper immunreagieren mit dem induzierenden Peptid sowie mit dem Protein, dem die Peptidsequenz im wesentlichen entspricht, wenn das Protein in einer SDS-denaturierten Form vorliegt, wie beispielsweise in einer Western-Blot-Analyse im Anschluß an eine SDS-PAGE-Analyse.
Die anti-Peptid-Antikörper können daher in Festphasentests für den Nachweis der Gegenwart eines Antigenes verwendet werden, das das 540-Protein oder das 517-Protein aus M. tuberculosis ist. In diesem Fall stellt die untersuchte Probe, beispielsweise Sputum, das Antigen zur Verfügung, das an die Festphasenmatrix zur Bildung eines festen Trägers befestigt wird. Eine wäßrige Lösung, die die anti-Peptid-Antikörper oder ihre idiotypischen Teile (Bindungsstellen enthaltende Teile) enthält, wird zugemischt, aufbewahrt und getrennt von der Festphase, wie zuvor für die Gegenwart von anti-65 kD-Protein-Antikörpern diskutiert. Die Gegenwart von gebundenen anti-Peptid-Antikörpern wird anschließend getestet, um die Gegenwart von M. tuberculosis-Antigen in der Probe zu bestimmen, wobei den allgemeinen Mischungs-, Trennungs- und Analyseschritten, die zuvor beschrieben wurden, gefolgt wird. Ganze Antikörper und ihre Idiotyp enthaltenden Teile, beispielsweise Fab- und F(ab')&sub2;- Teile, werden insgesamt als paratopische Moleküle bezeichnet.
In beispielhaften Untersuchungen wurden Antikörper (paratopische Moleküle) gegen sowohl die aminoterminalen als auch die carboxyterminalen Polypeptidsequenzen (Petide 1 und 54 der Tabelle 4, s.u.) des 540-Proteines in weißen Neuseeland-Kaninchen erzeugt. Unterschiedliche Verdünnungen reiner M. tuberculosis Kulturen wurden an die Wände von Mikrotiterplatten gebunden, um einen festen Träger zu bilden, und die eine oder andere der beiden wäßrigen anti-Peptid-Antikörper-Präparationen wurde mit dem festen Träger gemischt, um eine Mischung aus fester und flüssiger Phase zu bilden. Nach dem Aufbewahren der Mischung aus fester und flüssiger Phase für einen Zeitraum, der für die anti-Peptid-Antikörper ausreichend ist, an die vorhandenen mykobakteriellen Antigene zu binden, wurden die Phasen getrennt. Die feste Phase wurde gespült, um die Entfernung ungebundener anti-Peptid-Antikörper sicherzustellen. Die Gegenwart von anti- Peptid-Antikörpern, die an die feste Phase gebunden waren, wurde anschließend durch übliche Verfahren bestimmt.
Als ein Ergebnis dieser Untersuchung wurde festgestellt, daß die Gegenwart eines mykobakteriellen Antigenes bei einer Konzentration von ungefähr 10&sup5; Organismen pro Napf nachgewiesen werden konnte. Sputumproben von Personen mit aktiven M. tuberculosis-Infektionen enthalten typischerweise ungefähr 10&sup5; bis 10&sup6; Organismen in dem Probenvolumen, das in dieser Untersuchung verwendet wurde. Anti-Peptid-Antikörper, die gegen ein erfindungsgemäßes Peptid erzeugt worden sind, wie beispielsweise die gegen die Peptide 1 und 54 hervorgerufenen, können daher zum Nachweis mykobaktierieller Antigene verwendet werden, die in einem Ausmaß vorhanden sind, das in klinischen Umgebungen gefunden wird.
Antikörper wurden auf gleiche Weise gegen das immunologisch aktive rekombinante 540-Fusionsprotein, das von pTB22 produziert wird, erzeugt und eine ähnliche Antikörperbindungsuntersuchung durchgeführt. Die Ergebnisse waren im allgemeinen ähnlich den oben diskutierten, mit der Ausnahme, daß dieser Test etwas empfindlicher war, vermutlich ein Ergebnis des polyklonalen Charakters der induzierten Antikörper.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Tests auf mykobakterielle Antigene können mehrere zusätzliche Immuntests unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt werden, die (a) durch das zuvor erwähnte 540-Protein und besonders (b) durch einen immunobgisch aktiven Teil davon induziert werden, beispielsweise das Fusionsprotein, das von pTB22 erzeugt wird, ein Fusionprotein, das ein erfindungsgemäßes Peptid, einen Teil oder die Gesamtheit eines anderen Moleküles, beispielsweise β-Galaktosidase, fusioniert enthält, oder durch ein erfindungsgemäßes Peptid. Solche zusätzlichen Immuntests sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen beispielsweise Doppelantikörper, "Sandwich"-Tests und Kompetitionstests, in denen ein Peptid oder ein anderes hier beschriebenes Antigen mit einem mykobakteriellen Antigen in der getesteten Probe um die Antikörper konkurriert.
In jedem der Immuntests wird eine auf die Gegenwart eines mykobakteriellen 65 kD-Zellwallprotein-a-Antigens zu testende Probe in einem wäßrigen Medium mit paratopischen Molekülen, die gegen das 540-Protein erzeugt worden sind, oder spezieller gegen einen immunologisch aktiven Teil davon gemischt. Die resultierende Mischung wird für einen Zeitraum aufbewahrt, der für die paratopischen Moleküle ausreichend ist, mit dem in der gemischten Probe vorhandenen mykobakteriellen Antigen eine Immunreaktion einzugehen und einen Immunreaktanten zu bilden. Die Gegenwart und gewöhnlich die Menge des gebildeten Immunreaktanten wird bestimmt.
Die paratopischen anti-Peptidmoleküle können selbst einen Marker enthalten. Bevorzugt wird jedoch ein zweites markerhaltiges Reagenz verwendet, das mit den gebundenen paratopischen Molekülen reagiert, beispielsweise ganze anti-Peptid- Antikörper. Die Peroxidase-konjugierten Ziege-anti-Maus- Antikörper, die hier verwendet werden, sind für solche Reagenzien beispielhaft.
Ein Festphasentestkit, der die anti-Peptid-Antikörper oder andere paratopische Moleküle verwendet, die durch einen immunobgisch aktiven Teil des 540-Proteins induziert werden, ist erfindungsgemäß für die klinische Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens ebenfalls vorgesehen. Hier enthält der Kit in einer Packung mindestens eine Festphasenmatrix, an die das Antigen aus der Probe, auf das getestet wird, oder die Antikörper befestigt werden können, und eine Präparation der paratopischen anti-Peptidmoleküle oder der paratopischen, gegen einen immunologisch aktiven Teil des 540-Proteins gerichteten Moleküle, die mit dem 540 (65 kD)-Protein oder dem 517-Protein immunreagieren, in einer zweiten Packung. Zusätzliche Packungen von Reagenzien, die in Typ und Funktion den zuvor erwähnten ähnlich sind, können ebenfalls vorgesehen werden.
Zum Induzieren paratopischer Moleküle, beispielsweise gesamter Antikörper, wird ein nützliches Peptid typischerweise an ein antigenes Trägermolekül, beispielsweise Keyhole-Limpet- Hämocyanin (KLH; Napfschneckenhämocyanin) als Konjugat gebunden, das Konjugat wird anschließend in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel als ein Inokulum dispergiert und das Inokulum wird in das Laborsäugetier unter Verwendung gut bekannter Verfahren injiziert. Das geimpfte Tier wird behalten und ihm werden nach Bedarf Auffrischungsinjektionen gegeben, bis ein gewünschter Antikörpertiter gegen das induzierende Peptid erreicht ist. Das Antikörper enthaltende Serum des Säugetiers wird anschließend gewonnen, gegebenenfalls gereinigt und in einem diagnostischen Test, beispielsweise einem SDS-PAGE/ Western Blot, auf die Gegenwart eines im wesentlichen korrespondierenden Prote ines verwendet.
Das Wort "Inokulum" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die eine Menge eines Peptidkonjugates, eines Peptidpolymers (wie im folgenden beschrieben), des 65 kD-Proteins oder eines rekombinanten Proteines enthält, die für den beschriebenen Zweck ausreichend ist, und die in einem wäßrigen, physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel gelöst oder dispergiert ist. Beispielhafte Verdünnungsmittel sind gut bekannt und umfassen Wasser, physiologische Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, Ringerlösung, unvollständiges Freund'sches Adjuvanz und ähnliche.
Die Inokula können in Abhängigkeit von ihrer Verwendung unterschiedliche Mengen eines bevorzugten Peptides oder Polymers enthalten.
Wo paratopische Moleküle gebildet werden sollen oder ein Inokulum anderweitig als Impfstoff verwendet werden soll, werden ungefähr 100 bis 500 µg Peptid oder Peptidpolymer pro Injektion in Labortiere, beispielsweise Mäuse, Kaninchen oder Meerschweinchen, verwendet. Wie bekannt ist, werden größere Mengen für größere Tiere verwendet. Ähnliche Mengen von Peptid oder Polymer werden für den in vivo-DCH-Test verwendet.
Kleinere Mengen antigenes Peptid oder antigenes Peptidpolymer werden für in vitro-Stimulationstests verwendet. Bei Verwendung eines Gesamtvolumens von 200 Mikrolitern (µl) und ungefähr 1-2 x 10&sup4; PBMC und ungefähr 1 x 10&sup5; Antigen-präsentierender Zellen sind Konzentrationen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 50 µg Antigen pro ml nützlich.
Beispielhafte Verfahren für die chemische Synthese eines nützlichen Peptides sowie für die Herstellung eines Konjugates und die Verwendung des Konjugates zum Erzeugen von Antikörpern können in den US-Patenten Nrn. 4636463, 4599231, 4599230, 4545931, 4544500 gefunden werden, deren Offenbarungen insgesamt hier durch Verweis einbezogen sind.
Eine weitere Verwendung für ein erfindungsgemäßes bevorzugtes Peptid ist ein Test auf die Gegenwart von mykobakteriell exponierten (oder immunen), d.h. zuvor immunologisch exponierten mononukleären Zellen, beispielsweise T-Zellen, in einer Körperprobe, die solche Zellen enthält. Mykobakteriell exponierte (oder immune) mononukleäre Zellen sind Zellen, die selbst einem mykobakteriellen Immunogen immunologisch ausgesetzt waren oder deren Vorläuferzellen einem solchen Immunogen derart ausgesetzt waren. Ein bevorzugtes Peptid kann daher verwendet werden, um festzustellen, ob ein Säugetier gegen ein Mykobakterium immunisiert worden ist oder eine mykobakterielle Infektion hat oder gehabt hat.
In einem solchen Test werden periphäre mononukleäre Blutzellen, insbesondere T-Zellen, aus dem Säugetier zur Verfügung gestellt. Diese Zellen werden gemischt und in einem wäßrigen Zellkulturmedium mit einer stimulierenden Menge sowohl Antigenpräsentierender Zellen als auch eines bevorzugten erfindungsgemäßen Peptides in Kontakt gebracht, um eine stimulierende Zellkultur zu bilden. Die stimulierende Zellkultur wird für einen Zeitraum aufbewahrt, der für die vorhandenen immunen mononukleären Zellen ausreichend ist, stimuliert zu werden und von dieser Stimulation Zeugnis zu geben, gewöhnlich ungefähr 18 bis 96 Stunden und meistens 24 bis 48 Stunden unter üblichen Zellkulturbedingungen. Das Auftreten einer mononukleären Zellstimulation wird anschließend bestimmt.
Wo eine mononukleäre Zellstimulation festgestellt wird, weist sie auf das Vorhandensein von Zellen in der getesteten mononukleären Zellpopulation hin, die selbst einem Mykobaktenum immunologisch exponiert waren oder deren Elterlinie einem Mykobakterium immunologisch ausgesetzt war.
Wie durch die in Tabelle 3, oben, gezeigten Ergebnisse veranschaulicht ist, waren das rekombinante 540-Protein und das rekombinante Fusionsprotein, das einen Teil des β-Galaktosidasemoleküls und einen immunologisch aktiven Teil des 540-Proteines enthält, für die Stimulation mykobakteriologisch immuner mononukleärer Zellen in vivo in einem DCH-Test nützlich. Solche Moleküle können in dem oben beschriebenen Test und in den im folgenden beschriebenen Stimulationstests auf die gleiche Weise wie die Peptide und anstelle eines Peptides verwendet werden.
Die Stimulation mononukleärer Zellen kann auf mehrere Arten bestimmt werden, die in der Technik gut bekannt sind und von denen einige im folgenden besonders beschrieben werden. Die Zellen der mononukleären Zellpopulationen, die gewöhnlich stimuliert werden, sind T-Zellen, und aus diesem Grund werden die mononukleären Zellen im folgenden üblicherweise als T-Zellen bezeichnet. Genauer gesagt sind die Zellen, die typischerweise stimuliert werden, T-Zellen, die das CD4- oder T4-Antigen (CD4&spplus; oder T4&spplus;) und solche, die das CD8- oder T8-Antigen (CD8&spplus; oder T8&spplus;) aufweisen. Diese T-Zellen werden oft allgemeiner als Helfer- und Killer- bzw. cytotoxische T-Zellen bezeichnet.
Beispielhafte Wege, auf denen eine T-Zell-Stimulation bestimmt werden kann, umfassen (a) die Proliferation, getestet als Aufnahme eines radiomarkierten Nukleosides, beispielsweise [³H]- Desoxythymidin, auch bezeichnet als [³H]-Tdr, [³H]-Thymidin ([³H]- T), (b) die Ausscheidung von Interferon-γ, (c) die Ausscheidung von Interleukin-2 (IL-2), (d) die Ausscheidung von Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF), (e) Cytotoxizität, ein Phänomen, das bei T-Zellen, beispielsweise T4&spplus;-T-Zellen, sowie bei T8&spplus;-Zellen auftreten kann, (f) die Fähigkeit zum Bereitstellen einer B-Zell-Helferfunktion in vitro, (g) die Fähigkeit von immunen T-Zell-Klonen, eine verzögerte Hautüberempfindlichkeitsreaktion (DCH) in vivo auszulösen, wie hier und im US-Patent Nr. 4,689,397 beschrieben, dessen Offenbarungen hier durch Verweis einbezogen werden, und (h) die Fähigkeit von Immun-T-Zell-Klonen, in vivo eine schützende Immunität zu verleihen.
Für die Verwendung im unmittelbar zuvor beschriebenen Test ist außerdem ein Kit vorgesehen. Dieser Kit kann eine Anzahl von Behältern umfassen, von denen mindestens einer ein erfindungsgemäßes bevorzugtes Peptidantigen oder ein Polymer eines solchen Peptidantigenes enthält, dessen wiederholte Einheiten aus einem Peptid mit "Di-Cys-Enden" bestehen, wie im folgenden diskutiert. Eine Mischung von zwei oder mehr solcher bevorzugter Peptide oder ihrer Polymere kann ebenfalls vorhanden sein. Im Behälter ist eine ausreichende Menge eines bevorzugten Peptides oder Peptidpolymers enthalten, um mindestens einen Test unter Verwendung dieses Verfahrens durchzuführen.
Der Testkit kann weiter eine vorher gemessene Menge eines Puffers oder eines anderen Salzes zur Herstellung eines Inokulums des Peptides oder Polymers nach Zusatz von Wasser oder anderen geeigneten wäßrigen Medien umfassen. Das Inokulum kann auch in einer vorgemischten wäßrigen Form zur Verfügung gestellt werden, entweder in der Konzentration für die Verwendung oder als ein zu verdünnendes wäßriges Konzentrat.
Natürlich können sich die speziellen Bestandteile und Konzentrationen solcher Bestandteile zwischen in vitro- und in vivo Tests unterscheiden sowie zwischen verschiedenen Säugetieren, deren Zellen zu testen sind. Solche Bestandteile und Konzentrationen können durch den Fachmann leicht bestimmt werden. Es ist weiter zu verstehen, daß ein zuvor beschriebenes Fusionsprotein, das einen immunologisch aktiven Teil eines mykobakteriellen 65 kD-Zellwallprotein-a-Antigenes umfaßt, ebenfalls zum Ausschluß eines Peptides oder Peptidpolymers als Antigen verwendet werden kann. Das Antigen des Kits kann daher im weiteren Sinn als ein mykobakterielles Antigen beschrieben werden.
Die Sequenz eines nützlichen Peptides entspricht im wesentlichen einer Sequenz entweder des 540- oder des 517-Proteines, die zuvor diskutiert worden sind. Eine wesentliche Entsprechung der Peptidsequenzen kann auf mehrere Arten bestimmt werden.
Natürlich entsprechen sich zwei Peptide mit identischen Sequenzen im wesentlichen, so wie es zwei Peptide tun, die identische Sequenzen enthalten, aber darüber hinaus eine oder mehrere weitere Sequenzen enthalten. Ähnlich entsprechen sich zwei Sequenzen im wesentlichen, die sich durch konservative Substitutionen unterscheiden, beispielsweise Isoleucin für Leucin oder Valin, Asparaginsäure für Glutaminsäure, Asparagin für Glutamin, Arginin für Lysin, Serin für Threonin, Phenylalanin für Tryptophan und Tyrosin für Phenylalanin.
Zwei Sequenzen können sich auch im wesentlichen entsprechen, wenn Antikörper, die gegen eine erzeugt worden, mit der anderen immunreagieren. Beispielsweise können die besonderen im folgenden offenbarten Peptide zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die mit dem 65 kD(540)-Protein immunreagieren, und folglich entsprechen solche Peptide im Hinblick auf ihre Sequenz im wesentlichen der Sequenz des 65 kD-Proteines.
Der biochemische Beweis aus Immuntests und aus der Analogie mit konservierten Protein-Protein-Wechselwirkungen in aufgelösten kristallographischen Röntgenstrukturen mit sich unterscheidenden Sequenzen, beispielsweise bei den Dimerkontakten von oligomeren Enzymen, weist darauf hin, daß die Konservierung der Protein-Protein-Erkennung keine strenge Konservierung der Sequenz erfordert, um verwandt zu sein. Während einzelne Aminosäurerestveränderungen eine solche Erkennung in Abhängigkeit von der Natur der Substitution in einem großen Ausmaß beeinträchtigen können, kann die Verwandtschaft und die wesentliche Entsprechung von zwei sich unterscheidenden Aminosäuresequenzen hinsichtlich der Protein-Protein (und antigenen und/oder immunogenen) -Erkennung in Form von sieben grundlegenden Aminosäureparametern ausgedrückt werden:
(1) Hydrophobizität;
(2) evolutionäres Auftreten von Veränderungen in bekannten Sequenzen
(3) Größe der Seitenketten
(4) Ladung und Polarität
(5) Präferenz für eine gebogene Sekundärstruktur
(6)Präferenz für eine β-Strang-Sekundärstruktur und
(7) Präferenz für helikale Sekundärstrukturen. Um das Ausmaß einer Sequenzidentität, die für die antigene und/oder immunogene Erkennung relevant ist, und daher die wesentliche Entsprechung von Peptidvarianten zu definieren, kann eine Konsensusmatrix auf der Grundlage der oben angegebenen 7 Kriterien auch verwendet werden, um jedem Aminosäurepaar in den Sequenzen, die fur eine wesentliche Entsprechung berücksichtigt werden, numerische Werte zuzuerkennen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine Konsensusmatrix verwendet werden, die von Dr. Elisabeth Getzoff und Dr. John Tainer, Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA, entwickelt worden ist. Diese Konsensusmatrix lautet wie folgt, wobei die einzelnen Aminosäurereste im Interesse einer präzisen Darstellung im Einbuchstabencode angegeben sind:
Ein Sequenzvergleich unter Verwendung der vorstehenden Konsensusmatrix involviert die Bestimmung aller möglichen Zuordnungen und die anschließende Bewertung dieser Zuordnungen durch die Matrix. Zwei Sequenzen werden dann einander zugeordnet, indem die maximale Übereinstimmung mit der Konsensumatrix bestimmt wird. Eine Zuordnungsbewertung in Standardabweichungseinheiten kann bestimmt werden, indem der Unterschied zwischen der maximalen Übereinstimmung und der durchschnittlichen maximalen Übereinstimmung für eine statistische Permutation der beiden Sequenzen bestimmt wird und dann durch die Standardabweichung der statistischen Bewertung geteilt wird.
Für die vorliegenden Zwecke zeigt ein Konsensusmatrixpunktestand von mehr als 3 Standardabweichungen (ungefähr ein Durchschnittswert von ungefähr 3 pro Rest) eine signifikante Verwandtschaft bei einem Zuverlässigkeitsgrad (confidence level) von mehr als 99,7 %. Dies ist ein restriktives Kriterium, weil es eine Frequenz von 0,005 für alle Peptide mit 5 Resten und 0,0014 für alle Peptide mit 13 Resten gibt, die in 2222 bekannten Proteinsequenzen auftreten. Ähnlich zeigt ein Konsensusmatrixpunktestand von mehr als 2 Standardabweichungen (ungefähr ein Durchschnittswert von ungefähr 2 pro Rest) eine wesentliche Entsprechung, bei einem Zuverlässigkeitsgrad von mehr als 95,4% signifikant zu sein.
Um für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eine wesentliche Entsprechung zu bestimmen, wird der Konsensusmatrixpunktestand durch Feststellen des Matrixwertes für jedes zugeordnete Aminosäurepaar, das betrachtet wird, und anschließendes Summieren der individuellen Werte für jedes solches Paar rechnet. Die erhaltene Summe wird dann mit der Anzahl von Standardabweichungen verglichen, die den gewilnschten Zuverlässigkeitsgrad signifikant macht. Wenn die erhaltene Summe größer als das Produkt der ausgewählten Anzahl von Standardabweichungen, multipliziert mit der Anzahl der in Betracht gezogenen Aminosäurepaare ist, dann entsprechen die im Vergleich stehenden Aminosäuresequenzen im wesentlichen dem angezeigten Zuverlässigkeitsgrad.
Um beispielsweise die wesentliche Übereinstimmung der Aminosäuresequenz en
-Lys-Trp-Phe-Cys-Glyund
-Arg-Ile-Phe-Cys-Gly-
festzustellen, ergibt die Konsensusmatrix die folgenden Werte: Wert Insgesamt
Für eine wesentliche Übereinstimmung bei einem Zuverlässigkeitsgrad von 99,7 % muß der Konsensusmatrixpunktestand die Anzahl der in Betracht gezogenen Aminosäurepaare, multipliziert mit 3, übersteigen, d.h. 5 x 3 oder 15. Insoweit als 27 größer ist als 15, gibt es tatsächlich eine wesentliche Entsprechung zwischen den beiden oben gezeigten Peptidsequenzen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gibt es eine wesentliche Entsprechung zwischen Peptiden innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung von gegenwärtig bevorzugt mindestens bei einem Zuverlässigkeitsgrad von 95%, und besonders bevorzugt bei einem Zuverlässigkeitsgrad von 99%.
Eine DNA-Sequenz kann einer anderen DNA-Sequenz im wesentlichen entsprechen, wenn beide Sequenzen Sequenzen von 15 Basen, die in Phase oder identisch sind, enthalten, oder Basen, die nicht identisch sind, aber für eine identische Sequenz von Aminosäuren kodieren, oder für Aminosäurerestsequenzen kodieren, die sich im wesentlichen entsprechen. Daher werden Aminosäuresequenzen, die einander im wesentlichen entsprechen, von DNA- Sequenzen kodiert, die sich im wesentlichen entsprechen.
Es sollte festgehalten werden, daß 2 oder mehr Peptidsequenzen sich im wesentlichen entsprechen können, wie durch eine oder beide der beiden letztgenannten Definitionen bestimmt, und doch verschiedene Immunreaktivitäten mit Antikörpern aufweisen, die gegen das intakte Protein gerichtet sind, wie es in der Natur gefunden wird oder bei T-Zellen, die mit solchen natürlichen Proteinen stimuliert sind. Ein Beispiel dieses Phänomens wird im folgenden diskutiert.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide wurden verschiedene Proliferationstests durchgeführt. Die Ergebnisse für untersuchte Peptide sind unten gezeigt und diskutiert.
Eine Untersuchung wurde unter Verwendung gesammelter periphärer mononukleärer Blutzellen (PBMC) aus mit M. bovis BCG geimpften Menschen durchgeführt. Die Einzelheiten dieser Untersuchung sind im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben. Kurz gesagt wurden die PBMC isoliert und in Kulturplattenvertiefungen ausgesät. Solche PBMC-Populationen enthalten ihre eigenen endogenen Antigen-präsentierenden oder Ammenzellen. Ein erfindungsgemäßes Peptid wurde mit entweder 0,1 Mikrogramm pro Milliliter (µg/ml), 1 µg/ml oder 10 µg/ml Kultur als Antigen zugesetzt. Die Antigen/Zellkulturmischung wurde über einen Zeitraum von 6 Tagen aufbewahrt, und nach dieser Zeit wurde radiomarkiertes Thymidin zugemischt. Die Kulturen wurden 18 Stunden später geerntet und der Thymidineinbau in einem Flüssigkeitsszintillationsmeßgerät gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 5, unten, gezeigt. Tabelle 5 Protein 540 Pedtid-induzierte PBMC-Proliferation¹ Peptidnummer² Positionen der Reste³ proliferative Antwort&sup4;
¹ Die Proliferation wurde durch Einbau von [³H]-Thymidin in Zerfällen pro Minute (cpm) gemessen.
² In Klammern gesetzte Peptidzahlen weisen auf Vergleichsbeispiele hin
³ Peptidsequenzpositionen, wie in Tabelle 2 und in Abb. 2 gezeigt.
&sup4; Eine proliferative Antwort, die für eine optimale Peptidkonzentration angegeben wird, wird wie folgt dargestellt: "+++"= 10000-40000 cpm; "++" = 2000-10000 cpm; oder "-" = 300-700 cpm. Die Proliferation in Abwesenheit von Peptidantigen betrug 421 ± 37 cpm und betrug 82857 ± 2913 cpm in Gegenwart eines M. tuberculosis-Extraktes. Die Standardabweichungen überschritten in keiner der Dreifachmessungen 15%.
* Peptide, von denen vorhergesagt wird, daß sie amphiphile Helices bilden.
Die oben gezeigten Ergebnisse wiesen darauf hin, daß 9 der 20 untersuchten Peptide eine starke proliferative Antwort hervorriefen. So wurden 9 Bereiche des 540-Proteins als humane T- Zell-Antigene identifiziert.
Von 7 Bereichen des 540-Proteins wurde mittel computergestützter Analyse vorhergesagt, daß sie amphiphile Helices bilden. Bereiche, die amphiphile Helices bilden, scheinen eine höhere Wahrscheinlichkeit dafür zu haben, von T-Zellen erkannt zu werden. Berzofsky, (1985) Science. 229: 932-940. Jedoch ergaben nur 5 dieser 7 Peptide eine proliferative Antwort. Das weist darauf hin, daß Amphiphilizität weder ausreichend noch notwendig ist, damit ein Peptid mit T-Zellen in Wechselwirkung tritt.
In weiteren Untersuchungen mit PBMC aus einzelnen mit BCG immunisierten Menschen wurde ein Einfluß des HLA-Typs auf die Reaktivität festgestellt. Daher reagierten Lymphozyten aus zwei Personen mit dem HLA-DR4-Allel mit dem Peptid 62 (Positionen 364-408), aber nicht mit Peptid 30 (Positionen 291-305), während Zellen von 3 Personen mit HLA-DRL-Allel mit Peptid 30 reagierten, aber nicht mit Peptid 62.
Die oben gezeigten Ergebnisse weisen auf eine genetische HLA- Restriktion auf die proliferative Antwort hin. Eine Mischung bevorzugter Peptide oder ihrer Polymere ist daher bevorzugt, wenn eine nicht inzüchtige Population, beispielsweise Menschen, untersucht wird, so daß falsch-negative Antworten minimiert werden können.
Eine andere Proliferationsuntersuchung wurde mit 16 der oben erwähnten Peptide durchgeführt. Die proliferativen Zellen waren hier entweder eine oder zwei T-Zellklone oder eine polyklonale T-Zellinie. Ein T-Zellklon kam von einem Tuberkulosepatienten (AH) und wird K8AH genannt. Der zweite T-Zellklon wurde von einer Person (JM) erhalten, die mit Hitze-getötetem M. leprae geimpft wurde und wird als A7JM bezeichnet. Die polyklonale T- Zellinie (JM) wurde ebenfalls aus den Zellen von JM erhalten, die anfangs mit M. bovis-BCG stimuliert worden waren, gefroren gelagert wurden und anschließend mit einem rekombinanten 65 kD- Protein aus M. tuberculosis stimuliert wurden (Oftung et al., (1987), J. Immunol., 138: 927-931).
Die Proliferation wurde wiederum mit dem [³H]-Thymidin-Einbauverfahren getestet. Hierbei wurden autologe PBMC, die bestrahlt worden waren, um eine Proliferation zu inhibieren, aber ausreichend lebensfähig waren, um als Antigen-präsentierende Zellen zu wirken, zu den Kulturen sowohl isolierter T-Zellklone als auch der Zellinie zusammen mit einem mykobakteriellen Antigen zugefügt. Nach 3 Tagen Aufbewahren wurden die Kulturen 4 Stunden mit dem Radiomarker pulsmarkiert, geerntet und dann gezählt.
Die Einzelheiten dieser Untersuchung sind im Abschnitt "Material und Methoden" ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6, unten, gezeigt. Tabelle 6 Protein 540 Peptid-induzierte Proliferation¹ Proliferative Antwort³ Peptidnummer² M. tuberculosis rekomb. 65 kD&sup5; M. tuberculosis&sup5; M. bovis BCG&sup5; M. leprae&sup5;
1,2 siehe Fußnoten zu Tabelle 5
³ proliferative Antworten in cpm x 10&supmin;³ Standardabweichung für zwei oder drei Replikauntersuchungen unter Verwendung von 10 µg/ml jeden Peptides. Positive Werte sind unterstrichen.
&sup4; Antwort in Abwesenheit von Antigen.
&sup5; affinitätsgereinigtes rekombinantes M. tuberculosis-65 kD- Protein mit 50 µg/ml und gesamten Mykobakterien mit 20 µg/ml.
Die in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse zeigen die klonale Spezifität der untersuchten Peptide für Antigene. Dabei zeigte der für den M. tuberculosis-Komplex (Oftung et al., (1987), J. Immunol., 138: 927-931) spezifische T-Zellklon K8AH eine proliferative Antwort nach Stimulieren mit einem Inokulum, das Peptid 24 (231-245) enthielt. Der T-Zellklon A7JM, der eine Kreuzreaktivität mit M. tuberculosis und M. ledrae zeigt, reagierte auf die Stimulation durch Mischen und Kontakt mit einem Inokulum, das ein anderes Segment des 65 kD-Proteins (540-Protein) enthielt, dargestellt durch das Peptid 22 (211-225), aber nicht auf Inokula, die die flankierenden und überlappenden Peptide 21 (201-215) und 23 (219-233) enthielten.
Die polyklonale T-Zellinie JM proliferierte ebenfalls in Antwort auf das Inkontaktbringen mit Inokula, die die Peptide 24 und 22 enthalten. Diese T-Zellinie zeigte ebenfalls eine signifikante Proliferation in Antwort auf das Mischen und Inkontaktbringen mit einem Inokulum, das das Peptid 23 enthält, dessen Sequenz die Sequenzen der beiden Peptide 24 und 22 überlappt und von dem vorhergesagt worden war, daß es eine amphiphile Helix bilde. Das Inkontaktbringen der polyklonalen T-Zellinie mit einem Inokulum, das das Peptid 46 enthielt (Position 451-465), stellte ebenfalls eine signifikante Stimulation zur Verfügung.
Die genomische Sequenz des 65 kD-Proteines von M. leprae und das mutmaßliche Translationsprodukt des Genes sind publiziert (Mehra et al., (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 7013- 7017.) Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen des 65 kD-Proteines aus M. leprae und M. tuberculosis zeigt, daß die beiden Sequenzen sehr ähnlich sind, wobei es zwischen ihnen nur relativ wenig Unterschiede gibt.
Vom T-Zellklon A7JM ist zuvor gezeigt worden, daß er als Reaktion auf die Stimulation sowohl mit ganzen M. leprae als auch mit ganzen M. tuberculosis proliferiert (Mustafa et al., (1986), Lepr. Rev. Suppl., 2: 123-130). Im Einklang mit diesen Feststellungen proliferierte der Klon A7JM ebenfalls, wenn er mit einem das Peptid 64, unten, enthaltendem Inokulum gemischt und in Kontakt gebracht wurde, dessen Sequenz sich von der des Peptides 22 durch konservativen Austausch des Restes an Position 215 von Glutaminsäure in Asparaginsäure in Peptid 22 unterschied.
(22) AVLEDPYILLVSSKV
(64) AVLEDPYILLVSSKV
Der T-Zellklon K8AH kann zwischen M. tuberculosis und M. leprae, die für die Stimulation als gesamte Bakterien dargeboten werden, unterscheiden und war auf ähnliche Weise fähig, die gleiche Unterscheidung auf dem Peptidniveau vorzunehmen. Das mit M. tuberculosis in Zusammenhang stehende Peptid 24 (231- 245) konnte daher verwendet werden, um den Klon K8AH zu stimulieren, während der Kontakt mit einem Inokulum, das Peptid 65, unten, enthält, das die analoge M. leprae-Sequenz enthielt, den Klon nicht zur Proliferation stimulierte. Das Peptid 65 enthaltende Inokula stimulierten den Klon A7JM oder die polyklonale Zellinie JM ebenfalls nicht.
(24) LLPLLEKVIGAGKPL
(65) LLPLLEKVIQAGKSL
Wie aus dem Vergleich der oben gezeigten Sequenzen der Peptide 24 und 65 entnommen werden kann, unterscheiden sich diese Peptide durch Substitution von 2 Resten nahe ihren Carboxylenden. Das Glycin (G) bei Position 240 des Peptides 24 ist substituiert und ist Glutamin (Q) im Peptid 65 und das Prolin (P) an Position 244 des Peptides 24 ist substituiert und ein serin (S) in Peptid 65.
Die Erkennung des Peptides 24 durch den Klon K8AJ muß daher durch Glycin 240 und/oder Prolin 244 beeinflußt werden. Interessanterweise verursachte ein das Peptid 25 (241-255) enthaltendes Inokulum, das Prolin 244 enthält, keine Stimulation von Zellen des Klones K8AH, wenn es mit diesen Zellen gemischt und in Kontakt gebracht wurde.
Um zu bestimmen, ob ein das Peptid 65 enthaltendes Inokulum die stimulatorische Antwort, die durch das Peptid 24 auf Zellen des T-Zellklones K8AH verursacht wird, inhibieren könnte, wurde eine Blockierungsuntersuchung durchgeführt. Diese Untersuchungen zeigten, daß das mit M. leprae verwandte Peptid 65 die durch das M. tuberculosis-verwandte Peptid 24 induzierte Antwort nicht blockieren konnte. Diese Feststellung impliziert wiederum, daß einer oder beide der Reste an den Positionen 240 und 244 des Peptides 24 kritisch sind.
Weitere Stimulationsuntersuchungen wurden unter Verwendung von mit M. leprae verwandten und M. tuberculosis-Peptiden und den zuvor erwähnten T-Zellklonen und T-Zellinien durchgeführt. Ein das Peptid 23 enthaltendes Inokulum verursachte die Stimulation der polyklonalen Zellinie. Die Sequenz des Peptides ist in M. leprae und M. tuberculosis identisch (siehe auch Tabelle 6).
Zusätzlich konnten zwei mit M. leprae verwandte Peptide, 64 und 66, die jeweils eine einzelne Aminosäuresubstitution im Vergleich zu ihren mit M. tuberculosis verwandten Peptiden, 22 bzw. 46, enthalten, eine Stimulation der gegen M. leprae immunen Zellinie JM hervorrufen, wenn Inokula, die das eine oder das andere enthielten, gemischt wurden und mit diesen Zellen in Kontakt gebracht wurden. Weder das M. leprae verwandte Peptid 64 noch das Peptid 66 stimulierten Zellen von T-Zellklon K8AH. Die Sequenzen von Peptid 66 und dem ihm analogen Peptid 46 sind unten gezeigt.
(46) IAFNSGLEPGVVAEK
(66) IAFNSGMEPGVVAEK
Jedes der Peptide 64, 65 und 66 entspricht im wesentlichen den Peptiden 22, 24 bzw. 46. Ungeachtet dieser wesentlichen Übereinstimmung zeigen die Ergebnisse, daß es Unterschiede in der Reaktivität solcher Peptide auf der T-Zellebene geben kann.
Das verschiedene Reaktivitäten bei der T-Zellstimulation für im wesentlichen entsprechende Peptide gefunden wurden, die sich in ihrer Sequenz unterschieden, ist nicht besonders überraschend angesichts des Typs der Wechselwirkung, von dem angenommen wird, daß er in die T-Zellstimulation durch ein Antigen involviert ist, im Vergleich zu einer Antigen-Antikörper-Wechselwirkung.
Eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung wird daher im wesentlichen als eine relativ einfache Liganden-Rezeptoren-Wechselwirkung angesehen, in der Substitutionen von polaren durch polare Reste (z.B. Glutaminsäure für Asparaginsäure in den Peptiden 22 und 66) oder apolare für apolare ungefähr der gleichen Größe (z.B. Leucin für Methionin in den Peptiden 46 und 47) typischerweise keine großen Konsequenzen haben. Tatsächlich ist gezeigt worden, daß für einige Influenza-verwandte Peptide mit 13 Resten drastische Substitutionen auftreten können, wobei geringe Unterschiede hinsichtlich der Bindung durch einen monoklonalen Antikörper, der gegen das Parentalpeptid erzeugt wurde, festgestellt werden. Siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 4,631,211.
Von der T-Zellstimulation wird auf der anderen Seite angenommen, daß sie einem Sandwich ähnele, indem die T-Zelle und die Antigen-präsentierende oder Ammenzelle das Brot sind und das Antigen die Füllung. Ein Peptidantigen muß daher an zwei Rezeptoren binden, einem auf der T-Zelle und dem anderen, von dem angenommen wird, daß es ein oder mehrere Proteine des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf der Ammenzelle sind. Zusätzlich wird angenommen, daß die Bindung zwischen Antigen und den Rezeptoren der T-Zellen und Ammenzellen schwächer ist, als die übliche Antigen-Antikörper-Bindung. Es war daher nicht überraschend, daß die Substitutionen von Glycin gegen Glutamin und Prolin gegen Serin zwischen den Peptiden 24 und 65 zu Unterschieden bei der T-Zell-Stimulation führten.
Wie zuvor erwähnt, kann sich die T-Zell-Stimulation auf eine Anzahl von Weisen manifestieren. Die vorherige Diskussion hat sich in erster Linie mit in vitro- und in vivo-Proliferations tests befaßt. Die unten diskutierten Ergebnisse unter Verwendung der T-Zellklone K8AH und A7JM zeigen weitere Manifestationen der T-Zell-Stimulation und Weisen, auf denen solche Stimulation bestimmt werden kann.
Standardtests für die Ausscheidung von IL-2, Granulocyten- Makrophagen-Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) und Interferon-γ in die Überstände von wäßrigen stimulatorischen T-Zell- Kulturen wurden unter Verwendung der oben klonierten T-Zellen durchgeführt, um die Stimulation zu veranschaulichen. Die Cytotoxizität gegen Makrophagen, die mit dem gleichen stimulatonschen Peptid oder ganzen Mykobakterien pulsbehandelt worden waren, wurde ebenso untersucht. Einzelheiten dieser Untersuchungen sind im Abschnitt "Material und Methoden" zur Verfügung gestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7, unten, gezeigt. Tabelle 7 Protein 540; Peptid-induzierte stimulatorische Antworten in T-Zellklonen¹ T-Zellklone² Cytotoxizität&sup6; Peptid M. tuberculosis
¹ Die T-Zellklone wurden durch das Peptidantigen stimuliert, von dem zuvor gezeigt worden ist, daß es den jeweiligen Klon spezifisch aktivieren kann. Die Stimulation wurde mit vier Verfahren getestet. T-Zellen und Antigen-präsentierende Zellen (APC) ohne Antigen wurden als negative Kontrollen in allen Tests verwendet. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (wo berechnet) von zweifachen oder dreifachen Kulturen ausgedrückt.
² Der Kulturinhalt zusätzlich zu dem Medium ist bei jedem Eintrag gezeigt, wobei Pluszeichen (+) auf die Gegenwart von gemischten zellulären Bestandteilen und Antigen (Peptid oder M. tuberculosis) hinweisen, wo sie vorhanden sind.
³ Die Ergebnisse sind in Einheiten pro ml ausgedrückt.
&sup4; Der Test beruht auf drei unabhängigen Untersuchungen unter Verwendung von drei verschiedenen Knochenmarks-Donoren. Die Ergebnisse sind als kolonieformende Einheiten GM pro 2x10&sup5; Zellen ausgedrückt. Die in Klammern gesetzten Prozentsätze beziehen sich auf die Anzahl der von einem GM-CSF-positiven Kontrollüberstand induzierten Kolonien.
&sup5; Ergebnisse, ausgedrückt als internationale Einheiten pro ml.
&sup6; Ergebnisse, ausgedrückt als Prozentsätze, wie diskutiert im Abschnitt "Material und Methoden". APC + Antigen wurde als Negativkontrolle verwendet.
&sup7; n.b. nicht bestimmt.
Die Ergebnisse der Tabelle 7 zeigen weiter Standardverfahren, die zum Bestimmen der Gegenwart stimulierter T-Zellen zusätzlich zum zuvor diskutierten Proliferationstest nützlich sind.
Tests der T-Zellklone K8AH und A7JM wiesen darauf hin, daß beide den Helfer/Inducer(T4&spplus;, T8&supmin;)-Phonotyp zeigen. Zellen des T4&spplus;-Phänotyps sind in erster Linie Helferzellen, die ein Antigen plus Klasse II HLA-Protein erkennen. Von solchen Zellen ist auch bekannt, daß sie eine Cytotoxizität aufweisen, wie in Tabelle 7 gezeigt ist.
Tuberkulose ist eine Erkrankung&sub1; in der der zelluläre Teil der Immunantwort involviert ist in den wesentlichen Ausschluß des humoralen (Antikörper-) Teiles der Immunantwort. Daher weist die Fähigkeit der bevorzugten Peptidantigene, die T-Zellklone zu stimulieren, daß sie nicht nur proliferieren, sondern auch IL-2, GM-CSF und Interferon-γ ausscheiden, deren jedes einen Teil der zellulären Immunitätsantwort darstellt, darauf hin, daß diese Peptide, ihre Polymere und Mischungen davon sowie das 540-Protein (65 kD-Protein) eine bedeutende Rolle bei der protektiven Immunität spielen können.
Diese Rolle bei der zellulären Immunität wird unterstrichen durch die Makrophagen-Cytotoxizität, die die Klone aufweisen, die von den Peptiden oder den gesamten Mykobakterien stimuliert werden. Eine ähnliche Cytotoxizität für andere auf Mykobakterien reaktive T-Zellklone ist beschrieben worden (Mustafa et al., (1987), Clin. Exp. Immunol., 69: 255-262; Kaufman et al., (1986), Lep. Rev. 57, Suppl. 2: 101-111.) Es wird jedoch angenommen, daß die oben erwähnten Resultate der erste Beweis dafür sind, daß die gleiche Sequenz eines Proteinantigenes sowohl in die T-Zell-Hilfe als auch die Cytotoxizität verwickelt ist. Von der in vivo-Rolle solcher T4&spplus; cytotoxischen T-Zellen wird angenommen, daß sie solche Makrophagen zerstören, die unfähig geworden sind, ihre intrazellulär wachsenden Mykobakterien abzutöten.
Von einem bevorzugten Peptid wurde hier zuvor beschrieben, daß es die gegen Mykobakterien immunen mononukleären Zellen stimulieren kann, und von einem solchen Peptid wurde gesagt, daß es zum Testen einer gegenwärtigen oder vorherigen immunologischen Exposition solcher Zellen gegenüber Mykobakterien nützlich wäre. Ein besonders bevorzugtes Peptid oder sein Polymer kann außerdem ein Tier zum Schutz gegen mykobakterielle Infektionen immunisieren, beispielsweise gegen M. tuberculosis.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf einen Impfstoff gegen Mykobakterien, beispielsweise M. tuberculosis, der ein physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt, das als Immunogen eine zur Immunisierung wirksame Menge (1) eines Peptides enthält, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen einem besonders bevorzugten T-Zell-stimulierenden Peptid entspricht, das hier beschrieben ist, oder (2) eines Polymers eines solchen besonders bevorzugten T-Zell-stimulierenden Peptides, wie es hier beschrieben wird.
Beispielhafte, besonders bevorzugte Peptide umfassend die Peptide 22 und 24. Weitere besonders bevorzugte Peptide sind jene, deren Sequenzen im wesentlichen einer Sequenz des M. tuberculosis-540-Proteines oder eines anderen mykobakteriellen 65 kD- Proteines entsprechen und die 5 bis ungefähr 40, besonders bevorzugt ungefähr 10 bis ungefähr 20 Reste enthalten und weiter die Proliferation von gegen Mykobakterien immunen, und für eine Tuberkuloseimpfstoff, gegen M. tuberculosis immunen T-Zellen stimulieren können, die den T4&spplus; - und/oder T8&spplus;-Phänotyp aufweisen.
Weitere besonders bevorzugte Peptide können erhalten werden, indem ein Verfahren verfolgt wird, das dem zuvor diskutierten ähnlich ist. Polyklonale T-Zellen von einem oder mehreren Individuen werden mit einem Inokulum in Kontakt gebracht, das ein erfindungsgemäßes Peptid enthält. Von einem solchen Peptid ist bereits gezeigt worden, daß es die Proliferation von gegen Mykobakterien immunen T-Zellen stimulieren kann. Die eine Prohferation induzierenden Peptide werden notiert und die proliferativen T-Zellen werden mittels des beschränkten Verdünnungsverfahrens kloniert, das von Oftung et al., (1987), J. Immunol., 138: 927-931, beschrieben worden ist. Die Phänotypen der proliferierten T-Zellen werden bestimmt, beispielsweise mit der OKT-Serie monoklonaler Antikörper, die von Ortho Diagnostic systems, Inc., Raritan, N.J., erhältlich sind. Ein oder zwei der Peptide, die die Proliferation von T-Zellen mit T4&spplus; - und/oder T8&spplus;-Phänotyp verursachen können, werden in dem Impfstoff verwendet.
Besonders bevorzugt wird eine Mischung aus Peptiden, Polymeren, die solche Peptide als wiederholte Einheiten haben, oder eines Polymers, dessen wiederholte Einheiten eine Mischung aus solchen Peptiden sind, die die Proliferation von T4&spplus; - und/oder T8&spplus; -T-Zellen hervorrufen, verwendet. Der Grund für diese Bevorzugung stammt aus der bereits erwähnten MHC-Restriktion. Zusätzlich wird gewöhnlich eine MHC-Restriktion zwischen T4&spplus;- und T8&spplus;-T-Zellen gefunden, wobei die erstgenannte Antigen plus Klasse II MHC-Protein erkennt und die letztgenannte erkennt Antigen plus Klasse I MHC-Protein.
Peptide, die im wesentlichen Teilen des 517-Proteines entsprechen, sind ebenfalls hier nützlich und werden hinsichtlich ihrer wesentlichen Entsprechung ähnlich den zuvor diskutierten Peptiden definiert. Die Peptide, die im wesentlichen einer Sequenz des 517-Proteines entsprechen, können nur 5 Reste enthalten und sind daher etwas kürzer als das kürzeste der zuvor diskutierten Peptide.
Drei Peptide (genannt 55, 56 und 57) und deren Varianten entsprechen im wesentlichen Sequenzen, die, von links nach rechts in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus und unter Verwendung des Einbuchstabencodes geschrieben, die folgende Formel haben:
55) NNNIG,
56) XGNZG und
57) FNSGSGNIGF(I)GNSG
worin X ein Aminosäurerest ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus F, S, T, L, D und T besteht; Z ist ein Aminosäurerest, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus T, I, L, S und V besteht; und in Klammern gesetzten Reste können die zu ihrer Linken in der Sequenz gezeigten Reste ersetzen. So sind in Peptid 57 F und I alternative Reste. X wird besonders bevorzugt aus der aus F, S und T bestehenden Gruppe ausgewählt; und Z wird aus der aus T und I bestehenden Gruppe ausgewählt.
Bei Verwendung der zuvor beschriebenen Konsensusmatrix, um zu berechnen, ob die Varianten Pentapeptide, die zuvor mittels ihrer Konsensussequenz XGNZG definiert worden sind, einander im wesentlichen entsprechen, stellt man fest, daß alle diese Varianten im wesentlichen mindestens einem Zuverlässigkeitsgrad von 99% entsprechen. Das kann leicht festgestellt werden, indem die großen Unterschiede bestimmt werden, die durch Substitutionen verursacht werden, und dann der resultierende Konsensusmatrixpunktestand berechnet wird und dieser Wert mit der dreifachen Zahl der verglichenen Reste, S, verglichen wird, (3x5=15).
Für den X-Rest führt daher das Substituieren eines Ile (1)- Restes durch einen Asp (D)-Rest oder eines Ser (S)-Restes durch einen Phe (F)-Rest zu einem Wert von -3 von der Matrix. Ähnlich führt die Substitution von Ile (I) durch Ser (S) oder Ser (S) durch Val (V) zu einem Wert von -2 von der Matrix. Da nur zwei Glycinreste (G) und der Asn (N)-Rest in irgendeiner der zuvor verglichenen Konsensuspentapeptidsequenzen vorhanden sind, kann die Gegenwart solcher Reste einen Punktestand von 22 (8+6+8=22) zur Verfügung stellen. Das Abziehen von fünf [(-3)+(-2)] für die oben erwähnte Substitution von 22 stellt einen Gesamtpunktestand für die verglichenen Pentapeptide von 17 zur Verfügung.
Da 17 größer als 15 ist, stellt jede der oben erwähnten Substitutionen zur Konsensussequenz Pentapeptide zur Verfügung, die im wesentlichen mindestens dem Zuverlässigkeitsgrad von 99% entsprechen. Da weiterhin die oben erwöhnten Substitutionen die größten numerischen Unterschiede im Gesamtpunktestand verursachen, erzeugt jede andere der zuvor diskutierten Substitutionen sowohl für X als auch Z in der Konsensussequenz einen Gesamtpunktestand, d.h., wo X Thr oder Leu und Z Thr oder Leu ist, erzeugt dies in der Konsensussequenz einen Gesamtpunktestand, der größer als 17 ist, und folglich entsprechen alle diese Pentapeptide ebenfalls im wesentlichen jedem anderen mindestens mit einem Zuverlässigkeitsgrad von 99%.
Die Peptide 55 und 56 werden typischerweise als eine einer Vielzahl von sich wiederholenden Einheiten eines Polymers mit einem relativ geringen Molekulargewicht verwendet, d.h. weniger als ungefähr 10000 Dalton Gewicht. Das kleinste solcher Polymere oder Oligomere enthält zwei der fünf Peptidreste (Pentapeptide) über eine Peptidbindung aneinander gebunden, die zwischen dem carboxyterminalen Rest einer ersten wiederholten Pentapeptideinheit und dem aminoterminalen Rest einer zweiten wiederholten Pentapeptideinheit gebildet ist.
Beispielsweise kann das Peptid 57, oben, als ein Polymer oder Oligomer angesehen werden, das zwei solcher sich wiederholenden Pentapeptideinheiten über eine Peptidbindung aneinander gebunden enthält, und außerdem weitere vier Reste am Aminoterminus des Oligomers enthält.
Ähnliche Berechnungen können auch für Varianten anderer hier offenbarter Peptide durchgeführt werden, die hier als ein Mittel zum Bestimmen, ob ein Peptid mit einer Sequenz, die von einer der spezifisch numerierten Sequenzen verschieden ist, einem spezifisch numerierten Peptid oder einem Teil davon im wesentlichen entspricht. Für die Zwecke von Epitop-Paratop- Wechselwirkungen sind Sequenzen, die mindestens fünf Reste enthalten, die kürzesten Sequenzen, die verglichen werden sollten, da mindestens fünf oder sechs Reste für die Epitop-Paratop- Wechselwirkung erforderlich zu sein scheinen. Siehe beispielsweise Elder et al., (1987), J. Virol., 61: 8-15; Atassi, (1975), Immunochemistry, 12: 423-438; und Benjamini et al., (1969), Biochemistry, 8: 2242-2246.
Auf gleiche Weise kann die Sequenz

NNNIGNNNIGNNNIG

in isolierter Form, die an den Nukleotidpositionen 3270 bis 3226 der Abb. 2 ebenfalls vorhanden ist, als polymeres oder oligomeres Trimer der Sequenz von Peptid 55 angesehen werden. Auf ähnliche Weise kann eine isolierte Form der Sequenz von der Nukleotidposition 3210 bis 3107 als ein Polymer oder oligomer angesehen werden, das acht wiederholte XGNZG-Pentapeptide enthält. Jedes der oben erwähnten Polymere oder Oligomere enthält eine Vielzahl von sich wiederholenden Pentapeptideinheiten, die über Peptidbindungen aneinander gebunden sind.
Festphasenpeptidsyntheseverfahren, wie sie z.B. in den oben diskutierten US-Patenten offenbart sind, deren Offenbarungen hier durch Verweis einbezogen werden, sind typischerweise die nützlichsten Mittel zum Herstellen von Oligomeren und Polymeren, die bis zu insgesamt ungefähr 40 Gesamtresten enthalten (acht sich wiederholende Pentapeptideinheiten).
Gentechnologische Verfahren, so wie sie hier beschrieben werden, sind zum Herstellen großer Polymere, die mehr als 8 sich wiederholende Pentapeptideinheiten enthalten, besonders nätzlich. Beispielsweise kann ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit der in Abb. 2 von der Nukleotidposition 2959 bis zur Nukleotidposition 2303 gezeigten Sequenz und in Phase mit der illustrierten Aminosäuresequenz des Proteines 517, aus dem in Abb. 2 gezeigten größeren Molekül ausgeschnitten werden oder aus geeigneten Desoxyribonukleinsäurederivaten unter Verwendung bekannter Verfahren synthetisiert werden und anschließend in einen entsprechenden Plasmidvektor ligiert werden, um ein Peptidpolymer zu exprimieren, das hinsichtlich seiner Sequenz im wesentlichen dem Polymer entspricht, das die sich wiederholenden Pentapeptideinheiten, die unterhalb der Sequenz gezeigt sind, an den in Abb. 2 gezeigten Positionen enthält.
Höhere Molekulargewichtspolymere, d.h. mit durchschnittlichen Molekulargewichten von ungefähr 10000 bis 1000000 oder mehr, die ein oder mehrere der oben erwähnten 540-Protein- oder 517- Protein-Pentapeptideinheiten enthalten, können auch durch oxidative Polymerisierung eines Peptides erhalten werden, das mit Cystein (Cys; C)-Resten endet, oder einem "diCys-endigen" Peptid. Das resultierende Polymer enthält so seine sich wiederholenden Einheiten durch oxidierte Cystein (Cystin)-Disulfidbindung aneinander gebunden.
Beispielsweise kann jedes der zuvor diskutierten Peptide des 540-Proteines oder Pentapeptides 517-Proteines synthetisiert werden, so daß es einen zusätzlichen Cys-Rest sowohl am Aminoals auch am Carboxylende enthält, um die Cys-endigen Peptide in ihrer reduzierten Form zur Verfügung zu stellen. Nach der Synthese werden in einem typischen Laboransatz 10 mg des diCys- Peptids (enthaltend Cystein-Reste in nicht oxidierter Form) in 250 Millilitern (ml) 0,1 molarem (M) Ammoniumbicarbonatpuffer gelöst. Das gelöste diCys-endige Peptid wird dann durch sanftes Rühren der resultierenden Lösung über einen Zeitraum von ungefähr 18 Stunden an der Luft oder bis es kein mit dem Ellman- Test nachweisbares freies Mercaptan mehr gibt, an der Luft oxidiert. (Siehe Ellman, (1959), Arch. Biochem. Biophys., 82: 70- 77.)
Das so hergestellte Polymer enthält eine Vielzahl synthetischer, sich wiederholender Peptideinheiten, die aneinander durch oxidierte Cystein (Cystin)-Reste gebunden sind. Solche Polymere enthalten typischerweise ihre sich wiederholenden Peptideinheiten aneinander gebunden auf Kopf-an-Schwanz-Weise sowie auf Kopf-an-Kopf- und Schwanz-an-Schwanz-Weise; d.h., die Aminotermini der beiden sich wiederholenden Peptideinheiten können über einen einzelnen Cystinrest aneinander gebunden werden, so, wie auch zwei Carboxyltermini so verbunden werden können, da die verbindenden Gruppen an beiden Peptidtermini identisch sind.
Die sich wiederholende Pentapeptideinheit des 517-Proteines kann selbst in Form eines Oligomers enthalten sein, das bis zu ungefähr acht sich wiederholende Pentapeptideinheiten enthält, oder in einem kürzeren Peptid, beispielsweise dem 14-Reste- Peptid 57. Weiterhin kann ein gentechnologisch manipuliertes Polypeptid, beispielsweise das, das aus der DNA-Sequenz der Nukleotide an den Positionen 2059 bis 3303 hergestellt wird, das weiter manipuliert worden ist, um Kodons für Cys (TGT oder TGC) am 5'- und 3'-Ende zu enthalten, ebenfalls polymerisiert werden.
Das Molekulargewicht eines solchen Polymeres kann durch den Zusatz kettenbeendender Reagenzien gesteuert werden. Beispielhafte kettenbeendende Reagenzien sind Cystein selbst und ein Peptid, beispielsweise ein zuvor beschriebenes Pentapeptid, das weiter einen einzelnen Cys-Rest, bevorzugt an einem Terminus, enthält.
Die vollständigen Namen für einzelne Aminosäurereste sowie die gut bekannten dreibuchstabigen Abkürzungen werden hier manchmal verwendet. Einbuchstabenabkürzungen (Code) werden ebenfalls verwendet. Die Konkordanztabelle, unten, zeigt den vollständigen Namen sowie die dreibuchstabigen und einbuchstabigen Abkürzungen für jeden hier genannten Aminosäurerest (siehe beispielsweise L. Stryer, (1981), Biochemistry, 2. Auflage, W.H. Freeman & Co., San Francisco, Seite 16). Die hier verwendeten Aminosäurereste sind in der natürlichen L-Form, wenn es nicht anders angegeben ist. Konkordanztabelle Aminosäure Dreibuchstabenabkürzung Einbuchstabenabkürzung Alanin Arginin Asparagin Asparaginsäure Asparagin oder Asparaginsäure Cystein Glutamin Glutaminsäure Glycin Histidin Isoleucin Leucin Lysin Methionin Phenylalanin Prolin Serin Threonin Tryptophan Tyrosin Valin

III. Material und Methoden

A. Rekombinante Untersuchungen

1. Bakterien, Phagen und Plasmide
Die in dieser Arbeit verwendeten E. coli-Stämme waren BNN97 (Young et al., (1983), Science, 222: 778-782; ATTC 37194), JM83 (Yanisch-Perron et al., (1985), Gene. 33: 103-119; auch ATCC 35607), JM101 (Yanisch-Perron et al., (1985), Gene. 33: 103- 119; auch ATCC 33876), Y1089 (Young et al., (1983), Science. 222: 778-782; auch ATCC 37196), und Y1090 (Young et al., (1983), Science&sub4; 222: 778-782; auch ATCC 37197). Die Plasmide pUC19 (Yanisch-Perron et al., (1985), Gene. 33: 103-119) und pMC1871 (Shapira et al., (1983), Gene, 25: 71-82) wurden von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J., erworben. Die rekombinante DNA-Bank von M. tuberculosis-Fragmenten genomischer DNA im Vektor λgt11 wurde von R. Young et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 2583-2587 konstruiert und durch das "Program for Research in the Immunology of Tuberculosis" von der Weltgesundheitsorganisation zur Verfügung gestellt. Die rekombinanten Phagen λRY3143 und λRY3L46 wurden von R.A. Young großzügigerweise zur Verfügung gestellt (Whitehead Institute, M.I.T.; Young et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 2583-2587). Subklone der mykobakteriellen DNA-Inserts in diesen rekombinanten Phagen wurden in pUC19 oder M13mp9 (Messing et al., (1982), Gene. 19: 269-276; M13mp9 wird im Katalog aus dem August 1983 der Bethesda Research Laboratories, Inc., zum Verkauf angeboten), unter Verwendung üblicher rekombinanter DNA- Verfahren (Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) konstruiert.

2. Antiseren

Für das 65 kD-Antigen spezifische monoklonale Antikörper wurden von der Immunology of Tuberculosis Scientific Working Group unter einem Stipendium der WHO/World Bank/UNDP-Spezialprogramm zur Impfstoffentwicklung erhalten. Diese Antikörper umfaßten IT-13 (WTB-78; Coates et al., (1981), Lancet. 2: 167-169), IT- 31 (SA2D5H4; T. Buchanon, nicht veröffentlicht) und IT-33 (MLIIH9; Gillis es al., (1981), Infect. Immun., 37: 172-178). Anti-β-Galactosidase-Antikörper wurden von Cooperbiomedical, Malvern, PA, erworben. Polyklonale Kaninchen-Antiseren, die gegen beschalltes M. tuberculosis, Stamm H37Rv, gerichtet waren, wurden wie zuvor beschrieben hervorgerufen (Minden et al., (1984), Infect. Immun., 46: 519-525).
3. Immunologische Durchmusterung der λgt11-M. tuberculosis- Bank
Klone, die mit den monoklonalen Antikörpern reaktiv waren, die für das 65 kD-Antigen spezifisch sind, wurden im wesentlich wie von Young et al. (Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 2583-2587) beschrieben isoliert. Kurz gesagt wurden auf jeder 150 mm LB-Platte 0,6 ml einer frischen Übernachtkultur von Y1090-Zellen mit 1-2x10&sup5; Plaque-bildenden Einheiten (pfu) der Bank infiziert. Nach 3,5 bis 4 Stunden Wachstum bei 42ºC wurden die Plaques mit einem trockenen Nitrozellulosefilter überschichtet, der mit 10 millimolarem (mM) Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG; erhältlich von Sigma Chemical Co.) gesättigt war. Die Platten wurden weitere 3,5 bis 4 Stunden bei 37ºC inkubiert und dann auf Raumtemperatur gebracht und die Position der Filter markiert.
Die Filter wurden kurz in TBSC [50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat)] gewaschen und dann in TBST mit 20% fötalem Kälberserum inkubiert. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Filter auf TBST plus Antikörper übertragen.
Für die anfängliche Durchmusterung enthielt der Antikörpermix eine 1:1000 Verdünnung der gemischten IT-13, IT-31 und IT-33. Die Filter wurden mit der Antikörperlösung über Nacht bei 4ºC unter leichter Bewegung inkubiert, in TBST gewaschen und mit biotinyliertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin, dem Vectastain ABC Reagenz, und Entwickler wie vom Hersteller beschrieben (Vector Laboratories, Burlingame, CA) umgesetzt. Nach Entwicklung der Farbe wurden die Filter mit mehrfach gewechseltem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.
Positiven Signalen entsprechende Phagen wurden zweimal Plaquegereinigt. Um zu bestimmen, welcher monoklonale Antikörper mit welchem der rekombinanten Phagen reagierte, wurden ungefähr 100 pfu einer gereinigten Phagenstammlösung in einem kleinen Flekken auf einem Rasen Y1090 E. coli auf einer LB (Luria-Bertani- Nährmedium) Platte inokuliert. Die Phagen wurden wachsengelassen und induziert, um die fremden Proteine wie oben beschrieben zu synthetisieren. Die Filter wurden dann mit einer 1:1000 Verdünnung eines der monoklonalen Antikörper umgesetzt. Die anschließenden Schritte waren dann die gleichen wie für die ursprüngliche Durchmusterung.
4. Western-Blot-Tests
Zellen, die Phagen oder Plasmide enthielten, in denen die Expression der Fremdsequenzen unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des E. coli-lac-Genes standen, wurden induziert, um die Fremdproteine durch 2 Stunden Inkubation der Zellen in Gegenwart von 2,5 mM IPTG zu synthetisieren. Rohlysate von Zellen, die λgt11-Rekombinanten exprimierten, wurden wie von Huynh et al., (1985), DNA Cloning Techniques: A Practical. Gover, Hrsg., IRL Press, Oxford, Band 1, Seiten 49-78 beschrieben, hergestellt. Kurz gesagt wurden diese Lysate gemacht, indem die Zellen aus Übernachtkulturen geerntet wurden und die Zellen in 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, enthaltend 100 µg Lysozym/ml, resuspendiert wurden. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde Natriumdodecylsulfat (SDS) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zugesetzt. Allen Rohlysaten wurde ein Proteaseinhibitor (Trasylol, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in einer Endkonzentration von 0,03%-0,3% zugesetzt.
Die rohen Proteinpräparationen wurden auf einem 10% Polyacrylamid-SDS-Laemmli-Gel (Laemmli, (1970), Nature, 227: 680-685) elektrophoretisiert und die getrennten Proteine elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen (Towbin et al., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354). Die immobilisierten Proteine wurden mit einer 1:1000 Verdünnung von monoklonalem Antikörper IT-13 in TBST über Nacht bei 4ºC umgesetzt. Die Nitrozellulosefilter wurden dann gewaschen, mit Peroxidasekonjugiertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin umgesetzt und wie zuvor beschrieben entwickelt (Niman et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4949-4953).
5. Nukleinsäuresequenzierung
Die Sequenzen von 5'-endmarkierten Restriktionsfragmenten der mykobakteriellen DNA wurden durch eine Modifikation des chemischen Teilabbauverfahrens von Maxam und Gilbert (Brow et al., (1985), Mol. Biol. Evol., 2: 1-12; und Maxam et al., (1976), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 560-564) bestimmt. Für die M13/Didesoxy-Sequenzierungsuntersuchungen wurden Sau3AI- Fragmente aus den mykobakteriellen DNA-Inserten in die BamHI- Stelle von M13mp9 subkloniert. Aus den M13-Rekombinanten wurde Phagen-DNA isoliert und einer Didesoxykettenterminations- Sequenzierungsreaktion unterworfen (Biggin et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 3963-3965 und Sanger et al., (1980), J. Mol. Biol., 143: 161-178). Die Produkte der Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem 6%igen Acrylamid/7M Harnstoff/0,5-2, 5xTBE-Sequenzgradientengel elektrophoretisiert (Biggin et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 3963- 3965). Die Gele wurden unter Vakuum getrocknet und mit einem Kodak XRP-1-Film exponiert. Die Nukleotidsequenzen wurden unabhängig für beide Stränge der mykobakteriellen DNA bestimmt.
Die computergestützten Analysen der Nukleinsäuresequenzen und abgeleiteten Proteinsequenzen wurden unter Verwendung der Daten und Programme durchgeführt, die von den Nucleic Acid and Protein Identification Resources der National Institutes of Health zur Verfügung gestellt werden sowie der Programme von Chow et al., (1978), Adv. Enzym., 47: 45-148 und Hopp and Woods (Hopp et al., (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 3824-3828).
6. β-Galactosidasetests
Die Zellen wurden in B-Nährmedium oder B-Nährmedium plus 2,5 mM IPTG bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD&sub6;&sub0;&sub0;) von ungefähr 0,3 wachsengelassen. Die Rohlysate wurden gemacht und die β-Galactosidase auf ihre Aktivität getestet, wie von Miller, (1972), Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben.
7. Fähigkeit der Rekombinanten, DCH hervorzurufen
(a) DCH-Tests
Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um zu bestimmen, ob die rekombinanten Proteine oder gereinigten Proteinderivate (PPd) (Connaught Laboratories, Ltd., Willowdale, Canada) DCH-Reaktionen in Hartley-Meerschweinchen hervorrufen würden, die mit beschallten M. tuberculosis, M. bovis oder Kochsalzlösung immunisiert worden waren. Gruppen von Meerschweinchen wurden drei wöchentliche intramuskuläre (i.m.) Injektionen von ultraschallbehandeltem Material gegeben, das in unvollständigem Freundlischen Adjuvanz (IFA) als physiologisch verträglichem Verdünnungsmittel suspendiert war. Jede Injektion enthielt 1,0 Milligramm (mg) Protein. Einige Tiere erhielten eine vierte Injektion, so daß eine Woche nach der letzten Injektion alle Tiere intradermal (i.d.) getestet wurden. Die Testantigene umfaßten rohe und teilweise gereinigte rekombinante Extrakte sowie Kochsalzlösung und PPd als Kontrollen. Die Testantigene wurden 1-10 µg verdünnt in 100 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von pH 7,0 (PBS), enthaltend 0,0005% Tween 20 als physiologisch verträgliches Verdünnungsmittel, verwendet. Gruppen von nicht immunisierten Meerschweinchen wurden ähnlich getestet. Alle i.d.-Injektionen wurden in rasierte Areale der Meerschweinchenflanken verabreicht. Die Reaktionen wurden nach 24, 48 und 72 Stunden abgelesen und wurden als positiv angesehen, wenn die Durchmesser der Erytheme und verhärteten Bezirke 10 mm überschritten.
(b) Herstellung von Rohlysaten
E. coli, die ein Plasmid oder einen p-Phagen von Interesse enthielten, wurden durch Inkubation bei 37ºC unter Belüftung in B- Nährbrühe bis zu einer späten Phase wachsengelassen, in der die Absorption bei 600 nm (A&sub6;&sub0;&sub0;) zwischen ungefähr 0,4 und 0,6 betrug. Dann wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt und die Bakterien für 2 Stunden weiter inkubiert.
Die bakterielle Kultur wurde dann 10 Minuten auf Eis abgekühlt und die Zellen durch 10 Minuten Zentrifugation bei 6000 rpm geerntet. Das resultierende Zellpellet wurde einmal in TBS (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl) durch Resuspendieren und Rezentrifugieren gewaschen und anschließend in einem Volumen von TBS mit 0,5 molar Saccharose, daß 1/10 des ursprünglichen Kulturvolumens äquivalent war, resuspendiert (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Der resultierenden resuspendierten Lösung wurde Lysozym bis zu einer Endkonzentration von 50 µg/ml zugesetzt und diese Mischung wurde 10 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in einem gleichen Volumen TBS resuspendiert. Anschließend wurden DNAse, Trasylol und SDS (Sigma) zur resultierenden Mischung zugesetzt, so daß die Endkonzentrationen 1 µg/ml, 0,1% bzw. 1% betrugen. Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur für einen Zeitraum von 10 Minuten unter periodischem Mischen weiter inkubiert, um eine Vervollständigung der Zelllyse zu bewirken. Die resultierenden Rohlysate wurden bis zur Verwendung bei -20ºC gelagert.
(c) Teilreinigung von exprimiertem 65 kD-Protein
Proteine, die die 65 kD-Antigene enthielten, wurden teilweise durch differentielle Ammoniumsulfatpräzipitation aus Lysaten von E. coli, die das Protein exprimierten, gereinigt. Zu diesem Zweck wurde ein Rohlysat zuerst mit einer Lösung von gesättigtem Ammoniumsulfat (SAS) vereinigt, um eine Endkonzentration von 30% der ursprünglichen Lysatkonzentration zu ergeben. Die Präzipitation wurde bewirkt, wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, und der resultierende Überstand wurde zurückbehalten. Der Überstand wurde dann mit SAS vereinigt, um eine Konzentration von 50% der des ursprünglichen Lysates zu ergeben, und erneut eine Präzipitation durchgeführt. Der resultierende Niederschlag wurde zurückbehalten, und PBS resuspendiert und gegen PBS dialysiert. Das resultierende dialysierte Material wird als teilweise gereinigt bezeichnet.
(d) Präparation von M. tuberculosis-Extrakten
M. tuberculosis-Stamm H37Rv und M. bovis-Stamm BCG wurden aus der Kultursammlung des National Jewish Hospital and Research Center, Denver, CO, erhalten und wie zuvor beschrieben wachsengelassen (Minden et al., (1972), Science. 176: 57-58 und Minden et al., (1972) Infect. Immun., 6: 574-582).
Die Bakterien wurden hitzegetötet und durch Beschallen mit einer Ultraschallbehandlung aufgebrochen, bis sich bei mikroskopischer Untersuchung mehr als 95% der Zellen als aufgebrochen zeigten. Die aufgebrochenen Bakterien wurden dann einer Ultrazentrifugation bei 200000xg für einen Zeitraum von 2 Stunden unterworfen, und der Überstand wurde zurückbehalten. Die so erhaltenen Überstände werden als H37Rv-S bzw. BCG-S bezeichnet und ihre Antigene und biologischen Eigenschaften sind beschrieben worden.

B. Peptiduntersuchungen

1. Mykobakterielle Antigene
Armadillo-abgeleitete getötete M. leprae wurden von Dr. R.J.W. Rees, Mill Hill in London aus der IMMLEP (WHO) Bank zur Verfügung gestellt. M. tuberculosis und M. bovis-BCG wurden freundlicherweise von Dr. Eng, National Institute of Public Health, Oslo, Norwegen, zur Verfügung gestellt. Die Bakterien wurden durch Bestrahlung (2,5 mrad) getötet. Rekombinantes M. tuberculosis 65 kD-Antigen, von λgt11 als β-Galactosidase-Fusionsprotein exprimiert, wurde aus E. coli-Lysaten wie in Oftung et al., (1987), J. Immunol., 138: 927-931, beschrieben auf einer anti-β-Galactosidasesäule mit hoher Affinität (Promega Biotech, Madison, USA) gereinigt.
2. Synthetische Peptide
Die geschützten Peptidharze wurden durch übliche Merryfield- Festphasenverfahren in Gruppen von 100 nach dem Verfahren der gleichzeitigen multiplen Peptidsynthese (Houghten, (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 5131-5135; und Houghten et al., (1985), Inter. J. Pept. Prot. Res., 27: 673-678) hergestellt und jeweils 24 wurden zu einer Zeit in einem neuen Gerät mit vielen Gefäßen (Houghten et al., (1986), Biotechnigues. 4: 522- 529) gespalten. Jede Synthese führte zur Erzeugung von 50 bis 75 mg Peptid. Typische Reinheiten der Rohpeptide lagen im Bereich von 65-95%.
3. T-Zellklone und Linien
Der T-Zellklon K8AH aus einem Tuberkulosepatienten (AH) und der T-Zellklon A7JM aus einer gestorbenen, mit M. leprae geimpften Person (JM) wurden mittels des beschränkten Verdünnungsverfahrens wie beschrieben (Oftung et al., (1987), J. Immunol., 138: 927-931) etabliert. Die T-Zellinie wurde aus periphären mononukleären Blutzellen (PBMC) des Spenders JM durch Stimulation von 2x10&sup6; PBMC/ml in vollständigem Medium (RPMI 1640 + 15% AB-Serum + 1% Penicillin und Streptomycin) mit M. bovis-BCG (20 µg/ml) in Costarplatten mit 24 Vertiefungen erzeugt. Nach 6 Tagen Inkubation bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft wurden Antigen-reaktive Zellen durch Zufügen von 100 E/ml rekombinantem IL-2 zweimal pro Woche expandiert. Nach einer Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff wurden die T-Zellen in vitro durch Stimulation von 2x10&sup5; Zellen/ml in Costarplatten mit 24 Vertiefungen mit ganzen Bakterien als Antigen (20 µg/ml) in Gegenwart von 106 bestrahlten autologen PBMC als Ammen- (Antigen-präsentierenden) Zellen und rekombinantem IL-2 (100 E/ml) propagiert. Die effiziente Expansion von Klonen und Linien wurde durch Stimulation mit Antigen und Ammenzellen einmal und IL- 2 zweimal pro Woche erreicht. Die Bestimmung von T-Zellteilmengen wurde wie zuvor beschrieben (Oftung et al., (1987), J. Immunol. 138: 927-931) durchgeführt.
4. Peptid-induzierte T-Zellklon-Stimulationstests
Die folgenden Tests wurden für die Erfinder von Dr. Frederik Oftung am Labor für Immunologie, Norwegian Radium Hospital, Oslo, Norwegen, durchgeführt. Die ursprünglichen Tests für T- Zell-Stimulation wurden unter Verwendung kodierter Proben durchgeführt.
(a) Antigen-induzierte Proliferation von T-Zellklonen und -Linien
Klonale (1x10&sup4;) oder polyklonale (2x10&sup4;) T-Zellen und bestrahlte autologe PBMC (1x10&sup5;) wurden in jede Vertiefung von Costarplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden verteilt. Mykobakterielle Antigene in Form ganzer Bakterien, rekombinanter Antigene als affinitätsgereinigtem Material oder synthetischer Peptide wurden dann dreifach oder zweifach zugefügt. Das gesamte Kulturvolumen wurden bei 200 Mikrolitern (µl) gehalten. Nach 72 Stunden Inkubation wurde den Kulturen ein 4-Stunden- Puls von 0,045 mBq [³H]-Thymidin (spezifische Aktivität = 185x10³ mBq/mM) gegeben. Die Zellen wurden dann geerntet und die eingebaute Radioaktivität durch Flüssigkeitsszintillationsmessung (Mustafa et al., (1983), Clin. Exp. Immunol. 52: 29- 37) bestimmt.
Die Ergebnisse werden als Mittelwerte (der Dreifach- oder Zweifachbestimmungen) der Zerfälle pro Minute (cpm) ausgedrückt. Die Zellen wurden als in Antwort auf ein gegebenes Antigen proliferierend angesehen, wo die cpm in Kulturen mit Antigenen minus cpm in Kulturen ohne Antigen mehr als 1000 und cpm in Kulturen mit Antigen geteilt durch cpm in Kulturen ohne Antigen mehr als 2 betrugen.
(b) Lymphokin-Erzeugung und -Test
T-Zellklone (2x10&sup5; Zellen/ml) wurden auf Vertiefungen von Costarplatten mit 24 Vertiefungen mit adhärenten Zellen von 1x10&sup6; bestrahlten autologen PBMC plus Antigen in optimalen Konzentrationen verteilt. Nach 16 oder 48 Stunden Inkubation wurden zellfreie Überstände gesammelt und bei -20ºC gelagert, bis sie auf Lymphokinaktivitäten untersucht wurden. Die IL-2-Aktivität in den Überständen, die nach 16 Stunden Inkubation geerntet worden waren, wurde über ihre Fähigkeit zur Stimulation der Proliferation eines IL-2-abhängigen Maus-T-Zellklones (CTLL 2), (Mustafa et al., (1985), Clin. Exp. Immunol. 62: 474-481) bestimmt. Die Granulocytenmakrophagen-CSF (GM-CSF) -Aktivität der gleichen Überstände wurde getestet als die Fähigkeit der Überstände, die Koloniebildung in mononukleären Knochenmarkszellen zu induzieren (Dahl et al., (1972), Acta Pathol. Microbiol. Scand. Sect. Bp 80: 863-870). Die nach 48 Stunden geernteten Überstände wurden verwendet, um die Interferon-γ-Aktivität nach dem Verfahren von Dahl und Degree (Acta Pathol. Microbiol. Scand Sect. B. 80: 863-870) zu bestimmen, wobei humane embryonale Lungenfibroblasten und vesikulärer Stomatitisvirus als angreifendes Virus verwendet wurden.
(c) Cytotoxizitätstest
Die adhärenten Zellen aus 1x10&sup6; autologen bestrahlten PBMC in Costarplatten mit 24 Vertiefungen wurden mit Antigenen in optimalen Konzentrationen pulsbehandelt und die Dichte der T- Zellklone wurde auf 1x10&sup5; Zellen pro Vertiefung eingestellt. Nach 7 Tagen Inkubation wurden die T-Zellen weggewaschen und 0,5 ml 0,03% Neutralrot (in Kochsalzlösung + 10% FBS) wurden jeder Vertiefung zugesetzt und die Platten 30 Minuten inkubiert. Neutralrot wurde dann aus den Vertiefungen durch Waschen entfernt und der von den Makrophagen aufgenommene Farbstoff durch Zufügen von 0,5 ml 0,05 M Essigsäure in 50% Ethanol freigesetzt (Parish et al., (1983), J. Immunol. Methods. 58: 225). Der Prozentsatz Cytotoxizität wurde aus spektrophotometrischen Absorptionsmessungen bei 540 nm (OD&sub5;&sub4;&sub0;) gemäß der Formel
Cytotoxizität (%) = OD&sub5;&sub4;&sub0; Kon. - OD&sub5;&sub4;&sub0; Untersuchung/OD&sub5;&sub4;&sub0; Kon.
berechnet, wobei OD&sub5;&sub4;&sub0; Kon. = OD&sub5;&sub4;&sub0; der Kontrollkulturen mit adhärenten Zellen plus T-Zellklonen und OD&sub5;&sub4;&sub0; Untersuchung = OD&sub5;&sub4;&sub0; von Untersuchungskulturen mit adhärenten Zellen + T-Zellklonen + Antigen.
5. Peptidinduzierte Stimulation vereinigter T-Zellen
Stimulationstests von vereinigten humanen T-Zellen wurden für die Erfinder von Dr. Stefan Kaufman aus dem Max-Planck-Institut für Immunologie, Freiburg, Westdeutschland, durchgeführt. Für die Tests wurden wiederum kodierte Proben zur Verfügung gestellt.
Das Testverfahren war wie folgt: Mononukleäre Zellen wurden aus periphärem Blut von mit M. bovis-BCG-geimpften Personen aus Ficoll-Hypaque-Gradienten isoliert (Emmerich et al., (1986), J. Exp. Med., 163: 1024-1029; und Boyum, (1968), Scand J. Clin. Lab. Invest., 21: (Suppl. 97) 31) und wurden verwendet, um ungefähr 2x10&sup5; Zellen/Vertiefung in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen auszusäen. Anschließen wurden 0,1 µg/ml, 1 µg/ml und 10 µg/ml Antigen zugefügt.
Nach sechs Tagen Kultur wurde jeder Vertiefung 1 mikroCurie (µCi) [³H]-Thymidin zugefügt. Achtzehn Stunden später wurden die Kulturen auf Glasfaserfiltern geerntet. Der Thymidineinbau wurde in einem Flüssigkeitsszintillationsmeßgerät gemessen.
Für die Tests aus Tabelle 5 wurden die PBMC vereint. Da die Untersuchungen mit HLA-Restriktionen im Zusammenhang standen, wurden die PBMC separat gehalten und die HLA-Allele durch übliche Verfahren festgestellt.
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden. Der Fachmann wird verstehen, daß Modifikationen und/oder Variationen der offenbarten Gegenstände vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der hier ausgeführten Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Peptid, das im wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz mit 5 bis ungefähr 40 Aminosäureresten besteht, die im wesentlichen einer Sequenz des Proteines mit 540 Aminosäureresten aus Mycobacterium tuberculosis entspricht, die durch eine Formel dargestellt wird, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

2. Polypeptid, das im wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz mit 5 bis ungefähr 40 Aminosäureresten besteht, die im wesentlichen einer Sequenz des Proteines mit 517 Aminosäureresten aus Mycobacterium tuberculosis entspricht, die durch eine Formel dargestellt wird, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus:

worin X ein Aminosäurerest ist, der aus der aus F, S, T, L, D und 1 bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Z ist ein Aminosäurerest, der aus der aus T, I, L, S und V bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und der in Klammern gesetzte Rest kann den in der Sequenz zu seiner linken gezeigten Rest ersetzen.

3. Polymer, umfassend eine Vielzahl von sich wiederholenden Peptideinheiten, wobei die sich wiederholenden Peptideinheiten im wesentlichen aus einer Sequenz bestehen, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Polymer nach Anspruch 3, worin die sich wiederholenden Peptideinheiten durch oxidierte Cysteinreste aneinander gebunden sind, die an den Enden der sich wiederholenden Einheiten vorhanden sind.

5. Polymer, umfassend eine Vielzahl von sich wiederholenden Pentapeptideinheiten, wobei jede der sich wiederholenden Pentapeptideinheiten im wesentlichen aus einer Sequenz besteht, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, durch die Formel

dargestellt wird, wobei X ein aus der aus F, S, T, L, D und I bestehenden Gruppe ausgewählter Aminosäurerest ist und Z ein Aminosäurerest ist, der aus der aus T, I, L, S und V bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Polymer nach Anspruch 5, wobei die sich wiederholenden Pentapeptideinheiten durch oxidierte Cysteinreste, die an den Enden der sich wiederholenden Einheiten vorhanden sind, aneinander gebunden sind.

7. Verfahren zum Feststellen der Gegenwart von gegen Mycobakterien immunen mononukleären Säugerzellen in einer Körperprobe, umfassend die Schritte

(a) Mischen der in Kontakt stehenden mononukleären Säugerzellen, die untersucht werden sollen, in einem wäßrigen Medium mit einer stimulierenden Menge sowohl Antigen präsentierender Zellen als auch mycobakteriellen Antigenes, um eine stimulierende Zellkultur zu bilden, wobei das mycobakterielle Peptidantigen eine Sequenz hat, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus

bestehenden Gruppe ausgewählt ist;

(b) Aufbewahren der stimulierenden Zellkultur über einen Zeitraum, der für die vorhandenen, gegen Mycobakterien immunen mononukleären Zellen ausreichend ist, stimuliert zu werden und die Stimulation nachzuweisen; und

(c) Bestimmen der Gegenwart einer mononukleären Zellstimulation.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Verfahren in vitro durchgeführt wird, und die Stimulation durch einen Test bestimmt wird, der aus der aus (i) mononukleärer Zellproliferation, (ii) Interleukin-2-Sekretion, (iii) Interferon-γ-Sekretion, (iv) Sekretion von Granulocyten-Makrohagen-Kolonie-stimulierendem Faktor und (v) Cytotoxizität bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Peptidantigen als ein Polymer vorhanden ist, das sich wiederholende Einheiten hat, die aus dem Peptidantigen zusammengesetzt sind, und die sich wiederholenden Einheiten des Peptidantigenes aneinander über oxidierte Cysteinreste an ihren Enden gebunden sind.

10. Paratopische Moleküle, die mit einem Peptid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 immunreagieren.

11. Paratopische Moleküle, die mit einem Peptid immunreagieren, das eine Aminosäuresequenz hat, die, von links nach rechts und in Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus geschrieben, durch eine Formel dargestellt wird, die aus der Gruppe

ausgewählt ist.