DE3650676T2

DE3650676T2 - Verfahren und mittel zur sortierung und bestimmung biologischer informationen

Info

Publication number: DE3650676T2
Application number: DE3650676T
Authority: DE
Inventors: George Pieczenik
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-08-28
Filing date: 1986-08-28
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2006-08-29
Also published as: IL79881A0; IL79881A; ATE165363T1; AU626252B2; EP0241487B1; EP0241487A1; WO1987001374A3; AU6338086A; DE3650676D1; WO1987001374A2

Description

Die Erfindung betrifft die Charakterisierung und Identifizierung der Erkennungsstellen von Antikörpern. Besonders betrifft die Erfindung die Ermittlung der von einem Antikörper erkannten spezifischen Aminosäuresequenz und der diese Aminosäuresequenz codierenden Nucleinsäuresequenz.
Die die allgemeine Grundlage der Antikörperproduktion erklärende Clonselektionstheorie von Burnet hat eine fast vollständige Akzeptanz gefünden (Burnet, M., Sci. Am. 204 (1961), 58, und Jerne, N. K., Harvey Lecture 70 (1976), 93). Die Theorie beruht auf mehreren Voraussetzungen: (1) da einzelne Zellen, d. h. Lymphocyten, im Immunsystem differenzieren, kann jede nur eine Art von Antikörpermolekül produzieren; (2) das vollständige Spektrum von möglichen Antikörper-produzierenden Zellen ist in den lymphoiden Geweben vor der Stimulierung durch ein beliebiges Antigen vorhanden; d. h., der Schritt, bei dem jeder Lymphocyt zur Produktion von nur einer Art von Antikörpermolekül spezifiziert wird, erfolgt in Abwesenheit eines potentiellen Antigens für diesen Antikörper; und (3) Lymphocyten, die einen für ein bestimmtes Antigen spezifischen Antikörper produzieren können, werden durch die Gegenwart dieses Antigens zur Proliferation und Produktion von großen Mengen des Antikörpers induziert. Ein enormes Spektrum von genetisch einzigartigen lymphoiden Zellen ist in den lymphoiden Organen, z. B. in der Milz, jedes Säugers vorhanden. Die Milz kann als eine Bank von Zellen, von denen jede einen einzigartigen Antikörper produzieren kann, angesehen werden, und die Bank ist so groß, daß für jedes beliebige willkürliche Antigen mindestens eine Lymphzelle, die das Antigen erkennen und die für das Antigen spezifischen Antikörper produzieren kann, in der Bank vorhanden ist.
Bisher war zur Produktion eines ein interessierendes Antigen erkennenden Antikörpers die antigene Stimulierung eines Labortiers erforderlich. Das Antigen wird üblicherweise in ein Labortier injiziert und nach einer geeigneten Inkubationszeit eine zweite Injektion verabreicht. Die Milzzellen des Tiers werden anschließend geerntet und mit Myelomzellen fusioniert. Nach der Fusion mit einer Milzzelle überträgt die Myelomzelle auf die Milzzelle ihre Fähigkeit zum Wachstum in Kultur. Uberlebende Kolonien von fusionierten Zellen, d. h., Hybridome, werden anschließend zur Identifizierung von Clonen durchmustert, die das Antigen spezifisch erkennende Antikörper produzieren. Dieses Verfahren muß jedesmal wiederholt werden, wenn die Produktion eines Antikörpers gegen ein bestimmtes Antigen gewtinscht wird. Für jedes interessierende Antigen ist es erforderlich, (1) ein Tier mit einem Antigen zu stimuheren, (2) seine Milz zu entfernen und die Milzzellen mit Myelomzellen zu Hybridzellen zu verschmelzen und (3) Clone zu verdünnen, zu züchten und auf eine spezifische Antikörperproduktion zu durchmustern. Obwohl Antigen-erkennende Antikörper produziert werden, identifiziert dieses Verfahren nicht das Epitop, d. h., die vom Antikörper erkannte spezifische Stelle auf dem Antigen; und die Entwicklung von Antikörpern, die für eine bestimmte vorherbestimmte Stelle oder Region des Antigens spezifisch sind, kann nicht gesteuert werden. Ferner sind Hybridomverfahren bei der direkten Entwicklung von monoclonalen Antikörpern, die Haptene erkennen, d. h., Moleküle, die Antikörpererkennungsstellen enthalten, die jedoch bei einer Injektion ohne einen Träger in ein Labortier keine antigene Reaktion erzeugen, nicht effektiv. Da die antigene Stimulierung und Antikörperproduktion potentielle Risiken für den Wirt bergen, wurde die Verwendung von menschlichen Wirten bei der Entwicklung von monoclonalen Antikörpern ausgeschlossen.
Als Bindungsdomäne eines Malariavirus-Oberflächenprotein-spezifischen monoclonalen Antikörpers wurde eine Domäne von maximal 40 Aminosäuren Länge ermittelt. A. H. Cochrane et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 5651, insertierten eine 340 Basenpaarsequenz von einem Plasmodium knowlesi-Gen in den pBR322- Vektor. Der gentechnisch hergestellte Vektor produzierte in E. coli ein beta-Lactamase- Fusionspolypeptid, das mit einem für ein P. knowlesi-Circumsporozoit oder CS-Protein spezifischen monoclonalen Antikörper reagierte. Dieser Befund zeigte, daß die Bindungsdomäne des monoclonalen Antikörpers auf einen von der insertierten Sequenz codierten Bereich des CS-Proteins oder etwa 110 Aminosäuren beschränkt war. J. R. Lupski et al., Science 220 (1983), 1285, verwendeten das gleiche System und lokalisierten unter Verwendung von Transpositionskartierungsverfahren weiter die Bindungsdomäne in einem Bereich von 40 Aminosäuren des CS-Proteins.
N. Green et al., veröffentlichte PCT-Anmeldung 84/00 687, produzierten Antikörper durch Inokulation von synthetischen Peptiden in Labormäuse. Die Antikörper, die als Antwort auf Peptide, die eine Länge von 8 bis 40 Aminosäureresten aufwiesen und den Sequenzen in einem Influenzavirusprotein entsprachen, produziert wurden, waren mit dem Virus in vitro kreuzreaktiv.
J. B. Dame et al., Science 225 (1984), 593, sequenzierten das CS-Gen von Plasmodium falciparum und fanden 41 Tandem-Wiederholungssequenzen eines Tetrapeptids mit geringer Variation. Unter Verwendung von synthetischen Peptiden von 4, 7, 11 und 15 Aminosäureresten der häufigsten sich wiederholenden Aminosäuresequenz führte Dame anschließend kompetitive Bindungstests durch, um zu ermitteln, welche Peptidlänge die Bindung des CS-Proteins an einen für dieses Protein spezifischen monoclonalen Antikörper hemmen würde. Dame stellte fest, daß die synthetische Sequenz aus 4 Aminosäuren die Bindung nicht signifikant hemmte, daß jedoch die Sequenzen aus 7, 11 und 15 Aminosäuren die Bindung inhibierten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß dieser monoclonale Antikörper für das CS-Protein eine das sich wiederholende Tetrapeptid enthaltende Sequenz von 5 bis 7 Aminosäuren erkennt.
WO 84/03564 offenbart ein Verfahren zum Nachweis der Sequenz eines für einen bestimmten Antikörper spezifischen Epitops eines bestimmten bekannten Proteins. Das Dokument lehrt die Produktion einer Reihe von Peptiden, wobei jedes eine einer Sequenz in der bekannten Aminosäuresequenz entsprechende Sequenz von einer Reihe von Aminosäuren umfaßt und dieses Polypeptid überlappende Aminosäuresequenzen aufweist.
Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft eine Population von Oligonucleotiden, die jeweils zwischen 1 bis etwa 50 Tandemsequenzen der gleichen Länge von etwa 4 bis etwa 12 Nucleinsäuretripletts enthält. Jedes Oligonucleotid codiert ein entsprechendes Oligopeptid mit etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten, und die vollständige Population repräsentiert mindestens etwa 10% aller Oligopeptidsequenzen der ausgewählten Länge. In bevorzugten Ausführungsformen weist jedes Mitglied der Oligonucleotidpopulation eine Einzelkopie der Sequenz von Nucleotidtripletts auf, die Oligonucleotidsequenz weist zwischen 5 und 7 Tripletts auf und die Oligonucleotidpopulation wird durch Zufallsscheren von genetischem Material von Säugern erzeugt oder aus den Nucleinsäurebestandteilen chemisch synthetisiert.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Population von durch die vorstehend beschriebenen Oligonucleotide codierten Oligopeptiden, die zwischen 1 und etwa 50 Tandemsequenzen der gleichen Länge mit etwa 4 bis etwa 12 alpha-Aminosäureresten enthalten, und die Population macht mindestens 10% aller Peptidsequenzen der vorbestimmten Länge aus. In bevorzugten Ausführungsformen hat jedes Mitglied der Population eine Einzelkopie der Peptidsequenz, die Oligopeptidsequenz weist zwischen 5 und 7 L-Aminosäurereste auf und die Population wird durch Scheren von Proteinen erzeugt oder wird aus den L- Aminosäurebestandteilen chemisch synthetisiert.
In einem dritten Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Population von Vektoren, wobei jedes Mitglied der Population eine im wesentlichen identische autonom replizierbare Nucleinsäuresequenz umfaßt, wobei mindestens ein Teil jeder Sequenz ein Strukturgen ist, und eine Oligonucleotidinsertion gemäß der vorstehenden Definition, die rekombinant in das Strukturgen innerhalb des Vektors insertiert ist, wobei ein signifikanter Anteil der Vektorpopulation deren rekombinante Strukturgene exprimieren kann, wenn sie in die entsprechenden Wirtszellen transferiert werden, und wobei die Expression der rekombinanten Strukrurgene rekombinante Polypeptide erzeugt, die Aminosäuresequenzen gemäß der vorstehenden Definition umfassen. Die Erfindung betrifft ferner die rekombinante Polypeptidpopulation, die von der Vektorpopulation, wie vorstehend beschrieben. produziert wird, und besonders eine Population, in der jede Tandemeinheit von Nucleotidtripletts 5 bis 7 Nucleotidtripletts umfaßt.
Ein vierter erfindungsgemaßer Gesichtspunkt betrifft eine Matrix, die eine Population von Peptidsequenzen und eine heterogene Population von Antikörpern, die im wesentlichen an alle Mitglieder einer vorstehend als zweiter erfindungsgemaßer Gesichtspunkt beschriebenen Oligopeptidpopulation binden können, einschließt.
Ein fünfter erfindungsgemaßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Konstruktion der vorstehend beschriebenen Matrix, das folgende Schritte einschließt: (1) Gewinnung einer Population von Polypeptiden, die eine einheitliche Länge von etwa 4 bis 12 alpha-Aminosäureresten aufweisen und mindestens etwa 10% aller Peptidsequenzen der vorbestimmten Länge einschließen; (2) Gewinnung einer heterogenen Population von Antikörpern, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Polypeptidpopulation binden können; und (3) Inkontaktbringen der Antikörper mit den Antigenen für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, so daß eine Bindung erfolgt. In bevorzugten Ausführungsformen Jede der Peptidsequenzen und Antikörper wird isoliert und jede Peptidsequenz wird einzeln mit jedem Antikörper in Kontakt gebracht, bis mindestens ein Peptidsequenz-Antikörper-Bindungspaar identifiziert ist; die Peptidsequenzen können auf einem geeigneten Substrat immobilisiert und die Antikörper markiert werden; die Antikörper können immobilisiert und die Peptidsequenzen markiert werden; oder die Peptidsequenzen können aus den Polypeptiden ausgeschnitten werden.
Die Erfindung stellt ein effizientes und bequemes Mittel zur Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen jeden beliebigen spezifischen Bereich eines beliebigen interessierenden Antigens oder Haptens bereit. Zur erfindungsgemäßen Produktion von monoclonalen Antikörpern ist keine antigene Stimulierung eines Wirtstiers erforderlich. Die Erfindung betrifft die Antikörper bindenden Eigenschaften einer Testspezies, ist jedoch vollständig unabhängig von der Fähigkeit der Testspezies zur Induktion einer antigenen Antwort in vivo. Die Erfindung ermöglicht die Identifikation der von einem Antikörper erkannten spezifischen Peptidsequenz auf einem Protein. Die Spezifität von verschiedene Sequenzen auf dem gleichen Antigen erkennenden Antikörpern kann differenziert werden. Ferner ermöglicht die Erfindung die Charakterisierung und Lokalisierung der Nucleotidsequenz, die die von einem Antikörper erkannte Aminosäuresequenz codiert, auf einem Chromosom.
Unter Verwendung von üblichen monoclonalen Verfahren können Antikörper produziert werden, die beispielsweise mit einer nicht bestimmten Stelle auf einem bestimmten Plasmodium-Circumsporozoit-Protein oder einem bestimmten Influenza-Virus reagieren können. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können alle Epitope auf diesem Molekül oder Organismus identifiziert und ein alle diese Epitope erkennender Antikörper erhalten werden. Ein Epitop ist eine spezifische Stelle auf der Oberfläche eines von einem Antikörper erkannten Antigens. Durch kluge Kombination einer Reihe von verschiedenen Antikörpern, von denen jeder ein anderes Epitop auf der Oberfläche eines bestimmten Antigens erkennt, kann ein Material mit einem beliebigen gewünschten Grad an Spezifität erhalten werden. Ferner können unter Verwendung der Erfindung Sequenzen, die z. B. in Circumsporozoitenproteinen von mehreren Plasmodium-Arten oder in mehreren Influenza-Stämmen üblich sind, identifiziert und auf diese üblichen Sequenzen erkennende Antikörper durchmustert werden, wodurch ein einziger Satz von Antikörpern identifiziert wird, von denen jeder gegen ein breites Spektrum von Malaria- oder Influenza-Infektionen wirksam ist.
Bestimmte Viren wie das LAV- oder HTLV-III-Virus enthalten auf ihren Oberflächen sowohl stark mutierbare als auch konstante Bereiche. Die Fähigkeit der Viren zur Veränderung ihrer Oberflächeneigenschaften behinderte die Entwicklung von monoclonalen Antikörpern gegen diese Viren durch monoclonale Standardverfahren. Jeglicher Antikörper, der einen mutierbaren Bereich eines Virus erkennt, wird ineffektiv, wenn das Virus mutiert und sich ein Stamm mit einer veränderten Konfiguration im vom Antikörper erkannten Bereich entwickelt. Nach der Identifizierung und Charakterisierung der konstanten Bereiche eines Virus ermöglicht die Erfindung die Identifizierung und Produktion von Antikörpern, die diese konstanten Bereiche erkennen, auch wenn die diese konstanten Bereiche umfassenden Peptidsequenzen nicht selber eine immunogene Antwort in vivo erzeugen. Diese Antikörper sind gegen verschiedene Virusstämme wirksam.
Weitere erfindungsgemäße Merkmale und Vorteile können der nachstehenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und den Ansprüchen entnommen werden.

Bevorzugte Ausführungsformen

Es wird angenommen, daß ein Epitop begrenzte Dimensionen von etwa 30 bis 50 Angstrom aufweist. Ein Antikörper, der eine spezifische Peptidsequenz oder Konfiguration von Kohlenhydraten auf der Oberfläche eines Antigens erkennt, erkennt die gleiche Konfiguration, wenn sie auf einem anderen Antigen als Duplikat vorhanden ist oder dieser sehr nahekommt. Dieses Phänomen liegt der manchmal bei monoclonalen Antikörpern beobachteten Kreuzreaktivität zugrunde.
Die Größe der Antikörpererkennungsstelle entspricht einer Peptidsequenz im Bereich von etwa 4 bis etwa 12 Aminosäureresten. Säugerproteine und -polypeptide bestehen fast ausschließlich aus den zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren, d. h. Glycin und die L-Isomere von Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Serin, Threonin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin, Glutamin, Cystein, Methionin, Histidin, Lysin und Arginin. Es sind etwa drei Millionen (20&sup5;) verschiedene mögliche Sequenzen der zwanzig Aminosäurereste bei einer Anordnung von fünf Aminosäuren und etwa sechzig Millionen bei einer Anordnung von sechs Aminosäuren möglich. Diese endliche Zahl von Peptidsequenzen kann das vollständige Spektrum von möglichen Antikörpererkennungsstellen repräsentieren. Die Produktion und Aufrechterhaltung einer repräsentativen Probe des vollständigen Spektrums von Antikörpern und einer repräsentativen Probe der Peptidsequenzen der geeigneten Länge liefern die Mittel (1) zum Durchmustern eines beliebigen interessierenden Antikörpers zur Ermittlung der von ihm gebundenen genauen Peptidsequenz und (2) zum Durchmustern eines beliebigen Proteins zum Auffinden eines für das Protein spezifischen Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung identifiziert Antikörperbindungsstellen, die eine primäre Peptidsequenz oder z. B. eine Kohlenhydratsequenz, die einer Peptidsequenz sehr nahekommt, umfassen.
Ungeachtet dieser Annahmen stellt die Erfindung die Mittel und Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von Epitopen und von diese bindenden Antikörpern bereit.

Antikörperproduktion

Gemaß der Clonselektionstheorie hat ein nicht-stimulierter Säugerwirt die Kapazität zur Produktion von Antikörpern gegen ein breites Spektrum von Fremdantigenen. Die Gegenwart eines Antigens löst die Proliferation von solchen Lymphocyten aus, die bereits vorhanden sind und die Fähigkeit zur Produktion von Antikörpern gegen das Antigen aufweisen. Da es eine endliche Zahl von Peptidsequenzen von der von den Antikörpern erkannten Länge gibt, kann erwartet werden, daß jeder Säuger die Fähigkeit zur Produktion von Antikörpern, die die meisten, wenn nicht alle diese Sequenzen erkennen, aufweist. Daher kann die Milz einer Maus oder eines anderen Labortiers als eine geeignete Quelle für ein vollständiges Spektrum von Antikörpern dienen. Die Milz kann von einem Labortier gewonnen werden, und unter Verwendung von Standardverfahren werden die einzelnen Zellen mit Myelomzellen füsioniert und Hybridomstämme entwickelt.
Je nach den gewtinschten Charakteristika der erhaltenen Hybridompopulation können entweder antigenstimulierte Tiere oder nicht spezifisch mit dem interessierenden antigenen Material stimulierte Tiere verwendet werden.
Wenn antigenstimulierte Tiere verwendet werden, dann produziert ein höherer Anteil der erhaltenen Hybridome für das verwendete Antigen spezifische Antikörper. Wenn andererseits nicht-stimulierte Tiere verwendet werden, dann kann erwartet werden, daß die von der erhaltenen Population von Hybridomen gewonnenen Antikörper ein breiteres Spektrum von Antikörpern repräsentieren, das von den Tieren produziert werden kann. Die Antikörper, die von einem unter Standardlaborbedingungen aufgezogenen ausgewachsenen Tier produziert werden, reflektieren die individuelle Expositionsgeschichte und werden durch sie beschränkt. Wenn die Milzen aus mehreren nicht-stimulierten ausgewachsenen Tieren geerntet und miteinander kombiniert werden und die Milzzellen mit Myelomzellen füsioniert werden, dann produziert die erhaltene Population von Hybridomen ein vollständigeres Spektrum von Antikörpern als Hybridome von jedem beliebigen einzelnen Individuum. Antikörper, die von Hybridomen produziert werden, die von Milzzellen von aseptisch aufgezogenen ausgewachsenen Tieren oder von fötalen oder neonatalen Tieren stammten, reflektieren keine Expositionsgeschichte, und es kann erwartet werden, daß sie eine Zufallsprobe des vollständigen Spektrums von Antikörpern repräsentieren, das von den Tieren produziert werden kann.
Da für dieses Verfahren keine antigene Stimulierung des Spendertiers vor der Ernte der Milz erforderlich ist, können nun von menschlichen Zellen stammende Antikörper entwickelt werden. Normale Milzzellen können aus einem oder einer Reihe von menschlichen Spendern gewonnen, die geernteten Zellen mit Myelomzellen füsioniert und, wie vorstehend beschrieben, gezüchtet werden. Alternativ kann eine Bank von menschlichen Antikörpern im Laufe der Zeit entwickelt werden, indem Zellkulturen von z. B. einer großen Zahl von Myelompatienten mit jeweils einem anderen Tumor gewonnen werden.

Produktion von Peptidsequenzen

Die Produktion der gewünschten Population von Peptiden, die von den Oligonucleotiden gemäß der vorstehenden Definition codiert wird, umfaßt die Produktion entweder durch zufälliges Scheren von Proteinen und anschließende Gewinnung durch Elektrophorese der Peptidsequenzen mit der geeigneten Länge oder durch Synthese der gewunschten Peptidsequenzen aus ihren Aminosäurebestandteilen.
Alternativ können diese Peptide durch gentechnische Verfahren produziert werden. Gemäß diesem allgemeinen Verfahren produzierte Peptide können als codierte Peptide bezeichnet werden. Eine Population von Nucleotidsequenzen mit der richtigen Länge wird zunächst erzeugt, um Peptidsequenzen der gewünschten Länge zu codieren. Dies kann durch zufälliges Spalten von biologischem genetischem Material mit einer anschließenden Elektrophorese zur Gewinnung dieser Nucleotidsequenzen, die durch Scheren die gewünschte Länge erhielten, oder durch Synthese aus Nucleinsäurebestandteilen erreicht werden.
Je nach den gewünschten Charakteristika der erhaltenen Population von Nucleotidsequenzen und letztlich der zu produzierenden Peptidsequenzen werden verschiedene Verfahren zum Erhalt der Nucleotidpopulation verwendet. Wenn eine zufällige Population von Nucleotidsequenzen gewünscht wird, dann können die Nucleotide durch Zugabe der vier Nucleinsäuren mit gleicher Häufigkeit an jeder Position der wachsenden Nucleotidketten synthetisiert werden. Wenn gewünscht wird, daß die synthetisierten Nucleotidtripletts mehr die Verteilung von natürlich vorkommenden Tripletts reflektieren, dann kann die Häufigkeit von jeder verwendeten Nucleinsäure, die an der ersten, zweiten oder dritten Position von jedem Triplett verwendet wird, manipuliert werden, um der Häufigkeit näherzukommen, mit der jeder Nucleinsäurerest an jeder Position in der Natur erscheint, wie von F. H. C. Crick et al., Origin of Life 7 (1976), 389-397, vorgeschlagen. Eine beliebige von mehreren Quellen von genetischem Material kann gewählt werden, um durch Scheren Nucleotidsequenzen von der gewunschten Länge zu erhalten, z. B. zelluläre DNA oder cDNA. cDNA liefert selbstverständlich eine getreuere Darstellung der natürlich vorkommenden codierenden Sequenzen.
Nach dem Erhalt kann die gewünschte Population von Nucleotidsequenzen anschließend behandelt werden, um die Insertion jeder Sequenz in einen Vektor und die anschließende Gewinnung der gewünschten Peptidsequenz aus der Kultur von Wirtszellen, die den gentechnisch hergestellten Vektor einschließen, zu erleichtern. Beispielsweise können AUG-Sequenzen unter Verwendung von bekannten Verfahren an jedes Ende von jedem Mitglied der Population von Nucleotidsequenzen ligiert werden. Nach der Translation jeder Nucleotidsequenz wird die gewünschte Peptidsequenz von Methioninresten flankiert. Das translatierte Protein kann anschließend mit Bromcyan behandelt werden, das Peptide an Methioninstellen spaltet, um die gewünschte Peptidsequenz aus dem Protein auszuschneiden. Das Spaltprodukt kann anschließend durch Elektrophorese gereinigt werden. Alternativ kann eine Restriktionsendonuclease- Erkennungsstelle an jedes Ende von jedem Mitglied der Population von Nucleotidsequenzen ligiert werden, und anschließend kann die Population von Nucleotidsequenzen mit der die ligierte Sequenz erkennenden Endonuclease behandelt werden, um "überstehende" Enden zu erzeugen, die die Insertion des Nucleotids in die Restriktionsstelle in einem von der Endonuclease erkannten Vektor erleichtern.
Jede Nucleotidsequenz wird anschließend in einen geeigneten Vektor insertiert. Das Verhältnis der Nucleotidsequenzen zu den Vektoren kann gesteuert werden, um sicherzustellen, daß nicht mehr als eine Nucleotidsequenz in einen beliebigen Vektor insertiert wird. Die Nucleotidsequenz muß an einer Stelle in dem Vektor insertiert werden, an der sie nach dem Transfer des Vektors in eine geeignete Wirtszelle in Phase translatiert wird und an der sie die Replikation des Vektors unter den verwendeten experimentellen Bedingungen nicht behindert. Die Nucleotidsequenz muß in einen nicht-essentiellen Bereich des Vektors insertiert werden. Pieczenik, US-Patent Nr.4,359,535, offenbart ein Verfahren zur Insertion von Fremd-DNA in einen nicht-essentiellen Bereich eines Vektors.
Die Nucleotidsequenz wird vorteilhaft so insertiert, daß die von der Nucleotidsequenz codierte Peptidsequenz auf der äußeren Oberfläche des Vektors exprimiert wird. Zur Herstellung von Insertionen mit diesen Charakteristika wird zunächst ein geeigneter Vektor, z. B. ein Phage oder Plasmid, gewählt. Der Vektor wird anschließend gemäß dem Verfahren, das von Pieczenik, US-Patent Nr.4,359,535, offenbart wird, zufällig gespalten, um eine Population von linearen DNA-Molekülen mit zirkulär permutierten Sequenzen zu erhalten. Nach den Spaltungsschritten kann ein synthetischer Oligonucleotidlinker, der eine einzigartige auf dem ursprünglichen nicht-modifizierten Vektor nicht vorhandene Nucleotidsequenz trägt, an beide Enden jedes linearisierten Vektors durch glattendige Ligierung angefügt werden. Die zufälligen linearen Moleküle können anschließend mit den für die angefügten Sequenzen spezifischen Restriktionsendonucleasen behandelt werden, um überstehende Enden zu erzeugen.
DNA, die ein Genprodukt, z. B. menschliches Hömoglobin, das im Vektor nicht vorhanden ist, codiert, wird zur gewünschten Größe, z. B. fünfzehn Nucleotide lang, fraktioniert, und die Nucleotidsequenzen werden mit dem gleichen Typ von Linker, der bei den zufälligen linearen Molekülen verwendet wird, ligiert. Die fraktionierten Nucleotidsequenzen werden anschließend in die zufälligen linearen Moleküle insertiert und die modifizierten Vektoren in geeignete Wirtszellen transferiert. Die Wirtszellen werden verdünnt, plattiert und die einzelnen Kolonien gezüchtet. Auf Replikaplatten werden die Kolonien mit einem für das Genprodukt spezifischen monoclonalen oder polyclonalen Antikörper durchmustert.
Eine positive Reaktion mit dem Antikörper identifiziert eine Kolonie, in der die insertierte Nucleotidsequenz in Phase translatiert wird, und sich die codierte Peptidsequenz auf der für den Antikörperdurchmusterungstest zugänglichen äußeren Oberfläche des Polypeptids oder Proteins befindet. Bei Verwendung eines monoclonalen Antikörpers im Durchmusterungsschritt identifiziert dieses Verfahren nur die Kolonien, in denen die spezifische Peptidsequenz, die die vom Antikörper erkannte Stelle umfaßt, auf der äußeren Oberfläche des Polypeptids oder Proteins insertiert ist. Bei Verwendung eines polyclonalen Antikörpers oder eines Gemisches von mehreren monoclonalen Antikörpern wird eine beliebige Kolonie, die auf der äußeren Oberfläche des Polypeptids oder Proteins eine beliebige Peptidsequenzinsertion enthält, die eine Erkennungsstelle des Fremdgenprodukts umfaßt, identifiziert. Dieses Verfahren identifiziert Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet werden können.
Der Insertionsschritt erzeugt eine Population von Vektoren, von denen jeder eine Nucleotidinsertion enthält, die eine andere Peptidsequenz codiert, wobei jede codierte Peptidsequenz die gleiche gewünschte Zahl von Aminosäureresten enthält. Diese Population von Vektoren wird anschließend in eine Population von geeigneten Wirtszellen transferiert. Konzentrationen von Vektoren und von Wirtszellen können gesteuert werden, um sicherzustellen, daß nicht mehr als ein Vektor in eine beliebige Wirtszelle transferiert wird. Die Zellen werden plattiert und gezuchtet und die translatierten Proteine werden daraus gewonnen.

Erzeugung der Matrix

Die besondere Konstruktion der Matrix, die vom vollständigen Antikörperspektrum oder von den vorstehend beschriebenen Peptidsequenzen erzeugt wurde, hängt von ihrer Verwendung ab. Entweder die Antikörper oder die Peptidsequenzen werden auf einem Substrat, z. B. Nitrocellulose, immobilisiert. Die Immobilisierung kann durch kovalente Bindung der Antikörper oder Peptidsequenzen an das Substrat erreicht werden. Jede Stelle auf der Matrix ist durch eine einzige chemische Spezies, d. h. ein monoclonaler Antikörper oder ein gereinigtes Peptid, besetzt. Die Quelle von jeder einzelnen immobilisierten Spezies wird als getrennte Kultur aufrechterhalten. Allgemein werden die Antikörperpeptidsequenzen oder die Testspezies mit einem geeigneten Marker wie einer fluoreszierenden Verbindung, einem Enzym oder einem radioaktiven Marker markiert. Die Peptidsequenz selbst kann als ein empfindlicher biologischer Anzeiger dienen, wenn sie auf der Oberfläche eines Proteins oder Vektors liegt.
An den Immobilisierungstellen der Antikörper werden die Peptidsequenzen mit den Antikörpern unter geeigneten Bedingungen und über einen ausreichenden Zeitraum in Kontakt gebracht, so daß jeder immobilisierte Antikörper an die für ihn spezifische Peptidsequenz bindet. An den Immobilisierungstellen der Peptidsequenzen werden die Antikörper anschließend mit den Peptidsequenzen in Kontakt gebracht, so daß jede immobilisierte Peptidsequenz von einem für diese Sequenz spezifischen Antikörper erkannt und gebunden wird. Jeder Komplex aus der Peptidsequenz und ihres gebundenen Antikörpers kann als Bindungspaar bezeichnet werden. In einigen Fällen werden die Antikörper oder Peptidsequenzen selber auf dem Substrat immobilisiert; in anderen Fällen werden die die Antikörper oder Peptide produzierenden Zellkulturen immobilisiert. Bindungspaare werden in einem einzigen Schritt erzeugt, wobei die natürliche Affinität von Antikörpern für die Peptidsequenzen, für die sie spezifisch sind, ausgenutzt wird. Bei einem Inkontaktbringen einer Peptidprobe mit einer Population von immobilisierten Antikörpern sortieren sich die Peptide selber, und jedes bindet an den entsprechenden Antikörper. Ebenso sortieren sich die Antikörper bei einem Inkontaktbringen einer Probe von Antikörpern mit einer Population von immobilisierten Peptiden selber, und jeder bindet an das entsprechende Peptid. Das Sortieren erfolgt, obwohl die funktionellen Charakteristika von einem beliebigen der einzelnen Antikörper oder Peptide zuvor nicht bekannt sind.
Eine Matrix, bei der die Antikörper auf dem Substrat immobilisiert werden, wird als eine Matrix mit immobilisiertem Antikörper oder AIM bezeichnet. Wenn jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, wird die Matrix als P-AIM bezeichnet. Ebenso wird eine Matrix, bei der die Peptidsequenzen auf dem Substrat immobilisiert werden, als eine Matrix mit immobihsiertem Peptid oder PIM bezeichnet. Wenn jede immobilisierte Peptidsequenz ein Bindungspaar mit einem entsprechenden Antikörper erzeugt, wird die Matrix als A-PIM bezeichnet.
Üblicherweise umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren das Inkontaktbringen einer Testspezies mit einer intakten P-AIM oder einer intakten A-PIM, wobei die spezifischen Charakteristika der Matrix von der Natur der gesuchten Information abhängen. Angesichts der großen Zahl von unterschiedlichen Hybridomen und gentechnisch hergestellten Clonen, die in das erfindungsgemäße Verfahren eingeschlossen sind, können die Antikörper oder Peptidsequenzen sehr dicht auf dem Substrat immobilisiert werden. Bereiche mit einer kompetitiven Bindung werden identifiziert, wenn die Testspezies mit der Matrix in Kontakt gebracht wird. Kolonien aus diesen Bereichen können anschließend gewonnen, weniger dicht erneut plattiert und der kompetitive Bindungsschritt mit der Testspezies wiederholt werden, um die den Antikörper oder die Aminosäuresequenz produzierende einzelne Kolonie, bei der eine Paarung behindert wurde, spezifisch zu identifizieren.

Durchmustern auf einen interessierenden Antikörper oder eine interessierende Testspezies

Eine P-AIM wird sowohl zur Identifizierung und zum Erhalt von Antikörperclonen, die für eine interessierende Testspezies spezifisch sind, als auch zur Identifizierung der von einem interessierenden Antikörper erkannten spezifischen Peptidsequenz verwendet. Die Testspezies kann beispielsweise ein Virus, Bakteriophage, Virus-Hüllprotein, Oberflächenprotein eines viralen oder bakteriellen Pathogens, Protein auf der Oberfläche einer malignen Zelle, Enzym oder Peptid mit der Sequenz eines gewählten Teils eines interessierenden Proteins sein. Die Testspezies muß keine Peptide enthalten, sondern kann z. B. ein Wirkstoff oder Kohlenhydrat mit einer Konfiguration, die einer Peptidsequenz nahekommt, sein.
Die Testspezies wird mit einer P-AIM in einem kompetitiven Bindungstest mit jedem der komplexierten Bindungspaare in Kontakt gebracht. Jedes Bindungspaar besetzt eine einzige Stelle auf der Matrix.
Bei Markierung dieser Paare können jegliche durch die Gegenwart der Testspezies gestörten Paarungen identifiziert werden.
Ein besonders empfindliches Markierungsverfahren wird erhalten, wenn die an die immobilisierten Antikörper gebundenen Peptidsequenzen auf der Oberfläche eines Proteins oder Vektors liegen. Nach der Herstellung der P-AIM und der Erzeugung der Bindungspaare wird die P-AIM zur Entfernung jeglicher nicht-gebundenen Peptidsequenzen sorgfältig gewaschen. Die Testspezies wird anschließend mit der P- AIM in Kontakt gebracht. Jegliche Peptidsequenzen, die von ihren entsprechenden Antikörpern durch die Gegenwart der Testspezies ersetzt werden, können direkt von der P-AIM abtitriert werden. Verfügbare Verfahren haben eine ausreichende Empfindlichkeit zum Nachweis der Gegenwart von nur zehn Proteinmolekülen oder Vektororganismen im titrierten Überstand.
Wenn die Testspezies markiert ist, kann ihre Bindung direkt nachgewiesen werden. Jeder Clon, der einen an eine Testspezies bindenden Antikörper produziert, wird identifiziert und gezüchtet, um eine Antikörperquelle bereitzustellen. Jede Kultur, die eine Peptidsequenz produziert, die durch die Gegenwart eines interessierenden Antikörpers ersetzt wird, wird identifiziert und gezüchtet, um eine Quelle dieser Peptidsequenz bereitzustellen.
Eine PIM wird sowohl zur Identifizierung der spezifischen Sequenzen auf einem Testprotein oder Testpolypeptid, das von Antikörpern erkannt werden kann, und zur Identifizierung der spezifischen Peptidsequenzen, die von einem interessierenden Antikörper erkannt werden, verwendet. Das Verfahren zum Durchmustern einer PIM ist zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren zum Durchmustern einer AIM analog. Das Testprotein oder die Peptidsequenz oder der Testantikörper wird mit einer intakten A- PIM in einem kompetitiven Bindungstest mit jedem der Antikörper-Peptidsequenzpaare in Kontakt gebracht. Die Paarungen, die durch die Gegenwart des Testproteins oder Polypeptids oder Testantikörpers gestört werden, werden festgestellt, und die die Aminosäuresequenz produzierenden Clone, bei denen die Paarung gestört wird, werden identifiziert und gezüchtet. Durch dieses Verfahren kann nicht nur die vom Antikörper erkannte Aminosäuresequenz ermittelt werden, es ist jetzt genauso möglich, die diese Aminosäuresequenz codierende Nucleinsäuresequenz als die Insertion in den Vektor, der im die erkannte Aminosäuresequenz produzierenden Clon enthalten ist, zu identifizieren.

Beispiel I

Zur Erläuterung bestimmter erfindungsgemäßer Gesichtspunkte wird nachstehend ein Verfahren zur Ermittlung der Antikörpererkennungsstellen auf Insulin beschrieben.

Produktion von Hybridomzellinien

Mehrere C57B1/10-Mäuse werden intraperitoneal mit 100 Mikrogramm menschlichem Insulin, das in Alaun ausgefällt und mit 2 x 10&sup9; getöteten Bordetella pertussis-Organismen als Adjuvans vermischt wurde, immunisiert. Eine zweite Injektion von 100 bis 200 Mikrogramm Insulin in physiologischer Kochsalzlösung wird einen Monat später gegeben.
Drei Tage nach der zweiten Injektion werden die Mäuse durch Genickdislokation getötet, die Milzen aseptisch entfernt und in eine 10 ml GKN-Lösung enthaltende bakteriologische Petrischale aus Plastik transferiert. Die GKN-Lösung enthält pro Liter destilliertem Wasser: 8 g NaCl, 0,4 g KCl, 1,77 g Na&sub2;HPO&sub4; x 2H&sub2;O, 0,69 g NaH&sub2;PO&sub4; x H&sub2;O, 2 g Glucose und 0,01 g Phenolrot. Die Zellen werden mit einem Spatel aus der Kapsel gekratzt. Zellklumpen werden durch Auf- und Abpipettieren mit einer 10 ml-Plastikpipette weiter dispergiert. Die Suspension wird in ein 15 ml- Polypropylenröhrchen transferiert, in dem die Klümpchen 2 bis 3 Minuten absitzen können. Die Zellsuspension wird in ein anderes Röhrchen dekantiert und 15 Minuten bei Raumtemperatur bei 170 g zentrifugiert. Die Zellen werden erneut in GKN gewaschen und schließlich in 1 bis 2 ml GKN resuspendiert. Ein 20 Mikroliter-Aliquot der mit 1 ml Trypanblaulösung angefärbten Zellsuspension wird zur Ermittlung der Ausbeute von Milzzellen gezählt.
10&sup8; gewaschene Milzzellen und 5 x 10&sup7; 8-Azaguanin-resistente Myelomzellen (z. B. Zellinie X63Ag8.6.5.3; FO; oder Sp2/0-Ag14) werden in einem konischen 50 ml-Röhrchen (Falcon 2070) vereinigt. Das Röhrchen wird mit GKN gefüllt und bei 170 bis 200 g bei Raumtemperatur zentrifügiert. Der Überstand wird anschließend abgezogen und 0,5 ml 50% Lösung von Polyethylenglycol in GKN tropfenweise dem Pellet zugesetzt. Diese Zugabe erfolgt über einen Zeitraum von einer Minute bei Raumtemperatur, während das Pellet durch Rühren aufgelöst wird. Nach 90 Sekunden werden 5 bis 10 ml GKN langsam über einen Zeitraum von 5 Minuten zugesetzt. Die Zellsuspension wird anschließend 10 Minuten stehen gelassen, wonach große Zellklumpen durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 10 ml-Pipette dispergiert werden. Die Zellsuspension wird anschließend in 500 ml Dulbecco's modifiziertem Eagle's- Medium, das 10% fötales Kälberserum und HAT-Medium enthält, verdünnt. 1 ml- Aliquots werden in 480 Vertiefungen von Costar-Platten (Costar Tissue Culture Cluster 24, Kat. Nr.3524, Costar, 205 Broadway, Cambridge, MA), die schon 1 ml HAT- Medium und 10&sup5; peritoneale Zellen oder 10&sup6; Milzzellen enthalten, verteilt. Die Platten werden in einem vollständig feuchten Ihkubator bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2; in Luft gehalten. Nach 3 Tagen und danach zweimal pro Woche wird 1 ml Medium aus jeder Vertiefung entfernt und durch HAT-Medium ersetzt. Nach 7 bis 10 Tagen werden die Vertiefungen auf Hybride untersucht und das HAT-Medium durch HT-Medium ersetzt. Interessierende Zellpopulationen werden durch einen Transfer in Zellkulturflaschen zum Einfrieren, Clonieren und zur Produktanalyse vermehrt. 10&sup6; peritoneale Zellen werden zu diesem Zeitpunkt zu jeder Kulturflasche zugesetzt.
Durch die vorstehend beschriebenen Verfähren produzierten Hybridome werden unter Verwendung von Standardverfahren vermehrt und doniert. Der von jeder Hybridomlinie produzierte monoclonale Antikörper wird aus dem Kulturüberstand gereinigt und durch Affinitätschromatographie auf einer Protein A-Sepharosesäule konzentriert.

Produktion der Genbank

cDNA wird von einer heterogenen Population von mRNA synthetisiert. Die cDNA wird zufällig geschoren, und die 15 Nucleotidfragmente werden durch Elektrophorese gewonnen. Diese Fragmente werden in Phase in das die beta- Galactosidase von lambda-gt11 codierende Strukturgen gemäß dem von Pieczenik im US-Patent Nr. 4,359,535 offenbarten Verfahren insertiert. Jeder der erhaltenen Clone produziert das normale lambda-gt11-Protein, das eine Fremdsequenz von 5 Aminosäureresten enthält, die durch das in das beta-Galactosidasegen insertierte Fragment aus 15 Nucleotiden codiert wird.

Durchmustem und genaue Identifizierung der Antikörper-Bindungsstellen

Die Bank wird mit einer Dichte von 25 000 Plaques pro 150 mm²-Platte plattiert und unter Verwendung eines Pools von monoclonalen Antikörpern, die mit menschlichem Insulin reagieren und mit dem nicht-modifizierten lambda-gt11-Phagen nicht reagieren, immunologisch durchmustert. Das immunologische Durchmustern wird im wesentlichen gemäß dem von R. A. Young et al., Science 222 (1983), 778, beschriebenen Verfahren durchgeführt, das hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Die durch das Durchmusterungsverfahren identifizierten lambda-gt11-Clone werden als Lysogene in den E. coli-Stamm RY 1089 (ATCC 37,196) eingeführt. Lysogene werden bei 32ºC in 50 Mikrogramm Ampicillin pro Milliliter enthaltenden Medien bis zu einer Absorption bei 550 mm von 0,4 bis 0,8 gezüchtet. Die Phagen werden 20 Minuten bei 44ºC durch vorsichtiges Schütteln induziert, und anschließend wird Isopropylthiogalactosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 2 mM zugesetzt und die Kultur eine weitere Stunde bei 37ºC geschüttelt, um die Expression der beta- Galactosidase und möolicher Fusionsproteine zu erhöhen.
Die Lysate werden anschließend einer Elektrophorese auf einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) unterzogen und durch Elektroblotting auf Nitrocellulose transferiert. Die pelletierten Zellen von 0,1 ml jeder Lysogenkultur werden in 20 Mikroliter SDS-Gelprobenpuffer (3% SDS, 10% Glycerin, 10 mM Dithlothreit, 62 mM Tris-HCl, pH 6,8) 5 Minuten bei 95ºC für eine Elektrophorese gelöst. Die Western-Blot-Analyse wird gemäß einer Modifikation des Verfahrens von H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1979), 4350, durchgeführt. Proteine werden durch SDS-PAGE gemäß dem Verfahren von Laemmli, Nature 277 (1970), 680, mit einem 4,5% Sammelgel und einem 8 bis 12% Gradientengel getrennt. Das Filter wird 90 Minuten mit einem einzigen der vorstehend selektierten monoclonalen Antikörper, der zu einer Konzentration von 1:20 000 mit 0,05% Tween-20 und 20% FCS enthaltendem PBS verdünnt ist, umgesetzt. Der an das Filter gebundene Antikörper wird mit ¹²&sup5;I-markiertem Schafantiserum, das gegen den vollständigen Maus-Antikörper hergestellt wurde, inkubiert (Verdünnung auf 2 x 10&sup5; CpM/ml mit 0,05 % Tween-20 und 20% FCS enthaltendem PBS) und anschließend durch Autoradiographie nachgewiesen. Das mit dem verwendeten spezifischen Antikörper reagierende Lysogen enthält den gentechnisch hergestellten lambda-gt11- Clon, dessen beta-Galactosidase-Enzym mit einer Sequenz aus 5 Aminosäuren fusioniert ist, die der vom Antikörper erkannten Sequenz aus 5 Aminosäuren vom Insulin entspricht. Die Elektrophorese- und Elektroblottingschritte werden für jeden der vorstehend ausgewählten monoclonalen Antikörper wiederholt und die spezifischen Sequenzen auf dem Insulinmolekül, die von jedem dieser Antikörper erkannt werden, identifiziert.

Beispiel II

Das Verfahren von Beispiel 1 wird modifiziert, um den Schritt der Inokulation der Mäuse mit menschlichem Insulin zu eliminieren. Ein identisches Emteverfahren wird zum Erhalt von Milzzellen von nicht mit Antigenen stimulierten Mäusen verwendet. Die Milzzellen werden mit Myelomzellen zu Hybridzellen verschmolzen, wie in Beispiel 1 beschrieben, und die erhaltenen Hybridome vermehrt und doniert. Trotz der Eliminierung des Antigenstimulierungsschritts werden durch das Durchmustern Clone identifiziert, die mit menschlichem Insulin reagierende Antikörper produzieren.

Beispiel III

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung wird nachstehend ein Verfahren zur Erzeugung und zum Durchmustern einer cDNA-Expressionsbank beschrieben. In diesem Beispiel wird die cDNA-Bank aus INRNA von glatten Hühnermuskeln hergestellt.

Herstellung einer Genbank

Die Gesamt-RNA des glatten Muskels wird aus den Mägen und Muskelmägen von 11 Tage alten Hühnerembryonen gemäß dem Verfahren von J. M. Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979), 5294, und J. R. Feramisco et al., J. Biol. Chem. 257 (1982), 11024, hergestellt. Poly(A)&spplus;-RNA wird durch zwei Zyklen der Adsorption an und Elution von Oligo(dT)-Cellulose gemäß dem Verfahren von H. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972), 1408, isoliert. Ausgehend von etwa 25 Mikrogramm poly(A)&spplus;-RNA wird der erste und zweite Strang der cDNA unter Verwendung der reversen Transkriptase des Myeloblastosevirus der Hühner synthetisiert. Das doppelte Linkerverfahren von Kartz und Nicodemus, Gene 13 (1981), 145, kann verwendet werden. Die doppelsträngige cDNA mit intakten Haarnadelschleifen an den Enden, die den 5'-Enden der poly(A)&spplus;-mRNA entsprechen, werden mit dem Klenowfragment der E. coli-DNA-Polymerase I (von Boehringer Mannheim oder New England Biolabs erhältlich) aufgefüllt. Die aufgefüllte cDNA wird anschließend an ³²P-markierte SalI- Octanucleotidlinker (von Collaborative Research, Waitham, MA, erhältlich) ligiert. Die cDNA mit SalI-Linkern, die an das Ende angefügt sind, das dem 3'-Ende der poly(A)&spplus;-mRNA entspricht, wird anschließend mit der Nuclease 51 behandelt, um die Haamadelschleife zu zerstören, und erneut mit dem Klenowfragment der DNA- Polymerase I von E. coli aufgefüllt. Die EcoRI-Octanucleotid-Linker (auch von Collaborative Research erhältlich) werden an die cDNA ligiert. Die DNA wird sowohl mit EcoRI als auch SalI vollständig gespalten. Eine Sepharose 48-Säule, die mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), das 1 mM EDTA und 300 mM NaCl enthält, äquilibriert ist, wird zur Isolierung und Reinigung der cDNA-Fragmente mit einer Länge von 15 Nucleotiden verwendet, die von zwei Octanucleotidlinkern flankiert werden.
Der Plasmidvektor pUC8, der von Vieria et al., Gene 19 (1982), 259, beschrieben wird, wird mit EcoRI und SalI vollständig gespalten und zweimal mit einem 1:1 (Vol./Vol.) Gemisch von Phenol und Chloroform extrahiert. Das 2,9 Kilobasen- Fragment wird von dem 16 Nucleotide langen Fragment auf einer, wie vorstehend beschrieben, äquilibrierten Sepharose 413-Säule getrennt. Das große Fragment enthaltende Fraktionen werden vereinigt und mit Ethanol ausgefällt. Die cDNA wird an den Vektor in einem Gewichtsverhältnis von Vektor zu cDNA von 1 000 : 1 ligiert. Etwa 1 Nanogramm cDNA wird an 1 Mikrogramm Plasmidvektor ligiert.
Standardverfahren werden zur Transformation des E. coli-Stamms DH-1 mit dem gentechnisch hergestellten pUC8-Vektor verwendet. Die Bakterien werden auf 82 mm-Nitrocellulosefilter (Millipore Triton-freies HATF), die auf Ampicillin-Platten gelegt wurden, zum Erhalt von etwa 1 000 Kolonien pro Filter plattiert. Die Kolonien werden auf Nitrocellulosefiltern replikaplattiert (von Schleicher & Schüll erhältlich) und die Replikaplatten erneut sowohl auf selektiven Platten zum Durchmustern auf Antikörper und Hybridisierung als auch auf Glycerinplatten zur Langzeitaufbewahrung bei -70ºC gezüchtet.

Antikörperproduktion und immunologisches Durchmustern

Jede Platte wird immunologisch durchmustert, um Kolonien zu identifizieren, die eine 15 Nucleotide lange cDNA-Insertion, die einem Teil des Hühner- Tropomyosingens entspricht, enthalten. Monoclonale Antikörper zur Verwendung beim Durchmustern werden, wie nachstehend beschrieben, entwickelt.
Milzzellen werden von mit Hühner-Tropomyosin als Antigen stimulierten Spendermäusen geerntet. Alternativ werden Milzzellen von nicht antigenstimulierten Mäusen geerntet. Die Milzzellen werden mit Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomstämmen füsioniert. Der von jeder Hybridomlime produzierte monoclonale Antikörper wird aus dem Kulturüberstand gereinigt und durch Affinitätschromatographie auf einer Protein A-Sepharosesäule konzentriert.
Antikörper werden auf eine Reaktivität mit Hühner-Tropomyosin und mit dem kein Plasmid enthaltenden bakteriellen Ausgangsstamm DH-1 durchmustert. Diese Antikörper, die mit Tropomyosin reagieren und mit DH-1 nicht reagieren, werden zur Verwendung beim Durchmustern der transformierten bakteriellen Kolonien ausgewählt.
Als Vorbereitung zum Durchmustern werden die bakteriellen Kolonien durch Suspension der Nitrocellulosefilter 15 Minuten in einer mit CHCl&sub3;-Dampf gesättigten Atmosphäre lysiert. Jedes Filter wird anschließend in eine einzelne Petrischale in 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,5/150 mM NaCl/5 mM MgCl&sub2;, enthaltend 3% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin, 1 Mikrogramm DNase und 40 Mikrogramm pro Milliliter Lysozym, gegeben. Jedes Filter wird über Nacht bei Raumtemperatur vorsichtig geschüttelt und anschließend in Salzlösung (50 mM Tris-HCl, pH 7,5/150 mM NaCl) gespült. Jedes Filter wird mit einer verdünnten Salzlösung eines monoclonalen Antikörpers inkubiert, der aus den Antikörpern ausgewählt wurde, die eine Reaktivität mit Tropomyosin, jedoch nicht mit DH-1 zeigen. Die Filter werden anschließend fünfmal mit Salzlösung bei Raumtemperatur gewaschen, wobei jeder Waschschritt eine halbe bis eine ganze Stunde dauert. Die Filter werden anschließend mit 5 x 10&sup6; CpM von ¹²&sup5;I- markiertem Ziegen-anti-Maus-IgG mit einer spezifischen Aktivität von etwa 107 CpM/Mikrogramm inkubiert und in 10 ml Salzlösung, die 3 % Rinderserumalbumin enthält, verdünnt. Das Ziegen-anti-Maus IgG kann eine affinitätsgereinigte Fraktion sein. Die Markierung wird aemäß dem Chloramin-T-Verfahren von Burridge, K., Methods Enzymol. 50 (1978), 57, durchgeführt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde werden die Filter erneut in Salzlösung mit fünf- oder sechsmaligem Wechseln bei Raumtemperatur gewaschen, getrocknet und 24 bis 72 Stunden unter Verwendung von Dupont Cronex Lightning Plus-Röntgen-Verstärkerschirmen autoradiographiert. Beim immunologischen Durchmustern ist vorteilhafterweise ein Filter eingeschlossen, auf dem sich definierte Mengen von unterschiedlichen gereinigten Proteinen befinden. Dies dient einer weiteren Kontrolle der Spezifität des immunologischen Nachweises der Antigene. Mengen von weniger als 1 Nanogramm gereinigtes Protein können in diesen Tests nachgewiesen werden.
Dieses Verfahren ermöglicht die Identifikation und Charakterisierung der spezifischen Sequenz aus fünf Peptiden des Tropomyosin-Proteins, das durch einen bestimmten monoclonalen Antikörper identifiziert wird. Da dieses immunologische Durchmusterungsverfahren mit verschiedenen monoclonalen Antikörpern wiederholt wird, werden mehrere unterschiedliche antigene Stellen auf dem Tropomyosin-Protein identifiziert. Die 15 Nucleotide lange Sequenz der cDNA, die jede antigene Stelle codiert, wird in der cDNA-Bank aufbewaßrt, und eine jede Stelle erkennende Antikörperquelle wird in den getrennten Hybridomlinien aufbewahrt.

Verwendung

Die Erfindung kann zur Produktion von bestimmte Testspezies erkennenden und bindenden Antikörpern und zur Ermittlung entweder (1) der von einem Antikörper erkannten spezifischen Peptidsequenz auf einem Protein, Enzym oder Peptid oder (2) einer Aminosäuresequenz mit einer Konfiguration, die der Struktur einer von einem Antikörper erkannten Nicht-Peptid-Testspezies sehr ähnlich ist, verwendet werden. Die Erfindung wird ferner verwendet, um die Nucleotidsequenz, die die von einem Antikörper erkannte Aminosäuresequenz codiert, zu ermitteln.
Zur Identifizierung einer Peptidsequenz, die einer Antikörper-Bindungsstelle auf einer Testspezies sehr nahekommt, kann entweder eine A-PIM oder eine P- AIM verwendet werden. Bei Verwendung einer A-PIM wird die Testspezies zunächst mit der intakten A-PIM in Kontakt gebracht. Jegliche eine Affinität für die Testspezies aufweisende, an immobilisierte Peptidsequenzen gebundene Antikörper werden durch "Kompetition" zur Bindung an die Testspezies von der Matrix "entfernt". Die Peptidsequenz, die an einer Stelle immobilisiert ist, wo die Antikörper durch "Kompetition entfernt" werden, weist eine konformationelle Ahnlichkeit zu der Stelle auf der Testspezies auf, an die die Antikörper nun gebunden sind. Bei Verwendung einer P-AIM wird die Testspezies zunächst mit der intakten P-AIM in Kontakt gebracht. Die Testspezies ersetzt jegliche Peptidsequenzen, die eine ausreichende konformationelle Ahnlichkeit zu einer Antikörpererkennungsstelle auf der Testspezies aufweisen, so daß ein Antikörper, der an die Peptidsequenz binden kann, auch an die Testspezies binden kann. Die ersetzten Peptidsequenzen können anschließend von der Matrix abtitriert und identifiziert werden. Die Testspezies muß nicht proteinartig sein oder von Peptiden abstammen. Sie kann beispielsweise ein Kohlenhydrat oder ein nicht-peptidischer Wirkstoff sein. Es kann erwartet werden, daß die Erkennungsstelle einer nicht-peptidischen Substanz der Konformation einer Peptidsequenz sehr nahekommt. Eine Testspezies kann die Bindung an mehr als einer einzigen Stelle auf einer Matrix stören; dies beruht darauf, daß es mehr als eine unterschiedliche Antikörpererkennungsstelle auf der Testspezies gibt oder daß zwei oder mehr unterschiedliche Peptidsequenzen jeweils der Konformation einer Erkennungsstelle auf der Testspezies ahneln. Die Testspezies muß nicht immunogen sein, d. h. bei einer Inokulation in einen Säuger die Produktion von Antikörpern in vivo induzieren; die Antikörperbindungsstellen einer Testspezies können charakterisiert werden, obwohl die Testspezies nicht immunogen ist.
Wenn die Testspezies ein krankheitserregendes Mittel wie ein Vims oder Bakterium ist, dann können die Peptidsequenzen, die eine ähnliche Konformation wie die Antikörpererkennungsstellen des krankheitserregenden Mittels aufweisen, zur Entwicklung eines Impfstoffs verwendet werden. Ein synthetisches Antigen, das die identifizierte Peptidsequenz oder die identifizierten Peptidsequenzen einschließt, induziert nach einer Injektion in den Blutkreislauf eines Patienten die Produktion von Antikörpern gegen das krankheitserregende Mittel.
Wenn die Testspezies das rekombinante Genprodukt einer Genexpressionsbank ist, kann genau ermittelt werden, welche Bereiche des Genprodukts die Antikörpererkennungsstellen ausmachen. Die identifizierten Peptidsequenzen entsprechen den Sequenzen, die im von Antikörpern erkannten Genprodukt enthalten sind.
Wenn die Testspezies ein Genprodukt ist, wie beispielsweise ein Protein, Enzym oder Peptid, dann liefert die Erfindung ferner ein Mittel zur Lokalisierung des das Genprodukt codierenden Gens in einem Genom. Nach der Identifizierung der Peptidsequenzen, die durch das Durchmustern des Genprodukts mittels der Matrix identifiziert wurden, werden die diese Peptidsequenzen produzierenden rekombinanten Zellinien identifiziert und die diese Peptidsequenzen codierenden rekombinanten Nucleotidsequenzen gewonnen. Die Nucleotidsequenzen können anschließend als eine DNA-Sonde zur Lokalisierung des das Genprodukt codierenden Gens auf dem Genom verwendet werden. Da jede Nucleotidsequenz ziemlich kurz ist, d. h. eine Länge von 5 bis 12 Tripletts aufweist, kann erwartet werden, daß jegliche Sequenz oder eine sehr ähnliche Sequenz mehr als einmal im Genom vorkommt. Daher werden mehrere unterschiedliche Nucleotidsequenzen, von denen jede eine unterschiedliche Peptidsequenz codiert, in einer DNA-Sonde vorteilhaft verwendet. Durch einen Bereich auf einem Chromosom, an dem mehrere Nucleotidsequenzen nahe beieinander hybridisieren, wird das das Genprodukt codierende Gen identifiziert.
Zur Ermittlung der von einem bestimmten interessierenden Antikörper erkannten Peptidsequenz kann entweder eine PIM oder eine P-AIM verwendet werden. Bei Verwendung einer PIM muß nicht jede immobilisierte Peptidsequenz an einen entsprechenden Antikörper gebunden werden. Der interessierende Antikörper kann direkt mit einer Matrix von immobilisierten Peptidsequenzen in Kontakt gebracht werden. Jegliche vom interessierenden Antikörper gebundenen immobilisierten Sequenzen können dann direkt identifiziert werden. Bei Verwendung einer P-AIM wird der interessierende Antikörper zunächst mit der intakten P-AIM in Kontakt gebracht. Jegliche an immobilisierte Antikörper gebundene Peptidsequenzen, die vom interessierenden Antikörper erkannt werden können, werden durch "Kompetition" zur Bindung an den interessierenden Antikörper von der Matrix entfernt. Die Peptidsequenzen, die durch "Kompetition" von der Matrix durch die Gegenwart des interessierenden Antikörpers "entfernt" wurden, können von der Matrix abtitriert und identifiziert werden.
Wenn gewünscht wird, die Nucleotidsequenz zu ermitteln, die die von einem interessierenden Antikörper erkannte Peptidsequenz codiert, kann die rekombinante Zellinie, die die von dem Antikörper erkannte Peptidsequenz produziert, identifiziert und die die Peptidsequenz codierende Nucleotidsequenz gewonnen und sequenziert werden.
Wenn der interessierende Antikörper ein Antikörper ist, der von einem an einer Autoimmunerkrahkung leidenden Patienten produziert wird, und der Antikörper die eigenen Zellen des Patienten angreift, wodurch das Funktionieren dieser Zellen beeinträchtigt wird, dann kann die von dem Antikörper erkannte Peptidsequenz eine Grundlage zur Behandlung des Patienten liefern. Die vom Antikörper erkannte Peptidsequenz kann dem Patienten in einer wirksamen Menge in vivo verabreicht werden, um den Antikörper kompetitiv zu inhibieren) die eigenen Zellen des Patienten anzugreifen. Der Zustand des Patienten verbessert sich, da weniger Antikörper zum Angriff auflebende Zellen verfügbar sind, und die Verabreichung von Peptiden induziert keine weitere Antikörperproduktion, da die Peptide zur Induktion einer Immunantwort zu kurz sind.
Zur Identifizierung eines mit einer Testspezies reagierenden Antikörpers wird eine AIM verwendet. Es muß nicht jeder immobilisierte Antikörper an eine entsprechende Peptidsequenz gebunden sein. Die Testspezies kann direkt mit einer Matrix von immobilisierten Antikörpern in Kontakt gebracht werden. Jegliche an die Testspezies gebundenen immobilisierten Antikörper können direkt identifiziert werden, und die diese Antikörper produzierenden Clone können gezüchtet werden, um eine Antikörperquelle bereitzustellen. Die Testspezies muß nicht proteinartig sein oder von Peptiden stammen. Sie kann beispielsweise ein Kohlenhydrat oder ein nicht peptidischer Wirkstoff sein. Die Testspezies muß nicht inununogen sein. Es können Antikörper erhalten werden, die eine Testspezies erkennen, obwohl die Testspezies in vivo keine Antikörperproduktion induziert.
Die die Testspezies erkennenden Antikörper können in einem Immuntest verwendet werden, um auf die Gegenwart der Testspezies in einer biologischen Probe zu testen.
Wenn die Testspezies mit einer Krankheit in Zusammenhang steht, dann kann ein die Testspezies erkennender Antikörper in einem Diagnosetestkit zur Ermittlung des Zustandes eines Patienten verwendet werden. Der Antikörper wird mit einer geeigneten Probe von dem Patienten in Kontakt gebracht, um auf die Gegenwart der mit einer bestimmten Krankheit in Zusammenhang stehenden Testspezies zu testen. Der Antikörper kann in ein diagnostisches Testkit eingeschlossen werden, das ein Epitop auf einer mit einer Krankheit in Zusammenhang stehenden Substanz erkennt.
Wenn die Testspezies eine Population von malignen Zellen, z. B. Krebszellen, eines Patienten ist, dann kann ein Antikörper, der die malignen Zellen erkennt, während gesunde Zellen des Patienten nicht erkannt werden, verwendet werden, um Wirkstoffe zielsicher zu malignen Zellen zu bringen. Eine Probe von malignen Zellen wird mit einer MM in Kontakt gebracht, und an maligne Zellen bindende Antikörper werden identifiziert. Eine Probe von gesunden Zellen des Patienten wird mit einer Kopie der Matrix in Kontakt gebracht, und an die malignen Zellen, jedoch nicht an gesunde Zellen bindende Antikörper werden ausgewählt. Eine ausgewählte Antikörper produzierende Hybridomlinie wird gezüchtet, um eine Quelle für ausgewählte Antikörper bereitzustellen. Ein Wirkstoff, z. B. cytotoxischer Wirkstoff, wird anschließend an die ausgewählten Antikörper gebunden und eine wirksame Menge der mit einem Wirkstoff verknüpften Antikörper dem Patienten verabreicht.

Weitere Ausführungsformen

Weitere Ausführungsformen sind im Schutzbereich der folgenden Ansprüche.
Beispielsweise muß die Matrix nicht durch Immobilisierung der Antikörper oder der Aminosäuresequenzen auf einem Substrat konstruiert werden. Jeder einen Antikörper produzierende Clon und jeder eine Peptidsequenz produzierende Clon können getrennt gezüchtet werden. Jeder Antikörper wird einzeln mit jeder Peptidsequenz getestet. Die Entsprechung zwischen einzelnen Antikörpern und den von ihnen erkannten Peptidsequenzen kann aufgezeichnet werden. Eine Testspezies kann anschließend gegen jede der einen einzelnen Antikörper produzierenden Kulturen getestet werden. Jegliche an die Testspezies bindenden Antikörper können identifiziert werden, und die vom Antikörper erkannte spezifische Peptidsequenz kann durch die entsprechende die Peptidsequenz produzierende Kultur ermittelt werden. In ähnlicher Weise kann ein Testantikörper gegen jede der eine einzelne Peptidsequenz produzierenden Kulturen getestet werden. Die vom Testantikörper erkannte spezifische Peptidsequenz oder erkannten spezifischen Peptidsequenzen können direkt ermittelt werden, indem die einzigartige Peptidsequenz, die von jeglichen eine positive Bindungsantwort mit dem Testantikörper zeigenden Kulturen produziert wird, charakterisiert wird. Dieses allgemeine Verfahren kann leicht für jede beliebige der spezifischen Verwendungen einer vorstehend beschriebenen Matrix verwendet werden.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden in der nachstehend beschriebenen Liste zusammengefaßt:
a) Eine Population von Oligonucleotiden, wobei:
jedes Mitglied der Population im wesentlichen aus 1 bis etwa 50 Tandemsequenzen mit etwa 4 bis etwa 12 Nucleotidtripletts besteht,
jedes Mitglied der Population die gleiche Anzahl von Tandem- Wiederholungssequenzen der gleichen Länge aufweist,
jede der Tandemsequenzen eine entsprechende Peptidsequenz mit etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten codiert und
die Population mindestens etwa 10% aller Peptidsequenzen der ausgewählten Länge codiert.
aa) Die Oligonucleotidpopulation nach Punkt a), wobei jedes Mitglied der Population eine Einzelkopie der Nucleotidtriplettsequenz umfaßt.
ab) Die Oligonucleotidpopulation nach Punkt a), wobei jede Sequenz 5 bis 7 Nucleotidtripletts umfaßt.
ac) Die Oligonucleotidpopulation nach Punkt aa), wobei die Population durch Scheren von genetischem Material von Säugern erzeugt wird.
ad) Die Oligonucleotidpopulation nach Punkt a), wobei die Population aus den Nucleinsäurebestandteilen chemisch synthetisiert wird.
b) Ein Verfahren zur Herstellung einer Population von Peptiden, die durch die Oligonucleotide nach Punkt a) codiert werden, wobei:
jedes Mitglied der Population 1 bis etwa 50 Tandem-Peptidsequenzen mit etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten umfaßt,
jedes Mitglied der Population die gleiche Anzahl von Tandemsequenzen der gleichen Länge aufweist, und
die Population mindestens etwa 10% aller möglichen Peptidsequenzen der ausgewählten Länge enthält,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: das zufällige Scheren von Proteinen oder die zufällige chemische Synthese aus den L-Aminosäurebestandteilen,
oder die Herstellung der entsprechenden Oligonucleotide durch zufällige Spaltung von biologischem genetischem Material oder die zufällige Synthese aus den Nucleinsäurebestandteilen, Insertion der Nucleotidsequenzen in Vektoren, Transfer der Vektoren in geeignete Wirtszellen, Züchtung der Zellen und Gewinnung der Peptide.
ba) Das Verfahren nach Punkt b), wobei jedes Mitglied der Population eine Einzelkopie der Peptidsequenz umfaßt.
bb) Das Verfahren nach Punkt b), wobei jede Sequenz 5 bis 7 L- Aminosäurereste umfaßt.
bc) Das Verfahren nach Punkt ba), wobei die Population durch Scheren von Proteinen erzeugt wird.
bd) Das Verfahren nach Punkt b), wobei die Population aus den L- Aminosäurebestandteilen chemisch synthetisiert wird.
c) Eine Population von Vektoren, wobei jedes Mitglied der Population eine im wesentlichen identische autonom replizierbare Nucleinsäuresequenz umfaßt, wobei mindestens ein Teil jeder Sequenz ein Strukturgen ist, und
eine Oligonucleotidinsertion gemaß der Definition in Anspruch 1, die rekombinant in das Strukturgen innerhalb des Vektors insertiert ist, wobei ein signifikanter Anteil der Vektorpopulation deren rekombinanten Strukturgene exprimieren kann, wenn sie in die entsprechenden Wirtszellen transferiert werden, und wobei die Expression der rekombinanten Strukturgene rekombinante Polypeptide erzeugt, die Aminosäuresequenzen gemäß der Definition nach Anspruch 6 umfassen.
be) Die rekombinante Polypeptidpopulation, die von der Vektorpopulation nach Punkt c) produziert wird.
bf) Die rekombinante Polypeptidpopulation nach Punkt be), wobei jede Tandemeinheit von Nucleotidtripletts 5 bis 7 Nucleotidtripletts umfaßt.
cc) Die Vektorpopulation nach Punkt c), wobei die replizierbare Sequenz ein Plasmid ist.
cd) Die Vektorpopulation nach Punkt cc), wobei das Plasmid pBR322 ist.
ce) Die Vektorpopulation nach Punkt c), wobei die replizierbare Sequenz ein Virus ist.
cf) Die Vektorpopulation nach Punkt ce), wobei das Virus lambda-gt11 ist.
cg) Die Vektorpopulation nach Punkt ce), wobei das Virus ein Vaccinia- Stamm ist.
ch) Die Vektorpopulation nach Punkt c), wobei die replizierbare Sequenz einen filamentösen Bakteriophagen umfaßt.
ci) Die Vektorpopulation nach Punkt ch), wobei der filamentöse Bakteriophage pUC8 ist.
e) Eine heterogene Population von Antikörpern, die Antikörper, die an im wesentlichen jedes Mitglied der Peptidpopulation nach Punkt b binden können, umfassen.
ea) Ein Verfahren zur Produktion einer heterogenen Population von Antikörpern, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Gewinnen von Lymphzellen aus einem Säuger, der nicht mit einem bestimmten Antigen stimuliert wurde,
Fusion der Lymphzellen mit Myelomzellen zur Produktion von Hybridomzellen, und
Züchtung einzelner Hybridomzellinien, die Antikörper gegen ein breites Spektrum von Antigenen produzieren können.
eb) Das Verfahren nach Punkt ea), wobei der Säuger bis zur Gewinnung der Lymphzellen aseptisch aufgezogen wird.
ec) Das Verfahren nach Punkt ea), wobei die Lymplizellen aus einem fötalen oder einem neonatalen Säuger, der auf eine antigene Stimulierung noch nicht antworten kann, gewonnen werden.
f) Eine Population von Bindungspaaren, die umfaßt:
eine Population von Peptidsequenzen der gleichen Länge, wobei die Länge etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäurereste ist, wobei die Population mindestens 10% aller Peptidsequenzen der ausgewählten Länge umfaßt, und
eine heterogene Population von Antikörpern, die Antikörper umfaßt, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Oligopeptidpopulation binden können, im wesentlichen jedes Mitglied der Peptidpopulation, das an seinen entsprechenden Antikörper gebunden ist.
g) Eine Matrix. die ein Substrat, an dem die Sequenzen immobilisiert werden können, und eine Population von Peptidsequenzen der gleichen Länge gemäß der Definition in Punkt b umfaßt, wobei die Länge bei etwa 4 bis etwa 12 L- Aminosäureresten liegt, wobei die Population mindestens 10% aller Peptidsequenzen der ausgewählten Länge umfaßt, und
eine heterogene Population von Antikörpern, die Antikörper umfassen, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Oligopeptidpopulation binden können.
ga) Die Matrix nach Punkt g), wobei jede der Peptidsequenzen an einem geeigneten Substrat immobilisiert wird und die immobilisierten Peptidsequenzen mit Antikörpern in Kontakt gebracht werden.
gb) Die Matrix nach Punkt ga), wobei jeder der Antikörper mit einem geeigneten Marker markiert wird, der die Bindung nicht wesentlich stört und ein Mittel zur Identifizierung von Bindungspaaren liefert.
gc) Die Matrix nach Punkt g), wobei jeder der Antikörper an einem geeigneten Substrat immobilisiert wird und die immobilisierten Antikörper mit den Peptidsequenzen in Kontakt gebracht werden.
gd) Die Matrix nach Punkt gc), wobei jede der Peptidsequenzen mit einem geeigneten Marker markiert wird, der die Bindung nicht wesentlich stört und ein Mittel zur Identifizierung von Bindungspaaren liefert.
ge) Die Matrix nach Punkt gd), wobei jede der Peptidsequenzen auf der Oberfläche eines Fusionsproteins oder eines modifizierten Vektors liegt, wobei das Protein oder der Vektor selbst den Marker umfaßt.
gf) Die Matrlx nach Punkt g, wobei jede der Peptidsequenzen mit jedem der Antikörper bis zur Identifizierung von mindestens einem Peptidsequenz-Antikörper- Bindungspaar in Kontakt gebracht wird.
i) Ein Verfahren zur Konstruktion einer Matrix nach Punkt g, die umfaßt: Gewinnung einer Population von Peptidsequenzen mit etwa 4 bis etwa 12 L- Aminosäureresten, wobei jedes Mitglied der Population die gleiche Länge aufweist, wobei die Population mindestens 10% aller Peptidsequenzen der vorbestimmten Länge um-
Gewinnung einer heterogenen Population von Antikörpern, die Antikörper umfaßt, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Peptidsequenzpopulation binden können, und
Inkontaktbringen der Antikörper mit den Peptidsequenzen für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, so daß mindestens ein Peptidsequenz-Antikörper-Bindungspaar erzeugt wird.
ia) Das Verfahren nach Punkt i), das ferner den folgenden Schritt umfaßt: Markierung der Antikörper, Peptidsequenzen oder beider mit einem geeigneten Marker, der die Bindung nicht wesentlich stört und ein Mittel zur Identifizierung von Bindungspaaren liefert.
ib) Das Verfahren nach Punkt i), wobei jede der Peptidsequenzen und jeder der Antikörper gereinigt werden und jede der Peptidsequenzen mit jedem der Antikörper bis zur Identifizierung von mindestens einem Peptidsequenz-Antikörper-Bindungspaar in Kontakt gebracht wird.
ic) Das Verfahren nach Punkt ib), wobei jede der Peptidsequenzen einzeln mit jedem der Antikörper bis zur Identifizierung von mindestens einem Peptidsequenz- Antikörper-Bindungspaar in Kontakt gebracht wird.
id) Das Verfahren nach Punkt i), wobei jede der Peptidsequenzen auf einem geeigneten Substrat immobilisiert wird und die immobilisierten Peptidsequenzen mit den Antikörpern in Kontakt gebracht werden.
ie) Das Verfahren nach Punkt id), wobei jeder der Antikörper mit einem geeigneten Marker, der die Bindung nicht wesentlich stört und ein Mittel zur Identifizierung von Bindungspaaren liefert, markiert wird.
if) Das Verfahren nach Punkt i), wobei jeder der Antikörper an einem geeigneten Substrat immobilisiert wird und die immobilisierten Antikörper mit den Peptidsequenzen in Kontakt gebracht werden.
ig) Das Verfahren nach Punkt if), wobei jede der Peptidsequenzen mit einem geeigneten Marker, der die Bindung nicht wesentlich stört und ein Mittel zur Identifizierung von Bindungspaaren liefert, markiert wird.
ih) Das Verfahren nach Punkt ig), wobei jede der Peptidsequenzen auf der Oberfläche eines Fusionsproteins oder modifizierten Vektors liegt, wobei das Protein oder der Vektor selbst den Marker umfaßt.
ii) Das Verfahren nach Punkt i), wobei jede der Peptidsequenzen von einem gentechnisch hergestellten Vektor als Teil eines größeren Fusionspolypeptids translatiert wird.
ij) Das Verfahren nach Punkt ii), wobei jede Peptidsequenz aus ihrem Ausgangspolypeptid ausgeschnitten wird.
j) Ein Verfahren zur Ermittlung der immunologischen und/oder genotypischen Eigenschaften einer Testspezies, wobei die Testspezies ein Antikörper, Virus, Bakteriophage, Enzym, Protein, Polypeptid, nicht-peptidischer Wirkstoff oder eine nicht-peptidische bioaktive Substanz ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Konstruktion einer Matrix nach Punkt g, die eine Population von Peptidsequenzen der gleichen Länge umfaßt, wobei die Länge etwa 4 bis etwa 12 L- Aminosäurereste ist, wobei die Population mindestens 10% aller Peptidsequenzen der ausgewählten Länge umfaßt; und eine heterogene Population von Antikörpern, die Antikörper umfassen, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Peptidsequenzpopulation binden können;
Inkontaktbringen der Antikörper mit den Peptidsequenzen für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, so daß mindestens ein Peptidsequenz-Antikörper-Bindungspaar erzeugt wird,
Inkontaktbringen der Testspezies mit der Matrix,
Beobachtung, wo die Testspezies die Bindungspaare stört, und Identifizierung der Peptidsequenz oder des Antikörpers an der Stelle oder den Stellen, an denen die Bindung gestört ist.
k) Ein Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen Peptidsequenz, die eine ausreichende Konformationsähnlichkeit zu einer Antikörpererkennungsstelle auf einer Testspezies aufweist, so daß ein Antikörper, der die Erkennungsstelle erkennen und an sie binden kann, auch an die Peptidsequenz binden kann, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen der Testspezies mit einer Matrix nach Punkt g),
Beobachtung. wo die Testspezies die Bindungspaare stört, und
Identifizierung einer Peptidsequenz, die ein Bindungspaar umfaßt, das durch die Gegenwart der Testspezies gestört ist.
ka) Das Verfahren nach Punkt k), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Peptid ist, wobei jede immobilisierte Peptidsequenz ein Bindungspaar mit einem entsprechenden Antikörper erzeugt, und die Peptidsequenz, die an einer Stelle immobilisiert ist, an der die Bindung gestört wird, identifiziert wird.
kb) Das Verfahren nach Punkt k), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Antikörper ist, wobei jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, und eine Peptidsequenz, die durch die Gegenwart der Testspezies ersetzt wird, identifiziert wird.
m) Ein Verfahren zur Charakterisierung eines rekombinanten Genprodukts einer Genexpressionsbank, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen des rekombinanten Genprodukts mit einer Matrix,
Beobachtung. wo das Genprodukt die Bindungspaare stört, und
Identifizierung der Peptidsequenz, die ein Bindungspaar umfaßt, das durch die Gegenwart des rekombinanten Genprodukts gestört wird.
ma) Das Verfahren nach Punkt m), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Peptid ist, wobei jede immobilisierte Peptidsequenz ein Bindungspaar mit einem entsprechenden Antikörper erzeugt, und die Peptidsequenz, die an der Stelle immobilisiert ist, an der die Bindung gestört ist, identifiziert wird.
mb) Das Verfahren nach Punkt m), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Antikörper ist, wobei jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, und eine Peptidsequenz, die durch die Gegenwart des rekombinanten Genprodukts erzeugt wird, identifiziert wird.
n) Ein Verfahren zur Lokalisierung des Gens, das ein Protein, Enzym oder Peptid codiert, in einem Genom, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen des Proteins, Enzyms oder Peptids mit einer Matrix,
Beobachtung, wo das Protein die Bindungspaare stört,
Identifizierung der rekombinanten Zellinie, die eine Peptidsequenz produziert, die ein Bindungspaar umfaßt, das durch die Gegenwart des Proteins, Enzyms oder Peptids gestört wird, und
Verwendung der Nucleotidsequenz der das Peptid codierenden Oligonucleotidinsertion als DNA-Sonde zur Lokalisierung des das Protein codierenden Gens.
na) Das Verfahren nach Punkt n), wobei die Matrix eine Matrix mit innnobilisiertem Peptid ist, wobei jede immobilisierte Peptidsequenz ein Bindungspaar mit einem entsprechenden Antikörper erzeugt, und die Peptidsequenz, die an der Stelle immobilisiert ist, an der die Bindung gestört ist, identifiziert wird.
nb) Das Verfahren von Punkt n), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Antikörper ist, wobei jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, und eine Peptidsequenz, die durch die Gegenwart des Proteins, Enzyms oder Peptids ersetzt wird, identifiziert wird.
o) Ein Verfahren zur Ermittlung einer Peptidsequenz, die von einem ersten Antikörper erkannt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen des ersten Antikörpers mit einer Matrix nach Punkt g),
Beobachtung, wo der erste Antikörper an eine Matrix-assoziierte Peptidsequenz bindet und
Identifizierung der Peptidsequenz.
oa) Das Verfahren nach Punkt o), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Peptid ist, und die Peptidsequenz, die an einer Stelle immobilisiert ist, an der die Bindung gestört wird, identifiziert wird.
ob) Das Verfahren nach Punkt o), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Antikörper ist, wobei jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, und ein Peptid, das durch die Gegenwart des ersten Antikörpers ersetzt wird, identifiziert wird.
p) Ein Verfahren zur Ermittlung der Nucleotidsequenz, die eine Peptidsequenz codiert, die von einem ersten Antikörper erkannt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Inkontaktbringen des ersten Antikörpers mit einer Matrix nach Punkt g),
Beobachtung, wo der erste Antikörper an eine Matrix-assoziierte Peptidsequenz bindet und
Identifizierung der genetisch rekombinanten Zellinie, die die Peptidsequenz produziert, und
Ermittlung der die Peptidsequenz codierenden Oligonucleotidsequenz, die in den in die Zellinie transferierten Vektor insertiert ist.
pa) Das Verfahren nach Punkt p), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Peptid ist, und die Peptidsequenz, die an einer Stelle immobilisiert ist, an der die Bindung gestört wird, identifiziert wird.
pb) Das Verfahren nach Punkt p), wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Antikörper ist, wobei jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, und eine Peptidsequenz, die durch die Gegenwart des ersten Antikörpers ersetzt wird, identifiziert wird.

Claims

1. Population von Oligonucleotiden, wobei:

jedes Mitglied der Population im wesentlichen aus 1 bis etwa 50 Tandemsequenzen mit etwa 4 bis etwa 12 Nucleotidtripletts besteht,

jedes Mitglied der Population die gleiche Anzahl von Tandem-Wiederholungssequenzen der gleichen Länge aufweist,

jede der Tandemsequenzen eine entsprechende Peptidsequenz mit etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten codiert, und

die Population mindestens etwa 10 % aller Peptidsequenzen der ausgewählten Länge codiert.

2. Oligonucleotidpopulation nach Anspruch 1, wobei jedes Mitglied der Population eine Einzelkopie der Nucleotidtriplettsequenz umfaßt.

3. Oligonucleotidpopulation nach Anspruch 1, wobei jede Sequenz 5 bis 7 Nucleotidtripletts umfaßt.

4. Oligonucleotidpopulation nach Anspruch 2, wobei die Population durch Scheren von genetischem Material von Säugern erzeugt wird.

5. Oligonucleotidpopulation nach Anspruch 1, wobei die Population aus den Nucleinsäurebestandteilen chemisch synthetisiert wird.

6. Verfahren zur Herstellung einer Population von Peptiden, die durch die Oligonucleotide nach Anspruch 1 codiert werden, wobei:

jedes Mitglied der Population 1 bis etwa 50 Tandem-Peptidsequenzen mit etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten umfaßt,

jedes Mitglied der Population die gleiche Anzahl von Tandemsequenzen der gleichen Länge aufweist, und die Population mindestens etwa 10 % aller möglichen Peptidsequenzen der ausgewählten Länge enthält,

wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

das zufällige Scheren von Proteinen oder die zufällige chemische Synthese aus den L-Aminosäurebestandteilen, oder die Herstellung der entsprechenden Oligonucleotide durch zufällige Spaltung von biologischem genetischem Material oder die zufällige Synthese aus den Nucleinsäurebestandteilen, Insertion der Nucleotidsequenzen in Vektoren, Transfer der Vektoren in geeignete Wirtszellen, Züchtung der Zellen und Gewinnung der Peptide.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei jedes Mitglied der Population eine Einzelkopie der Peptidsequenz umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei jede Sequenz 5 bis 7 L- Aminosäurereste umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Population durch Scheren von Proteinen erzeugt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Population aus den L-Aminosäurebestandteilen chemisch synthetisiert wird.

11. Population von Vektoren, wobei jedes Mitglied der Population eine im wesentlichen identische autonom replizierbare Nucleinsäuresequenz umfaßt, wobei mindestens ein Teil jeder Sequenz ein Strukturgen ist, und

eine Oligonucleotidinsertion gemäß der Definition in Anspruch 1, die rekombinant in das Strukturgen innerhalb des Vektors insertiert ist, wobei ein signifikanter Anteil der Vektorpopulation deren rekombinante Strukturgene exprimieren kann, wenn sie in die entsprechenden Wirtszellen transferiert werden, und wobei die Expression der rekombinanten Strukturgene rekombinante Polypeptide erzeugt, die Aminosäuresequenzen gemäß der Definition in Anspruch 6 umfassen.

12. Rekombinante Polypeptidpopulation, produziert von der Vektorpopulation nach Anspruch 11.

13. Rekombinante Polypeptidpopulation nach Anspruch 12, wobei jede Tandemeinheit von Nucleotidtripletts 5 bis 7 Nucleotidtripletts umfaßt.

14. Matrix, umfassend ein Substrat, an dem die Sequenzen immobilisiert werden können, und eine Population von Peptidsequenzen der gleichen Länge gemäß der Definition in Anspruch 6, wobei die Länge bei etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten liegt, wobei die Population mindestens 10 20 % aller Peptidsequenzen der ausgewählten Länge umfaßt,

und

eine heterogene Population von Antikörpern, umfassend Antikörper, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Oligopeptidpopulation binden können.

15. Verfahren zur Konstruktion einer Matrix nach Anspruch 14, umfassend:

Gewinnung einer Population von Peptidsequenzen mit etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten, wobei jedes Mitglied der Population die gleiche Länge hat, wobei die Population mindestens 10 % aller Peptidsequenzen der vorbestimmten Länge umfaßt,

Gewinnung einer heterogenen Population von Antikörpern, umfassend Antikörper, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Peptidsequenzpopulation binden können, und Inkontaktbringen der Antikörper mit den Peptidsequenzen für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, so daß mindestens ein Peptidsequenz-Antikörper-Bindungspaar erzeugt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, weiterhin umfassend den folgenden Schritt:

Markieren der Antikörper, der Peptidsequenzen oder beider mit einem geeigneten Marker, der die Bindung nicht wesentlich stört und ein Mittel zur Identifizierung von Bindungspaaren liefert.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei jede der Peptidsequenzen gereinigt wird, jeder der Antikörper gereinigt wird und jede der Peptidsequenzen mit jedem der Antikörper in Kontakt gebracht wird, bis mindestens ein Peptidsequenz- Antikörper-Bindungspaar identifiziert ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei jede der Peptidsequenzen individuell mit jedem der Antikörper in Kontakt gebracht wird, bis mindestens ein Peptidsequenz-Antikörper-Bindungspaar identifiziert ist.

19. Verfahren nach Anspruch 15, wobei jede der Peptidsequenzen an einem geeigneten Substrat immobilisiert ist und die immobilisierten Peptidsequenzen mit den Antikörpern in Kontakt gebracht werden.

20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei jeder der Antikörper mit einem geeigneten Marker markiert wird, der die Bindung nicht wesentlich stört und ein Mittel zur Identifizierung von Bindungspaaren liefert.

21. Verfahren nach Anspruch 15, wobei jede der Peptidseguenzen von einem gentechnisch hergestellten Vektor als Teil eines größeren Fusionspolypeptids translatiert wird.

22. Verfahren zur Bestimmung von immunologischen und/oder genotypischen Eigenschaften einer Testspezies, wobei die Testspezies ein Antikörper, Virus, Bakteriophage, Enzym, Protein, Polypeptid, nicht-peptidischer Wirkstoff oder eine nicht-peptidische bioaktive Substanz ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Konstruktion einer Matrix nach Anspruch 14, umfassend eine Population von Peptidsequenzen der gleichen Länge, wobei die Länge bei etwa 4 bis etwa 12 L-Aminosäureresten liegt, wobei die Population mindestens 10 % aller Peptidsequenzen der ausgewählten Länge umfaßt; und eine heterogene Population von Antikörpern, umfassend Antikörper, die im wesentlichen an jedes Mitglied der Peptidsequenzpopulation binden können,

Inkontaktbringen der Antikörper mit den Peptidsequenzen für einen ausreichenden Zeitraum und unter geeigneten Bedingungen, so daß mindestens ein Peptidsequenz-Antikörper-Bindungspaar erzeugt wird,

Inkontaktbringen der Testspezies mit der Matrix, Beobachten, wo die Testspezies die Bindungspaare stört, und Identifizierung der Peptidsequenz oder des Antikörpers an der Stelle oder den Stellen, wo die Bindung ge stört ist.

23. Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen Peptidsequenz, die eine ausreichende Konformationsähnlichkeit mit einer Antikörpererkennungsstelle auf einer Testspe zies hat, so daß ein Antikörper, der die Erkennungsstelle erkennen und daran binden kann, auch an die Peptidsequenz binden kann, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Inkontaktbringen der Testspezies mit einer Matrix nach Anspruch 14,

Beobachten, wo die Testspezies die Bindungspaare stört, und

Identifizierung einer Peptidsequenz, die ein Bindungs paar umfaßt, das durch die Gegenwart der Testspezies gestört wird.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Peptid ist, wobei jede immobilisierte Peptidsequenz ein Bindungspaar mit einem entsprechenden Antikörper erzeugt, und die Peptidsequenz, die an einer Stelle immobilisiert ist, wo die Bindung gestört wird, identifiziert wird.

25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Antikorper ist, wobei jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, und eine Peptidsequenz, die durch die Gegenwart der Testspezies ersetzt wird, identifiziert wird.

26. Verfahren zur Lokalisierung des Gens in einem Genom, das ein Protein, Enzym oder Peptid codiert, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

Inkontaktbringen des Proteins, Enzyms oder Peptids mit einer Matrix nach Anspruch 14,

Beobachten, wo das Protein die Bindungspaare stört, Identifizierung der rekombinanten Zellinie, die einen Vektor nach Anspruch 11 umfaßt, wobei die Zellinie eine Peptidsequenz produziert, die in einem Bindungspaar vorliegt, das durch die Gegenwart des Proteins, Enzyms oder Peptids gestört wird, und

Verwendung der Nucleotidsequenz der Oligonucleotidsequenz der Oligonucleotidinsertion, die die Peptidsequenz codiert, als eine DNA-Sonde zur Lokalisierung des Gens, das das Protein codiert.

27. Verfahren zur Bestimmung einer Peptidsequenz, die durch einen ersten Antikörper erkannt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

Inkontaktbringen des ersten Antikörpers mit einer Matrix nach Anspruch 14,

Beobachten, wo der erste Antikörper an eine Matrix-assoziierte Peptidsequenz bindet, und

Identifizierung der Peptidsequenz.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Peptid ist und die Peptidsequenz, die an einer Stelle immobilisiert ist, wo die Bindung gestört wird, identifiziert wird.

29. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Matrix eine Matrix mit immobilisiertem Antikörper ist, wobei jeder immobilisierte Antikörper ein Bindungspaar mit einer entsprechenden Peptidsequenz erzeugt, und ein Peptid, das durch die Gegenwart des ersten Antikörpers ersetzt wird, identifiziert wird.